CN112807487A

CN112807487A - 纳米多糖复合物及其制造方法与用途

Info

Publication number: CN112807487A
Application number: CN202011148851.2A
Authority: CN
Inventors: 许明照
Original assignee: Panion and BF Biotech Inc
Current assignee: Panion and BF Biotech Inc
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2021-05-18
Also published as: TW202120105A

Abstract

本公开提出一种纳米多糖复合物及其制造方法与用途，纳米多糖复合物包括β‑1,3‑葡聚糖以及几丁质。其中纳米多糖复合物具有固态碳‑13交叉极化魔角旋转核磁共振的光谱包含以下峰值：176±0.2ppm、103±0.2ppm、87±0.2ppm以及74±0.2ppm。纳米多糖复合物具有促进伤口愈合、治疗干眼症及促进骨再生的功效。

Description

纳米多糖复合物及其制造方法与用途

技术领域

本公开为关于一种纳米多糖复合物及其制造方法与用途，特别是关于用于促进伤口愈合、用于治疗干眼症或用于骨骼重建的纳米多糖复合物及其制造方法与用途。

背景技术

在开发生物材料时，安全是首要考量因素。理想的生物材料应具有与宿主的生物相容性，并具有三个特性。首先，生物材料必须在生化上与宿主的生理系统相容，而且必须无毒、不引起排斥、不引起过敏和不致癌。其次，生物材料必须与周围组织具有生化相容性。第三，生物材料与活组织之间应该有适当的生物粘附接触。

根据材料类型，我们可以将生物材料分为四种类型:金属、陶瓷、聚合物和复合材料。聚合物，特别是生物聚合物，由于具有良好的生物相容性而受到了研究者的广泛关注。生物聚合物可以从动物、植物、真菌等物质中合成或提取。生物聚合物在医学上的应用越来越广泛，从用于伤口愈合的敷料到用于骨再生的骨植入物皆可使用生物聚合物。

纳米级生物材料具有独特的物理和化学性质，是当前生物材料研究的热点。纳米级材料可以提供更高的表面积，从而获得更好的分散性甚至更好的水化能力。此外，纳米级材料的表面改性也可以增加材料的新性能。然而，一般纳米级生物材料的制造方法耗时费工，且能源消耗高，或者无法同时提供合适的物理及化学性质。

发明内容

本公开提出一种纳米多糖复合物，包括：β-1,3-葡聚糖以及几丁质。其中纳米多糖复合物具有固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振(solid-state ¹³C cross polarizedmagic angle spinning nuclear magnetic resonance，ss ¹³C CP-MAS NMR)的光谱包含以下峰值：176±0.2ppm、103±0.2ppm、87±0.2ppm以及74±0.2ppm。

在一些实施方式中，ss ¹³C CP-MAS NMR的光谱进一步包括以下峰值： 77±0.2ppm、68±0.2ppm、62±0.2ppm以及23±0.2ppm。

在一些实施方式中，当ss ¹³C CP-MAS NMR的光谱包含176±0.2ppm 峰值时，表示羧基位于纳米多糖复合物的6号碳上。

在一些实施方式中，每克纳米多糖复合物中的羧基的含量大于0.2mmol。

在一些实施方式中，纳米多糖复合物具有ζ电位(zeta potential)介于-10 mV至-55mV之间。

在一些实施方式中，纳米多糖复合物的长度介于400nm至2000nm之间。

本公开另提供一种制造纳米多糖复合物的方法，包括以下步骤：提供多糖复合物；混合多糖复合物、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物 (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl，以下简称TEMPO)、助催化剂以及水以获得混合溶液；于混合溶液中加入氧化剂，在pH值为10的环境下对多糖复合物进行氧化反应，以使多糖复合物中6号碳的羟基反应为羧基；加入终止剂以终止氧化反应，以获得氧化多糖复合物；以及，透析分子重量小于8000 MW的氧化多糖复合物以获得纳米多糖复合物。

在一些实施方式中，上述方法还包括在加入终止剂的步骤之后，通过加入丙酮以析出氧化多糖复合物。

本公开另提供一种组合物用于制备促进伤口愈合的药物的用途，其中组合物包括上述纳米多糖复合物。

在一些实施方式中，组合物还包括丙烯酰胺硫酸盐水凝胶(AMP)。

在一些实施方式中，汗腺及毛囊在伤口愈合处生长。

本公开另提供一种组合物用于制备治疗干眼症的药物的用途，其中组合物包括上述纳米多糖复合物。

在一些实施方式中，组合物还包括高浓度血小板血浆，且高浓度血小板血浆为几丁质活化的高浓度血小板血浆。

本公开另提供一种组合物用于制备促进骨骼再生的药物的用途，其中组合物包括上述纳米多糖复合物。

本公开所述的新颖纳米多糖复合物具有医疗应用上的潜力，其多孔及胶体的物理性质，成为医学材料的优秀选择。在本公开一实施例中，在制备上，仅需以具有TEMPO的氧化系统便能产生该纳米多糖复合物。另外，本公开的纳米多糖复合物的表面具有高亲水性的羧基，具有良好的保水性，且易与其他亲水药物或细胞等结合。在创伤应用中，纳米多糖复合物可加速伤口愈合，并且可为愈合后的伤口提供功能性(汗腺及毛囊等)组织。在干眼症应用中，纳米多糖复合物亦显示良好的疗效。而当纳米多糖复合物作为高分子骨架，以修复骨缺损应用中，更展现了迅速凝血、加速生长且生长完整的不同面相疗效。因此，本公开所述的纳米多糖复合物在伤口愈合、治疗干眼症和骨再生方面都具有潜力。

附图说明

以下将结合附图阅读，根据以下详细描述可以最好地理解本公开的各方面。应理解，根据行业中的惯例，各种特征未按比例绘制。实际上，为了清楚起见，各种特征的尺寸可以任意地增加或减小。

图1A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的傅立叶转换红外线光谱仪(FTIR)的光谱。

图1B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振(solid-state ¹³C cross polarized magic angle spinning nuclearmagnetic resonance，ss ¹³C CP-MAS NMR)的光谱。

图1C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的X光绕射图谱。

图1D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量折线图。

图1E所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的尺寸的柱状图与ζ电位(zeta potential)的折线图。

图2A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的成胶状态图。

图2B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的保水能力的柱状图。

图2C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的表面与截面的扫描式电子显微镜(SEM)图。

图2D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的穿透式电子显微镜(TEM)图。

图3A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于人类纤维母细胞WS-1的细胞存活率分析(MTT assay)柱状图。

图3B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于第1型糖尿病的大鼠血液的凝血时间柱状图。

图3C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的愈合时间柱状图。

图3D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的剩余伤口面积与治疗时间折线图。

图3E所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的治疗愈合过程图。

图3F所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的伤口愈合前后比较图；上排为愈合前伤口图，下排为愈合后伤口图。

图3G所示为根据本公开一实施方式对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口于不同时间的愈合组织染色图。

图4A所示为根据本公开一实施方式的不同浓度纳米多糖复合物对于兔子眼角膜纤维母细胞(statens seruminstitut rabbit cornea，SIRC)的存活率分析 (WST-1assay)柱状图。

