CN112807273B - 一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用 - Google Patents

一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112807273B
CN112807273B CN202110204419.9A CN202110204419A CN112807273B CN 112807273 B CN112807273 B CN 112807273B CN 202110204419 A CN202110204419 A CN 202110204419A CN 112807273 B CN112807273 B CN 112807273B
Authority
CN
China
Prior art keywords
microneedle
gene editing
skin diseases
gene
skin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110204419.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112807273A (zh
Inventor
平渊
潘齐
万涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202110204419.9A priority Critical patent/CN112807273B/zh
Publication of CN112807273A publication Critical patent/CN112807273A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112807273B publication Critical patent/CN112807273B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
    • A61M37/0015—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin by using microneedles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
    • A61M37/0015—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin by using microneedles
    • A61M2037/0053—Methods for producing microneedles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用，所述基因编辑微针包括：针尖部分和基座部分，所述针尖部分包含两种纳米复合物和针尖基质，所述基座部分为基座基质。本发明的基因编辑微针能够提高基因编辑效率，递送糖皮质激素药物和基因编辑核糖核蛋白复合物在皮肤中的滞留，协同改善皮肤炎症环境，所述微针具有修复皮损组织的皮肤屏障功能，从而达到缓解银屑病和特异性皮炎的炎症进程。本发明还提供该基因编辑微针在制备用于治疗炎症性皮肤病中的应用。

Description

一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用
技术领域
本发明涉及药剂学、生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用。是一种新型微针贴片递送基因编辑核糖核蛋白复合物，以及用于制备治疗炎症性皮肤病的药物的应用。
背景技术
炎症性皮肤病(ISDs)是一类生活中较常见的疾病，其病理特征是通过产生促炎细胞因子，激活先天性和适应性免疫反应。在各种炎症性皮肤病中，银屑病和特应性皮炎等正日益成为威胁公众健康的主要问题，病程时间持续长，难以被彻底治愈。银屑病，是一种免疫介导的炎症性皮肤病，临床的主要特征为皮肤显著增厚、红斑性斑块和附着的银色鳞片。银屑病在全球流行率高达2-3％，并对人们的生活质量产生重大负面影响。银屑病最主要的病理特征是角质形成细胞过度增殖、表皮增生以及炎症性白细胞在表皮层和真皮层中大量浸润。由于角质形成细胞的异常分化、炎性免疫相关细胞大量浸润、真皮和表皮中促炎性细胞因子释放增加，这些异常激活的免疫反应在银屑病的发生和发展过程中至关重要。目前银屑病确切的发病机制仍不清楚，主要是环境和遗传因素之间的相互作用，包括创伤、链球菌感染和药物(如β-受体阻滞剂和IFN-α)。目前对银屑病的治疗包括局部用药(包括皮质类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂、维生素D类似物和维甲酸酯)、光疗疗法、传统系统性全身药物(甲氨蝶呤、阿维A、环孢素和延胡索酸盐)和生物制剂(包括抗TNF抗体、抗IL-12抗体、抗IL-23抗体、抗IL-17A抗体)。