CN112794906A - 抗4-1bb的单链抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗4‑1BB的单链抗体及其应用。本发明所提供的单链抗体的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第31‑35位、第50‑64位、第98‑106位所示；轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第156‑166位、第182‑188位、第221‑229位所示。本发明所提供的单链抗体能结合人和猴4‑1BB。本发明抗体在用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病的患者的血液或组织中的4‑1BB或作为免疫增强物或者免疫调节剂治疗疾病诸如癌症、自身免疫疾病、炎症疾病、和感染疾病等中将具有重要潜在应用价值。

Description

抗4-1BB的单链抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗4-1BB的单链抗体及其应用。
背景技术
4-1BB属肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，由肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)基因编码，由Kwon和Weissman在激活的鼠T细胞克隆分化筛选过程中首先发现。Schwarzh等从人活化T细胞中分离出与鼠4-1BB具同源性的人4-1BB，并将其命名为CD137。4-1BB是Ⅰ型膜糖蛋白，不同于PD-1/PD-L，4-1BB的表达具有激活依赖性，其介导T细胞活化的共刺激信号，广泛存在于免疫细胞包括激活的NK细胞、活化的T细胞、树突状细胞(DC)、单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞表面。人的4-1BB具有255个氨基酸，以单体和二聚体形式表达于细胞表面，且易与配体形成三聚体，进而开启信号转导。
研究表明，4-1BB对维持免疫稳态具有重要作用，且对抗肿瘤免疫记忆至关重要。其介导的共刺激信号可增强T细胞的功能，提高T细胞对肿瘤细胞的监视和病毒感染的免疫防御作用。一些4-1BB激动剂抗体能够增加共刺激分子表达，并且显著增强T细胞免疫应答，引起抗肿瘤功效。利用配体4-1BBL或激活型4-1BB单抗激活4-1BB，可刺激T细胞和抗原提呈细胞增殖并分泌细胞因子，提高机体的抗肿瘤免疫应答水平。进一步的，4-1BB单一治疗和组合治疗肿瘤模型已经确定持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答。与此同时，4-1BB激动剂在许多本领域认可的自身免疫模型中也已经显示抑制自身免疫反应。4-1BB信号途径可诱导体内CD4+ T细胞介导的免疫耐受，阻止自身免疫性疾病的发生、发展。4-1BB这种双重活性提供了抗肿瘤活性，同时可减弱自身免疫副作用。
单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。单链抗体只有完整抗体的一条链，因此得名为单链抗体。单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性；易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度；免疫源性小，可消除排异反应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗4-1BB的单链抗体及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种抗4-1BB的单链抗体。
本发明所要求保护的抗4-1BB的单链抗体，由重链可变区和轻链可变区连接而成；所述重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第31-35位、第50-64位、第98-106位所示；所述轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第156-166位、第182-188位、第221-229位所示。
进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1自N端起第1-117位，或者与SEQ ID No.1自N端起第1-117位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1自N端起第133-239位，或者与SEQ ID No.1自N端起第133-239位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
更进一步地，所述单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-239位，或者与SEQID No.1的第1-239位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
第二方面，本发明要求保护前文所述单链抗体与载体蛋白形成的融合抗体。
在本发明的具体实施方式中，所述载体蛋白为Fc。
进一步地，所述融合抗体可以是任何类别，如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。优选4-1BB抗体是IgG类别，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，更优选IgG4亚型。
更进一步地，所述Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第240-472位所示，或者与SEQID No.1自N端起第240-472位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
更加具体地，所述融合抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者与SEQ IDNo.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
第三方面，本发明要求保护核酸分子。
本发明所要求保护的核酸分子编码前文所述的单链抗体或前文所述融合抗体。
本发明的核酸分子可以是DNA或RNA，可以包含或不包含内含子序列。优选的，所述核酸分子是cDNA分子。