图4B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物结合高浓度血小板血浆后对SIRC细胞于不同时间的存活率分析柱状图。

图4C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物结合高浓度血小板血浆后的兔子眼角膜纤维母细胞迁移试验柱状图。

图4D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物施用于患有严重干眼症兔子角膜的前后比较图。

图4E所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物施用于患有严重干眼症兔子角膜的前后萤光比较图。

图4F所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物施用于患有严重干眼症兔子角膜的组织分析比较染色图；比例尺(scale bar)长度为125μm。

图5A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于小鼠膜内骨生成前类骨母细胞(MC3T3-E1 mouse preosteoblasts)的细胞存活率分析柱状图。

图5B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物骨架及 MC3T3-E1细胞迁移的SEM图。

图5C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物及HAps(60％hydroxyapatite/40％β-tricalcium phosphate)对于健康大鼠血液的凝血时间柱状图。

图5D所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生后MicroCT的矢状切面及横状切面比较图。

图5E所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生后，大鼠患部的横状切面重建图形的比较图。

图5F所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生的柱状图。

图5G所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生的组织分析比较图。

具体实施方式

为了使本公开的叙述更加详尽与完备，下文详细描述本公开的实施方式与具体实施例；但这并非实施或运用本揭示内容具体实施例的唯一形式。以下所揭示的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。

于本文中所使用的「包含」、「包括」、「具有」及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、元件与/或组件，但不排除其它的特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件，与/或其中的群组。

制备例1

取热水萃取的灵芝(Ganoderma tsugae，松杉灵芝)纤维50g(购自Kang Jian，中国台湾南投)，以400mL 1N氢氧化钠在85℃的环境下进行分解，持续24小时。分解后，收集反应残留物并以去离子水清洗，以去除残留的氢氧化钠。接着使用过氧化氢(过氧化氢与反应残留物的重量比为1：3)进行脱色获得浆状混合物。脱色(漂白)后，以二次去离子水完整清洗脱色后的浆状混合物。通过过滤以及冻干清洗后的浆状混合物，即得本公开所称的多糖复合物(SC)。

关于多糖复合物的纳米化，包括物理方法及化学方法，而在制备例1中，将描述纳米化的物理方法，说明如下。将4g的多糖复合物分散于200mL的二次去离子水中，使用均质机

PT 3100D以10,000rpm的转速进行均质化5分钟。接着，使用高压均质机

N-2在压力为20,000psi 的状态下，进行纳米化，执行循环数分别为3循环、5循环以及10循环，以获得纳米多糖复合物。前述纳米多糖复合物依据纳米化执行的循环数分别以 SCN3、SCN5以及SCN10代表。纳米化后，悬浮的纳米多糖复合物将呈现胶状。

制备例2

与制备例1不同的是，制备例2在收集多糖复合物的步骤之后，将以化学氧化方法进行纳米多糖复合物的制造。具体来说，在制备例2中的化学方法，是通过具有TEMPO的氧化体系来执行的。

将5g的多糖复合物分散于375mL的二次去离子水中，前述二次去离子水中包括0.0625g TEMPO以及0.625g溴化钠以获得混合溶液。以TEMPO为媒介来氧化具有多糖复合物的混合溶液(浆状)的程序，将在加入5％次氯酸钠(NaClO)水溶液后启动。NaClO的加入量有5种(分别为每克多糖复合物加入1.66、3.33、5.00、6.67及10mmol NaClO)，接着将前述5种加入量的NaClO 加入混合溶液，并在室温下持续搅拌。反应中，将加入5N的氢氧化钠以及1N的氯化氢，以维持pH值为10的氧化反应的环境，持续2小时或直到没有任何碱被消耗。前述氧化反应将在加入5mL乙醇后终止，接着加入200mL 丙酮来析出以TEMPO为媒介氧化的多糖复合物，其呈现浆状。前述浆状的多糖复合物将以

D80进行透析，其中，将透析分子量介于6000至8000 之间的多糖复合物。透析的步骤将在二次去离子水中于室温下执行7天。透析后的多糖复合物将进一步以高压均质机

N-2在压力为20,000 psi的状态下，进行1循环的均质化，接着冻干得到纳米多糖复合物的产物。前述产物将依据NaClO氧化剂的加入量分别以T016SC、T033SC、T050SC、T067SC以及T100SC来代表。

关于上述制备例1及2中所述的产物，即纳米多糖复合物，其各种物质特性及实施方式将搭配附图，并在以下说明中详细描述。

于本公开的一些实施方式中，提出一种纳米多糖复合物，包括：β-1,3- 葡聚糖以及几丁质。β-1,3-葡聚糖通常从蘑菇或真菌中提取，是最具生物活性的多糖生物高聚物之一。并且，β-1,3-葡聚糖具有伤口愈合或骨质再生等效果。在一实施方式中，纳米多糖复合物包含β-1,3-葡聚糖与几丁质，其中β-1,3- 葡聚糖相对于几丁质的摩尔比为大约60：40。

实施例1

关于上述纳米多糖复合物的各种性质及检测数据，请参考图1A至图1E。关于代号，图中SC代表多糖复合物；SCN3代表以经过高压均质机进行3循环所制成的纳米多糖复合物；SCN5代表以经过高压均质机进行5循环所制成的纳米多糖复合物；CN10代表以经过高压均质机进行10循环所制成的纳米多糖复合物；T016SC代表每公克多糖复合物以1.66mmolNaClO进行氧化制成的纳米多糖复合物；T033SC代表每公克多糖复合物以3.33mmol NaClO进行氧化制成的纳米多糖复合物；T050SC代表每公克多糖复合物以5.0mmol NaClO进行氧化制成的纳米多糖复合物；T067SC代表每公克多糖复合物以 6.67mmol NaClO进行氧化制成的纳米多糖复合物；T100SC代表每公克多糖复合物以10.0mmol NaClO进行氧化制成的纳米多糖复合物。

如图1A所示，图1A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的 FTIR光谱。纳米多糖复合物具有3400cm^-1、2900cm^-1以及1060cm^-1三个峰值，其分别代表纤维素质或几丁质成分的峰值，即O-H、C-H以及C-O。当氧化程度提高，1620cm^-1的峰值出现，其代表C＝O，同时代表C-H为2920cm^-1的峰值也降低。前述两个峰值改变(C＝O及C-H)代表在纳米多糖复合物中，6 号碳上生成了羧基。

接着请参考图1B，图1B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的ss ¹³CCP-MAS NMR的光谱。由图1B所示，在一些实施方式中，上述具有β-1,3-葡聚糖以及几丁质的纳米多糖复合物的1号碳至6号碳的峰值分别为大约103±0.2ppm、大约62±0.2ppm、大约74±0.2ppm、大约87±0.2 ppm、大约77±0.2ppm、大约68±0.2ppm。而8号碳为纳米多糖复合物中几丁质的乙酰酰胺碳，其峰值为大约23±0.2ppm。在一些实施方式中，当纳米多糖复合物受到氧化剂NaClO氧化的程度愈高，6号碳上的羟基会反应为羧基，而此时6号碳的峰值为大约176±0.2ppm。同时，因为氧化作用的缘故，5号碳的峰值也会由大约77ppm移至74ppm，并与3号碳的峰值稍微重叠。于此，必须说明的是，此处提及的氧化及其相关步骤与程序，已于制备例2中详述。

