CN112779216A

CN112779216A - 体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法及其药物组合物

Info

Publication number: CN112779216A
Application number: CN201911086773.5A
Authority: CN
Inventors: 张顺浪; 林杰良; 杨智雅
Original assignee: Medigen Biotechnology Corp
Current assignee: Medigen Biotechnology Corp
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN112779216B

Abstract

本发明涉及一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，该方法以含有纳豆激酶的培养基进行自然杀伤细胞培养，专属针对自然杀伤细胞提供优化的培养环境，且在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，有效率地提升细胞扩增倍数，并产生高纯度及对癌细胞具有高度毒杀活性的自然杀伤细胞。本发明还涉及一种用于抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，其包含自然杀伤细胞。

Description

体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法及其药物组合物

技术领域

本发明涉及一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法。本发明还涉及一种包含自然杀伤细胞的药物组合物。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer Cells；NK细胞)是一群具备CD3^-CD56⁺表现型的细胞，通常存在于淋巴结、各器官及外周血液中。NK细胞在人体外周血液淋巴细胞中约占5～20％，因此外周血液是NK细胞方便的来源之一。NK细胞在1970年代被发现具有毒杀癌细胞之特性，且事先不需要经过教育或致敏(Priming)的过程。之后研究发现，NK细胞除了可以毒杀癌细胞之外，还可以杀死病毒感染的细胞、癌化的细胞及老化应激的细胞(StressedCells)。

过去的研究已显示NK细胞具有治疗肿瘤的潜力。自体NK细胞治疗癌症之做法，是将病人外周血液之NK细胞分离后，以体外细胞扩增和活化的技术培养约14天，再输注入该病人体内以达到治疗癌症之效果。过去实施体外细胞扩增和活化方法时，多数将NK细胞与癌饲养细胞(Cancer feeder cell)共同培养，以达到大幅提高NK细胞数量的目的。但使用癌饲养细胞之扩增方法仍无法解决安全性的问题。在将扩增后自然杀伤细胞输注病人体内前，难以确定癌饲养细胞是否已完全去除，因此产生安全性的疑虑。再者，即使体外培养后的NK细胞数量有大幅提升，若该NK细胞毒杀癌细胞的活性不佳，后续应用于自体细胞疗法之效果仍非常有限。据此，有必要开发一种不使用癌饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，且该方法能有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性的NK细胞。

纳豆激酶(nattokinase)是纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)所分泌的胞外酶，已知具有溶解血栓的活性及分解纤维蛋白之功能，可应用于心血管疾病之预防及治疗。纳豆激酶目前以口服给予，以营养补充品的形式使用。尽管已有研究探讨个体食用纳豆或纳豆萃取物，有助于调节个体的免疫力(Takeda et al.,Traditional&KampoMedicine,Vol.3Iss.2 100-106,2016)，但其作用的有效成分及相关机制目前仍不清楚。此外，纳豆激酶应用于体外免疫细胞培养方法与效用，目前未有相关研究。

发明内容

本发明一方面提供一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，其包含以下步骤：自血液样品分离出外周血单核细胞；自该外周血单核细胞分离出自然杀伤细胞；将该自然杀伤细胞悬浮于含有纳豆激酶的培养基并置于细胞培养盘中培养；以及每隔二至三天更换该含有纳豆激酶的培养基，培养12至16天。

本发明另一方面，提供一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，该方法所使用的培养基含有浓度为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。

本发明另一方面，提供一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，该方法所使用的培养基还包含辅酶Q10，其中该辅酶Q10在该培养基中的浓度为100nM至1000nM。

在本发明一些具体实施方式中，以体外扩增和活化自然杀伤细胞方法所产生的细胞中21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

在本发明一些具体实施方式中，以体外扩增和活化自然杀伤细胞方法所产生的细胞中41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。

在本发明一些具体实施方式中，该体外扩增和活化自然杀伤细胞方法不包含将自然杀伤细胞与癌饲养细胞共同培养的步骤。

在本发明一些具体实施方式中，该体外扩增和活化自然杀伤细胞方法可达到1135倍至1750倍的细胞扩增倍数。

本发明另一方面涉及一种细胞，其以前述的方法制得。

在本发明一些具体实施方式中，以前述方式制得的细胞中，包含92％至97％的自然杀伤细胞。

在本发明一些具体实施方式中，以前述方式制得的细胞，当该细胞与K562细胞在活体外以5:1的比率共同培养时，所述细胞具有63％至81％的癌细胞毒杀活性。

本发明另一方面涉及一种用于抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，其包含以上述方法制得的自然杀伤细胞及药学上可接受的赋形剂。

