CN112806257A - 一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法。该方法利用亲本四倍体小麦AABB和二倍体节节麦DD杂交，对杂交种幼胚ABD离体培养，获得ABD植株幼苗，继而进行染色体加倍处理，获得低世代的人工合成六倍体小麦AABBDD，再利用同一个四倍体小麦亲本AABB与其进行回交，获得五倍体小麦材料AABBD，利用五倍体小麦材料自交，通过自交过程中染色体重组，产生染色体交换、易位、倒位、缺失、插入等染色体行为，在遗传后代中产生丰富的变异类型，形成不同染色体组成的四倍体小麦新材料，本发明能在相对较短时间内诱导四倍体小麦的染色体出现新的结构变异，有益突变效率高，突变类型丰富，环保、安全、成本小。

Description

一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法

技术领域

本发明属于植物新品系选育技术领域，具体涉及一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法。

背景技术

四倍体小麦（Triticum turgidum L., 2n=4x=28, AABB）属于小麦族一年生植物，为异源多倍体，包含A基因组和B基因组两大亚基因组。四倍体小麦为普通小麦（Triticum aestivum L. 2n=6x=42，AABBDD）的近缘物种，具有多种优良性状，能够作为育种亲本，定向改良普通小麦品种，从而提高小麦品种的产量与品质，实现小麦育种新突破。四倍体小麦中的硬粒小麦是国际上生产意大利面或通心粉的主要原料，其蛋白质含量高、质地坚硬，在全世界的种植面积仅次于普通小麦。所以，创制四倍体小麦新突变，增加遗传变异，有利于四倍体小麦的科学研究和育种利用。

目前，在四倍体小麦中常用的创制遗传变异的方法主要是通过化学和物理等因素，诱发生物体产生突变，人工化学诱变如甲基磺酸乙酯（EMS）诱变，物理诱变如α射线、γ射线等辐射诱变。但化学诱变和物理诱变成本较高，而且有益突变频率较低，还存在环境污染的潜在风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，以解决现有技术中四倍体小麦创制遗传变异的化学诱变和物理诱变成本较高，而且有益突变频率较低，还存在环境污染的潜在风险的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，包括下述步骤：

（1）利用遗传稳定的亲本四倍体小麦AABB与遗传稳定的二倍体节节麦DD进行有性杂交并套袋，在授粉12-15天后，获得三倍体幼胚ABD；

（2）将步骤（1）获得的三倍体幼胚ABD在实验室利用组织培养技术进行小麦幼胚离体培养，获得ABD植株幼苗；

（3）将步骤（2）获得的ABD植株幼苗移栽到田间自然生长，待出现两到三个分蘖时，取回室内，洗净幼苗根部并晾干，然后对ABD幼苗进行染色体加倍处理；

（4）将步骤（3）处理后的幼苗移栽到低温环境自然生长，获得新合成的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD；

（5）以步骤（4）中获得的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD为母本，步骤（1）中使用的亲本四倍体小麦AABB为父本，在田间进行有性杂交，自然成熟后获得五倍体杂交种子AABBD；

（6）将步骤（5）中获得的五倍体杂交种子AABBD在田间播种，自然生长发育，套袋自交5-6代，获得不同的自交株系，利用荧光原位杂交或基因组原位杂交技术对获得的自交株系的染色体数目和结构进行鉴定观察，筛选获得新型四倍体小麦材料种子；

（7）将步骤（6）中筛选获得的新型四倍体小麦材料种子在田间播种，自然生长发育，套袋自交获得种子，通过自交加代繁殖，可获得变异丰富、遗传稳定的新型四倍体小麦。

进一步的，所述步骤（2）中，小麦幼胚离体培养采用MS固体培养基进行培养。

进一步的，所述步骤（3）中，对ABD幼苗进行染色体加倍处理的方法为：将ABD幼苗用秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液浸泡，同时利用氧气泵在混合溶液底部保持充氧状态；在温度为20℃、光照的环境条件下，处理18-22h，之后冲水清洗； ABD幼苗的染色体加倍处理完成。

进一步的，所述秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.04%-0.06%的秋水仙碱溶液，再配制体积百分比浓度为1.2%-1.8%的二甲基亚砜溶液；最后将二者溶液混合均匀，即为秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液。

进一步的，配制的秋水仙碱溶液的质量百分比浓度为0.05%，配制的二甲基亚砜溶液的体积百分比浓度为1.5%。

进一步的，所述光照的光源为日光灯。

进一步的，所述步骤（6）中，筛选获得新型四倍体小麦材料种子具体包括下述步骤：

①以步骤（1）中的供体亲本四倍体小麦AABB为对照，对获得的自交株系进行表型鉴定，筛选出表型性状有变异的株系；

②利用荧光原位杂交技术或基因组原位杂交技术对步骤①筛选出的表型性状有变异的株系幼苗根细胞的染色体数目和结构进行细胞学鉴定，筛选获得具有28条染色体数目，且染色体组成和结构与步骤（1）中亲本四倍体小麦AABB有差异的四倍体小麦新材料，即为新型四倍体小麦材料。

进一步的，所述步骤（4）中，所述低温环境的温度为3-6℃。

基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：

（1）本发明提供的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，利用亲本四倍体小麦AABB和二倍体节节麦DD进行杂交，利用组培技术对杂交种幼胚ABD离体培养，获得ABD 植株幼苗，对ABD 植株幼苗进行染色体加倍技术处理，获得低世代的人工合成六倍体小麦AABBDD，再利用亲本四倍体小麦AABB与新创制的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD进行回交，获得五倍体小麦材料AABBD，利用五倍体小麦材料自交，通过自交过程中染色体重组，产生染色体交换、易位、倒位、缺失、插入等染色体行为，在遗传后代中产生丰富的变异类型，形成不同染色体组成的四倍体小麦新材料，这样创制四倍体小麦遗传变异的方法具有变异频率高，不具有环境污染的风险；本发明能在相对较短时间内诱导四倍体小麦的染色体出现新的结构变异，比现有的辐射诱变、化学诱变等方法的诱变效率更高，诱变类型更丰富，而且更环保安全、更简洁方便、更节约成本。

（2）本发明提供的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，能创制出不同染色体结构、不同表型特征等多类型的四倍体新材料，遗传后代中的AB基因组均来自于四倍体小麦亲本材料，D基因组均来自于二倍体节节麦材料，通过此方法能创制出大量变异类型的、具有不同染色体结构变异的四倍体小麦新材料，例如创制出四倍体4D（4B）代换系，四倍体2DS-2AL易位系等不同染色体结构新材料，表型方面出现穗长、颖壳蜡质、条锈病抗性、叶鞘绒毛、叶耳绒毛、叶片和穗部蜡质等性状方面变异丰富的四倍体新材料。

附图说明

图1是本发明实施例1-3中创制四倍体小麦遗传变异方法的技术线路图；

图2是实施例1中创制出的2份典型四倍体新材料的染色体结构图（a为四倍体小麦亲本材料AABB，b为四倍体新材料4D（4B）代换系，c为2DS-2AL易位系）；

图3是实施例1中创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M1）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）在颖壳上的对比图；

图4是实施例1中创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M2）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）在叶鞘绒毛上的对比图；

图5是实施例1中创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M3）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）在叶耳绒毛上的对比图；

图6是实施例1中创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M4）与四倍体小麦亲本材料穗部特征对比图；

图7是实施例1中创制出的其中三份四倍体小麦新材料（M5、M6和M7）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）进行田间条锈病鉴定的抗性差异的叶片对比图；

图8是实施例1中创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M8）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）穗部特征对比图。

具体实施方式

如图1所示：

实施例1：

一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，包括下述步骤：

（1）利用遗传稳定的亲本四倍体小麦AABB与遗传稳定的二倍体节节麦DD进行有性杂交并套袋，在授粉12-15天后，获得三倍体幼胚ABD；

（2）将步骤（1）获得的三倍体幼胚ABD在实验室利用组织培养技术进行小麦幼胚离体培养，获得ABD植株幼苗；

小麦幼胚离体培养采用MS固体培养基进行培养，MS固体培养基的具体配方如下：

1）100×铁盐母液500ml（1.39克FeSO₄·7H₂O，1.86克Na₂EDTA·2H₂O）；

2）20×大量元素母液500ml（16.5克NH₄NO₃，19克KNO₃，1.7克KH₂PO₄，3.7克MgSO₄·7H₂O，3.32克无水CaCl₂）；

3）100×微量元素母液200ml（16.6毫克KI，124毫克H₃BO₃，338毫克MnSO₄·H₂O，172毫克ZnSO₄·7H₂O，5毫克Na₂MoO₄·2H₂O，0.5毫克CoCl₂·6H₂O,0.5毫克CuSO₄·5H₂O）；

4）100×肌醇溶液200ml；

5）100×有机溶液200ml（烟酸10毫克，盐酸吡哆辛10毫克，盐酸硫胺2毫克，甘氨酸40毫克）；

6）1升固体MS培养基：（铁盐母液10ml，大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，肌醇溶液10ml，有机溶液10ml，蔗糖30克，灭菌水10ml，琼脂粉8克，余量为去离子灭菌水；PH=5.7）。

（3）将步骤（2）获得的ABD植株幼苗移栽到田间自然生长，待出现两到三个分蘖时，取回室内，洗净幼苗根部并晾干，然后对ABD幼苗进行染色体加倍处理；

对ABD幼苗进行染色体加倍处理的方法为：将ABD幼苗用秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液浸泡（秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.05%的秋水仙碱溶液，再配制体积百分比浓度为1.5%的二甲基亚砜溶液；最后将二者溶液混合均匀，即为秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液）；同时利用氧气泵在混合溶液底部保持充氧状态（保持混合溶液在整个实验过程中有持续气泡产生即可）；在温度为20℃、光照（日光灯照射）的环境条件下，处理20h，之后冲水2h， ABD幼苗的染色体加倍处理完成；

（4）将步骤（3）处理后的幼苗移栽到低温环境（3-6℃）的田间自然生长，获得新合成的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD；

（5）以步骤（4）中获得的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD为母本（筛选20株），步骤（1）中使用的亲本四倍体小麦AABB为父本，在田间进行有性杂交（组培20个AABBDD/AABB杂交组合），自然成熟后获得五倍体杂交种子AABBD；

（6）将步骤（5）中获得的五倍体杂交种子AABBD（每个组合随机选取30粒杂交种）在田间播种，自然生长发育，套袋自交5-6代，获得不同的自交株系（每个组合获得稳定的自交株系为120-150个），利用荧光原位杂交或基因组原位杂交技术对获得的稳定自交株系根细胞的染色体数目和结构进行鉴定观察，筛选获得新型四倍体小麦材料种子，每个组合后代产生的新的稳定四倍体新材料（代换系，易位系，渐渗系等）为80-100个；筛选获得新型四倍体小麦材料种子具体包括下述步骤：

①以步骤（1）中的供体亲本四倍体小麦AABB为对照，对获得的自交株系进行表型鉴定，筛选出表型性状有变异的株系；

②利用荧光原位杂交技术或基因组原位杂交技术对步骤①筛选出的表型性状有变异的株系幼苗根细胞的染色体数目和结构进行细胞学鉴定，筛选获得具有28条染色体数目，且染色体组成和结构与步骤（1）中亲本四倍体小麦AABB有差异的四倍体小麦新材料，即为新型四倍体小麦材料；

经过鉴定，此方法获得变异株系的频率大约是同倍型四倍体小麦材料之间杂交获得变异株系频率的5倍，利用此方法在后代中可获得不同的新型四倍体小麦材料；如图2所示，是通过该方法创制出的2份典型四倍体新材料的染色体结构图（a为四倍体小麦亲本材料，b为四倍体新材料4D（4B）代换系，c为2DS-2AL易位系）；

（7）将步骤（6）中筛选获得的新型四倍体小麦材料种子在田间播种，自然生长发育，套袋自交获得种子，通过自交加代繁殖，可获得变异丰富、遗传稳定的新型四倍体小麦，与供体四倍体亲本相比较，遗传后代中主要产生了穗长、叶片蜡质、穗部蜡质、颖壳蜡质、条锈病抗性、叶鞘绒毛、叶耳绒毛等性状方面变异丰富的新型四倍体材料，具体的：

如图3所示，该方法创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M1）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）在颖壳上的对比图（注：LDN为颖壳和穗节有蜡质的四倍体小麦亲本材料，AABBDD为新合成无蜡质的六倍体小麦新材料，M1为创制的一份穗部无蜡质的四倍体小麦新材料）；

如图4所示，该方法创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M2）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）在叶鞘绒毛上的对比图（注：LDN为四倍体小麦亲本材料，AABBDD为合成的六倍体小麦新材料，DD为二倍体节节麦亲本材料，M2为创制出的一份叶鞘有绒毛的四倍体小麦新材料）；

如图5所示，该方法创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M3）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）在叶耳绒毛上的对比图（注：LDN为叶耳无绒毛的四倍体小麦亲本材料，AABBDD为新合成的六倍体小麦新材料，DD为二倍体节节麦亲本材料，M3为创制的一份叶耳有绒毛的四倍体小麦新材料）；

如图6所示，该方法创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M4）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）穗部特征对比图（注：LDN为四倍小麦亲本材料，AABBDD为新合成的六倍体小麦新材料，M4为创制出的一份穗长增长、小穗数增加的大穗四倍体小麦新材料）；

如图7所示，该方法创制出的其中三份四倍体小麦新材料（M5、M6和M7）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）进行田间条锈病鉴定的抗性差异的叶片对比图；（注：LDN为四倍小麦亲本材料，AABBDD为新合成的六倍体小麦新材料，M5和M6为创制出的两份抗条锈病的新材料，M7为创制出的一份宽叶片四倍体新材料）；田间条锈病鉴定的抗性差异结果为：LDN高感，AABBDD为中感-中抗，M5、M6为高抗，M7为高感；

如图8所示，该方法创制出的其中一份四倍体小麦新材料（M8）与四倍体小麦亲本材料AABB（LDN）穗部特征对比图（注：LDN为四倍小麦亲本材料，AABBDD为新合成的六倍体小麦新材料，M8为创制出的一份叶片和叶鞘有蜡质的四倍体小麦新材料。

实施例2：

与实施例1不同的是：

步骤（3）中，对ABD幼苗进行染色体加倍处理的方法为：将ABD幼苗用秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液浸泡（秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.06%的秋水仙碱溶液，再配制体积百分比浓度为1.2%的二甲基亚砜溶液；最后将二者溶液混合均匀，即为秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液）；同时利用氧气泵在混合溶液底部保持充氧状态（保持混合溶液在整个实验过程中有持续气泡产生即可）；在温度为20℃、光照（日光灯照射）的环境条件下，处理18h，之后冲水2.2h， ABD幼苗的染色体加倍处理完成。

其余同实施例1，并且创制出了与实施例1相同四倍体小麦新材料。

实施例3：

与实施例1不同的是：

步骤（3）中，对ABD幼苗进行染色体加倍处理的方法为：将ABD幼苗用秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液浸泡（秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.04%的秋水仙碱溶液，再配制体积百分比浓度为1.8%的二甲基亚砜溶液；最后将二者溶液混合均匀，即为秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液）；同时利用氧气泵在混合溶液底部保持充氧状态（保持混合溶液在整个实验过程中有持续气泡产生即可）；在温度为20℃、光照（日光灯照射）的环境条件下，处理22h，之后冲水1.8h， ABD幼苗的染色体加倍处理完成。

其余同实施例1，并且创制出了与实施例1相同四倍体小麦新材料。

Claims (8)

1.一种拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）利用遗传稳定的亲本四倍体小麦AABB与遗传稳定的二倍体节节麦DD进行有性杂交并套袋，在授粉12-15天后，获得三倍体幼胚ABD；

（2）将步骤（1）获得的三倍体幼胚ABD在实验室利用组织培养技术进行小麦幼胚离体培养，获得ABD植株幼苗；

（3）将步骤（2）获得的ABD植株幼苗移栽到田间自然生长，待出现两到三个分蘖时，取回室内，洗净幼苗根部并晾干，然后对ABD幼苗进行染色体加倍处理；

（4）将步骤（3）处理后的幼苗移栽到低温环境自然生长，获得新合成的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD；

（5）以步骤（4）中获得的低世代人工合成六倍体小麦AABBDD为母本，步骤（1）中使用的亲本四倍体小麦AABB为父本，在田间进行有性杂交，自然成熟后获得五倍体杂交种子AABBD；

（6）将步骤（5）中获得的五倍体杂交种子AABBD在田间播种，自然生长发育，套袋自交5-6代，获得不同的自交株系，利用荧光原位杂交或基因组原位杂交技术对获得的自交株系根细胞的染色体数目和结构进行鉴定观察，筛选获得新型四倍体小麦材料种子；

（7）将步骤（6）中筛选获得的新型四倍体小麦材料种子在田间播种，自然生长发育，套袋自交获得种子，通过自交加代繁殖，可获得变异丰富、遗传稳定的新型四倍体小麦。

2.根据权利要求1所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，小麦幼胚离体培养采用MS固体培养基进行培养。

3.根据权利要求1所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，对ABD幼苗进行染色体加倍处理的方法为：将ABD幼苗用秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液浸泡，同时利用氧气泵在混合溶液底部保持充氧状态；在温度为18-22℃、光照的环境条件下，处理18-22h，之后冲水清洗； ABD幼苗的染色体加倍处理完成。

4.根据权利要求3所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，所述秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.04%-0.06%的秋水仙碱溶液，再配制体积百分比浓度为1.2%-1.8%的二甲基亚砜溶液；最后将二者溶液混合均匀，即为秋水仙碱和二甲醛亚砜的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，配制的秋水仙碱溶液的质量百分比浓度为0.05%，配制的二甲基亚砜溶液的体积百分比浓度为1.5%。

6.根据权利要求3所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，所述光照的光源为日光灯。

7.根据权利要求1所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，筛选获得新型四倍体小麦材料种子具体包括下述步骤：

①以步骤（1）中的供体亲本四倍体小麦AABB为对照，对获得的自交株系进行表型鉴定，筛选出表型性状有变异的株系；

②利用荧光原位杂交技术或基因组原位杂交技术对步骤①筛选出的表型性状有变异的株系幼苗根细胞的染色体数目和结构进行细胞学鉴定，筛选获得具有28条染色体数目，且染色体组成和结构与步骤（1）中亲本四倍体小麦AABB有差异的四倍体小麦新材料，即为新型四倍体小麦材料。

8.根据权利要求1所述的拓宽四倍体小麦遗传变异的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述低温环境的温度为3-6℃。

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