接着参考图1C，图1C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的X光绕射图谱。由图1C可知，2θ为6.2°及20.8°的两个峰值显示于图中(即 SC较为突出的两个尖峰点)。随着氧化程度的增加，前述两个峰值愈来愈平缓，此变化表示，氧化程度的增加会进而增强纳米多糖复合物的非晶形特性，并提升冻干材料的再分散性。

参考图1D，图1D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量折线图。在一实施方式中，每克纳米多糖复合物中的羧基含量(mmol/g)大于0.2mmol。在一些实施例中，如图1D所示，随着氧化剂NaClO 加入量的增加，羧基含量几乎呈线性成长，而醛基维持着较低的含量。在一些实施例中，T016SC中每克纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量分别为 0.2238mmol及0.2348mmol；T033SC中每克纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量分别为0.2184mmol及0.6881mmol；T050SC中每克纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量分别为1.8030mmol及0.1194mmol；T067SC中每克纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量分别为2.4275mmol及0.2517mmol； T100SC中每克纳米多糖复合物中羧基与醛基的含量分别为3.0486mmol及 0.5976mmol。由上叙述可知，每克纳米多糖复合物中醛基的含量皆小于1mmol，因此可确保本公开的纳米多糖复合物较不具有化学毒性。

在一实施方式中，纳米多糖复合物的长度介于400nm至2000nm之间，例如，但不限于400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000 nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm、1600nm、1700nm、 1800nm、1900nm、2000nm或者此等值中任意两者之间的任何值。在一实施方式中，纳米多糖复合物的ζ电位介于-10mV至-55mV之间的ζ电位，例如，但不限于-10mV、-15mV、-20mV、-25mV、-30mV、-35mV、-40mV、 -45mV、-50mV、-55mV或者此等值中任意两者之间的任何值。具体而言，图1E所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的尺寸与ζ电位的折线图。图中所示SCN3、SCN5及SCN10，分别代表形成纳米多糖复合物前，以NanoLayer^TM进行纳米化的循环数，SCN3为3循环，SCN5为5循环，SCN10 为10循环。SCN3、SCN5及SCN10的长度分别为774.6nm、735.4nm及627.6 nm，且标准差分别为311.08nm、106.83nm及87.47nm。在一实施方式中， SCN3、SCN5及SCN10具有相似的ζ电位，其约为-10mV。在一实施方式中，根据T016SC、T033SC、T050SC、T067SC及T100SC的不同氧化程度可知，前述纳米多糖复合物的长度分别为1809.2nm、1352.2nm、539.2nm、 466.4nm及422.8nm；而标准差分别为360.43nm、109.76nm、49.35nm、 6.02nm及25.63nm。并且，前述纳米多糖复合物的ζ电位，分别为-31.3mV、 -42.8mV、-51.6mV、-51.1mV及-50.4mV。根据上述，可知当执行纳米化的循环次数愈多，长度会有变小的趋势。同时，可知当纳米多糖复合物受到氧化的氧化程度愈高，长度亦会有变小的趋势，而ζ电位会有上升的趋势。

实施例2

关于纳米多糖复合物的成胶后性质，请参考图2A至图2D。请先参考图 2A，图2A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的成胶状态图。通过倒置瓶的方式，可以观察到纳米多糖复合物的成胶状态。由高压均质机

N-2在压力为20,000psi的状态下，进行纳米化3、5及10循环后的纳米多糖复合物SCN3、SCN5及SCN10皆可成胶。

继续参考图2A，将T016SC、T033SC、T050SC、T067SC以及T100SC 的纳米多糖复合物溶于水中并搅拌10分钟后，仅T100SC完全溶解，而其他四者仍是呈现纤维状水凝胶(hydrogel)。搅拌30分钟后，仅T050SC在倒置瓶中显示出了成胶的性质。然而，T050SC、T067SC以及T100SC的成胶性质在1小时的时间点消失，且成胶性质将不复存在。当搅拌持续6小时， T033SC出现了成胶的性质，且继续搅拌至24小时后，仍显示着成胶的状态。由上述可知，当受到氧化的程度愈高，则羧基的含量也愈高，纳米多糖复合物如T050SC、T067SC以及T100SC便愈易溶于水，且其溶解时间分别为30 分钟、10分钟及小于10分钟。相反的，T016SC因为羧基的含量较少，以致于需要更长的时间(约6小时)来溶解以及成胶，但如T016SC的成胶性质是持续存在不会消失的。

接着，请参考图2B，图2B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的保水能力图。将浓度皆为500μL 2％(w/v)的SCN5、T033SC及T050SC 分别注入具有孔底面积为2cm²的24孔多孔盘中后进行冻干，以获得0.5 mg/cm² SCN5、T033SC及T050SC的呈海绵薄膜(sponge film)的纳米多糖复合物。SCN5、T033SC及T050SC的保水能力分别为约每克呈海棉膜状的纳米多糖复合物具有28.59±1.96、56.15±1.57以及48.48±2.54g的水。SCN5、T033SC及T050SC的纳米多糖复合物皆具有良好的保水能力，但相较于 SCN5，T033SC及T050SC的保水能力则更好。由此可见，当纳米多糖复合物表面具有羧基时，其亲水性更佳，并能与更多的水分子键结。另外，T033SC 的保水能力又比T050SC再优秀一些，这是由于T033SC的3D结构更加完整的缘故。关于此处所述的3D结构将搭配后续图式描述。

如图2C所示，图2C所示为根据本公开一实施方式的呈海棉膜状的纳米多糖复合物的表面与截面的SEM图。在SEM图中，SCN5、T033SC及T050SC 在表面及截面中皆表现出高度的孔洞结构。SCN5及T050SC在表面具有类似的片状结构，但于截面处，T050SC的片状结构相较于SCN5具有更小的孔洞。相反的，T033SC则是在表面及截面皆具有梳状结构。

接着请参考图2D，图2D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物的TEM图。SCN5、T033SC及T050SC纳米多糖复合物的纤维长度分别为约753.36±103.72、825.54±109.18以及496.54±39.78nm。而纤维的宽度分别为约12.40±2.16、27.87±5.04以及33.83±6.93nm。相较于T033SC及 T050SC，SCN5具有更为缠绕的纤维，这是由于SCN5的ζ电位较低的缘故(图 1E)。当纳米多糖复合物的表面电位愈高，其纤维的分离性及分散性愈佳。

实施例3

人类纤维母细胞WS-1细胞存活率分析(MTT assay)

(1)配制细胞液：将人类纤维母细胞WS-1培养于最低必须培养基 (minimumessential medium，简称MEM)中，在37℃以及二氧化碳浓度5％的湿度环境下培养。MEM中包含10％胎牛血清FBS、1％NEAA、1％丙酮酸钠、 0.5％乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、0.5％维生素C磷酸镁(L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salthydrate)、10⁴IU/mL盘尼西林、10⁴μg/mL链霉素及25μg/mL两性霉素。在多孔盘的每一孔中，加入总量为5x 10⁴个的WS-1细胞，并培养1天。

