CN112795591B - 鉴定牡丹授粉受精基因的vigs沉默体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系。本发明所提供的鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系，包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。本发明利用同源克隆技术克隆了牡丹授粉受精基因PoMYB1和PoMYB2保守区段作为靶基因构建TRV2载体，成功建立了VIGS沉默体系，有效地降低了这两个基因的表达量。本研究结果对牡丹基因功能研究具有重要意义，也为解析牡丹授粉受精过程的分子机制奠定了基础。

Description

鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系。

背景技术

牡丹为芍药科芍药属牡丹组落叶亚灌木，是我国传统名花。近年来，发现牡丹籽油中含有极为丰富的不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸，国家卫生部于2011年批准牡丹籽油成为新资源食品，因此，油用牡丹的研究与开发成为木本油料植物研究的新热点。牡丹作为一种具有中国特色的潜在油料作物，提高种子产量成为研究的重点。受精成败是影响牡丹结实性的关键因素，通过提高受精率来增加种子数量，进而提高产量，对于牡丹油用产业的发展和加速观赏品种的改良具有重要的意义。以影响受精过程的关键调控因子MYB为切入点，从转录和转录调节多个层面系统探讨MYB的功能，利用分子生物学和细胞生物学等技术建立MYB基因功能与牡丹受精结实之间的联系，有望在国内外率先阐明MYB调控牡丹受精的分子机制，为被子植物受精机制的深入研究增加理论基础，进一步为提高牡丹结实率和远缘杂交育种效率奠定基础。MYB调控牡丹受精机制的解析，可通过人工调控基因的表达来探索提高牡丹结实率的新途径，也可以提高牡丹组间、种间育种效率，加快培育优异新品种的步伐，对于增加油用牡丹种子产量、种质创新，加快油用、观赏牡丹产业发展、创造更大的经济价值均具有重要的意义。

MYB转录因子通过参与调控花粉发育、花药开裂、花粉管导向、精细胞释放和雌雄细胞之间的识别和互作等有性生殖过程在植物受精过程中发挥着关键作用，从而影响植物结实。在拟南芥中，MYB33和MYB65对花粉囊和花粉都具有促进发育的作用；MYB4、MYB21、MYB24、MYB26、MYB32和MYB57参与花粉壁的形成和调控花药的开裂；超表达MYB24基因会导致植株花器官发育不良，花粉无活性；MYB80调控绒毡层发育和花粉粒外壁的形成；DUO1(MYB125)基因不仅调控生殖细胞的有丝分裂，还参与调控精细胞的分裂和分化；在助细胞中表达的MYB98基因参与调控花粉管的导向；MYB97、MYB101和MYB120突变体的花粉管在进入胚囊后不停止生长和爆裂释放精细胞，导致胚珠不能正常受精；在番茄中，MYB64参与花粉壁形成及调控番茄雄性育性；在甘蓝型油菜中，MYB80参与绒毡层发育从而引起雄性不育；在水稻中，MYB106参与调控花粉育性从而影响结实率；在棉花中，超表达MYB25时纤维数量增加但受精率降低。因此，MYB转录因子广泛参与植物受精过程的各个阶段并影响受精的成败。而授粉受精基因相关研究报道极少，因此开展相关基因功能研究对于理解其受精过程具有重要意义。

牡丹再生和遗传转化很困难，尚未见其遗传转化体系的报道，利用转基因技术验证牡丹基因的功能存在技术瓶颈。此外，牡丹从实生苗到开花需要3年左右的时间，开花相关基因的表型鉴定困难较大。

病毒诱导的基因沉默VIGS(Virus-induced gene silencing)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliff F,Martin-HemandezA M,Baulcombe D C.2001.Tobacco rattle virus as a vector for analysis of genefunction by silencing.Plant J，25：237-245.)。

发明内容

为了弥补以上领域的缺陷，本发明提供了鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系。

本发明所提供的鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系，包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。

所述VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。

本发明还提供了鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系的构建方法。

本发明所提供的所述鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用添加了Xba I酶切位点和Sac I酶切位点的特异性引物进行PoMYB1靶片段的PCR扩增，利用添加了EcoR I酶切位点和Kpn I酶切位点的特异性引物进行PoMYB2靶片段的PCR扩增，分别得到用于VIGS沉默的PoMYB1靶片段、PoMYB2靶片段；