附图说明

图1是本发明实施例1的NK细胞体外扩增和活化方法流程图；

图2是本发明所产生的细胞扩增倍数分析；

图3是本发明所产生的NK细胞毒杀癌细胞的能力测试结果，其中图3A以K562作为被NK细胞毒杀的癌细胞株，其中图3B以HepG2、HT-29以及A549作为被NK细胞毒杀的癌细胞株；

图4是本发明所产生的NK细胞抑制癌细胞生长的小鼠实验结果。

具体实施方式

有鉴于上述待解决之问题，本发明提出一种不使用癌饲养细胞之NK细胞体外扩增方法，该方法将纳豆激酶应用于NK细胞体外扩增，提供NK细胞良好的培养环境，有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性之NK细胞。

定义

用于本说明书，“自然杀伤细胞”(Natural killer cell，简称NK细胞)指细胞表面抗原呈现CD3^-CD56⁺的细胞。

用于本说明书，“癌饲养细胞”(cancer feeder cell)指体外免疫细胞培养中，加入活的癌细胞共同培养以达到提升免疫细胞扩增的效果，加入的其他活的癌细胞称之为癌饲养细胞。

用于本说明书，“细胞扩增倍数”以下列方式判断：“经体外培养14天后的细胞数量”除以“自外周血单核细胞分离出之起始NK细胞数量”。

用于本说明书，“毒杀癌细胞的活性”是以K562细胞株或其他癌细胞株为靶标细胞(target cell)，并以NK细胞为效应细胞(effector cell)，在效应细胞与靶标细胞的比例(E:T ratio)为5:1的情况下，将靶标细胞死亡的比例做为毒杀效率。

材料与方法

本发明所述外周血样品，依据伦理委员会通过的计划，自受试者手臂采集全血，置于无菌采血管，于室温存放待后续处理。

本发明所使用的基础培养基可选用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM及RPM1-1640等市售培养基。

本发明所述培养基中，有时含有适当的蛋白质、细胞激素、抗体、血清、化合物等成分。所述细胞激素有时为白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)或白介素-21(IL-21)。

自PBMC分离NK细胞的方法

包括但不限于使用Dynabeads(Invitrogen公司)、CliniMACS磁珠(MiltenyiBiotec公司)或其他市售的免疫磁珠，将表达细胞表面抗原CD3和/或CD34的细胞分离除去，达到纯化NK细胞之效果。

以流式细胞仪方式分析细胞表面抗原

以2x10⁵细胞/50μl将扩增和活化后的细胞置于96孔盘，并加入3μl荧光标记的抗体于4℃反应15分钟，接着以磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphate buffer saline；简称PBS)清洗3次后，加入400μl PBS悬浮细胞，再以流式细胞仪(Beckman公司)分析细胞表面之荧光标记。上述荧光标记之抗体包含anti-CD3抗体(Invitrogen公司)、anti-CD56抗体(Invitrogen公司)、anti-TRAIL抗体(BD Bioscience公司)以及anti-NKG2A抗体(R&Dsystem公司)。

NK细胞毒杀癌细胞能力测试方式

将扩增和活化后的细胞做为效应细胞(effector cell)，并以K562细胞株(慢性骨髓性血癌细胞株)、HepG2细胞株(肝癌细胞株)、HT-29细胞株(大肠癌细胞株)或A549细胞株(肺癌细胞株)做为毒杀靶标细胞(target cell)。将效应细胞及靶标细胞以0.25:1、0.5:1、1:1或5:1混合培养后，反应4小时，再以7-AAD进行细胞染色，由此测定凋亡的细胞数量。

体外扩增和活化NK细胞的方法

如图1所示，步骤11是自血液样品分离外周血单核细胞(PBMC)。将未经冷藏或冷冻的外周血样品置于50ml离心管内并离心。离心结束后，去除上层的血浆，加入适量的PBS稀释后，再加入3ml的Ficoll-paque Plus(GE Healthcare公司)。于室温离心20分钟后，吸取PBMC层的细胞，并以PBS清洗3次，所得的细胞即为PBMC。

接着，自PBMC中纯化NK细胞(如图一步骤12)：在每1x10⁷ PBMC的条件下，以80μl含有0.5％BSA、2mM EDTA的PBS悬浮PBMC。在每1x10⁷细胞的条件下，添加30μl CD3磁珠(MACSCD3 MicroBeads human,Miltenyi Biotec公司)到所述PBMC悬浮液中，将所述包含磁珠的PBMC悬浮液均匀搅拌后，置于4℃下15分钟。之后，所述PBMC悬浮液以300xg离心10分钟并去除上清液后，以500μl含有0.5％BSA、2mM EDTA的PBS悬浮PBMC，再将所述PBMC悬浮液通过LDColumn层析管(Miltenyi Biotec公司)，通过磁力将细胞表面表达CD3抗原的细胞从所述悬浮液中分离，以2x 1ml含有0.5％BSA、2mM EDTA的PBS清洗层析管，收集流出的细胞，即取得纯化后的NK细胞。

接着，进行NK细胞扩增和活化：将NK细胞以培养基均匀的配制成浓度介于2～10x10⁵/ml的细胞悬浮液后，转移至培养盘，在37℃及5％CO₂的环境下进行NK细胞扩增(如图1步骤13)。所述NK细胞培养基是以AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific公司)为基础培养基，并添加浓度范围为200～1000IU/ml的白介素-2(IL-2)(Thermo FisherScientific公司)、浓度范围为10～50ng/ml的白介素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)、浓度范围为100～200ng/mL的白介素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)，以及浓度范围为5～20FU/ml的纳豆激酶(NSK-SD；Japan Bio Science Laboratory公司)。所述培养基，可另添加浓度范围为100～1000nM之辅酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。在本发明较佳实施例中，于所述培养基另添加100nM之辅酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。

此后，每隔二至三天观察细胞的生长状况，根据细胞生长状况更换新鲜的NK细胞培养基至14±2天为止(如图1步骤14)。所述每隔二至三天更换的NK细胞培养基，是以前一段所述方式配制的。最后，将培养盘中的细胞与培养基混合液移至离心管，以离心方式收集所述混合液中的细胞，再以PBS清洗，重复此步骤三次后，以PBS将细胞均匀的打散，如此即获得扩增和活化后的NK细胞。

经前述方法所获得之扩增和活化后的NK细胞，可混合于适当的赋形剂中保存，所述赋形剂可为磷酸缓冲液，最后制备成药物组合物。

实施例

实施例1、NK细胞扩增倍数测试

为测试并优化NK细胞扩增和活化方法，本实施例探讨所述NK细胞培养基的添加物及其添加量，试验组分别使用培养基A、培养基B或培养基C，对照组则使用培养基D。所述对照组与实验组都以同一受试者的外周血分离出之PBMC进行测试。所述培养基A、培养基B、培养基C及培养基D，都以AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific公司)为基础培养基，并添加浓度范围介于200～1000IU/ml的白介素-2(IL-2)(Thermo Fisher Scientific公司)、浓度范围介于10～50ng/ml的白介素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)，以及浓度范围介于100～200ng/mL的白介素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)。为测试添加纳豆激酶对于NK细胞体外扩增和活化的效用，所述实验组(培养基A、培养基B及培养基C)添加有20FU/ml(FU系指纤维蛋白分解单位，fibrin degradation unit)或5FU/ml的纳豆激酶。为测试同时添加纳豆激酶与辅酶Q10对于NK细胞体外扩增和活化的效用，在所述培养基A同时加入20FU/ml的纳豆激酶与100nM的辅酶Q10。培养基A、培养基B、培养基C及培养基D的成份汇总如下表1。

表1、培养基成份

图2的实验结果显示，使用含有纳豆激酶的培养基A、培养基B或培养基C培养14天后，NK细胞扩增倍数都达到1000倍以上，具体而言，扩增倍数为1135至1750倍。相较与此，使用无添加纳豆激酶的培养基D培养14天后，NK细胞扩增倍数只有498倍。由此可知添加5～20FU/ml的纳豆激酶，能有效提升NK细胞的扩增倍数。比较培养基A及培养基B的实验结果，显示在含有纳豆激酶的培养基中再添加辅酶Q10，NK细胞扩增倍数自1326倍提升至1750倍。

实施例3、NK细胞对癌细胞的毒杀能力测试

为进一步探讨以本发明扩增后的NK细胞活性，本实施例测试以不同培养基扩增后NK细胞对癌细胞的毒杀能力。首先，试验组分别使用培养基A、培养基B或培养基C，对照组则使用培养基D，所述培养基成份如表1所示。所述对照组与实验组都以同一受试者的外周血分离出的PBMC进行扩增和活化。实验结果显示(图3A)，使用含有纳豆激酶的培养基A、培养基B或培养基C培养14天后，当E:T比例为5:1且以K562作为被NK细胞毒杀的癌细胞株时，毒杀效率均达到60％以上，具体而言，毒杀效率为63.1％～81.2％。相较与此，使用无添加纳豆激酶的培养基D培养14天后，毒杀效率只有39.8％。由此可知培养基中添加5～20FU/ml的纳豆激酶，不仅能提升NK细胞的扩增倍数，扩增后的NK细胞对于癌细胞也具有较高之毒杀活性。比较培养基A及培养基B的实验结果，显示在含有纳豆激酶的培养基中再添加辅酶Q10，NK细胞对于癌细胞的毒杀能力还可再提高，自68.3％增加至81.2％。

综上，以优选的实施例培养基A扩增和活化后的NK细胞，测试该NK细胞对不同癌细胞株的毒杀能力。实验结果显示(图3B)，使用含有纳豆激酶及辅酶Q10培养基扩增和活化后的NK细胞(即培养基A组)，均能有效毒杀HepG2细胞株(肝癌细胞株)、HT-29细胞株(大肠癌细胞株)及A549细胞株(肺癌细胞株)，且相较于使用不含纳豆激酶的培养基(即培养基D组)，对于癌细胞明显有较高的毒杀能力。

实施例4、细胞表面抗原分析

为测试本发明所产生的细胞中，NK细胞的占比(即纯度)，以及该NK细胞之活化状态，因此使用anti-CD3、anti-CD56、anti-TRAIL以及anti-NKG2A抗体标示细胞表面抗原，再以流式细胞仪分析，结果如表2所示。活化状态的NK细胞表面表现TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand)分子，具有较佳的癌细胞毒杀活性。NKG2A系位于NK细胞表面的抑制性受体，若NK细胞表面表达NKG2A，显示该NK细胞的活性属于被抑制的状态。换言之，当NK细胞表面不表达NKG2A抗原，该NK细胞具有更好的癌细胞毒杀活性。

表2、细胞表面抗原分析结果

表2显示，使用培养基A、培养基B或培养基C所产生的细胞中，92％至97％是NK细胞，显示本发明可产生极高纯度之NK细胞。再者，使用培养基A、培养基B或培养基C所产生的细胞中，41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞，显示多数细胞为高度活化状态的NK细胞；相较于此，使用不含纳豆激酶的培养基D所产生的细胞中，仅37％至54％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。另外，使用培养基A、培养基B或培养基C所产生的细胞中，仅21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞，显示多数细胞具有较佳的癌细胞毒杀活性；相较于此，使用不含纳豆激酶的培养基D所产生的细胞中，高达41％至53％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

实施例5、NK细胞抑制肿瘤细胞增生的小鼠实验

所有动物实验依据适当的动物保护，并使用实验动物保护及使用委员会或小组(IACUC)所核定的合乎道德的实验步骤与准则进行。为测试以本发明扩增后的NK细胞抑制癌细胞增生的能力，将雌性NOD/SCID小鼠(平均体重为20公克)分配至不同组别，一组对照组(n＝5)、一组实验组(n＝5)。将100μl含有1x10⁷的K562细胞(肿瘤细胞)以皮下注射方式给予对照组及实验组小鼠，称为实验第0天。在实验第0天、第4天、第8天、第12天及第14天，将100μl含有1x10⁷以优选的实施例培养基A产生的细胞，静脉注射方式给予实验组；并于同样的时间点，将相同体积100μl的生理食盐水以静脉注射方式给予对照组。持续记录小鼠的活动力、体重、毛色及皮下肿瘤的生长情况至第18天。实验结果显示，在第18天，实验组小鼠体内的肿瘤体积为97.6mm³，明显小于对照组的肿瘤体积364.8mm³。据此，本实施例以含有纳豆激酶及辅酶Q10培养基扩增和活化后NK细胞，在活体内能有效抑制肿瘤细胞的生长，表示扩增后NK细胞的活性极佳，具有临床治疗的应用性。

Claims

1.一种体外扩增和活化自然杀伤细胞的方法，其包含以下步骤：

(a)自血液样品分离出外周血单核细胞；

(b)自所述外周血单核细胞分离出自然杀伤细胞；

(c)将所述自然杀伤细胞悬浮于含有纳豆激酶的培养基并置于细胞培养盘中培养；以及

(d)每隔二至三天更换所述含有纳豆激酶的培养基，培养12至16天；

其中所述纳豆激酶在所述培养基中的浓度为5FU/ml至20FU/ml。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含辅酶Q10；其中所述辅酶Q10在所述培养基中的浓度为100nM至1000nM。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述培养基还包含基础培养基以及细胞激素。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法产生的细胞中21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法产生的细胞中41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法不包含将自然杀伤细胞与癌饲养细胞共同培养的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述方法可达到1135倍至1750倍的细胞扩增倍数。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述自外周血单核细胞分离出自然杀伤细胞的步骤是以免疫磁珠的方式分离自然杀伤细胞。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法制得的细胞。

10.如权利要求9所述的细胞，其中所述细胞中21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

11.如权利要求9所述的细胞，其中所述细胞中41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。

12.如权利要求9所述的细胞，其中包含92％至97％的自然杀伤细胞。

13.如权利要求9所述的细胞，当所述细胞与K562细胞在体外以5:1的比率共同培养时，所述细胞具有63％至81％的癌细胞毒杀活性。

14.一种用于抑制肿瘤细胞增殖的药物组合物，其包含权利要求9所述的自然杀伤细胞及药学上可接受的赋形剂。