(2)将纳米多糖复合物加入细胞液中进行细胞存活率分析：将SCN5及 T050SC以0.005％、0.025％、0.05％、0.1％及0.5％(w/v)的浓度加入多孔盘的各个孔洞中，并继续培养3天进行细胞存活率分析。3天后，加入MTT溶液 (每毫升MEM中1毫克MTT溶液)，并在37℃以及二氧化碳浓度5％的湿度环境下再培养1小时。接着移除具有MTT的培养基，并加入1mLDMSO，最后以550nm的光度进行测量分析。

细胞存活率分析结果如图3A所示，SCN5及T050SC在加入细胞液后，均显示了良好的细胞存活率。仅在SCN5以5％(w/v)的浓度加入细胞液后，显示了约20％的细胞死亡，但这应是可接受的范围。据此，可以证明本公开所述的纳米多糖复合物不具毒性，且具有高度生物相容性。

实施例4

对于具有第1型糖尿病的大鼠血液的凝血时间

(1)控制组及实验组准备：分别于圆底软管中置入10mg纱布、SCN5及 T050SC，并置于37℃水浴中。

(2)诱导大鼠罹患糖尿病以及采血：根据大鼠体重，以每公斤体重将65mg 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)静脉注射至大鼠体内，以诱导大鼠罹患第1 型糖尿病。接着以心脏穿刺采集大鼠患病后的血液，并记录针头穿刺大鼠的时间。

(3)凝血试验：每个圆底软管加入500μL的大鼠血液，并将软管置于37℃水浴中，待血液完全凝结后记录时间。

凝血时间如图3B所示，纱布(简称G)、SCN5及T050SC对于罹患糖尿病的大鼠血液的凝血时间分别为约143.25±13.89、106.75±13.52及114.25± 15.84秒。由此可见，纳米多糖复合物相较于纱布，凝血时间减少了约30秒。这应是由于纳米多糖复合物中存在纳米纤维结构所致。

实施例5-1

对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的愈合时间

动物实验皆依据台北医学大学动物实验中心的操作流程(LAC-2017-0352) 来执行。

(1)控制组及实验组的敷料准备：G，纱布及聚氨酯膜(PU film)。H，丙烯酰胺硫酸盐(AMP)水凝胶。SCN5/H，SCN5纳米多糖复合物及丙烯酰胺硫酸盐水凝胶。T050SC/H，T050SC纳米多糖复合物及丙烯酰胺硫酸盐水凝胶。

(2)诱导大鼠罹患糖尿病以及血糖追踪：大鼠(Sprague Dawley rat，SD rat) 饲养于12小时昼夜转换的环境中，且给予充足的食物及水分。在大鼠成长7 周后，根据大鼠体重，以每公斤体重将65mg链脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 静脉注射至大鼠体内，以诱导大鼠罹患第1型糖尿病。使用

Performa血糖计追踪大鼠血糖。诱导注射7天后，若大鼠的血糖高于400mg/dL，则判定大鼠罹患糖尿病。接着，使用

麻醉大鼠。

(3)大鼠伤口愈合试验：使用8-mm组织取样器(biopsy punch)制造伤口，并利用环状硅夹板固定伤口以防止伤口变形或收缩。接着，将四种敷料G、 H、SCN5/H及T050SC/H随机涂敷于伤口后，以绷带缠绕固定敷料。在第0、 1、3、6、9、12、14、16、18及20天，会更换敷料。而在第0、1、3、6、9、 12、14、16、18、20及21天，以ImageJ software(NIH)纪录伤口图像。

伤口治疗结果与流程如图3C至图3F所示。参考图3C，图3C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的愈合时间图。4种敷料G、H、SCN5/H及T050SC/H使用后，所须的愈合时间分别大约为19.5±1.7、16.5±1.0、14.5±1.9及14±1.6天。SCN5/H组与 G组、T050SC/H组与G组及T050SC/H组与H组在愈合时间皆有显著差异。由此可以发现，SCN5/H及T050SC/H能够加速伤口愈合。而另一方面，G及 H的治疗效果没有显著差异。

接着请参考图3D，图3D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的剩余伤口面积与治疗时间图。使用敷料直到第6天时，SCN5/H及T050SC/H便已显示出明显的疗效。相较于G 组及H组，SCN5/H组及T050SC/H组在第6天时，其涂敷的伤口所剩面积皆明显小于G组及H组。由此可知，SCN5/H及T050SC/H在治疗初期便已具备良好的伤口愈合效果。

关于伤口治疗时所记录的影像，请参考图3E，图3E所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的治疗愈合过程图。在第6天至第12天可以发现，SCN5/H组及T050SC/H组涂敷的伤口迅速缩小；而G组及H组的伤口缩小速率则缓慢许多。因此，可以证明，SCN5/H及T050SC/H所示的纳米多糖复合物对于慢性伤口，如糖尿病等个体的伤口，具有良好的治疗效果，且效果较一般使用的纱布更佳。

参考图3F，图3F所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的伤口愈合前后比较图。关于愈合后所留下的疤痕，可由图中发现，SCN5/H组及T050SC/H组的伤口愈合后，相较于G 组及H组，并未产生明显的疤痕。

实施例5-2

对于具有第1型糖尿病的大鼠的伤口组织分析

(1)大鼠伤口组织取样：在上述实施例5-1中，已诱导了大鼠罹患第1型糖尿病，并制造伤口及涂敷4种敷料G、H、SCN5/H及T050SC/H。在本实施例中，将进一步在涂敷后的第14及21天对伤口进行组织取样，以10％(w/v) 福马林的磷酸缓冲液进行固定，接着以乙醇脱水后由石蜡包埋。

(2)伤口组织截面染色分析：将包埋后的组织切片得到截面，并使用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，以下简称H&E)染色及Masson三色染色法(以下简称MT)染色，接着使用光学显微镜观察及记录。关于新生组织的免疫化学染色，将微血管以单株兔子抗大鼠抗体对内皮细胞标志，即分化簇31(以下简称CD31)染色。细胞核使用赫斯特染色(Hoechst 33342)，最后使用光学显微镜观察及记录。

请参考图3G，图3G所示为根据本公开一实施方式对于具有第1型糖尿病的大鼠伤口的愈合组织分析图。关于H&E染色，在第14天时，G组的伤口中间显示了红色染色，大量的巨噬细胞及纤维母细胞迁移至表皮层及真皮层，即为发炎反应。新生的组织较厚且表皮层厚度不均。而H组则于伤口表皮层表面有红色染色。这些显示了发炎反应的染色都接近真皮层上端，这表示伤口已处于发炎后期。相较于G组及H组，SCN5/H组及T050SC/H组在第14天的组织截面皆显示了已经愈合的状态，伤口已经闭合且并未出现发炎反应。而中等数量的纤维母细胞聚集在真皮层，表示正在重建组织，且真皮均匀生长并形成薄的角质层。在第21天时，4个组别都已完全愈合。然而， G组的真皮层仍显示有纤维母细胞，表示组织仍在重建。又相较于SCN5/H 组及T050SC/H组，H组的表皮厚度不一致，更证明了SCN5/H及T050SC/H 即如同先前叙述的，使伤口疗合后的伤疤较小。