所述PoMYB1靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；扩增所述PoMYB1靶片段的特异性引物如下：

MYB1-VF1：GCTCTAGAATTGCCACTATCACAGTCGCC；

MYB1-VR1：CCGAGCTCTCAAATATCCGTATCAGTAGAGAAGTT；

所述PoMYB2靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；扩增所述PoMYB2靶片段的特异性引物如下：

MYB2-VF1：CGGAATTCTCAACGAGGAGAAAAATCACGA；

MYB2-VR1：GGGGTACCCTGACATACTTGGAGGAGCACTAG；

(2)用Xba I酶和Sac I酶将所述PoMYB1靶片段和TRV2载体进行双酶切，用EcoR I酶和Kpn I酶将所述PoMYB2靶片段和TRV2载体进行双酶切，酶切完成后将PoMYB1靶片段或PoMYB2靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载体进行连接，连接之后转化E.coLi DH5α感受态细胞，筛选阳性单菌落，然后转化到农杆菌GV3101中，即得到所述VIGS沉默体系。

所述鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系在鉴定牡丹类授粉受精基因PoMYB1和/或PoMYB2中的应用也属于本发明的保护范围。

鉴定牡丹授粉受精基因的方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的鉴定牡丹授粉受精基因的方法，使用所述的VIGS沉默体系。

所述方法包括如下步骤：

以牡丹带花柄的花朵为材料，注射含有所述VIGS沉默载体的菌液；

将注射后的花柄用去离子水漂洗，去除多余菌液；

将所述花柄采用水培方式进行培养，之后检测目的基因的表达水平以及花粉管的变化。

所述带花柄的花朵的花发育时期为紧实的花蕾。

注射花柄直到菌液从萼片处溢出为止。

将所述花柄采用水培方式进行培养的条件为：将花柄浸于去离子水中，在温度为23℃-25℃、湿度50％-60％的条件下暗培养1天；之后转移至16h光照/8h黑暗周期、温度为23℃-25℃、湿度50％-60％的条件下正常光照培养。

所述含有重组载体的菌液为：含有在烟草脆裂病毒TRV2载体上插入序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列得到的重组载体菌液以及含有烟草脆裂病毒TRV1载体的菌液。

本发明利用同源克隆技术克隆了牡丹授粉受精基因PoMYB1和PoMYB2保守区段作为靶基因构建TRV2载体，成功建立了VIGS沉默体系，有效地降低了这两个基因的表达量。本研究结果对牡丹基因功能研究具有重要意义，也为解析牡丹授粉受精过程的分子机制奠定了基础。

影响VIGS沉默效果的因素很多。首先是沉默基因片段长度和位置的选择，本发明利用扩增保守区段长度在350-400bp的片段来沉默同源家族基因，取得了较好的沉默效果。如针对某一特异基因进行沉默时，则需考虑序列的特异性，可以通过沉默非翻译区或者特异区段的办法，确保沉默特异目标基因。本发明采用烟草脆裂病毒TRV为载体，其能有效地将目标基因在生长点或分生组织中沉默，并获得系统的沉默效果。此外，利用TRV沉默基因后的植物材料对温度比较敏感，本发明在光照培养箱控温(23-25℃)控湿(相对湿度50％-60％)的条件下进行，获得了较好的实验结果。因此，成功沉默基因需要严格掌控好每个技术环节。

针对牡丹遗传转化困难、无法验证基因功能等问题，本发明通过VIGS技术，采用二因素二水平共8个试验处理，利用VIGS技术成功沉默了PoMYB1和PoMYB2基因。建立了PoMYBs最佳VIGS体系，用PoMYBs基因保守区段为靶片段，以带花柄的紧实花蕾为材料，注射后置于去离子水中，暗培养1d(23℃-25℃，湿度50％-60％)；之后转移至23℃-25℃、湿度50％-60％的环境，正常光照培养后进行检测和分析。本结果为验证牡丹MYBs基因的功能奠定了基础，也为验证牡丹中其他重要功能基因提供了研究思路和技术依据。