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2自5’端起第91-105位、第148-192位、第292-318位所示；编码所述轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2自5’端起第466-498位、第544-564位、第661-687位所示。
更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNo.2自5’端起第1-351位或者与SEQ ID No.2自5’端起第1-351位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.2自5’端起第397-717位或者与SEQ ID No.2自5’端起第397-717位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
更加具体地，编码所述单链抗体的核苷酸序列为SEQ ID No.2自5’端起第1-717位或者与SEQ ID No2自5’端起第1-717位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))。
更加具体地，编码所述融合抗体的核苷酸序列为SEQ ID No.2或者与SEQ ID No2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(FR))
本发明的核酸分子可以用合适的分子生物学技术获得。
第四方面，本发明要求保护含有前文所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞。
本发明进一步提供含本发明提供核酸分子的宿主细胞(即所述重组细胞)。所述宿主细胞可以是表达载体可利用的任何细胞。例如高等真核宿主细胞，如哺乳动物细胞包含例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，低等真核宿主细胞，如酵母细胞，及可以是原核细胞，如细菌细胞、大肠杆菌等。重组核酸构建体导入宿主细胞中的转染方法如电穿孔、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、脂质转染、噬菌体感染等。可通过已知方法将当编码抗体基因的表达载体导入宿主细胞中，通过将该宿主细胞培养足以使得结合分子在宿主细胞中表达，由此产生抗体。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明所述单链抗体或融合抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明所述单链抗体或融合抗体的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或75％以上的同一性的核苷酸，只要编码所述单链抗体或融合抗体且具有所述单链抗体或融合抗体活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
第五方面，本发明要求保护药物组合物。
本发明所要求保护的药物组合物包含：(A1)前文所述的单链抗体或前文所述融合抗体；(A2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
第六方面，本发明要求保护权利要求1-9中任一所述的单链抗体或融合抗体或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细胞或药物组合物在如下任一中的应用：
(B1)制备用于检测4-1BB的产品，或检测4-1BB；
在实际应用中，可将所述抗体或其抗原结合片段用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病的患者的血液或组织中的4-1BB。
其中，所述4-1BB可为人4-1BB，也可为猴4-1BB。
(B2)制备用于阻断4-1BB/4-1BBL信号通路的产品，或阻断4-1BB/4-1BBL信号通路；
(B3)制备用于刺激T细胞活化的产品，或刺激T细胞活化；
(B4)制备用于促进T细胞分泌IFN-γ的产品，或促进T细胞分泌IFN-γ；
(B5)制备用于抑制结肠癌细胞生长的产品，或抑制结肠癌细胞生长；
(B6)制备用于抑制结肠癌肿瘤生长的产品，或抑制结肠癌肿瘤生长；
(B7)制备用于治疗和/或预防结肠癌的产品，或治疗和/或预防结肠癌；
(B8)作为免疫增强物，或制备免疫增强物；
(B9)作为免疫调节物，或制备免疫调节物；
(B10)制备用于治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病；
(B11)制备用于治疗和/或预防和/或诊断癌症的产品，或治疗和/或预防和/或诊断癌症；
进一步地，所述癌症可为4-1BB表达失调的癌症。
(B12)制备用于治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病；
进一步地，所述自身免疫疾病可为4-1BB表达失调的自身免疫疾病。
(B13)制备用于治疗和/或预防和/或诊断炎症疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断炎症疾病；
进一步地，所述炎症疾病可为4-1BB表达失调的炎症疾病。
(B14)制备用于治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病。
进一步地，所述感染性疾病可为4-1BB表达失调的感染性疾病。
实验证明，本发明所提供的单链抗体的融合抗体能结合人和猴4-1BB。本发明抗体在用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病的患者的血液或组织中的4-1BB或作为免疫增强物或者免疫调节剂治疗疾病诸如癌症、自身免疫疾病、炎症疾病、和感染疾病等中将具有重要潜在应用价值。
附图说明
图1为杂交瘤抗体SDS-PAGE。
图2为抗体结构图。
图3为杂交瘤分泌抗体识别人4-1BB。
图4为杂交瘤分泌抗体识别猴4-1BB。
图5为抗原结合片段识别人4-1BB。
图6为抗原结合片段识别猴4-1BB。
图7为FACS比较各抗原结合片段与人4-1BB亲和力。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，阳性对照抗体为Pfizer公司的Utomilumab(PF-05082566，专利号：US8337850B2)和Bristol Myers Squibb公司的Urelumab(BMS-663513，专利号：US7288638B2)，这两种抗体均为抗人4-1BB抗体。阴性对照抗体为人IgG(南京金斯瑞产品)。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的pCDNA3.4载体(Invitrogen，Cat:A14697)。