特异性皮炎，也被称为特应性湿疹，是最常见的慢性复发和非传染性皮肤病疾病之一，在发达国家终生患病率为15-20％。临床上常表现为早期起水疱、结痂，严重瘙痒和过度搔痒，皮肤红斑，反复出现湿疹性皮损，皮肤增厚，表皮屏障功能受损。特异性皮炎可能包括多种亚型，这些亚型通常由遗传易感个体的环境因素触发。遗传变异和环境因素等多种病理生理机制影响了特异性皮炎的临床表现和恶性循环，如结构蛋白filaggrin缺乏导致表皮屏障功能受损，可促进T细胞浸润性皮肤炎症。导致特异性皮炎发病的其他因素包括皮肤微生物群失调(特别是金黄色葡萄球菌过度生长)、全身免疫反应(包括免疫球蛋白E(IgE)介导的致敏)和神经炎症。目前对特异性皮炎的治疗包括局部保湿剂和抗炎药(如皮质类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂和cAMP特异性3′、5′-环磷酸二酯酶4抑制剂)、光疗、全身免疫抑制剂和全身免疫调节生物制剂。
在这两种炎症性皮肤病中，抗炎药，特别是局部应用糖皮质激素，被广泛认可为银屑病和特异性皮炎患者的一线抗炎治疗方法。类固醇敏感部位，如面部和韧带间，通常需要局部应用低效糖皮质激素。强效糖皮质激素可局部应用于皮肤较厚的部位。然而，大多数特异性皮炎和银屑病患者在长期的局部糖皮质激素治疗过程中，由于会产生一定程度的糖皮质激素抵抗作用，所以炎症性皮肤病患者对局部糖皮质激素治疗反应不佳。这表明，替代的治疗方案对于提高糖皮质激素抵抗或改善糖皮质激素治疗至关重要。
众所周知，炎症小体(NLRP)是胞浆内模式识别受体组装的多聚蛋白复合物，在固有免疫的发展过程中负责激活体液反应和识别病原体。炎症小体的组装过程，其本质是病原体相关分子模式和损伤相关分子模式的反应。炎症小体亚型种类复杂，其中，炎症小体3(NLRP3)与多种炎症免疫性皮肤病有关，包括特异性皮炎和银屑病等等。当NLRP3被激活后，NLRP3与适配器蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1结合形成NLRP3/ASC/pro-caspase1复合体，引起caspase-1的裂解和活化。活化的capase-1将IL-1β和IL-18的前体切割成成熟的形式，并引起多种促炎细胞因子的释放，包括IL-1β和IL-18。越来越多的证据表明，在炎症性疾病中，Caspase-1的过度表达及其激活剂NLRP3炎症小体的上调可导致糖皮质激素抵抗。NLRP3-Caspase-1炎症小体通过调节其反式激活域中功能性糖皮质激素受体的细胞水平，并减少糖皮质激素转录效应，以增加免疫相关细胞的糖皮质激素抵抗力。然而，当NLRP3炎症小体缺失时，Caspase-1的过度表达并不会改变免疫相关细胞的糖皮质激素敏感性，这表明NLRP3的激活与糖皮质激素抵抗之间有密切的联系。鉴于NLRP3炎症小体在炎症性免疫皮肤病的发病机制中的关键性作用，最近有很多研究致力于靶向NLRP3炎症小体以减轻炎症反应。近年来，小分子抑制剂因其靶向NLRP3炎症小体治疗ISDs的潜力而受到广泛关注。例如，从黄芪中分离出的小分子环黄芪醇，通过抑制巨噬细胞中NLRP3的表达，在小鼠模型中显示出良好的改善银屑病典型临床症状的能力。另一项研究表明，口服小分子CP456773(一种经过充分研究的特异性NLRP3抑制剂)可以通过阻止炎症体激活来减少皮肤炎症。然而，大多数研究的小分子抑制剂，如CY-09，通常通过调节与其激活相关的上游相关通路分子间接地抑制NLRP3炎症小体的功能。此外，尽管这些小分子对NLRP3有很好的拮抗作用，但是在炎症性皮肤疾病中，NLRP3炎症小体的激活主要位于人皮肤的表皮层和真皮层，口服应用这些抑制剂很难到达表皮和真皮层。
为了有效地进行给药治疗，必须克服皮肤的角质层的天然屏障。因此，高效直接的NLRP3抑制剂经皮给药是治疗ISDs的理想策略。
发明内容
本发明提供一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针，所述基因编辑微针包括：针尖部分a)和基座部分b)，所述针尖部分a)包含两种纳米复合物和针尖基质，所述基座部分b)包含基座基质。
所述两种纳米复合物包括：可降解高分子载体聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹的地塞米松(Dex)形成的纳米复合物PLGA/Dex以及可降解阳离子载体CP/Ad-SS-GD包裹基因编辑核糖核蛋白复合物形成的纳米复合物CP/Ad-SS-GD/RNP。所述高分子载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，所述可降解阳离子载体CP/Ad-SS-GD为β-环糊精偶联的低分子量聚乙烯亚胺(PEI-600kDa)与双胍基配体修饰的二硫键连接的金刚烷通过主客分子络合作用形成的超分子聚合物CP/Ad-SS-GD。
在一些实施方式中，其中所述地塞米松：所述基因编辑核糖核蛋白复合物的质量比为4：1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、或1:4。在一些实施方式中，其中所述地塞米松：所述基因编辑核糖核蛋白复合物的质量比优选为1:3。