附图说明

为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：

图1为含有TRV载体的菌液凝胶电泳检测结果；M为分子量标准从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2为菌液OD₆₀₀＝0.5时注射1次和注射2次的基因表达情况；其中，图2中A为注射1次的基因表达情况，图2中B为注射2次的基因表达情况。

图3为菌液OD₆₀₀＝1.0时注射1次和注射2次的基因表达情况；其中，图3中A为注射1次的基因表达情况，图3中B为注射2次的基因表达情况。

图4为菌液OD₆₀₀＝1.5时注射1次和注射2次的基因表达情况；其中，图4中A为注射1次的基因表达情况，图4中B为注射2次的基因表达情况。

图5为菌液OD₆₀₀＝2.0时注射1次和注射2次的基因表达情况；其中，图5中A为注射1次的基因表达情况，图5中B为注射2次的基因表达情况。

图6为不同授粉时期沉默PoMYBs后基因的表达量分析结果；其中，图6中A为PoMYB1的相对表达量；图6中B为PoMYB2的相对表达量。

具体实施方式

用于本发明的牡丹品种‘凤丹白’(Paeonia ostii‘Fengdanbai’)栽植于青岛农业大学胶州牡丹种质资源圃，花色为白色，购自山东省菏泽市曹州百花园。采摘‘凤丹白’植株上紧实且饱满的花蕾，留有10cm花柄。

本发明所用VIGS载体来自烟草脆裂病毒载体(tobacco rattle virus，TRV)，TRV1/TRV2为中国科学院植物研究所牡丹组舒庆艳老师馈赠(记载过该载体的非专利文献是：Zhen Z,Fu-Zhong L,Ying Z,et al.VIGS Expression Vector Construction andExpression Analyses of SmMsrA Gene in Eggplant[J].Acta Horticulturae Sinica,2015.)，其带有卡那筛选标记和35S启动子，pTRV2带有Xba I和Sac I等多克隆位点。

实施例1、

一、基因克隆

雌蕊总RNA的提取参照试剂盒说明书进行(RNAprep Pure Plant Kit，FastQuantcDNA天根生化科技(北京)有限公司)。根据公共数据库中MYB1和MYB2序列设计上下游引物克隆靶片段。用于VIGS沉默的PoMYB1片段设计上下游引物并添加Xba I和Sac I酶切位点。用于VIGS沉默的PoMYB2片段设计上下游引物并添加EcoR I和Kpn I酶切位点。扩增引物见表1。

表1本发明所用引物序列相关信息

注：下划线表示碱基酶切位点。

(1)PoMYB1靶片段的克隆序列分析

根据上下游引物扩增PoMYB1靶片段长度为386bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。所用的PCR反应体系和程序见表2和表3，所扩增的片段利用DNA凝胶回收试剂盒(购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司)按照说明书进行回收，并连接到PMD18-T载体(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5αChemically CompetentCell，购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司)。阳性克隆进行测序(由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成)。序列用DNAman5.0软件分析，其属于MYB家族。PoMYB1靶片段编码的PosMYB1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

表2 PCR反应体系

表3 PCR扩增程序

(2)PoMYB2基因克隆和序列分析

克隆的PoMYB2靶片段长度为388bp，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。所用的PCR反应体系和程序等方法同PoMYB1。序列用DNAman5.0进行分析，并与公共数据可进行BlastP分析，其属于MYB家族。PoMYB2靶片段编码的PoMYB2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

二、制备重组载体

首先对含有TRV2和TRV1(为中国科学院植物研究所牡丹组舒庆艳老师馈赠；记载过TRV1/TRV2的非专利文献是：(Zhen Z,Fu-Zhong L,Ying Z,et al.VIGS ExpressionVector Construction and Expression Analyses of SmMsrA Gene in Eggplant[J].Acta Horticulturae Sinica,2015.))的菌液进行PCR鉴定，鉴定引物见表1，扩增体系和程序见表4和表5。所扩增长度分别为700bp(TRV1)和400bp(TRV2)(图1)。