常规器材和试剂如下：
1、96孔酶标板(Nunc公司)；
2、铺板缓冲液：pH为7.0的磷酸盐缓冲液；
3、洗涤液：仅含0.05％体积百分含量Tween 20的pH为7.0的磷酸盐缓冲液；
4、封闭液：仅含10g/L BSA的洗涤液。
5、辣根过氧化物酶标记亲和素；
6、显色底物：四甲基联苯胺；
7、终止液：1M硫酸。
其中，所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mM，所述氯化钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mM，所述磷酸二氢钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mM，所述磷酸氢二钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mM。
实施例1、杂交瘤抗体的制备
1.1小鼠免疫
选用4～6周龄的Balb/c小鼠3只和C57b1/6小鼠3只，以人4-1BB胞外段(SEQ IDNo.3的第24-186位)为抗原免疫小鼠，每2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，用间接ELISA检测抗体产生情况，选择合适的免疫的小鼠，摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，，按常规方法进行细胞融合制备抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株。
1.2杂交瘤筛选
用ELISA筛选抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞。用10μg/ml人4-1BB(SEQ IDNo.5)包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液，于37℃孵育1小时，再用PBST洗板3次，加入4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(ThermoFisher公司)于37℃孵育45min，PBST洗板3次后，用四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)底物显色后，于450nm波长测定OD值。
用ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法。将培养板置于37℃、5％的CO2孵箱中培养，约5天后在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性并且长势好的单克隆细胞株进行扩大培养，即得到抗人4-1BB单克隆抗体杂交瘤细胞株，及时冻存细胞株。
1.3杂交瘤抗体鉴定
将筛选所得阳性并且长势好的抗人4-1BB抗体杂交瘤细胞株逐级扩大培养，离心(10000rpm离心10分钟)，取上清，将所得上清用Protein G亲和层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡Protein G柱(GE公司)，然后培养上清过柱，先采用A液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM磷酸钠、500mM NaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，再采用B液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM醋酸钠、150mM NaCl，pH3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30KDa浓缩离心管浓缩获得抗体。
免疫得到15个杂交瘤抗体细胞株，通过筛选，最终得到6个候选杂交瘤母细胞株，通过亚型鉴定及初步筛选后，细胞株详情及分别对应抗体如表1所示。
表1抗人4-1BB杂交瘤细胞株
Figure BDA0002271329130000061
Figure BDA0002271329130000071
淘汰13F8H8和37G11E2B3两个候选，收集细胞上清，分别纯化、浓缩，对样品进行SDS-PAGE电泳，电泳检测结果如图1所示。
对得到的抗人4-1BB抗体进行测序，结果显示，所得抗人4-1BB抗体为分子量大小为150Kb，包含重链和轻链，为典型的完整抗体。抗体结构如图2所示。
1.4杂交瘤分泌抗体识别人4-1BB
通过ELISA评估4种杂交瘤分泌抗体识别人4-1BB的亲和力。96孔板(96孔酶标板，Nunc公司)用人4-1BB(SEQ ID No.3)包被，浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将抗体用样品稀释液(PBS-T加入1％牛血清白蛋白)稀释到4000ng/ml，再用7个Ep管4倍稀释成梯度溶液，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。用洗涤液洗板三次，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠(ThermoFisher公司)100μl，振荡0.5小时。洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl。避光显色，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEK ELX-800酶标仪在450nm下测OD值。
通过上述步骤，杂交瘤分泌抗体均能识别并结合人4-1BB，ELISA结果OD450值如表2所示，分析图如图3所示。
表2杂交瘤分泌抗体识别人4-1BB
Figure BDA0002271329130000072
1.5杂交瘤分泌抗体识别猴4-1BB
采用ELISA方法评估杂交瘤分泌抗体识别猴4-1BB的亲和力。具体将猴4-1BB(Cy4-1BB)(SEQ ID No.4)抗原用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到1μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。将杂交瘤分泌抗体与阳性对照抗体Utomilumab用样品稀释液稀释到1000ng/ml，再用7个Ep管10倍稀释成梯度溶液，每个浓度设置两个复孔，每孔100μl加入板内，振荡1小时。再次洗板后，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠(ThermoFisher公司)100μl，振荡0.5小时。清洗之后，加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl显色。