在一些实施方式中，其中所述针尖基质由透明质酸钠和胶原三肽组成，透明质酸钠和胶原三肽的质量比为4：1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、或1:4。在一些实施方式中，其中所述针尖基质透明质酸钠和胶原三肽的质量比为质量比优选为1:1。
所述基座基质由透明质酸钠和胶原三肽组成，透明质酸钠和胶原三肽的质量比为1:1。
所述微针的制备方法，通过以下步骤实现：将上述提到的不同比例的透明质酸钠(分子量34kDa)和胶原三肽分散于水中，搅拌至充分溶解，加入上述提到的不同比例的可降解高分子载体包裹的地塞米松纳米复合物PLGA/Dex以及可降解阳离子载体包裹基因编辑核糖核蛋白复合物CP/Ad-SS-GD/RNP，搅拌至混合均匀，将上述针尖基质注入到微针模具中，通过离心并倒转6次使基质在模具中分布均匀，充满模具中的针尖部分；然后按照处方配比，取1g透明质酸钠(分子量34kDa)和1克胶原三肽分散于10mL水中，搅拌至充分溶解，得到微针基座基质。将基座基质加入上述含有微针针尖的模具中，离心使得基座铺平，在4℃下干燥24h，得到基因编辑微针。
本发明还提供上述的基因编辑微针在制备用于治疗炎症性皮肤病药物中的应用。所述药物的制剂形式为贴片。
本发明的基因编辑微针能够提高基因编辑效率，递送糖皮质激素药物和基因编辑核糖核蛋白复合物在皮肤中的滞留，协同改善皮肤炎症环境，从而用于炎症性皮肤病的治疗。
本说明设计了一种微针贴片，促进这两种纳米制剂的透皮给药，从而在表皮和真皮层释放基因编辑核糖核蛋白复合物和糖皮质激素，以有效治疗ISDs。微针贴片的设计如下：1)聚合物/Cas9核糖核蛋白纳米复合物胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物用于靶向NLRP3炎症小体。2)PLGA/地塞米松纳米颗粒胞内递送糖皮质激素。3)一种可溶性微针用于两种纳米制剂的经皮共给药。CRISPR/Cas9作为一种被广泛研究的基因组编辑工具，最近已经被用作针对NLRP3炎症小体的特异性抑制剂，以改善炎症性疾病。原则上，基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术不仅在DNA水平上抑制了NLRP3的激活，而且也有助于减少许多小分子抑制剂通常遇到的脱靶效应。同时，NLRP3炎性小体的破坏可进一步提高糖皮质激素治疗的敏感性。最后，糖皮质激素地塞米松在其入核的过程中也可诱导核孔扩张至60nm，从而促进基因编辑核糖核蛋白复合物进入细胞核编辑NLRP3基因。
此外，以透明质酸(HA)和胶原三肽(CTP)为微针的基质材料，我们制备的微针贴片不仅具有良好的生物相容性，而且可以促进胶原合成，减少经皮失水，促进皮肤损伤的组织修复。这是因为胶原三肽是一种纯度高、低过敏性、非抗原且具有生物活性的胶原蛋白，其平均分子量为280Da。CTP的结构简单的表示为Gly-X-Y,X和Y大多是脯氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸。这三种氨基酸成分使胶原蛋白更能抵抗一般蛋白酶的降解。多项研究表明，CTP可以改善皮肤皮损组织角质层的屏障功能，保持皮肤各层的含水量和结构的完整性，另外CTP甚至可通过调节Th2型炎症因子和趋化因子，对Th2型免疫反应也有一定的抑制作用。
本发明开发的以透明质酸和胶原三肽为基质的可溶解型微针同时递送两种纳米复合物达到可协同治疗银屑病和特异性皮炎的目的(针尖部分中的一种纳米复合物，即CP/Ad-SS-GD/RNP递送基因编辑核糖核蛋白复合物RNP即可敲除炎症小体NLRP3起到抗炎作用，又可提高糖皮质激素地塞米松长期使用产生的耐药性；另一种纳米复合物，即PLGA/Dex递送糖皮质激素地塞米松具有一定的抗炎作用，又可通过扩大核孔提高基因编辑核糖核蛋白复合物的胞内递送从而进一步增强敲除炎症小体NLRP3的效率)，同时微针基质中加入CTP修复皮损组织的皮肤屏障功能，从而达到缓解银屑病和特异性皮炎的炎症进程。因此，我们开发了一种新型的经皮治疗策略，在局部治疗炎症性皮肤病方面具有极大的应用潜力。
附图说明
图1是基因编辑微针贴片的形态学表征。
图2是基因编辑微针贴片刺入皮肤后药物的分布情况。
图3是PLGA/Dex增强CP/Ad-SS-GD/RNP纳米复合物的体外基因编辑效率评价。
图4是基因编辑微针贴片用于特异性皮炎治疗后皮肤组织病理分析。
图5是基因编辑微针贴片用于特异性皮炎治疗后皮肤组织病理分析。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：基因编辑微针贴片的制备
本实施例包括按质量百分比计的以下原料：
针尖基质：胶原三肽10％，透明质酸钠(分子量34kDa)10％，其余为水。
另外微针针尖基质中每10mL透明质酸钠+胶原三肽溶液中含地塞米松60μg、Cas9蛋白20ug以及sgRNA 5ug。