表4 PCR反应体系

PCR扩增程序如下表5：

表5 PCR扩增程序

含有TRV载体的菌液凝胶电泳检测结果见图1。TRV1所扩增片段大小为700bp左右，TRV2大小为400bp左右，证实扩增正确，可以用于后续研究。

上述所克隆的PoMYB1序列上下游分别含有Xba I和Sac I酶切位点，PoMYB2序列上下游分别含有EcoR I和Kpn I酶切位点。含有目的片段和TRV2载体的菌液进行质粒提取，采用高纯度质粒DNA小量试剂盒(购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司)，提取方法参照试剂盒说明书进行。同时分别用上述2个酶将靶片段和TRV2进行双酶切(内切酶购自TaKaRa)，酶切反应根据试剂说明书进行，并见表6和表7。酶切体系混匀后，置于37℃水浴1-2h。

表6 PoMYB1双酶切体系

表7 PoMYB2双酶切体系

酶切完成后将PoMYB1/PoMYB2靶片段与TRV2载体进行连接，采用T4DNA连接酶，连接体系见表8。

表8连接体系

连接之后转化E.coLi DH5α感受态细胞(购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司)，用含kan抗性的LB培养基筛选阳性单菌落，再进行PCR、质粒酶切鉴定。鉴定正确，将确定含有TRV2-PoMYB1和TRV2-PoMYB2大肠杆菌菌液进行测序(由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成)，确保序列的正确性。测序结果正确，然后转化到农杆菌GV3101中(农杆菌感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司)，转化方法为常规冻融法，转化后的农杆菌培养2-3d后，将单菌落菌液进行菌液PCR，对验证正确的农杆菌进行培养，用于VIGS试验。

三、VIGS体系建立

采用二因素二水平试验体系(表9)进行VIGS试验。因素A：菌液数量浓度，分别为0.5(A1)、1.0(A2)、1.5(A3)和2.0(A4)。因素B：注射次数，分别为1次(B1)和两次(B2)。TRV2-PoMYB1和TRV2-PoMYB2为目标基因，相应的TRV2空载体为对照。转化方法参照文献Zhen Z,Fu-Zhong L,Ying Z,et al.VIGS Expression Vector Construction and ExpressionAnalyses of SmMsrA Gene in Eggplant[J].Acta Horticulturae Sinica,2015.，采用注射器注射法。主要细节包括pTRV2-PoMYB1、pTRV2-PoMYB2、pTRV1和pTRV2菌液的OD₆₀₀值相同。将pTRV2-PoMYB1和pTRV2-PoMYB2菌液分别和pTRV1按体积比1:1混合；将pTRV2和pTRV1菌液按体积比1：1混合，暗处静置4h。牡丹花朵带12cm花柄剪下置于去离子水中，选择花蕾紧实、饱满且长势一致的‘凤丹白’,用1mL一次性注射器在‘凤丹白’花柄处(花蕾基部)通过压迫注射方式将含有重组病毒载体的根癌农杆菌重悬液注入花柄中，约注入2-3ml,使菌液在萼片及花柄中扩散，当有菌液从萼片处溢出时停止。以注射GV3101-pTRV2农杆菌菌液为阴性对照组,每个处理9个单株,重复3次。将注射感染后的植株在离心管中培养,浇足水，23℃-25℃，湿度50％-60％暗培养1d后转入16h/8h的光照/黑暗周期、23℃-25℃和湿度50％-60％条件下培养。分别收取接种pTRV2-PoMYB1和pTRV2-PoMYB2、pTRV2空载体的雌蕊置于液氮中速冻并存于-80℃保存备用。

表9用于VIGS体系的二因素二水平试验处理

四、基因表达分析

基因表达分析参照文献(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu QY,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyaninOmethyltransferase,is involved in pur ple flower coloration in Paeonia.J ExpBot，6 6：6563-77)，将所有样品进行总RNA的提取，并反转录成cDNA，作为荧光定量PCR的模板。具体方法参照试剂盒说明进行(FastQuant cDNA和SYBR Green，天根生化科技(北京)有限公司)并参考文献(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyaninOmethyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J ExpBot，66：6563-77)，荧光定量的反应体系和程序见表10和表11。本研究采用2-△△CT(Livak)法计算实时荧光定量PCR实验中基因的相对表达量，PsTubulin(accessionno.EF608942)作为内参基因(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wa ng L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O-methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J ExpBot，66：6563-77)。将菌液浓度和注射次数分开进行表达量分析，分9次生物学和3次技术重复。