通过上述步骤，实验证明杂交瘤分泌抗体均能识别Cy4-1BB分子，ELISA结果OD450值如表3所示，分析图如图4所示。
表3杂交瘤分泌抗体识别猴4-1BB
Figure BDA0002271329130000081
实施例2、抗体人源化及scFv-Fc抗原结合片段性质鉴定
选择得自如本发明所述淘选的分泌型抗体37G10F4。分析抗体基因序列，然后通过抗体Fab的同源建模与优化，表面扫描确定人源化突变位点，虚拟突变与分子动力学模拟，确定关键氨基酸等一系列分析设计合理的人源化抗体。通过人源化改造，得到12个候选scFv-Fc(人IgG4)形式的抗原结合片段(表4)，用于如本实施例进一步鉴定。
表4中的12个候选scFv-Fc(人IgG4)形式的抗原结合片段，其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的互补决定区(CDR)均相同，不同之处仅在于VH和VL中的框架区(FR)有氨基酸突变；Fc区也相同。重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNo.1自N端起第31-35位、第50-64位、第98-106位所示；轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第156-166位、第182-188位、第221-229位所示。
其中，scFvB60103的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第1-117位为重链可变区，第133-239位为轻链可变区，第240-472位为Fc。
对应于基因水平，scFvB60103的编码基因序列如SEQ ID No.2所示，第1-351位为重链可变区的编码基因(第91-105、148-192、292-318位分别编码三个HCDR)，第397-717位为轻链可变区的编码基因(第466-498、544-564、661-687位分别编码三个LCDR)，第718-1416位为Fc的编码基因。
表达和纯化表4中的12个候选scFv-Fc分子。以scFvB60103为例说明。人工合成scFvB60103抗体的编码基因(SEQ ID No.2)，然后将其插入pCDNA3.4载体，通过瞬转表达。瞬转操作具体使用Expi293表达系统(Thermo Fisher)产品，根据产品说明书操作流程。在OptiMEM中分别加入Expi Fectamine转染试剂、DNA质粒得到溶液A和B，然后将溶液A和溶液B混匀得到溶液C。将溶液C加入Expi293细胞(Thermo Fisher)中，培养Expi293细胞5天后。离心(10000rpm离心10分钟)，取上清，将所得上清用Protein G亲和层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡Protein G柱(GE公司)，然后培养上清过柱，先采用A液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM磷酸钠、500mM NaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，再采用B液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM醋酸钠、150mM NaCl，pH3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30KDa浓缩离心管浓缩获得scFvB60103目的分子。
(1)ELISA鉴定
ELISA鉴定scFv分子与人和猴4-1BB分子的亲和力(具体方法参见实施例1相关步骤)。具体如表4所示，结果显示，12种scFv-Fc分子均能识别人和猴4-1BB，其中scFvB60103识别能力最优。ELISA结果如图5和图6所示。
表4 scFv识别人和猴4-1BB
Figure BDA0002271329130000091
Figure BDA0002271329130000101
(2)FACS检测
所用试剂包括：
FACS缓冲液，该缓冲液为向PBS中添加BSA和叠氮化钠得到的溶液，该缓冲液中BSA的质量百分比浓度为2％，叠氮化钠的质量百分比浓度为0.02％；羊抗人FITC二抗(Sigma公司，避光保存)。
使用CHO-K1-hu4-1BB，用FACS方法检测ELISA检测结果中与人4-1BB结合活性较优的scFv分子与人4-1BB分子亲和力的差异。实验所用细胞为合肥瀚科迈博公司构建的细胞膜表面高表达人4-1BB的CHO-K1细胞(CHO-K1-hu4-1BB)和无4-1BB表达的野生型CHO-K1(中科院上海细胞库)。
人工合成人4-1BB基因序列(SEQ ID No.5)，然后按照本领域通用方法插入pCDNA3.4载体，然后用Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen公司)导入到野生型CHO-K1细胞。再加入G418(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)加压筛选，最终得到细胞膜高表达人4-1BB的CHO-K1细胞(CHO-K1-hu4-1BB，备用。
使用T75瓶培养待测细胞至80％满度，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞(每瓶细胞数在106个左右)，用约1ml缓冲液重悬清洗、离心并重悬细胞，得到细胞悬液，细胞浓度为1×107个细胞/ml。准备各个稀释梯度的各供试抗体(见表5)的稀释液25μl，向加有不同浓度抗体的各离心管中加入25μl的细胞悬液混匀，最终抗体浓度如表5中所示，将加入抗体浓度为0μg/ml的抗体稀释液的离心管作为空白对照。孵育30min后，用1ml FACS缓冲液清洗两次后，加入羊抗人FITC二抗，吹打重悬，避光孵育30min。再次用1ml FACS缓冲液清洗两次，然后每管加入500μl FACS缓冲液重悬，置于冰上避光，上机检测。将抗体Utomilumab(辉瑞制药有限公司)作为阳性对照。
通过上述步骤，比较不同scFv分子与人4-1BB的结合活性高低，如表5和图7所示，结果显示scFvB60103对应的EC50值最低，即其与人4-1BB亲和力最高，可以作为最优分子。
表5、FACS检测scFv与人4-1BB亲和力检测结果
Figure BDA0002271329130000102
Figure BDA0002271329130000111
序列表
<110> 合肥瀚科迈博生物技术有限公司
<120> 抗4-1BB的单链抗体及其应用
<130> GNCLN192310
<141> 2019-11-13
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Thr Gly Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly
145 150 155 160
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
210 215 220
Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp
225 230 235 240
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
340 345 350
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
465 470
<210> 2
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
caggtgcagc tgcaggagtc tggcccaggc ctggtgaagc cctctgagac cctgagcatc 60
acctgtacag tgagcggcag ctccctgaca tcctacggag tgcactgggt gcggcagcca 120
cctggcaagg gcctggaggg actgggcgtg atctggccag gaggcagcac caactataat 180
tccgccctga tgagccggct gacaatctct aaggacaaca gcaagtccca ggtgagcctg 240
aagatgtcta gcctgaccgc cgccgacaca gccatgtact attgcgcccg ggtgaccggc 300
acatggtact tcgacgtgtg gggccagggc accacagtga ccgtgtcctc tggcggcggc 360
ggctccggcg gcggcggatc cggaggagga ggcagcgaca tccagatgac ccagtcccca 420
agctccctgt ccgcctctct gggcgatagg gtgacaatca gctgctccgc ctctcagggc 480
atctccaact acctgaattg gtatcagcag aagccagacg gcaccgtgaa gctgctgatc 540
tactatacca gcacactgca ctccggagtg ccaagccggt tcagcggctc cggctctggc 600
accgacttta ccctgacaat ctctagcctg cagcccgagg atgtggccac atactattgt 660
cagcagtact ctaagctgcc ttggaccttc ggcggcggca caaagctgga gatcaaggat 720
aagcgggtgg agagcaagta tgggccccca tgcccaccat gcccagcacc tgagttcctt 780
gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 900
aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1140
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca gactaaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaa 1416
<210> 3
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 4
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg
195 200 205
Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
210 215 220
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
225 230 235 240
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250
<210> 5
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atgggcaact cctgctacaa catcgtggcc accctgctgc tggtgctgaa cttcgagcgc 60
acccgctccc tgcaggaccc atgctccaat tgtcccgccg gcaccttctg cgataacaat 120
aggaaccaga tctgctctcc ctgtccccct aatagcttta gctccgccgg aggacagagg 180
acatgcgaca tctgtagaca gtgcaagggc gtgttcagga cccgcaagga gtgttctagc 240
acaagcaacg ccgagtgcga ctgtacccct ggatttcact gcctgggagc aggatgttcc 300
atgtgcgagc aggattgtaa gcagggccag gagctgacca agaagggctg caaggactgc 360
tgtttcggca ccttcaacga tcagaagagg ggcatctgtc gcccttggac caactgcagc 420
ctggatggca agtccgtgct ggtgaatggc acaaaggaga gggacgtggt gtgcggacct 480
tctccagccg atctgagccc aggcgcctcc tctgtgaccc caccagcacc agcaagagag 540
cctggacact ccccacagat catctccttc tttctggccc tgacctctac agccctgctg 600
ttcctgctgt tctttctgac cctgaggttt tccgtggtga agaggggccg caagaagctg 660
ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga cccgtgcaga ccacacagga ggaggatggc 720
tgctcttgta ggtttccaga ggaggaggag ggaggatgtg agctg 765

Claims (10)

1.抗4-1BB的单链抗体，由重链可变区和轻链可变区连接而成；
所述重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第31-35位、第50-64位、第98-106位所示；和/或
所述轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1自N端起第156-166位、第182-188位、第221-229位所示。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列为SEQID No.1自N端起第1-117位，或者与SEQ ID No.1自N端起第1-117位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；和/或
所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1自N端起第133-239位，或者与SEQ IDNo.1自N端起第133-239位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
3.根据权利要求1或2所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体的氨基酸全序列如SEQ ID No.1的第1-239位所示，或者与SEQ ID No.1自N端起第1-239位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
4.权利要求1-3中任一所述单链抗体与载体蛋白形成的融合抗体。
5.根据权利要求4所述的融合抗体，其特征在于：所述载体蛋白为Fc；
进一步地，所述融合抗体为IgG，如IgG4；
更进一步地，所述Fc的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第240-472位所示，或者与SEQ IDNo.1自N端起第240-472位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；
更加具体地，所述融合抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
6.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1-3中任一所述的单链抗体或权利要求4或5所述融合抗体。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：在所述核酸分子中，编码所述重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2自5’端起第91-105位、第148-192位、第292-318位所示；和/或
在所述核酸分子中，编码所述轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LHCDR3的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2自5’端起第466-498位、第544-564位、第661-687位所示；
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.2自5’端起第1-351位或者与SEQ ID No.2自5’端起第1-351位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；和/或
进一步地，在所述核酸分子中，编码所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.2自5’端起第397-717位或者与SEQ ID No.2自5’端起第397-717位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；
更进一步地，编码所述单链抗体的核苷酸序列为SEQ ID No.2自5’端起第1-717位或者与SEQ ID No2自5’端起第1-717位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性；
更加具体地，编码所述融合抗体的核苷酸序列为SEQ ID No.2或者与SEQ ID No2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
8.含有权利要求6或7所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞。
9.药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含：
(A1)权利要求1-3中任一所述的单链抗体或权利要求4或5所述的融合抗体；
(A2)药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求1-9中任一所述的单链抗体或融合抗体或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细胞或药物组合物在如下任一中的应用：
(B1)制备用于检测4-1BB的产品，或检测4-1BB；
(B2)制备用于阻断4-1BB/4-1BBL信号通路的产品，或阻断4-1BB/4-1BBL信号通路；
(B3)制备用于刺激T细胞活化的产品，或刺激T细胞活化；
(B4)制备用于促进T细胞分泌IFN-γ的产品，或促进T细胞分泌IFN-γ；
(B5)制备用于抑制结肠癌细胞生长的产品，或抑制结肠癌细胞生长；
(B6)制备用于抑制结肠癌肿瘤生长的产品，或抑制结肠癌肿瘤生长；
(B7)制备用于治疗和/或预防结肠癌的产品，或治疗和/或预防结肠癌；
(B8)作为免疫增强物，或制备免疫增强物；
(B9)作为免疫调节物，或制备免疫调节物；
(B10)制备用于治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断具有4-1BB表达失调特征疾病；
(B11)制备用于治疗和/或预防和/或诊断癌症的产品，或治疗和/或预防和/或诊断癌症；
(B12)制备用于治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断自身免疫疾病；
(B13)制备用于治疗和/或预防和/或诊断炎症疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断炎症疾病；
(B14)制备用于治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病的产品，或治疗和/或预防和/或诊断感染性疾病。
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