CN112779169A - 一种高产植酸酶的突变菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物工程改造技术领域，提供了一种高产植酸酶的里氏木霉突变菌株及其应用。所述突变菌株是通过紫外诱变筛选获得的，保藏编号为CCTCC NO：M2019893，能高效表达耐温植酸酶，有利于促进植酸酶在饲料领域中的广泛应用。

Description

一种高产植酸酶的突变菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程改造技术领域，具体涉及一种高产植酸酶的突变菌株及其应用。

背景技术

植酸（phytic acid），即肌醇六磷酸（myo-inositol hexakisphosphate），简称PA。植酸广泛存在于动植物的各种组织中，其中磷的含量非常高。植物总磷含量的60%-90%是在植酸盐复合物中以植酸磷的形式存在的。动物随食物摄入体内的无机磷，80%会随粪便排出，这是因为单胃动物对植酸盐消化利用率较低，而食物中所含的无机磷大多是以植酸盐的形式存在，这对全球环境造成了非常严重的磷污染。众所周知，植酸对金属离子的螯合能力非常强。在中性或碱性条件下，它可以螯合某些矿物质如铁、锌、钙、镁、锰、铜、钾等从而形成难溶解的络合物，几乎不存在游离态，与EDTA的性质相近，被称为抗营养因子，对多种矿物质的吸收产生重要的影响。同时，在低pH值的条件下，植酸可以结合多种蛋白质，从而抑制许多消化酶（如胃蛋白酶等）的活性；在中性溶液中，植酸往往通过二价、三价的微量元素与一些氨基酸结合，从而降低该微量元素在生物体内的利用度，同时降低某些营养因子（如蛋白质、淀粉、脂类等）的消化与吸收。

植酸酶（myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases，phytase），属于磷酸单脂水解酶，是将植酸（或植酸盐）催化水解成无机磷酸（或无机磷酸盐）与肌醇的一类酶的总称，是酸性磷酸酶的一种，目前正作为一种新型的绿色食品添加剂使用。植酸酶可消除植酸的抗营养作用，增加钙、镁、锰、锌、铁和铜等元素的生物利用率，对氨基酸、碳水化合物及蛋白质的消化吸收具有促进作用；同时可减少磷的排放对环境的污染，减缓水生环境的富营养化。

多数微生物来源的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶，是一种3-磷酸酶，分子量约为45-60 kD，为糖基化蛋白的一种。微生物来源的植酸酶稳定性和作用范围大都比动物和植物来源的好，并且容易实现大规模的工业化生产。因此，微生物来源的植酸酶是近几年植酸酶研究开发的重点。植酸酶的微生物菌种来源主要有细菌、酵母菌以及丝状真菌等。其中，丝状真菌是发酵法产植酸酶的主要菌株，产植酸酶的细菌则主要有乳酸杆菌属（Lactobacillus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。因来源的微生物不同，所产植酸酶的最适作用温度和pH值也有较大的差异。一般来讲，微生物来源的植酸酶最适pH值的范围较植物来源的植酸酶要宽，真菌来源的植酸酶最适p H值范围在2.5-7.0，来源于细菌的植酸酶最适pH范围一般为偏碱性或中性。

微生物来源的植酸酶由于其本身的诸多优点，如它不受季节的影响，可以人为地进行生产控制；微生物发酵的生产周期相对较短；生产的植酸酶最适pH值范围较宽等，工业化开发的价值非常大。本发明即提供了一株植酸酶生产菌株，可显著提高植酸酶产量，在工业生产中具有巨大的商业价值。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产植酸酶的里氏木霉菌株及其应用。申请人首先构建得到重组表达植酸酶的里氏木霉重组菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株植酸酶产量得到显著提高的突变菌株，有利于植酸酶在饲料领域中的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有表达植酸酶基因的重组载体。

本发明一方面提供了一种突变菌株里氏木霉UEM-5（Trichoderma reesei UEM-5），已于2019年11月4日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2019893。

本发明还提供了所述里氏木霉突变株在生产植酸酶中的应用。

本发明所述突变菌株里氏木霉UEM-5摇瓶发酵上清液中植酸酶酶活达1365U/ml，比出发菌提高了64.5%；20L罐发酵上清液中植酸酶酶活高达13352 U/ml，比出发菌株提高了73.4％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株发酵产植酸酶酶活水平高，耐热性强，90℃处理3min后，酶活残留率高达84%，可广泛应用于饲料生产领域。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1植酸酶重组表达菌株的构建

申请人利用蛋白质工程技术改造获得一个耐高温植酸酶，然后根据木霉的密码子偏好性，将该植酸酶基因进行了密码子优化，由通用生物系统（安徽）有限公司合成植酸酶的编码核苷酸序列。

以合成的核苷酸序列为模板，设计引物，扩增出植酸酶基因片段。反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。

将上述获得的植酸酶基因片段与表达载体pVL002分别用限制性内切酶XbaI和MluI进行双酶切，并胶回收目的片段，将胶回收得到的植酸酶基因双酶切片段和表达载体pVL002双酶切片段用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布于LB+Amp平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到重组表达质粒。

原生质体制备：取宿主菌里氏木霉（Trichoderma reesei）UE菌株孢子悬液，接种于PDA+U (马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约2cm×2cm的菌落置于含120 mL YEG+U（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412）的三角瓶中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；将预冷的20 mL 1.2 M山梨醇（1.2 M山梨醇，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl₂）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入预冷的5 mL 1.2 M山梨醇溶液悬浮菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的1.2 M山梨醇悬浮分装（200 μL/管，原生质体浓度为10⁸个/mL）。

表达载体转化：以下操作均在冰上进行，取10 μg重组质粒加入到含有200 μL原生质体溶液的7 mL无菌离心管中，然后加入50 μL 25% PEG（25% PEG，50 mM Tris-Cl，50 mMCaCl₂），轻弹管底混匀，冰上放置20 min；加入2 mL 25% PEG，混匀后室温放置5 min；加入4mL 1.2 M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中（0.1% MgSO₄, 1%KH₂PO₄, 0.6% (NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖）；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上（2%葡萄糖，0.5% (NH₄)₂SO₄，1.5% KH₂PO₄，0.06% MgSO₄，0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），30℃培养5~7 d至有转化子长出，将生长出的转化子挑至下层培养基平板复筛，菌落边缘形态较光滑的菌株为即为阳性转化子。

发酵验证和酶活测定：将上述复筛得到的阳性转化子分别接种至PDA（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；琼脂粉1 .5％）固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44% (NH₄)₂SO₄，0.09% MgSO₄，2% KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250mL三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取发酵上清液进行植酸酶酶活力测试。

（1）酶活测定方法

酶活定义：在温度37℃、pH5.5条件下，每分钟从浓度5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol/L无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

测定方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（5.9）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.1）溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液（5.2）稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ax+b）。

反应后的试样在水浴中静置10min，在离心机（6.7）上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm波长处测定样品空白（A₀）和样品溶液（A）的吸光值，A-A₀为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

植酸酶活性按下式计算：

U=F×C/(m×30)

式中：

U--试样中植酸酶的活性，U/g；

C--根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；

F--试样溶液反应前的总稀释倍数；

m--试样质量，g；

30--反应时间，min。

结果显示，本发明构建得到的里氏木霉工程菌摇瓶发酵上清液的植酸酶酶活最高能达到830U/ml。申请人将酶活最高的这株里氏木霉工程菌命名为里氏木霉UE-5（Trichoderma reesei UE-5）。

实施例2 紫外诱变及筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以里氏木霉UE-5为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其植酸酶的产量。

1、确定致死率：

将里氏木霉UE-5接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷个/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷个/ml），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出40-60个菌落，先通过菌落形态，筛选出短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共110个，分别到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行植酸酶活力检测，同时以出发菌株里氏木霉工程菌UE-5作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的110株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中植酸酶的酶活高于出发菌；其中，85株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余25株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了5-10%。

申请人按照上述方法继续进行了8轮诱变筛选，最终获得1株植酸酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为里氏木霉UEM-5 Trichoderma reesei UEM-5）。里氏木霉UEM-5摇瓶发酵上清液中植酸酶的酶活最高，达1365U/ml，比出发菌提高了64.5%。

进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉UE-5和上述突变菌株里氏木霉UEM-5分别在20L罐中进行发酵。发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行植酸酶活力检测。

结果显示，出发菌株里氏木霉UE-5发酵上清液中植酸酶酶活为7700 U/ml，而突变菌株里氏木霉UEM-5的发酵上清液中植酸酶酶活高达13352 U/ml，比出发菌株提高了73.4％，取得了意料不到的技术效果。

实施例3 植酸酶的耐热性测试

将出发菌里氏木霉UE-5和突变菌里氏木霉UEM-5的发酵上清液，分别在90℃条件下处理3min，然后用冰水混合物速冷后，分别测定发酵上清液中植酸酶的残留酶活。以热处理前的初始酶活计100%，计算酶活残留率，结果见表1。

酶活残留率（%）=（初始酶活-热处理后的酶活）/初始酶活×100%

表1 热处理后里氏木霉发酵上清液中植酸酶酶活残留率

里氏木霉	90℃处理3min
		UE-5	82.5%
UEM-5	84%

从表1的数据可以看出，90℃处理3min后，突变菌株里氏木霉UEM-5重组表达的植酸酶发酵上清液的酶活残留率为84%，与出发菌株基本相当。

综上，本发明首先构建得到重组表达耐高温植酸酶的里氏木霉重组菌株UE-5，为了提高植酸酶的产量，申请人以里氏木霉UE-5为出发菌，通过紫外诱变的方式筛选获得一株突变菌里氏木霉UEM-5，其发酵上清液中植酸酶的酶活水平得到显著提高，且突变并未影响其所产植酸酶的耐热性，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年11月4日将里氏木霉UEM-5（Trichoderma reesei UEM-5）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019893。

Claims (4)

1.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，所述工程菌携带有表达植酸酶基因的重组载体。

2.一种里氏木霉突变菌，其特征在于，所述突变菌是以权利要求1所述的工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

3.如权利要求2所述的突变菌，其特征在于，所述突变菌的保藏编号为CCTCC NO: M2019893。

4.权利要求3所述突变菌在生产植酸酶中的应用。