表10荧光定量PCR扩增体系

表11荧光定量PCR扩增程序

结果：花柄中沉默MYBs后基因的表达量分析

利用所扩增保守区片段长分别为386bp和388bp的PoMYB1和PoMYB2基因片段构建TRV2载体，用于沉默目的基因。通过二因素二水平8个试验，寻找MYB基因沉默的最佳处理，对沉默后的基因表达量进行分析。

当菌液浓度OD₆₀₀＝0.5时，注射1次和2次，9个处理中PoMYB2基因相对表达量均未降低，基因沉默效率均为0，表明PoMYB2基因未被沉默(图2中A和图2中B)

当菌液浓度OD₆₀₀＝1.0时，注射1次和2次，所有样品PoMYB2基因相对表达量均显著降低，表达量下降幅度大部分在90％以上。注射1次的9个处理中，样品4基因相对表达量降低最多，为99.5％；样品3相对表达量降低最少，约为60％(图3中A)；注射2次的9个处理中，样品1表达量下降最大，约为99％；样品4和7基因相对表达量降低最少，为62％左右(图3中B)。试验结果表明所有样品中PoMYB2基因均被沉默，基因沉默效率高达100％。

当菌液浓度为OD₆₀₀＝1.5时，注射1次的9个处理中，有1，3，5，6，7，8，9七个处理中的基因相对表达量降低。其中，与对照空载体处理相比，样品8基因相对表达量降低最多，为99.2％；样品1，3，5，6，7，9六个处理之间差异不显著，基因表达量分别降低了70％、73％、52％、53％、54％、71％。基因沉默效果较好，沉默效率为77.8％(图4中A)。注射2次的9个处理中有七个处理PoMYB2基因相对表达量显著下降，分别为样品2，3，4，5，6，7，9，相对表达量均下降了约为90％左右。基因沉默效率与注射1次相同，为77.8％(图4中B)。两者均表明PoMYB2基因被沉默，基因沉默效率均为77％以上。

当菌液浓度为OD₆₀₀＝2.0时，注射1次和2次所有样品中，注射1次的9个处理中有3，7，8三个处理表达量降低，但降低幅度未超过50％，剩余样品中表达量均未降低(图5中A)，表明PoMYB2基因未被沉默。注射2次的9个处理中只有样品4中PoMYB2基因相对表达量降低量超过50％，剩余样品表达未降低(图5中B)。计算其沉默效率为10％，沉默效果差。

比较试验结果发现，注射次数相同时，随着农杆菌菌液浓度的增加，试验样品中基因的相对表达量先下降，后上升；沉默效率先升高，后降低。当菌液浓度为OD₆₀₀＝1.0时，样品中PoMYB2基因的相对表达量降低最多，与对照相比均下降90％以上。其中，降低幅度最大的为注射1次处理中的样品4与注射两次处理中的样品1，分别下降99.5％、99％。表明农杆菌浓度为1.0时，可以使PoMYB2基因被沉默，沉默效率达到100％，取得最好的沉默效果。菌液浓度相同时，随着注射次数的增加，样品中PoMYB2基因的相对表达量有所降低。当菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5时，注射1次和2次虽然基因均未被沉默，但注射1次的基因相对表达量与注射两次相比显著降低；当菌液浓度为OD₆₀₀＝1.0时，注射1次和2次所有样品在基因相对表达量和基因表达效率方面差异较小，注射两次的基因沉默效果略优于注射一次。与对照相比，表达量均大幅下降，降低幅度范围在90％-99.5％之间。基因沉默效率均为100％；当菌液浓度为OD₆₀₀＝1.5时，注射1次和2次，各组的9个处理中，均有部分样品基因未被沉默，沉默效率为77％左右，沉默效果较好；当菌液浓度为OD₆₀₀＝2.0时，注射2次9个处理中有1个处理PoMYB2基因被沉默，而注射1次的9个处理中基因均未被沉默。故注射2次处理效果优于注射1次。