请继续参考图3G，MT染色显示了再生组织中胶原蛋白的沉积。在第14 天，G组的胶原蛋白过度表现，但胶原的生长杂乱无章。H组中胶原蛋白生长较少，且结构也有耗损，由耗损的结构可知H组仍处于重建初期，换句话说发炎反应仍存在。而在SCN5/H组及T050SC/H组中，胶原蛋白完全占据真皮，且胶原纤维整齐分布，另外亦发现较短的胶原纤维。接着在第21天时， G组在真皮中的胶原蛋白沉积密度较少，伤口两侧显示了新生胶原蛋白的明显边界。H组在真皮中具有密集且短的胶原纤维，且以较为规律的方式沉积。在SCN5/H组及T050SC/H组中，显示了完整的重建结果。胶原纤维具有规律且密集的结构。两组结构显示了与正常皮肤相似的型态，仅接近真皮层上方少数区域显示了不完全重建。这些结果表示SCN5/H组及T050SC/H组在真皮层部分的伤口愈合时程较短。并且，胶原整齐并密集地沉淀，因此能够产生与正常皮肤相似的重建结果。

请继续参考图3G，CD31染色显示了新生血管形成的效果。在第14天可发现，G组及H组的真皮层有CD31的高度表现。与H组相比，G组的真皮层中血管面积大得多。这说明G组的组织相较于H组，缺氧或营养不良情况更严重，因此损伤组织需要更大的血流量来提供足够的氧气和营养。G及 H两组均处于炎症和增殖重叠期。然而，SCN5/H组及T050SC/H组的真皮层中央，血管形成(vascularization)较少，而底部的血管形成则较多。真皮层组织底部的血管形成表示真皮组织已几乎痊愈，而真皮层剩余的血管形成则是为了提供重建所需的氧气及养分。在第21天时，虽然G组相较于第14天血管形成已减少许多，但仍较其他组别高出不少。此显示G组已进行至重建的阶段。接着，H组相较于SCN5/H组及T050SC/H组，血管形成仍较多，H 组需要较多的血量供应。SCN5/H组及T050SC/H组具有最少的血管形成，且血管分布与正常皮肤相似。这些结果表示SCN5/H及T050SC/H，能使伤口完整修复如同正常组织。

综合以上关于图3A至图3G的描述，可以证明SCN5/H及T050SC/H具有促进糖尿病个体伤口愈合的潜力，且愈合后的结果几乎与正常组织相同。更须一提的是，以T050SC/H进行治疗的伤口，其汗腺及毛囊皆已生长出来。因此，伤口治疗后仍为具有功能的组织，而非疤痕组织，上述涂敷本公开的纳米多糖复合物的治疗程序能够产生具备功能性真皮的效果。

实施例6-1

兔子眼角膜纤维母细胞SIRC细胞存活率分析(WST-1assay，细胞增殖实验)

(1)配制细胞液：将SIRC细胞培养于MEM中，在37℃以及二氧化碳浓度5％的湿度环境下培养。MEM中包含10％胎牛血清FBS、10⁴IU/mL盘尼西林、10⁴μg/mL链霉素及25μg/mL两性霉素。在96孔盘的每一孔中，加入总量为8x 10²个的SIRC细胞，并培养1天。

(2)将纳米多糖复合物加入细胞液中进行细胞存活率分析：将不同浓度的 T033SC及T050SC加入各个具有培养基的孔中，而细胞存活率将于24小时及72小时加入10μL的1xWST-1试剂来决定。接着，继续在37℃以及二氧化碳浓度5％的湿度环境下培养3小时。四吡唑啉盐(tetrazolium salt)通过粒线体脱氢酶而被裂解为甲

(formazan)。活细胞的增殖导致了这些酶整体活性的增加，而相应的变化将使用染色溶液的吸光度(光度为440nm)来测量。

如图4A所示，图4A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于SIRC细胞存活率分析图。可知T033SC及T050SC在所有浓度下，与SIRC 细胞皆能有良好的生物相容性。然而，当纳米多糖复合物在溶液中的浓度愈高，其黏性会增加，同时透光度也会有所影响，因此，黏性与透光度是投放于眼睛的药物必须考量的性质。在一实施方式中，可使用浓度为300μg/mL 的纳米多糖复合物。

实施例6-2

纳米多糖复合物结合高浓度血小板血浆后对兔子眼角膜纤维母细胞 SIRC细胞存活率分析

(1)制备高浓度血小板血浆：自兔子(New Zealand white Dutch rabbits)耳缘静脉取9mL静脉血，并将全血装入涂有抗凝血复方柠檬酸钠溶液 A(anticoagulant citratedextrose solution,solution A，ACD-A)的采血瓶中，并以 2500rpm离心15分钟。离心后血液分为三层，取包含血沉棕黄层(buffy coat) 的中间层及包含血小板贫乏血浆的最上层，并以4800rpm进行第二次离心 15分钟。高浓度血小板血浆(以下简称PRP)位于管底部，将PRP取出后稀释至浓度为4.75x 10⁴血小板/μL。另外，在使用PRP前会依据每毫升PRP加入135μg低分子量几丁质进行活化。在一些实施例中，低分子量几丁聚糖的分子量为约50kDa至约190kDa，例如60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、 100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa、150kDa、160kDa、170kDa、 180kDa、或此等值中任意两者之间的任何值。

(2)纳米多糖复合物结合高浓度血小板血浆对于SIRC细胞存活率分析：兔子眼角膜纤维母细胞的培养方式如同实施例6-1，接着准备以下6组试验。分别为PRP，高浓度血小板血浆；L3，受低分子量几丁质活化后的高浓度血小板血浆LPRP；PRP+T033SC，300μg/mLT033SC结合PRP；PRP+T050SC， 300μg/mL T050SC结合PRP；L3+T033SC，300μg/mL T033SC结合LPRP； L3+T050SC，300μg/mL T050SC结合LPRP。将兔子眼角膜纤维母细胞分别与上述6组试验进行培养72小时，并于第24小时及第72小时以WST-1试剂检测细胞增殖以及进行WST-1试验。

请参阅图4B，图4B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物结合高浓度血小板血浆后对SIRC细胞存活率分析图。PRP组、PRP+T033SC 组以及PRP+T050SC组并未显示出明显的细胞增殖效果，这可能是因为PRP 并未受到活化所致。L3组、L3+T033SC组及L3+T050SC组在第24小时皆显示了高于150％细胞存活率，但L3组具有最好的细胞存活率，其为180％± 3.75％。然而，在经过72小时培养后，L3组的细胞存活率降至134.86％±12.87％，而L3+T033SC组及L3+T050SC组也分别降至124.82％±10.54％以及142.16％±7.86％。L3组、L3+T033SC组及L3+T050SC组的细胞存活率分别降低了25％、20％及13％。比较培养24小时与培养72小时的差异，L3 组在三者中的细胞存活率下降最多，由此可知道T033SC组及T050SC组能够维持细胞的生长条件。换句话说，纳米纤维能提供培养骨架，同时提供LPRP 的稳定释放及缓释的效果。前述药物释放的效果能够延长制剂的药效，提高便捷性和患者的遵嘱性(compliance)。又，L3+T050SC细胞增殖的效果最佳，因此后续实施例将以此组合作为试验。