基座基质：胶原三肽10％，透明质酸钠(分子量34kDa)10％，其余为水。
本实施例的制备方法：
1、按照处方配比，取1g透明质酸钠(分子量34kDa)和1克胶原三肽分散于10mL水中，搅拌至充分溶解，加入处方比例的可降解高分子载体包裹的地塞米松纳米复合物PLGA/Dex以及可降解阳离子载体包裹基因编辑核糖核蛋白复合物CP/Ad-SS-GD/RNP，搅拌至混合均匀，将上述针尖基质注入到微针模具中，通过离心并倒转6次使基质在模具中分布均匀，充满模具中的针尖部分。
2、按照处方配比，取1g透明质酸钠(分子量34kDa)和1克胶原三肽分散于10mL水中，搅拌至充分溶解，得到微针基座基质。将基座基质加入上述含有微针针尖的模具中，离心使得基座铺平，在4℃下干燥24h，得到基因编辑微针。
实施例2：基因编辑微针贴片的表征
具体操作方法如下：使用扫描电子显微镜观察有不同百分比胶原三肽的微针形态。将含有不同百分比胶原三肽的微针置于质构仪上，针尖朝上，质构仪的探头以1mm/s的速度向下移动，通过测定位移与力的曲线反应机械强度的大小。
为了考察微针在皮肤的溶解情况，将双载微针贴片作用于小鼠背部皮肤0、1、3和5min后移开，然后取出剩余的微针贴片用扫描电子显微镜拍摄。
为了评价微针的离体释药行为，首先将双载微针贴片浸放于含有GSH的PBS缓冲液中，并在37℃温和振荡。在每个取样时间，取一定体积的溶液并用等量的PBS代替。使用标准BCA法分析定量溶液的Cas9蛋白含量和高效液相色谱法测定地塞米松的含量。
实验结果：微针贴片是由生物相容性的HA和CTP的混合溶液通过微模压法制备。如图1所示，微针阵列的大小为8mm×8mm，同时整个阵列中微针的数量为15×15。扫描电子显微镜图像显示，单个微针呈金字塔形，微针基底的直径为200μm，单个微针的高度为600μm。10％或20％质量浓度的CTP的微针贴片与不含CTP的微针贴片相比，微针的的机械强度更高。所制备的微针贴片具有良好的机械性能，保证了皮肤的刺入具有足够的刚度。但同时当CTP含量从10％增加到20％时，微针的表面粗糙度明显改变。因此最终采用HA和10％的CTP作为微针的基质材料。图1展示了包载有PLGA/Rhodamine和CP/Ad-SS-GD/Cas9-FITC纳米粒子的微针贴片的荧光图像。可以看出观察到两种纳米颗粒在整个微针阵列中均匀分布，表明微针贴片的针尖成功负载了CP/Ad-SS-GD/Cas9-RNP-FITC两种纳米颗粒。同时通过研究微针贴片的Dex和Cas9蛋白的体外释放行为，可以发现微针贴片在体外溶解后，Cas9蛋白和小分子药物Dex将缓慢释放出来，而这一定程度保证了微针贴片起到长时间的治疗作用。
实施例3：基因编辑微针贴片刺入皮肤后药物的分布
为了研究微针体内降解行为，制备了包载PLGA/罗丹明B和CP/Ad-SS-GD/Cas9protein-FITC的双载微针贴片，然后将双载微针贴片作用于小鼠背部皮肤不同时间，分离出背部皮肤组织进行冷冻包埋，然后将组织放置于冷冻切片进行切片，于激光共聚焦显微镜下观察荧光分布
实验结果:如图2所示，微针贴片可成功刺入小鼠皮肤，深度约为300μm，当刺入小鼠皮肤后，微针针尖部分可迅速吸收皮肤组织中的液体并迅速溶解，同时罗丹明和Cas9-FITC大量释放出来，分布于表皮和真皮区。不同时间段的荧光图像证实了Dex和Cas9蛋白在体内的持续释放，表明微针贴片可作为两种药物缓释的体内储存库。
实施例4：PLGA/Dex增强CP/Ad-SS-GD/RNP纳米复合物的基因编辑效率
具体操作方法如下：首先通过体外转录的方法制备靶向NLRP3的sgRNA(sgNLRP3)。将3T3和DC2.4细胞接种到24孔板中过夜，待3T3和DC2.4细胞密度达到80％以上时，开始蛋白质和地塞米松的共递送实验。首先将CRISPR-Cas9蛋白与sgNLRP3在37℃孵育10分钟后形成CRISPR-Cas9/sgNLRP3复合物，再将CRISPR-Cas9/sgNLRP3复合物与P4充分混合后，加入100μL无血清DMEM培养基，震荡混匀。CRISPR-Cas9的剂量为每孔4μg，sgNLRP3的剂量为每孔2μg，P4的剂量为每孔8μg。地塞米松的浓度从0-1.6μg/mL。待室温孵育30分钟后，然后向混合溶液加入900μL无血清DMEM培养基。移除细胞培养基，使用PBS清洗两次后，加入含有P4/Cas9蛋白复合物的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入1mL的含有10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时。使用商业化试剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μL的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。