通过对不同处理的中PoMYB2基因表达量分析发现，8个处理中PoMYB2基因的表达量在处理3的沉默效率最高。当菌液浓度OD₆₀₀值为0.5、1.0、1.5时，注射1次和2次处理组的基因沉默效率相同分别为0、100％、78％；当菌液浓度OD₆₀₀值为2.0时，注射1次和2次处理组的基因沉默效率分别为0、10％。由此获得了沉默PoMYB2基因研究雌蕊发育和授粉受精过程的最适体系：注射花柄部位，菌液OD₆₀₀值为1.0，注射1次。

不同授粉时期沉默MYBs后基因的表达量分析：S1(圆桃期)、S2(分泌粘液期)、S3(授粉后24h)、S4(授粉后48h)。

在花朵未开放、花蕾处于蓬松状态时，进行人工去雄，对植株进行侵染，侵染体系为：注射法侵染花柄部位，菌液浓度OD₆₀₀为1.0，注射1次，置于去离子水中，暗处理24h(暗处理过程中由青岛农业大学科技楼温室提供稳定均一环境，设置其条件参数为：温度23℃-25℃，环境湿度50％-60％)，暗处理结束后，柱头分泌粘液时立即进行人工授粉，授粉结束后正常光照培养进行取样、检测和分析。

为明确授粉前后不同时期的雌蕊中TRV2-PoMYBs的表达丰度，以‘凤丹白’PoTubulin为内参基因，对授粉前后不同时期的雌蕊中TRV2-PoMYBs的相对表达量进行检测分析，结果表明TRV2-PoMYBs在授粉前后不同时期的表达丰度有显著差异。与VIGS空载对照植株相比，TRV2-PoMYBs植株的相对表达量均大幅下降，降低幅度范围在50.14％-99.97％之间，基因沉默效率均为100％。随着授粉时间的延长，TRV2-PoMYBs表达量表现为明显的下降趋势，TRV2-PoMYB1在S2中相对表达量为S3的7倍，TRV2-PoMYB1在S4时期下降幅度最大，相对表达量最低为0.03％(图6中A)。TRV2-PoMYB2在S3时期下降幅度最大，相对表达量最低为13.35％(图6中B)。

数据分析方法：

本研究中的序列利用DNAMAN5.0进行序列分析。荧光定量PCR数据采用软件SPSS19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL)进行显著性差异分析(P<0.05)，采用SigmaPlot 12.5软件绘制图表。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 鉴定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系

<130> SPI19249

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 370

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PoMYB1

<400> 1

attgccacta tcacagtcgc cctgtggagg tcaatggtgg gagagcttaa ttcttaacac 60

ggaaggccac aaagtatcca ccaatgtctc ttccaaaact acatctggag acgagttttt 120

attctttaag aacttatggg ttgaagaaaa tgcacttgca acagatatgg gacatagtga 180

aaatgcacct tcaacagata tgggacaaag tacagatgat cagtatttat tctttgagaa 240

cttttgggtt gaagaagagg cacctgcaac agacatggga caaaatgaag atgcttctgc 300

aacagatatg ggacaaagta atttcctcaa ctcttccatt agtaacttct ctactgatac 360

ggatatttga 370

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PoMYB1

<400> 2

Leu Pro Leu Ser Gln Ser Pro Cys Gly Gly Gln Trp Trp Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Leu Asn Thr Glu Gly His Lys Val Ser Thr Asn Val Ser Ser Lys

20 25 30

Thr Thr Ser Gly Asp Glu Phe Leu Phe Phe Lys Asn Leu Trp Val Glu

35 40 45

Glu Asn Ala Leu Ala Thr Asp Met Gly His Ser Glu Asn Ala Pro Ser

50 55 60

Thr Asp Met Gly Gln Ser Thr Asp Asp Gln Tyr Leu Phe Phe Glu Asn

65 70 75 80

Phe Trp Val Glu Glu Glu Ala Pro Ala Thr Asp Met Gly Gln Asn Glu

85 90 95

Asp Ala Ser Ala Thr Asp Met Gly Gln Ser Asn Phe Leu Asn Ser Ser

100 105 110

Ile Ser Asn Phe Ser Thr Asp Thr Asp Ile

115 120

<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PoMYB2

<400> 3

tcaacgagga gaaaaatcac gagctcgatt ccgataccaa acataatgga acgagcaagg 60

aaaattcaaa cacagttcaa gacgagaaac ctgaaagctc agataagata caaaccagtc 120

acaagtaccc aaggcatgtc ccagttctca ttctagatgg gggccttgga acatgttcct 180

cggaccaaca aatgcatgga cacggcaacg ttatgttgac aaataatcag caaatttctt 240

ctgctttttc tagtcttatt gtgtcttctc tgttacaaaa cccagcagcc catgctgcag 300

caagctttgc agctacattc tggccccgtg aagatgcttc agattcttct agtgctcctc 360

caagtatgtc ag 372

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PoMYB2

<400> 4

Asn Glu Glu Lys Asn His Glu Leu Asp Ser Asp Thr Lys His Asn Gly

1 5 10 15

Thr Ser Lys Glu Asn Ser Asn Thr Val Gln Asp Glu Lys Pro Glu Ser

20 25 30

Ser Asp Lys Ile Gln Thr Ser His Lys Tyr Pro Arg His Val Pro Val

35 40 45

Leu Ile Leu Asp Gly Gly Leu Gly Thr Cys Ser Ser Asp Gln Gln Met

50 55 60

His Gly His Gly Asn Val Met Leu Thr Asn Asn Gln Gln Ile Ser Ser

65 70 75 80

Ala Phe Ser Ser Leu Ile Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn Pro Ala Ala

85 90 95

His Ala Ala Ala Ser Phe Ala Ala Thr Phe Trp Pro Arg Glu Asp Ala

100 105 110

Ser Asp Ser Ser Ser Ala Pro Pro Ser Met Ser Ala

115 120

Claims (9)

1.沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系，包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系，其特征在于：所述VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。

3.权利要求1或2所述的沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用添加了Xba I酶切位点和Sac I酶切位点的特异性引物进行PoMYB1靶片段的PCR扩增，利用添加了EcoR I酶切位点和Kpn I酶切位点的特异性引物进行PoMYB2靶片段的PCR扩增，分别得到用于VIGS沉默的PoMYB1靶片段、PoMYB2靶片段；

所述PoMYB1靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；扩增所述PoMYB1靶片段的特异性引物如下：

MYB1-VF1：GCTCTAGAATTGCCACTATCACAGTCGCC；

MYB1-VR1：CCGAGCTCTCAAATATCCGTATCAGTAGAGAAGTT；

所述PoMYB2靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；扩增所述PoMYB2靶片段的特异性引物如下：

MYB2-VF1：CGGAATTCTCAACGAGGAGAAAAATCACGA；

MYB2-VR1：GGGGTACCCTGACATACTTGGAGGAGCACTAG；

(2)用Xba I酶和Sac I酶将所述PoMYB1靶片段和TRV2载体进行双酶切，用EcoR I酶和Kpn I酶将所述PoMYB2靶片段和TRV2载体进行双酶切，酶切完成后将PoMYB1靶片段或PoMYB2靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载体进行连接，连接之后转化感受态细胞，筛选阳性单菌落，然后转化到农杆菌中，即得到所述VIGS沉默体系。

4.权利要求1或2所述的沉默牡丹授粉受精基因的VIGS沉默体系在沉默牡丹授粉受精基因PoMYB1和/或PoMYB2中的应用。

5.一种沉默牡丹授粉受精基因的方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的VIGS沉默体系；所述方法包括如下步骤：

以牡丹带花柄的花朵为材料，注射含有所述VIGS沉默载体的菌液；

将注射后的花柄用去离子水漂洗，去除多余菌液；

将所述花柄采用水培方式进行培养，之后检测目的基因的表达水平。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述带花柄的花朵的花发育时期为紧实的花蕾。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述注射为注射花柄直到菌液从萼片处溢出为止。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将所述花柄采用水培方式进行培养的条件为：将花柄浸于去离子水中，在温度为23℃-25℃、湿度50％-60％的条件下暗培养1天；之后转移至16h光照/8h黑暗周期、温度为23℃-25℃、湿度50％-60％的条件下正常光照培养。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述含有所述VIGS沉默载体的菌液OD₆₀₀值为1.0，注射1次。

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