接着请参阅图4C，从0小时与24小时的培养结果，可知L3+T050SC这组表现了明显的细胞迁移现象。在接近24小时时，L3+T050SC组具有较小的细胞间距，这可能是由于T050SC能提供缓释效果的缘故。据此， L3+T050SC不但促进细胞迁移，更治愈了89％的伤口。

实施例6-3

对于具有严重干眼症的兔子进行纳米多糖复合物的治疗试验

动物实验皆依据台北医学大学动物实验中心的操作流程(LAC-2017-0152) 来执行。

(1)控制组及实验组：1％PBS、L3(LPRP)、T050SC及L3+T050SC。 L3(LPRP)、T050SC及L3+T050SC的浓度与实施例6-2相同。在干眼症诱发成功后，每天给药2次，持续5天。

(2)诱发兔子罹患严重干眼症：兔子(New Zealand white Dutch rabbits)饲养于12小时昼夜转换的环境中，且给予充足的食物及水分。在兔子成长15 周后，每天以3次20μL0.1％的苯扎氯胺(benzalkonium chloride，BAC)持续诱发干眼症3周，接着将诱发浓度改成0.2％BAC持续一周。

(3)治疗追踪：以角膜萤光素追踪治疗成效。先使用1-1.5mL

及 Xylazine麻醉(每公斤兔子体重5mg

+5mg Xylazine)兔子，并使兔子躺在手术台上。接着使用角膜萤光染色试纸(fluorescein sodium ophthalmic strips)进行萤光试验，先以PBS润湿试纸再覆盖于兔子眼角膜，染色后再以钴蓝光检镜(cobalt-blue lightophthalmoscopy)评估角膜型态。

请同时参考图4D及图4E，图4D所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物施用于患有严重干眼症兔子角膜的前后比较图。图4E所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物施用于患有严重干眼症兔子角膜的前后萤光比较图。健康的兔子眼睛应有透明的眼角膜，且不会显示出角膜萤光。在诱发兔子罹患严重干眼症之后，兔子眼角膜变得混浊，且能看见眼角膜的萤光染色。在第0天的给药，所有组别的角膜皆显现严重混浊，而在给予L3 及L3+T050SC后，角膜又再度呈现透明且溃疡也获得缓解。相反地，控制组及T050SC组的角膜仍不透明且可观察到溃疡。接着，如图4E所示，在给药达到第5天时，T050SC组、L3组及L3+T050SC组的萤光皆几乎消失，表示干眼症的症状皆受到舒缓。在钴蓝光检镜下，可发现L3组具有好的光学特性，但L3+T050SC组显示出更好的治疗成效，包含较佳的角膜溃疡缓解。

实施例6-4

对于具有严重干眼症的兔子进行纳米多糖复合物的治疗5天的组织分析

(1)兔子角膜取样：将上述诱发干眼症的兔子进行各组的治疗试验5天后，对角膜进行取样，再以10％(w/v)福马林的磷酸缓冲液固定，接着以乙醇脱水后由石蜡包埋。

(2)角膜组织截面分析：将取样后的组织切片得到截面，并使用H&E染色，接着使用光学显微镜对治疗后的角膜前缘、中央及后缘进行观察及记录。

请参阅图4F，图4F所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物施用于患有严重干眼症兔子角膜的组织分析比较图。在正常的角膜，会有约3-5 层上皮层(epitheliallayer)恰当且有组织地列于角膜的表面，且于H&E染色会显示出较为紫色的颜色，并且角膜中间的厚度为约49.2±2.2μm。在受到BAC诱发干眼症后，角膜的上皮细胞排列愈趋凌乱且有基质肿胀的现象，且角膜中间的厚度也降至约12.3±1.9μm。T050SC组相较于控制组是具有疗效的，其将角膜中间的厚度回复至约45.1±1.2μm，接近正常角膜厚度，也使角膜上皮细胞的排列较为有秩序亦无基质肿胀。然而，却有部分嗜酸性粒细胞浸润的现象发生，并且前弹力层(Bowmen层)变得肿胀，这可能与T050SC 组的角膜透明度较低有关。相反的，L3组及L3+T050SC组在治疗第5天时，显示了良好的角膜治疗效果。上皮细胞排列整齐，且角膜中间的厚度分别为 43.7±1.1μm及40.3±2.3μm。然而，L3+T050SC组似乎仍在重建的过程中，因为在基质上部及上皮层仍有不少纤维母细胞。关于以上试验结果，可发现 T050SC及PRP所释放的生长因子能修复严重干眼症的角膜。L3显示了不错的试验结果，这可能是因为L3快速释放生长因子的缘故，也因此在治疗严重干眼症的初期阶段能有显著效果。相较于L3，L3+T050SC则展现了缓释的效果。值得一提的是，T050SC的存在能增加保水性，这对于保持眼睛湿润环境具备良好功效，且应能在治疗后期仍保有良好疗效。综言之， L3+T050SC同时具有治疗及保水能力，相较于L3更能在后期有较佳的结果。

实施例7-1

小鼠膜内骨生成前类骨母细胞(MC3T3-E1 mouse preosteoblasts，以下简称MC3T3-E1细胞)细胞存活率分析

(1)配制细胞液：将MC3T3-E1细胞培养于最低必须培养基-α(minimum essentialmedium-α，简称MEM-α)中，在37℃以及二氧化碳浓度5％的湿度环境下培养。MEM-α中包含10％胎牛血清FBS、10⁴IU/mL盘尼西林、10⁴μg/mL链霉素及25μg/mL两性霉素。在多孔盘的每一孔中，加入总量为5x 10⁴个的MC3T3-E1细胞，并培养24小时。

(2)将纳米多糖复合物加入细胞液中进行细胞存活率分析：将SCN5及 T033SC以0.005％、0.025％、0.05％、0.1％及0.5％(w/v)的浓度加入多孔盘的各个孔洞中。细胞存活率实验会在第3天时实施，加入1x WST-1试剂，并在37℃以及二氧化碳浓度5％的湿度环境下再培养2小时。四吡唑啉盐通过粒线体脱氢酶而被裂解为甲

活细胞的增殖导致了这些酶整体活性的增加，而相应的变化将使用染色溶液的吸光度(光度为440nm)来测量。

(3)细胞迁移试验：系将MC3T3-E1细胞以2％(w/v)SCN5及T033SC所制成的骨架(scaffold)进行细胞迁移试验。在T033SC骨架与MEM-α培养4 小时后，即放入12孔盘中且每孔再放入2x 10⁵个的MC3T3-E1细胞，并再培养24小时。接着，以PBS清洗后使用4％福马林PBS缓冲液进行骨架的固定。之后，以CO₂超临界干燥将T033SC骨架冻干并拍摄SEM图。

如图5A所示，图5A所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物对于MC3T3-E1细胞的细胞存活率分析(WST-1assay)图。试验中，T033SC的所有浓度对于MC3T3-E1细胞皆完全没有显示出细胞毒性，即便是最高浓度 0.5％(w/v)亦未出现细胞毒性。然而，SCN5组却有些许细胞毒性，相同浓度下较T033SC组减少了约20％的细胞存活率。而在SCN5组的最高浓度0.5％(w/v)时，其细胞存活率仅剩60％。因此，T033SC对于骨再生应是较适合的材料，因为相较于SCN5，T033SC的生物相容性较好。

接着请参考图5B，图5B所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物骨架及MC3T3-E1细胞迁移的SEM图。必须预先说明的是，SCN5的骨架在与MEM-α培养1小时后便解体，而T033SC在经过所有试验后仍维持完整的骨架，因此仅以T033SC的SEM图来说明。T033SC骨架的平均厚度为约1167.93±23.34μm。由SEM图可以发现，在T033SC与MC3T3-E1细胞培养24小时后，MC3T3-E1细胞迁移至T033SC的骨架中。而MC3T3-E1细胞迁移的最大距离为约554.78μm，其为T033SC骨架的一半。由此可知，因为T033SC能够维持良好的3D结构且又能使MC3T3-E1细胞进入其结构中，所以冻干后的T033SC应为高分子骨架的良好材料。

实施例7-2

纳米多糖复合物与现行常用骨再生替代物对于凝血能力的比较

(1)试验组合制备：分别将10mg的HAps(60％hydroxyapatite/40％β-tricalciumphosphate，现行常用的补骨材料)、SCN5及T033SC放入圆底软管中，并在37℃下进行水浴。

(2)凝血试验：通过心脏穿刺自大鼠体内采血，当针头刺进大鼠时，并记录针头穿刺大鼠的时间。每个圆底软管加入500μL的大鼠血液，并将软管置于37℃水浴中，待血液完全凝结后记录时间。

请参考图5C，图5C所示为根据本公开一实施方式的纳米多糖复合物及HAps对于健康大鼠血液的凝血时间图。HAps组、SCN5组及T033SC组的凝血时间分别为156.67±6.51、105.00±19.47及114.00±7.55秒。相较于 HAps组，SCN5组及T033SC组皆缩短凝血约40秒。在骨折部位形成血肿 (hematoma)是骨再生的第一步。提高止血能力可缩短出血期，迅速形成血肿。

实施例7-3

对于具有骨缺损的大鼠进行纳米多糖复合物的治疗试验

动物实验皆依据台北医学大学动物实验中心的操作流程(LAC-2016-0519) 来执行。

(1)产生大鼠的骨缺陷：SD大鼠饲养于12小时昼夜转换的环境中，且给予充足的食物及水分。在大鼠成长8周后，使用

麻醉大鼠。于大鼠左大腿以手术刀切开1cm切口，并分离股骨两侧肌肉，接着使用5.00mm钻头在大鼠左侧股骨(metaphyseal femur)形成圆形的骨缺损。

(2)控制组与试验组：控制组，未做任何处理。HAps及T033SC植入骨缺损的部位，并以3.0nylon缝合观察。

(3)大鼠骨再生治疗记录：在第21天及第42天时，使用乙醚麻醉大鼠，并通过Skyscan 1176Micro CT记录大鼠骨再生结果。使用GPU-Nrecon重建骨再生部位的影像。并使用CTAn进行阈值及骨再生分析。

(4)大鼠骨再生组织分析比较：使用4％福马林将股骨固定及使用EDTA 脱钙，持续4周后以石蜡包埋。并以4μm的厚度将取样切片并以H&E染色后评估骨再生结果。

请同时参考图5D及图5E，图5D所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生后MicroCT的矢状切面及横状切面比较图。图5E所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生后，大鼠患部的横状切面重建影像的比较图。在第21天时，控制组仍显示一个清晰的缺损。而Haps组则在缺损处显示了骨植入物的存在，由于 HAps为一种矿物材料，在Micro CT中可以看到较少真正的新生骨。T033SC 组在股骨缺损处可以发现明显的骨再生。第42天时，经过T033SC治疗的骨缺损几乎完全修复了，而在原缺损处呈现平滑闭合的形样。HAps在第42天亦部分修复了缺损处，但植入的材料仍占据了大部分的缺损处。此时，控制组依旧显示清晰的骨缺损。

接着，请参考图5F，图5F所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生的分析图。HAps组的骨体积/总体积(BV/TV) 于第21天为51.1％、第42天为50.8％；T033SC组的BV/TV于第21天为 61.8％、第42天为59.6％。接受HAps及T033SC治疗的修复状况良好，其 BV/TV较控制组高出许多，但T033SC的BV/TV又较HAps高出了一些，并更接近正常股骨。

如图5G所示，图5G所示为根据本公开一实施方式的使用纳米多糖复合物或HAps进行骨再生的组织分析比较图。经由H&E染色后，T033SC组在原缺损区恢复后的股骨厚度最大，且厚度最均匀。相比之下，对照组和HAps 组的恢复均表现出骨生长不均匀和骨再生不完全。这可能是由于T033SC具有高度多孔的3D结构，可以使血管形成及骨的生长完整进入。

综上所述，T033SC骨架的高生物相容性促进骨细胞向缺损处迁移，增强细胞的再生和修复活性。T033SC还可以缩短凝血时间，使血肿提前发生，进而进入下一个修复阶段。此外，此种生物材料的表面6号碳的位置提供羧基，其能吸附钙离子形成离子复合物。当骨头受伤时，大量的钙离子会被释放到血液中，而T033SC的羧基可以从漏出的血液中拦截钙离子以防止其流失，并在缺陷部位沉淀。当骨细胞开始进行骨再生时，被拦截的钙离子可以作为骨再生的部分原料来源。

综合以上各种实施方式及实施例，可以证明本公开所述的纳米多糖复合物不论在基本性质或实施功效，皆有突出且优异的性能。本公开所述的新颖纳米多糖复合物具有医疗应用上的潜力，其多孔及胶体的物理性质，成为医学材料的优秀选择。在本公开所述的纳米多糖复合物在制备上，仅需以具有 TEMPO的氧化系统便能产生纳米多糖复合物。另外，本公开的纳米多糖复合物的表面具有高亲水性的羧基，具有良好的保水性，且易与其他亲水药物或细胞等结合。在创伤应用中，SCN5和T050SC可加速伤口愈合，T050SC 也可为愈合后的伤口提供功能性(汗腺及毛囊等)组织。在干眼症应用中， L3+T050SC亦显示良好的疗效。而当T033SC作为高分子骨架，以修复骨缺损应用中，更展现了迅速凝血、加速生长且生长完整的不同面相疗效。因此，本公开所述的纳米多糖复合物在伤口愈合、治疗干眼症和骨再生方面都具有巨大的潜力。

前述公开概述了几个实施例的特征，使得本领域技术人员可以更好地理解本公开的各个方面。本领域技术人员将理解，他们可以容易地将本公开用作设计或修改其他制程和结构的基础，以实现与本公开介绍的实施例相同的目的和/或实现相同的益处。本领域技术人员还应该理解，虽然本公开已以多种实施方式公开如上，然其并非用以限定本公开，任何本领域普通技术人员，在不脱离本公开的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本公开的保护范围当视随附的申请专利范围所界定者为准。

本公开提出一种纳米多糖复合物，包括：β-1,3-葡聚糖以及几丁质。其中纳米多糖复合物具有固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振(ss ¹³C CP-MAS NMR)的光谱包含以下峰值：176±0.2ppm、103±0.2ppm、87±0.2ppm以及74±0.2ppm。

在一些实施方式中，固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振光谱进一步包括以下峰值：77±0.2ppm、68±0.2ppm、62±0.2ppm以及23±0.2ppm。

在一些实施方式中，当固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振光谱峰值为176±0.2ppm时，羧基位于6号碳上。

在一些实施方式中，每克纳米多糖复合物中的羧基含量(mmol/g)大于0.2 mmol。

在一些实施方式中，β-1,3-葡聚糖相对于几丁质的摩尔比为大约60：40。

在一些实施方式中，纳米多糖复合物具有介于-10mV至-55mV之间的ζ电位。

在一些实施方式中，纳米多糖复合物是非晶形的。

本公开另提供一种制造纳米多糖复合物的方法，包括以下步骤：提供多糖复合物；混合多糖复合物、TEMPO、助催化剂以及水以获得混合溶液；于混合溶液中加入氧化剂，在pH值为10的环境下对多糖复合物进行氧化反应，以使多糖复合物中6号碳位置的羟基反应为羧基；加入终止剂以终止氧化反应，以获得氧化多糖复合物；以及，透析分子重量小于8000MW的氧化多糖复合物以获得纳米多糖复合物。

在一些实施方式中，提供多糖复合物的步骤包括：提供松杉灵芝；在碱存在下分解松杉灵芝；以及，通过漂白剂漂白已分解的松杉灵芝，以取得多糖复合物。

在一些实施方式中，碱为选自于由NaOH、LiOH、KOH、CsOH、Ca(OH)₂、 Ba(OH)₂、Mg(OH)₂、K₂CO₃、Na₂CO₃以及Cs₂CO₃所组成的群组。

在一些实施方式中，分解松杉灵芝的步骤在于80℃至100℃之间执行的。

在一些实施方式中，漂白剂为H₂O₂。

在一些实施方式中，氧化剂为次氯酸钠(NaClO)。

在一些实施方式中，次氯酸钠的浓度为介于每公克多糖复合物使用1.6 mmol至10mmol次氯酸钠之间。

在一些实施方式中，助催化剂为溴化钠(NaBr)。

在一些实施方式中，终止剂为乙醇。

在一些实施方式中，在加入终止剂的步骤之后，制造纳米多糖复合物的方法还包括通过加入丙酮以析出氧化多糖复合物。

在一些实施方式中，透析氧化多糖复合物的步骤之后，制造纳米多糖复合物的方法还包括均质化已透析的多糖复合物以取得纳米多糖复合物。

在一些实施方式中，均质化已透析的多糖复合物的步骤后，本方法还包括冷冻干燥已均质化的多糖复合物，以获得纳米多糖复合物。

本公开另提供一种根据上述方法取得的一种纳米多糖复合物。

本公开另提供一种用于制造纳米多糖复合物的方法，包括以下步骤：提供多糖复合物，以及均质化多糖复合物以获得具有长度介于400nm至2000 nm之间的纳米多糖复合物。

在一些实施方式中，均质化多糖复合物的步骤包括在每一循环至少为 10,000psi的条件下，均质化多糖复合物大于或等于三个循环。

在一些实施方式中，提供多糖复合物的步骤包括：提供松杉灵芝；在碱存在下分解松杉灵芝；以及，通过漂白剂漂白已分解的松杉灵芝，以获得多糖复合物。

在一些实施方式中，汗腺及毛囊在伤口愈合处生长。

在一些实施方式中，促进伤口愈合的组合物还包括丙烯酰胺硫酸盐(AMP) 水凝胶。

在一些实施方式中，用于治疗干眼症的组合物还包括高浓度血小板血浆。

在一些实施方式中，高浓度血小板血浆为几丁质活化的高浓度血小板血浆。

Claims

1.一种纳米多糖复合物，其特征在于，包括：

一β-1,3-葡聚糖；以及

一几丁质；

其中该纳米多糖复合物具有固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振(ss¹³C CP-MASNMR)的一光谱包含以下峰值：176±0.2ppm、103±0.2ppm、87±0.2ppm以及74±0.2ppm。

2.如权利要求1所述的纳米多糖复合物，其中固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振的该光谱进一步包括以下峰值：77±0.2ppm、68±0.2ppm、62±0.2ppm以及23±0.2ppm。

3.如权利要求1所述的纳米多糖复合物，其中当固态碳-13交叉极化魔角旋转核磁共振的该光谱包含176±0.2ppm峰值时，表示一羧基位于该纳米多糖复合物的6号碳上。

4.如权利要求3所述的纳米多糖复合物，其中每克该纳米多糖复合物中的该羧基的一含量大于0.2mmol。

5.如权利要求1所述的纳米多糖复合物，其中该纳米多糖复合物具有一ζ电位介于-10mV至-55mV之间。

6.如权利要求1所述的纳米多糖复合物，其中该纳米多糖复合物的一长度介于400nm至2000nm之间。

7.一种制造纳米多糖复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供一多糖复合物；

混合该多糖复合物、一2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物、一助催化剂以及水以获得一混合溶液；

于该混合溶液中加入一氧化剂，在pH值为10的环境下对该多糖复合物进行氧化反应，以使该多糖复合物中6号碳位置的羟基反应为羧基；

加入一终止剂以终止氧化反应，以获得一氧化多糖复合物；以及

透析一分子重量小于8000MW的该氧化多糖复合物以获得一纳米多糖复合物。

8.如权利要求7所述的制造纳米多糖复合物的方法，还包括，在该加入终止剂的步骤之后，通过加入一丙酮以析出该氧化多糖复合物。

9.一种组合物用于制备促进伤口愈合的药物的用途，其特征在于，其中该组合物包含如权利要求1至6中任一项所述的纳米多糖复合物。

10.如权利要求9所述的用途，其中该组合物还包括丙烯酰胺硫酸盐水凝胶。

11.如权利要求9所述的用途，其中一汗腺及一毛囊在一伤口愈合处生长。

12.一种组合物用于制备治疗干眼症的药物的用途，其特征在于，其中该组合物包含如权利要求1至6中任一项所述的纳米多糖复合物。

13.如权利要求12所述的用途，其中该组合物还包括一高浓度血小板血浆，且该高浓度血小板血浆为一几丁质活化的高浓度血小板血浆。

14.一种组合物用于制备促进骨骼再生的药物的用途，其特征在于，其中该组合物包含如权利要求1至6中任一项所述的纳米多糖复合物。