实验结果：我们研究了不同浓度的PLGA/Dex纳米复合物预处理细胞后，CP/Ad-SS-GD/RNP介导的基因编辑效率是否有增强。如图3所示，通过T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率，发现在DC2.4细胞上随着地塞米松浓度从0μg/mL增加到0.4μg/mL时，indelfrequency从29.6％增加到了36.2％。同时，在3T3细胞上，地塞米松浓度从0μg/mL增加到0.4μg/mL时，indel frequency从19.1％增加到了31.7％。综上所述，这些结果证实了PLGA/Dex纳米复合物进入细胞后，释放出来的Dex会扩张细胞核孔，促进Cas9从细胞质进入到细胞核，从而增加对NLRP3基因的基因组编辑效率。
实施例5:基因编辑微针用于特异性皮炎的治疗
6-8周龄雌性BALB/c小鼠在SPF级环境饲养。在造模24h将其背部用剃毛刀脱毛，脱毛面积为2cm×2cm，此面积为给药面积。然后进行小鼠分组，每组6只动物。分组包括分别为正常对照组(G1)，二硝基氯苯阳性造模组(G2)，空白微针贴片(G3)，单载PLGA/Dex微针贴片组(G4)，单载CP/Ad-SS-GD/RNP微针贴片组(G5)，双载微针贴片组(G6)，醋酸地塞米松乳膏组(G7)，他克莫司软膏组(G8)。首先，100μL的0.5％的二硝基氯苯溶液均匀涂抹于背部皮肤连续三天致敏后，于第二周在背部皮肤涂抹100μL的1％二硝基氯苯溶液连续四周，一周三次。微针贴片治疗每一周给药两次。治疗结束后，取小鼠背部皮肤，4％多聚甲醛固定，H&E染色观察。
实验结果：如图4所示，HE染色结果中可以看出正常对照组皮肤角质层完整，同时可见表皮的各层结构，包括颗粒层，棘层，以及基底层，真皮层呈现完整的正常结构。而DNCB阳性造模组角质层出现痂皮组织，表皮显著增生，真皮层胶原纤维增生，并同时又大量淋巴细胞浸润至表皮和真皮层。而对于醋酸地塞米松乳膏和他克莫司软膏治疗组，表皮增厚略有缓解，淋巴细胞浸润的严重度有所减少。相比于两种市售制剂，单载PLGA/Dex的微针贴片和单载CP/Ad-SS-GD/RNP的微针贴片组，角化层角化过度显著缓解，表皮增厚显著下降，胶原纤维增生程度大大降低，淋巴细胞浸润大大减少。对于双载微针贴片治疗组，角质层趋于正常，表皮厚度接近于正常对照组皮肤，无明显真皮胶原纤维增生和淋巴细胞浸润。
实施例6:基因编辑微针用于银屑病的治疗
6-8周龄雌性BALB/c小鼠在SPF级环境饲养。在造模24h将其背部用剃毛刀脱毛，脱毛面积为2cm×2cm，此面积为给药面积。然后进行小鼠分组，每组6只动物。分组包括分别为正常对照组(G1)，咪喹莫特阳性造模组(G2)，空白微针贴片(G3)，单载PLGA/Dex微针贴片组(G4)，单载CP/Ad-SS-GD/RNP微针贴片组(G5)，双载微针贴片组(G6)，醋酸地塞米松乳膏组(G7)，他克莫司软膏组(G8)。每天于背部无毛区域涂抹0.1g的5％咪喹莫特乳膏，持续7天。微针贴片每两天给药一次。治疗过程中进行银屑病皮损面积与严重度指数(PASI)评价。每一个评价指标都有四种等级。0，无；1，轻微；2，中度；3，明显；4，十分明显。治疗结束后，取小鼠背部皮肤，4％多聚甲醛固定，(H&E)染色观察。
实验结果：如图5所示，正常对照组小鼠角质层细胞形态正常，表皮各层结构清晰，包括颗粒层，棘层，以及基底层，真皮层呈现完整的正常结构。而对于阳性造模组，角质细胞会过度增生而出现角化过度，甚至有些区域还有角化不良的形成,表皮层和真皮层增厚，结构模糊，真皮层有大量炎症细胞浸润，这种皮肤病理特征类似人类的银屑病样皮损组织学改变。与银屑病模型组小鼠比较，单载微针贴片组治疗后小鼠皮肤角质层中角质细胞增生被抑制，表皮增厚不明显。双载微针贴片治疗后整个小鼠背部皮肤组织的结构跟正常对照组小鼠皮肤基本类似，说明其强大的抗炎作用。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。

Claims (6)

1.一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针，其特征在于，所述基因编辑微针包括：针尖部分和基座部分，所述针尖部分包含两种纳米复合物和针尖基质，所述基座部分为基座基质，所述两种纳米复合物分别为包括：可降解高分子载体包裹的地塞米松形成的纳米复合物PLGA/Dex以及可降解阳离子载体包裹基因编辑核糖核蛋白复合物形成的纳米复合物CP/Ad-SS-GD/RNP；
所述高分子载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，所述可降解阳离子载体CP/Ad-SS-GD为β-环糊精偶联的PEI-600 kDa的聚乙烯亚胺与双胍基配体修饰的二硫键连接的金刚烷通过主客分子络合作用形成的超分子聚合物CP/Ad-SS-GD。
2.根据权利要求1所述的一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针，其特征在于，所述地塞米松：所述基因编辑核糖核蛋白复合物的质量比为4：1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4。
3.根据权利要求1所述的一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针，其特征在于，所述针尖基质由透明质酸钠和胶原三肽组成，透明质酸钠和胶原三肽的质量比为4：1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4。
4.根据权利要求1所述的一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针，其特征在于，所述基座基质由透明质酸钠和胶原三肽组成，透明质酸钠和胶原三肽的质量比为1:1。
5.权利要求1所述的一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针在制备用于治疗炎症性皮肤病药物中的应用，其特征在于，所述皮肤病为特异性皮炎和银屑病。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为贴片。
CN202110204419.9A 2021-02-23 2021-02-23 一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用 Active CN112807273B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110204419.9A CN112807273B (zh) 2021-02-23 2021-02-23 一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110204419.9A CN112807273B (zh) 2021-02-23 2021-02-23 一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112807273A CN112807273A (zh) 2021-05-18
CN112807273B true CN112807273B (zh) 2022-06-17

Family

ID=75865180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110204419.9A Active CN112807273B (zh) 2021-02-23 2021-02-23 一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112807273B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113244162B (zh) * 2021-05-24 2022-08-02 杭州荔枝红生物科技有限公司 一种可溶性微针及其制备方法和在制备调节皮肤微生态产品中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104548197A (zh) * 2014-12-13 2015-04-29 浙江大学 一种地塞米松可控缓释plga微球及制备
CN108601883A (zh) * 2015-09-29 2018-09-28 埃吉诺维亚公司 递送方法和组合物
CN109431967A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 中山大学 一种治疗银屑病关节炎的可溶性微针
CN111840209A (zh) * 2020-08-13 2020-10-30 华中科技大学 可程序化释放银屑病治疗药物的微针贴片及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190082615A1 (en) * 2017-08-17 2019-03-21 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Phloem-based delivery of therapeutics

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104548197A (zh) * 2014-12-13 2015-04-29 浙江大学 一种地塞米松可控缓释plga微球及制备
CN108601883A (zh) * 2015-09-29 2018-09-28 埃吉诺维亚公司 递送方法和组合物
CN109431967A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 中山大学 一种治疗银屑病关节炎的可溶性微针
CN111840209A (zh) * 2020-08-13 2020-10-30 华中科技大学 可程序化释放银屑病治疗药物的微针贴片及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Amiko Hakuta et al..Anti-inflammatory effect of collagen tripeptide in atopic dermatitis.《Journal of Dermatological Science》.2017,第88卷第357-364页. *
Congfei Xu et al..Targeting of NLRP3 inflammasome with gene editing for the amelioration of inflammatory diseases.《NATURE COMMUNICATIONS》.2018,第9卷第1-14页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112807273A (zh) 2021-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Bilayer dissolving microneedle array containing 5-fluorouracil and triamcinolone with biphasic release profile for hypertrophic scar therapy
Vinatier et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes
DE60117984T2 (de) Zusammensetzung und verfahren zur reparatur und regenerierung von knorpel und anderen geweben
CN101500589B (zh) 半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用
EP2429515B1 (en) New medicines for topic use based on sulfated hyaluronic acid as activating or inhibiting agent of the cytokine activity
US9012404B2 (en) Compositions and methods for cardiac tissue protection and regeneration
KR102147169B1 (ko) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 가려움증 억제 또는 개선 용도
KR101033135B1 (ko) 상처 치유용 조성물 및 그의 용도
Yu et al. Enhanced transdermal efficiency of curcumin-loaded peptide-modified liposomes for highly effective antipsoriatic therapy
Priya et al. Microneedles-based drug delivery strategies: A breakthrough approach for the management of pain
KR20110131187A (ko) 여드름 및 기타 질환 치료용 비스파틴 치료제
CN106456542A (zh) 用于局部递送的适体
CN112807273B (zh) 一种治疗炎症性皮肤病的基因编辑微针及其应用
CN111329832A (zh) 一种治疗脱发的纳米脂质载体微针及其应用
CN115397443A (zh) 包含疼痛调节剂的干细胞来源的外排体及其用途
CN104903344A (zh) Pedf衍生的多肽在治疗骨关节炎中的用途
KR20070084456A (ko) 피불린-5의 생성을 촉진 및/또는 활성을 항진시키기 위한조성물 및 방법
CA3173554A1 (en) Fidgetin-like 2 as a target to enhance wound healing
CN112402359A (zh) 一种抑制细胞炎症因子治疗痛风急性发作的聚合物微针及制备方法
KR20170091456A (ko) 식물유래 유전자 절편 혼합물 제조 방법 및 이를 함유하는 비수계 조성물
CN104922698B (zh) 人干细胞生长因子注射液及其制备方法
Guo et al. Advances in Formulations of Microneedle System for Rheumatoid Arthritis Treatment
US11413313B2 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising clonal stem cells
JP7396585B2 (ja) Ｔｓｌｐ遺伝子発現抑制用、ｉｌ－３３遺伝子発現抑制用、又はフィラグリン産生促進用組成物
CN116059158A (zh) 一种靶向治疗银屑病的外泌体复合纳米水凝胶及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant