CN112770768A - 用于病毒载体的生产方法 - Google Patents
用于病毒载体的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112770768A CN112770768A CN201980054406.9A CN201980054406A CN112770768A CN 112770768 A CN112770768 A CN 112770768A CN 201980054406 A CN201980054406 A CN 201980054406A CN 112770768 A CN112770768 A CN 112770768A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lentiviral vector
- cell
- bioreactor
- transfection reagent
- reagent mixture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 98
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims abstract description 35
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 35
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000005056 compaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 88
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 78
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 68
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 10
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013014 purified material Substances 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 102100028685 H(+)/Cl(-) exchange transporter 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000766971 Homo sapiens H(+)/Cl(-) exchange transporter 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100024568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028787 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11A Human genes 0.000 claims description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 4
- 101000830603 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000854875 Homo sapiens V-type proton ATPase 116 kDa subunit a 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100020738 V-type proton ATPase 116 kDa subunit a 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 101000583178 Homo sapiens Pleckstrin homology domain-containing family M member 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100030349 Pleckstrin homology domain-containing family M member 1 Human genes 0.000 claims 1
- 108010038036 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Proteins 0.000 claims 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 127
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 9
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- -1 pleckhm 1 Proteins 0.000 description 7
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000648503 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11A Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000713756 Caprine arthritis encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 2
- 108010087740 Fanconi Anemia Complementation Group A protein Proteins 0.000 description 2
- 102000009095 Fanconi Anemia Complementation Group A protein Human genes 0.000 description 2
- 102000018825 Fanconi Anemia Complementation Group C protein Human genes 0.000 description 2
- 108010027673 Fanconi Anemia Complementation Group C protein Proteins 0.000 description 2
- 108010033305 Fanconi Anemia Complementation Group G protein Proteins 0.000 description 2
- 102000007122 Fanconi Anemia Complementation Group G protein Human genes 0.000 description 2
- 201000000106 Fanconi anemia complementation group A Diseases 0.000 description 2
- 201000000129 Fanconi anemia complementation group C Diseases 0.000 description 2
- 201000000127 Fanconi anemia complementation group G Diseases 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 101000613806 Homo sapiens Osteopetrosis-associated transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- RFVNOJDQRGSOEL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl octadecanoate Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCO RFVNOJDQRGSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 101001024441 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) Major facilitator superfamily multidrug transporter NAG3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920000049 Carbon (fiber) Polymers 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241001663880 Gammaretrovirus Species 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000662690 Homo sapiens Trafficking protein particle complex subunit 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000873785 Homo sapiens mRNA-decapping enzyme 1A Proteins 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000714192 Human spumaretrovirus Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001779 Leukocyte adhesion deficiency Diseases 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100040559 Osteopetrosis-associated transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100030264 Pleckstrin Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700014121 Pyruvate Kinase Deficiency of Red Cells Proteins 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000713656 Simian foamy virus Species 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100037456 Trafficking protein particle complex subunit 10 Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004917 carbon fiber Substances 0.000 description 1
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 102100035856 mRNA-decapping enzyme 1A Human genes 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical group C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N octylphenoxy polyethoxyethanol Chemical class CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000002865 osteopetrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010026735 platelet protein P47 Proteins 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/44—Multiple separable units; Modules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/14—Scaffolds; Matrices
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
相关申请
本申请要求于2018年8月16日提交的美国临时专利申请第62/765,112号的优先权,所述美国临时专利申请通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于制造重组慢病毒载体的方法。
背景技术
在粘附生物反应器中成功制造重组慢病毒载体具有挑战性,因为产量依赖于许多工艺参数,并且在公共领域中可获得的优化工艺参数的报告很少。最近报告了使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂实现的产量优于以磷酸钙(CaPho)沉淀为基础的转染。Valkama等人《基因疗法(Gene Therapy)》(2018)254,39-46(2018)。尽管有此类报告,但本发明人已研发出依赖于CaPho转染的经优化的方法。
附图说明
图1示出了描绘本公开的方法的说明性非限制性实施例的流程图。
发明内容
本公开提供了一种制造重组慢病毒载体的方法,所述方法包括:在具有一定床高和反应器体积的粘附生物反应器中的基质上以粘附方式在培养基中培养生产细胞,直到所述生产细胞达到预定细胞密度为止,其中所述基质包括低压实度宏载体;用转染试剂混合物转染所述生产细胞,其中所述转染试剂混合物包括一种或多种DNA多核苷酸、pH为中性的磷酸钙和缓冲盐水(例如,HEPES缓冲盐水);以及采集所述重组慢病毒载体,由此产生采集材料。在一些实施例中,所述方法包括使用半封闭式或封闭式系统处理所述采集材料,由此产生经纯化的材料。
根据以下详细描述和权利要求,本发明的其它特征和优点将变得显而易见并被其涵盖在内。
具体实施方式
本公开尤其提供了一种制造重组慢病毒载体的方法,所述方法包括:在具有一定床高和反应器体积的粘附生物反应器中的基质上以粘附方式在培养基中培养生产细胞,直到所述生产细胞达到预定细胞密度为止,其中所述基质包括低压实度宏载体;用转染试剂混合物转染所述生产细胞,其中所述转染试剂混合物包括一种或多种DNA多核苷酸、pH为中性的磷酸钙和缓冲盐水(例如,HEPES缓冲盐水);以及采集所述重组慢病毒载体,由此产生采集材料。本公开还提供了通过本文所描述的方法产生的重组慢病毒载体以及药物组合物和所述慢病毒载体和药物组合物的用途。
本公开的组合物和方法特别适用于基因疗法应用,包含单基因疾病和病症的治疗。本文提供的组合物和方法解决了限制基因疗法成功的因素,包含制造中重组慢病毒载体的低产量。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本发明的实践中,但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全文明确地并入。在发生冲突的情况下,应以本说明书(包含定义)为准。另外,本文所描述的材料、方法和实例仅是说明性的,而非限制性的。
除非特别相反地指示,否则本文设想的各个实施例将会采用本领域技术范围内常规的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学方法,所述方法中的许多出于说明的目的在下文进行描述。此类技术在文献中有充分解释。参见例如,Sambrook等人,《分子克隆:实验手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第3版,2001);Sambrook等人,《分子克隆:实验手册》(第2版,1989);Maniatis等人,《分子克隆:实验手册》(1982);Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子公司(Wiley and Sons),2008年7月更新);《精编分子生物学实验指南:当代分子生物学实验指南的方法概要(ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology)》,格林出版协会和威利跨学科出版社(GreenePub.Associatesand Wiley-Interscience);《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.));《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);Glover,《DNA克隆:一种实用方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》,第I卷和第II卷(IRL出版社(IRL Press),牛津,1985);Anand,《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》,(学术出版社(AcademicPress),纽约,1992);《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编,1984);Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to MolecularCloning)》(1984);Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1998);《当代免疫学指南(CurrentProtocols in Immunology)》,J.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober编,1991);《免疫学年度评论(Annual Review of Immunology)》;以及如《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著,所述文献中的每一个都通过引用明确并入本文。
以下说明中阐述了某些具体细节以便提供对本文所设想的本发明的各个说明性实施例的全面理解。然而,本领域技术人员应理解,可以在没有这些细节的情况下实践特定说明性实施例。另外,应理解,衍生自本文所描述的结构和取代基的各个组合的单独载体或载体组由本申请公开到与单独阐述每个载体或每组载体相同的程度。因此,特定载体结构或特定取代基的选择在本公开的范围内。
定义
如本文所用,术语“约”或“大约”是指某一数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在特定实施例中,术语“约”或“大约”在数字值之前时指示所述值加上或减去15%、10%、5%或1%的范围。
“转染”是指通过非病毒方法将裸DNA引入细胞的过程。
“感染”是指使用病毒载体将外源DNA引入细胞的过程。
“转导”是指使用病毒载体将外源DNA引入细胞中。
“载体拷贝数”或“VCN”是指样品中载体的拷贝数除以细胞数。通常,使用针对整合的前病毒的Psi序列的探针通过定量聚合酶链反应(qPCR)确定载体的拷贝数,并且使用针对人类管家基因的探针通过qPCR确定细胞数,对于所述人类管家基因,每个细胞将存在两个拷贝(每个染色体一个)。
“转导效率”是指用至少一个前病毒拷贝转导的细胞的百分比。例如,如果1×106个细胞暴露于病毒,并且0.5×106个细胞被确定在其基因组中具有病毒的至少一个拷贝,则转导效率为50%。用于确定转导效率的一种说明性方法是流式细胞术。
如本文所用,术语“逆转录病毒(retrovirus或retroviral)”是指RNA病毒,所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。逆转录病毒载体是用于基因递送的常见工具(Miller,2000,《自然(Nature)》.357:455-460)。一旦病毒整合到宿主基因组中,其就被成为“前病毒”。前病毒用作RNA聚合酶II的模板,并且指导由病毒编码的RNA分子的表达。说明性逆转录病毒(逆转录病毒科属)包含但不限于:(1)γ逆转录病毒属,如莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)和猫白血病病毒(FLV),(2)泡沫病毒属,如猿猴泡沫病毒,(3)慢病毒属,如人类免疫缺陷病毒-1和猿猴免疫缺陷病毒。
如本文所用,术语“慢病毒(lentiviral或lentivirus)”是指代复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于:人免疫缺陷病毒(HIV),包含HIV类型和2型HIV;维斯纳—梅迪病毒(VMV)病毒;山羊关节炎—脑炎病毒(CAEV);马传染性贫血病毒(EIAV);猫免疫缺陷病毒(FIV);牛免疫缺陷病毒(BIV);以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中,利用了基于HIV的载体主链(即,HIV顺式作用序列元件)。
逆转录病毒载体,并且在具体的实施例中,慢病毒载体,可以用于实践本发明。因此,如本文所用术语“逆转录病毒载体”意指包含“慢病毒载体”;并且如本文所用术语“逆转录病毒”意指包含“慢病毒”。
术语“载体”在本文中用于是指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。被转移的核酸通常连接到,例如插入到,载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制或逆转录的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包含病毒载体。有用的病毒载体包含例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
术语“病毒载体”可以指代能够将核酸转移到细胞中的基于病毒的载体或载体颗粒或指代被转移的核酸本身。病毒载体含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体。
术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的包含LTR的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体。术语“杂交”是指含有逆转录病毒例如慢病毒序列和非慢病毒病毒序列两者的载体、LTR或其它核酸。在一个实施例中,杂交载体包括用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒例如慢病毒序列。
在特定实施例中,可以使用术语“慢病毒载体”和“慢病毒表达载体”来指代慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。当本文中引用如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等元件时,应理解,这些元件的序列以RNA形式存在于本发明的慢病毒颗粒中并且以DNA形式存在于本发明的DNA质粒中。
根据某些具体实施例,大多数或全部病毒载体主链序列衍生自慢病毒,例如HIV-1。然而,应理解,可以使用许多不同来源的慢病毒序列,或者可以容置慢病毒序列中的某些慢病毒序列的多种取代和改变而不损害转移载体执行本文所描述的功能的能力。此外,各种慢病毒载体在本领域中是已知的,参见Naldini等人,(1996a、1996b和1998);Zufferey等人,(1997);Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号;和第5,994,136号,其中许多可以适于产生本发明的病毒载体或转移质粒。
如本文所用,术语“多核苷酸”或“核酸”是指DNA和RNA,例如,基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或DNA。多核苷酸包含重组、合成或分离的单链和双链多核苷酸。在一些实施例中,多核苷酸是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))。如本文所用,术语“多核糖核苷酸”或“核糖核酸”也指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))。优选地,本发明的多核苷酸包含与本文所描述的参考序列(参见例如序列表)中的任何参考序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的多核苷酸或变体,通常其中所述变体保持参考序列的至少一种生物活性。在各个说明性实施例中,设想了病毒载体和转移质粒多核苷酸序列以及包括所述病毒载体和转移质粒多核苷酸序列的组合物。在特定实施例中,设想了编码一种或多种治疗性多肽和/或其它所关注基因的多核苷酸。在特定实施例中,编码治疗性多肽的多核苷酸包含但不限于RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1基因。在特定实施例中,多核苷酸或其编码治疗性多肽的区域被密码子优化。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩大”总体上指代与在控制条件下在粘附生物反应器中执行的方法相比,本文所设想的组合物和/或方法能够引发、引起或产生更高数目的细胞、更高数目的转导细胞或更高的病毒产量。“增加的”或“增强的”产量通常是“统计上显著”的量,并且可以包1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、100、200或更多倍(例如,500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点,如1.5、1.6、1.7、1.8等)的粘附生物反应器在控制条件下的产量。
如本文所用,“控制条件”是指优化前的工艺条件。控制条件可以例如指表A中的实例1(Ex.1)或同等条件。
“减少”或“下降”或“减轻”或“降低”或“减缓”总体上指代与在控制条件下在粘附生物反应器中执行的方法相比,产生相对更少的总细胞、更少的转导细胞或更低产量的组合物或方法。“降低”或“减少的”产量通常是“统计学上显著的”量,并且可以包含与在控制条件下粘附生物反应器的产量相比减少了1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%或更高的百分比(例如,40%、50%、60%)(包含所有整数以及其之间且超过1,例如1.5,1.6,1.7、1.8的小数点)。
如本文所用,“CFC”是指集落形成细胞。集落形成细胞(CFC)测定用于通过造血祖细胞在半固体培养基中形成集落的能力来研究其增殖和分化模式。由固定数量的输入细胞形成的集落的数量和形态提供了关于祖细胞分化和增殖能力的初步信息。在Sarma等人“人类造血细胞的集落形成细胞(CFC)测定(Colony forming cell(CFC)assay for humanhematopoietic cells)”.《可视实验杂志(J Vis Exp.)》2010年12月18日;(46)中提供了示例性测定。
如本文所用,“CFU”是指集落形成单位。CFU被理解为CFC的同义词,但有时用于指在半固体培养基中生长的CFU的类型。
如本文所用,“TU”是指转导单位。TU/mL是逆转录病毒(慢病毒)制剂的功能滴度的常用量度。
如本文所用,“MOI”是指感染复数。
如本文所用,术语“施用”或“引入”是指将慢病毒载体或用慢病毒载体转导的细胞递送给受试者。
通常,当病毒载体或载体颗粒已经将异源DNA(例如,载体)引入细胞时,所述细胞被称为“经过转导的”。
如本文所用,术语“宿主细胞”是指已经用病毒载体或载体颗粒转导的细胞。应当理解,术语“宿主细胞”是指原始转导的细胞和其子代。
术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的,例如降低受试者体内发生疾病或其症状的可能性,和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应方面可以是治疗性的。如本文所用,“治疗”覆盖对哺乳动物的疾病的任何治疗并且包含:(a)防止疾病在可能倾向于患有疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者身上发生;(b)抑制疾病,即,中止疾病发展;或者(c)缓解疾病,即,使疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别关注了对发展中的疾病的治疗,其中所述治疗稳定或减少了患者的不期望的临床症状。理想的是,在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。理想的是,将在疾病的症状期期间并且在一些情况下在疾病的症状期之后施用主题疗法。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物,包含但不限于:人和非人灵长类动物,包含猿类和人类;哺乳类运动动物(例如,马);哺乳类农场动物(例如,绵羊、山羊等);哺乳类宠物(狗、猫等);以及啮齿动物(例如,小鼠、大鼠等)。
制造方法
在实施例中,本公开提供了一种制造重组慢病毒载体的方法,其中:在具有一定床高和反应器体积的粘附生物反应器中的基质上以粘附方式在培养基中培养生产细胞,直到所述生产细胞达到预定细胞密度为止,其中所述基质包括低压实度宏载体;所述生产细胞用转染试剂混合物转染;并且从经转染的细胞中采集重组慢病毒载体。在一些实施例中,转染试剂混合物包括一种或多种DNA多核苷酸、pH为中性的磷酸钙和/或HEPES缓冲盐水。重组慢病毒载体可以被称为“采集材料”。
在实施例中,转染步骤包括:对于每100%体积的组合的转染试剂混合物和培养基,向粘附生物反应器中添加约5%到约50%体积的转染试剂混合物。在实施例中,转染步骤包括:对于每100%体积的组合的转染试剂混合物和培养基,向粘附生物反应器中添加约10%到约40%体积的转染试剂混合物。在实施例中,转染步骤包括:对于每100%体积的组合的转染试剂混合物和培养基,向粘附生物反应器中添加约10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%体积的转染试剂混合物。在实施例中,转染步骤包括:对于每3体积的培养基,向粘附生物反应器中添加约0.8、0.9、1.0、1.1或1.2体积的转染试剂混合物。在实施例中,转染步骤包括:对于每3体积的培养基,向粘附生物反应器中添加约1体积的转染试剂混合物。
在实施例中,所述方法包括在转染步骤之后,采集步骤之前,等待至少约1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14小时或更长时间(例如,4-24小时、8-24小时、8-14小时、4-12小时或5-7小时)的时间段,例如,足够使病毒载体产生的时间。
在实施例中,所述方法包括在转染步骤之后使培养基再循环通过基质持续至少约1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14小时或更长时间同时将pH维持在固定pH(如约pH 6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4)下的步骤。在实施例中,所述方法包括在转染步骤之后使培养基再循环通过基质持续至少约5-7小时同时将pH维持在约7.2下。
在实施例中,采集步骤包括将培养基的pH维持在低于或略低于培养步骤的pH,例如,使pH约在约6.0到约7.3的范围内。在实施例中,采集步骤包括将培养基的pH维持在低于或略低于培养步骤的pH,例如,维持在pH 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1或7.2。在实施例中,采集步骤包括将培养基的pH维持在低于约pH 7.0。
在实施例中,采集步骤包括用至少约4反应器体积的采集培养基灌注基质,持续至少约24、48、60或72小时或在24到72小时的范围内。在实施例中,采集步骤包括用约4反应器体积的采集培养基灌注基质,持续约60小时。在实施例中,采集步骤包括用采集培养基灌注基质,持续约60小时,并以规则的时间间隔(例如每12、24、36或48小时)收集培养基或其部分。
在实施例中,所述方法包括使用半封闭式或封闭式系统处理采集材料,由此产生经纯化的材料。
在实施例中,处理步骤包括离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法中的一种或多种。
在实施例中,处理步骤包括通过在一个或多个离心浓缩器中离心采集材料将重组慢病毒载体浓缩。在实施例中,处理步骤包括通过切向流过滤将重组慢病毒载体浓缩。
在实施例中,所述方法包括测定经纯化的材料的重组慢病毒载体的感染滴度。在实施例中,与未如此制造的重组慢病毒载体相比,通过所述方法制造的重组慢病毒载体表现出的病毒转导功效增加至少约20%。在实施例中,与在未优化如本文所描述的工艺参数的情况下(例如,如实例1中所描述的试验1的生物反应器1-4)制造的重组慢病毒载体相比,通过所述方法制造的重组慢病毒载体表现出的病毒转导功效增加至少约20%。
可以使用用于纯化慢病毒载体的各种其它方法。
生物反应器、宏载体和生产系统
本公开的某些方面涉及用于在固定床中培养细胞的方法。说明性细胞培养装置在美国专利第8,597,939号、美国专利第8,137,959号、美国PG公开2008/0248552和WO2014093444中有提及并且可商购获得(例如,来自纽约州华盛顿港的颇尔生命科学(Life Sciences,Port Washington,N.Y.)的生物反应器,如纳米生物反应器和500/100生物反应器)。生物反应器被设计成允许从纳米生物反应器到更大的生物反应器的制造条件的调整,而结果不会产生明显的改变。因此,在纳米生物反应器上开发的制造条件可转移到任何生物反应器。也可以在本公开的方法中使用其它当前的或预期创建的固定床生物反应器。在一些实施例中,细胞在固定床生物反应器中培养。固定床生物反应器包含呈固定填充材料形式的形成固定床或填充床以促进细胞粘附和生长的载体。固定床的填充材料的布置会影响局部的流体、热量和质量传递并且通常是非常密集的,以在给定的空间中使细胞培养最大化。在一个实施例中,反应器包含壁,所述壁形成具有填充床或固定床的内部,所述填充床或固定床由填充材料(如纤维、珠粒、球体或类似物)构成以促进细胞粘附和生长。所述材料位于反应器内部内的隔室中,所述隔室可以包括中空的、竖直延伸的管件的上部部分。在反应器的内部内提供了第二隔室,用于将流体输送到隔室的至少部分地形成固定床的材料或从所述材料中输送流体。通常,填充材料应被布置成使细胞生长的表面积最大化,其中1,000平方米被认为是有利的表面积量(例如,这可以使用医用级聚酯微纤维作为填充材料来实现)。在一个实施例中,通过内置磁驱动叶轮可以实现均匀分布的培养基循环,从而确保低剪切应力和高细胞活力。细胞培养基从底部到顶部流动通过固定床。在顶部处,培养基以薄膜形式沿外壁落下,在所述外壁处,培养基吸收O2以在生物反应器中维持高KLa.。这种瀑布式充氧与温和的搅拌和生物质固定一起使生物反应器能够实现并维持高细胞密度。
如本文所用,“床高”是生物反应器或生物反应器的所谓的固定床(其中生物反应器使用固定床)的参数。在许多商业粘附生物反应器系统中,对于单次使用(一次性)系统中的生物反应器,提供了宏载体床,并且因此生物反应器的床高和固定床的床高通常是同义的。图2中展示了2cm、4cm或10cm的床高。
在一些实施例中,生物反应器的床高在约1cm到约15cm的范围内,或在约2cm到约12cm的范围内。在一些实施例中,生物反应器的床高为约2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、8cm、9cm、10cm、11cm或12cm。在一些实施例中,生物反应器的床高为约2cm。在其它实施例中,生物反应器的床高为约10cm。在某些实施例中,生物反应器的反应器体积为500ml到1500ml、500ml到100ml、约500ml、约600ml、约700ml、约800ml、约900ml、约1,000ml、约1,100ml、约1,200ml或约1,500ml。
在一些实施例中,固定床的床高在约1cm到约15cm的范围内,或在约2cm到约12cm的范围内。在一些实施例中,固定床的床高为约2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、8cm、9cm、10cm、11cm或12cm。在一些实施例中,固定床的床高为约2cm。在其它实施例中,固定床的床高为约10cm。在某些实施例中,固定床的反应器体积为500ml到1500ml、500ml到100ml、约500ml、约600ml、约700ml、约800ml、约900ml、约1,000ml、约1,100ml、约1,200ml或约1,500ml。
来源:https://biotech.pall.com/
在一些实施例中,固定床含有宏载体(例如,基质)。在一些实施例中,宏载体是纤维基质。在一些实施例中,宏载体是碳纤维基质。宏载体可以选自编织或非编织微纤维、聚酯微纤维(例如,医用级聚酯微纤维)多孔碳和壳聚糖基质。微纤维可以任选地由PET或任何其它聚合物或生物聚合物制成。在一些实施例中,宏载体包含珠粒。聚合物可以被处理成与细胞培养相容(如果此类处理必要的话)。可以使用的合适低压实度宏载体包含为生物反应器系统提供的专有宏载体;然而可以用本领域中已知或预期开发的其它合适低压实度宏载体进行代替。
合适的宏载体、基质或“承载材料”是:矿物载体,如硅酸盐、磷酸钙;有机化合物,如多孔碳;天然产物,如壳聚糖;聚合物或与细胞生长相容的生物聚合物。基质可以具有规则或不规则结构的珠粒形式,或可以包括聚合物或任何其它与细胞生长相容的材料的编织或非编织微纤维。填充物也可以作为具有孔隙或通道的单个零件提供。贮器中的填充物可以具有各种各样的形式和尺寸。在一些实施例中,基质是固体或多孔球体、薄片、多边形的微粒材料。通常为了避免使用时贮器内基质颗粒的移动,会使用足量的基质,因为基质颗粒的移动可能损伤细胞并可能影响气体和/或培养基的循环。可替代地,基质由元件组成,所述元件装配到内部贮器或贮器的隔室中并且具有足够的孔隙率和表面。其中一个实例是由Cinvention(德国(Germany))制造的碳基质(Carboscale)。在一些实施例中,纤维基质的细胞可及表面积介于150cm2/cm3与约1000cm2/cm3之间。在一些实施例中,低压实度宏载体的床高为2cm、4cm或10cm。
在一些实施例中,粘附生物反应器是具有模块化固定床的生物反应器。例如WO 2018007873A1和US20180195048A1中描述了在生物反应器中制造病毒载体,所述文献通过引用以其全文并入本文。如纳米生物反应器和500/100生物反应器生物反应器(纽约州华盛顿港的颇尔生命科学)等可商购获得的生物反应器可以包含具有可移除的、一次性或单次使用的固定床的生物反应器系统,所述固定床在紧凑的生物反应器体积中提供了较大生长表面积。与使用微载体的标准搅拌釜反应器相比,此类系统避免了几个较难处理且耗时的程序,包含人工操作、灭菌和水化微载体以及从预培养到最终工艺珠粒之间的转移。如本文所述,此类生物反应器可以实现(例如,500平方米)的培养面积当量和高达1500到2000L的采集流体体积的大规模处理,这有利于病毒的工业化规模生产(例如,用于在慢病毒生产中使用)。如本文所例示的,此类装置可以实现另外的优势,如低细胞接种量;以较短的预培养时间段达到感染的最佳细胞密度;和/或在培养生长阶段期间优化MOI、培养基和血清浓度。此类装置可以被配置成允许培养中的细胞快速灌注,例如,使得90%或更多的细胞经历相同的培养基环境。此外,并且不希望受到理论的束缚,单次使用或一次性固定床可以使下游处理精益化以最大化生产率,以及即使在规模扩大到相当于几个大型常规培养容器的情况下仍减少工艺区域的占用面积。由此,可以以最小的步骤和成本实现有利的生产率和纯度。
在一些实施例中,在转染步骤前实现的预定细胞密度为1-10,000×103个细胞/cm2。在一些实施例中,在转染步骤前实现的预定细胞密度为1-1,000×103个细胞/cm2、1,000-2,000×103个细胞/cm2、2,000-3,000×103个细胞/cm2、3,000-4,000×103个细胞/cm2、4,000-5,000×103个细胞/cm2、5,000-6,000×103个细胞/cm2或6,000-7,000×103个细胞/cm2。在一些实施例中,在转染步骤前实现的预定细胞密度为1-100×103个细胞/cm2、100-200×103个细胞/cm2、200-300×103个细胞/cm2、300-400×103个细胞/cm2、400-500×103个细胞/cm2、500-600×103个细胞/cm2或600-700×103个细胞/cm2。在一些实施例中,在转染步骤前实现的预定细胞密度为150-300×103个细胞/cm2。在一些实施例中,在转染步骤前实现的预定细胞密度为150-200×103个细胞/cm2、200-250×103个细胞/cm2或250-300×103个细胞/cm2。
生产细胞和细胞培养
生产细胞可以是适合生产慢病毒载体并适应或可适应以粘附方式生长的任何生产细胞或细胞系。在实施例中,生产细胞是HEK293细胞或其衍生物,任选地HEK293T细胞或其衍生物。在实施例中,生产细胞是粘附型HEK293或HEK293T细胞。
生产细胞(例如,HEK293或HEK293T细胞)可以在各种细胞培养基中培养,所述细胞培养基如达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)、极限必需培养基(MEM)、Iscove改良的达尔伯克氏培养基(IMDM)、OptiPROTM、293或Pro293TM培养基。包含上文细胞类型在内的生产细胞的培养条件是已知的并且在各种出版物中有所描述,或者可替代地培养基、补充剂和条件因子可以商业购买,例如如在坎布雷克斯生物产品(Cambrex Bioproducts)(新泽西州东卢瑟福(EastRutherford,N.J.))的目录和另外的文献中所描述的。在某些实施例中,生产细胞在无血清培养基中培养。可以使用的已知无血清培养基包含Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH生物科学(JRH Bioscience))。普通含血清培养基包含伊格尔氏基础培养基(BME)或极限必需培养基(MEM)(Eagle,《科学(Science)》,130,432(1959))或达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM或EDM),所述培养基通常与高达10%的胎牛血清或类似的添加剂一起使用。任选地,极限必需培养基(MEM)(Eagle,《科学》,130,432(1959))或达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM或EDM)可以在无任何含血清补充剂的情况下使用。类似于PF-CHO(JHR生物科学)等无蛋白质培养基、类似于ProCHO 4CDM(BioWhittaker)或SMIF 7(Gibco/BRL生命技术(Gibco/BRL Life Technologies))等化学成分确定的培养基以及类似于Primactone、Pepticase或HyPep.TM(全部来自奎斯特国际公司(Quest International))或乳白蛋白水解产物(Gibco公司(Gibco)和其它制造商)等促有丝分裂肽在现有技术中是充分已知的。基于植物水解产物的培养基添加剂具有可以排除病毒、支原体或未知感染原污染的特殊优势。
在一些实施例中,生产细胞包括促进病毒复制的一种或多种多核苷酸(例如,编码Gag-pol、Rev和/或env基因的多核苷酸)。在一些实施例中,生产细胞源自包装细胞系。在一些实施例中,生产细胞不是源自包装细胞系的。在实施例中,细胞系被工程化为在无辅助质粒的情况下表达Gag-pol、rev和Env(VSVG)中的一种或多种。适当的Gag-pol、Rev和Env多肽、编码这些多肽的质粒以及表达这些多肽的包装细胞系在本领域中已知且可获得。
转染试剂
尽管在某些实施例中,转染试剂是磷酸钙,但在一些实施例中,使用了其它转染试剂。合适的转染试剂可以是,例如,PEIProTM(PolyPlus)、JetPEITM、线性PEI或任何聚乙烯亚胺衍生物,或者任何其它功能性等效的转染试剂。在实施例中,转染试剂是阳离子聚合物,例如,LentifectinTM。在实施例中,转染试剂混合物包括适合于在细胞培养中使用的任何缓冲液,包含但不限于磷酸盐、柠檬酸盐-磷酸盐或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液。在实施例中,缓冲液为HEPES,并且混合物在HEPES缓冲盐水(例如,UltraSALINE A)中制备。在一些实施例中,缓冲液是本领域中已知的适合于细胞培养并与磷酸钙转染试剂相容的任何缓冲液。在某些实施例中,缓冲液为缓冲盐水,例如,HEPES缓冲盐水,如UltraSALINEA。在某些实施例中,缓冲液为(N,N-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸)(BES)。在实施例中,转染试剂混合物具有中性pH,例如pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8或在pH 6.5-7.8的范围内。在某些实施例中,转染试剂混合物的pH为约7.2或约7.4。在一个实施例中,转染试剂混合物pH为约7.2。
在实施例中,转染试剂混合物包括约90-200mM CaPho并且在37℃下pH为约7.0-7.6。在实施例中,转染试剂混合物包括约110mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约120mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约125mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约130mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约140mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约150mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约160mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约170mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。在实施例中,转染试剂混合物包括约180mM CaPho并且在37℃下pH为约7.2。
在实施例中,转染试剂混合物包括约110mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约120mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约125mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约130mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约140mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约150mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约160mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约170mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。在实施例中,转染试剂混合物包括约180mM CaPho并且在37℃下pH为约7.4。
在实施例中,转染试剂混合物包括约1到约150μg/mL的一种或多种DNA多核苷酸。在实施例中,转染试剂混合物包括约1到约120μg/mL的一种或多种DNA多核苷酸。在实施例中,转染试剂混合物包括约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90μg/mL的一种或多种DNA多核苷酸。在实施例中,转染试剂混合物包括约10、20或30μg/mL的一种或多种DNA多核苷酸。在实施例中,转染试剂混合物包括约20μg/mL的一种或多种DNA多核苷酸。在一些实施例中,转染试剂混合物应用两次或至少两次,使得例如2×20μg/mL的一种或多种DNA多核苷酸被递送给细胞。
在各个实施例中,工艺条件选自表B中提供的列举的实例。条件的其它组合是可能的。例如,在一些实施例中,pH为7.2或7.4。在一些实施例中,磷酸钙浓度为125mM或180mM。在一些实施例中,转染试剂混合物中的DNA浓度为20μg/mL或20μg/mL。在一些实施例中,转染试剂混合物被添加一次或两次。
表B:试验条件的非限制性实例
在某些实施例中,与参考方法相比,本公开的方法使细胞计数增加至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%。在某些实施例中,与参考方法相比,本公开的方法使滴度增加至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%。在某些实施例中,与参考方法相比,本公开的方法使每升转导单位增加至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%。在某些实施例中,与参考方法相比,本公开的方法使每升载体拷贝数增加至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%。在某些实施例中,与参考方法相比,本公开的方法使每升载体基因组增加至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%。在某些实施例中,本公开的方法使感染滴度增加至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%或至少约25%。在一些实施例中,参考方法包括用除CaPho以外的转染试剂进行转染。在一些实施例中,参考方法包括用包括约80mM、约100mM、约150mM、约180mM或约200mM的CaPho的转染试剂混合物进行转染。在一些实施例中,参考方法包括用pH为约6.4、约6.6、约6.8、约7.0、约7.4、约7.6或约7.8的转染试剂混合物进行转染。
在某些实施例中,HEK293细胞在生物反应器中在37℃下体积约800mL的DMEM细胞培养基中培养。将总体积为约200mL的包括DMEM细胞培养基与pH为7.2的UltraSALINE A、125mM CaPho和约20μg/mL的Chim.CD18-LV载体质粒的转染试剂混合物添加到生物反应器中。约6小时之后,开始培养基的连续采集并逐步持续约60小时。在采集之后,将采集材料储存以供进一步纯化。
多核苷酸
在各个实施例中,生产细胞用一种或多种多核苷酸转染或转导。在一些实施例中,所述生产细胞用包括表达盒(例如,编码所关注的多肽或多核苷酸(如治疗性多肽或治疗性RNA)的表达盒)的多核苷酸转染或转导。在特定实施例中,所述生产细胞用编码病毒蛋白质的一种或多种多核苷酸转染,所述病毒蛋白质对于产生病毒载体(例如,慢病毒载体)是必需的或期望的。
在实施例中,多核苷酸包括慢病毒载体基因表达盒,所述慢病毒载体基因表达盒包括所关注的基因或对所关注的多肽进行编码,所述多肽任选地选自由以下组成的组:R型特异性丙酮酸激酶(RPK)、整合素亚基β2(ITGB2)、范可尼贫血互补群A(FANCA)、范可尼贫血互补群C(FANCC)、范可尼贫血互补群G(FANCG)、T细胞免疫调节因子1(TCIRG1)、氯电压门控通道7(CLCN7)、肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)、含有M1的普列克底物蛋白同源性和RUN结构域(PLEKHM1)、TNF受体超家族成员11a(TNFRSF11A)以及破骨细胞生成相关的跨膜蛋白1(OSTM1)或其功能性片段或变体。
在一些实施例中,生产细胞包括促进病毒复制的一种或多种多核苷酸(例如,编码Gag-pol、Rev和/或env基因的多核苷酸)。在一些实施例中,生产细胞源自包装细胞系。在实施例中,生产细胞系被工程化为在无辅助质粒的情况下表达Gag-pol、rev和Env(VSVG)中的一种或多种。因此,在某些实施例中,生产细胞仅用包括表达盒的质粒转染,所述表达盒包括所关注的基因或对所关注的多肽进行编码。
在一些实施例中,在来自基因表达盒的相同或不同多核苷酸上向生产细胞提供编码病毒结构蛋白的一种或多种基因,所述基因表达盒包括所关注的基因或对所关注的多肽进行编码。例如,细胞可以用表达Gag-pol、rev和/或Env(VSVG)的1个、2个、3个或4个质粒转染。在特定实施例中,细胞用四个质粒转染,其中一个质粒编码Gag-pol,一个质粒编码Rev,一个质粒编码Env,并且一个质粒包括基因表达盒,所述基因表达盒包括所关注的基因或对所关注的多肽(例如,治疗性多肽)进行编码。适当的Gag-pol、Rev和Env多肽,编码这些多肽的质粒以及表达这些多肽的包装细胞系在本领域中已知且可用。
慢病毒载体、药物组合物和其用途
在一些实施例中,本公开提供了一种通过本公开的任何方法产生的重组慢病毒载体。
在一些实施例中,本公开提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括通过本公开的任何方法产生的重组慢病毒载体以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施例中,本公开提供了一种包括慢病毒载体或载体颗粒的药物组合物,其中所述载体颗粒的浓度介于每mL 1×107个载体颗粒(vp)与每mL 1×109个载体颗粒之间。在一些实施例中,药物组合物包括载体颗粒,所述载体颗粒的浓度为每mL至少约1×107个、每mL至少约1×107个、每mL至少约1×108个、每mL至少约1×109个、每mL至少约1×1010个或每mL至少约1×1011个载体颗粒(vp)。在一些实施例中,药物组合物包括载体颗粒,所述载体颗粒的浓度为每mL至少1×107个、每mL至少1×107个、每mL至少1×108个、每mL至少1×109个、每mL至少1×1010个或每mL至少1×1011个载体颗粒(vp)。在一些实施例中,药物组合物包括载体颗粒,所述载体颗粒的浓度为每mL约1×107个、每mL约1×107个、每mL约1×108个、每mL约1×109个、每mL约1×1010个或每mL约1×1011个载体颗粒(vp)。在某些实施例中,重组慢病毒载体通过本公开的任何方法产生。
在某些实施例中,重组慢病毒载体通过本公开的任何方法产生。
在特定实施例中,本公开提供了一种包括细胞群体的药物组合物,其中多个所述细胞通过重组慢病毒载体转导。在一些实施例中,所述细胞群体与通过本公开的任何方法产生的重组慢病毒载体接触或用所述重组慢病毒载体感染。
本发明包含包括如本文所描述的载体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物和调配物。所述载体可以与可用于制备通常是安全、无毒且期望的并且包含可接受以供灵长类动物使用的赋形剂的调配物的药学上可接受的载体、稀释剂和试剂组合。此类赋形剂、载体或稀释剂的实例包含但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。补充性活性化合物也可以并入调配物中。用于调配物的溶液或悬浮液可以包含:无菌稀释剂,如注射用水、盐水溶液、二甲基亚砜(DMSO)、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂;抗菌化合物,如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合化合物,如乙二胺四乙酸(EDTA);缓冲剂,如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;洗涤剂,如用于防止聚合的吐温(Tween)20;以及用于调节张力的化合物,如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。在特定实施例中,调配物是无菌的。
在一些实施例中,所述方法根据当前良好生产规范执行。根据当前良好生产规范制造意味着,为施用而制备的调配物足够安全以允许在控制法规和政府授权下将其施用于人类受试者。一般地,控制法规和授权将指示调配物符合预先批准的关于同一性、强度、质量和纯度的验收标准。验收标准包含用于确定调配物是否符合当前良好生产规范的数值限值、范围或其它合适的测试结果的量度。说明书示出了用于测试是否符合验收标准的分析程序。可以分批评估调配物。批是经过测试以确保符合验收标准的调配物的特定数量。
组合物或调配物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如,注射器,例如载药注射器)中。
在必要或有益的情况下,组合物和调配物可以包含如利多卡因等局部麻醉剂,以减轻注射部位处的疼痛。
在一些实施例中,本文所提供的药物组合物和调配物包括与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合的如本文所公开的治疗有效量的病毒载体,所述药学上可接受的载体和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其它蛋白质。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏溶液和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地,此调配物在4℃下在六个月内是稳定的。
在一些实施例中,本文所提供的药物组合物包括缓冲液,如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水以及本领域普通技术人员已知的其它缓冲液,如Good等人(1966)《生物化学(Biochemistry)》5:467中描述的那些缓冲液。包括腺病毒载体递送系统中含有的肿瘤抑制基因的药物组合物的缓冲液的pH可以在6.5到7.75的范围内,优选地7到7.5,并且最优选地7.2到7.4。
所产生的慢病毒载体和药物组合物可以直接使用或储存。
慢病毒载体和药物组合物可以用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症,例如,通过将所述慢病毒载体和药物组合物施用于受试者,或间接地,例如,通过用所述慢病毒载体感染细胞并且然后将所述细胞作为治疗性细胞施用于受试者。在特定实施例中,细胞在用慢病毒载体感染之前从受试者获得。
在一些实施例中,本公开提供了通过本公开的任何方法产生的重组慢病毒载体或本公开的药物组合物的用途,其用于向细胞提供由多核苷酸编码的多肽。
在一些实施例中,本公开提供了通过本公开的任何方法产生的重组慢病毒载体或本公开的药物组合物的用途,其用于治疗有需要的哺乳动物受试者的疾病或病症。在一些实施例中,所述疾病或病症为丙酮酸激酶缺乏症、白细胞粘附缺乏症、范可尼贫血和/或骨硬化病。
本文所提及的所有出版物均通过引用的方式并入本文中,以公开和描述引用出版物时结合的方法和/或材料。应当理解,在存在矛盾的情况下,本公开代替所并入出版物的任何公开内容。
另外应注意,权利要求可以被撰写成不包括任何任选的要素。因此,本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
仅提供本文所讨论的出版物在本申请的提交日期之前的公开内容。进一步地,所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同,实际的出版日期可能需要独立地确认。
本公开在以下实例中进一步描述,所述实例不限制权利要求中所描述的本公开的范围。
实例
实例1
ICELLIS反应器中慢病毒载体的优化制造
表1:试验参数
对于试验1-3,用于产生慢病毒载体以测试系统的质粒对增强绿色荧光蛋白(EGFP)转基因进行编码。对于试验4,所使用的质粒为Chim.CD18-LV载体,其对CD18转基因进行编码。
在每个试验中,使用四个生物反应器。所述四个生物反应器被配置为0.53、0.8、2.6或4型,使得在iCELLis纳米中宏载体的表面积为0.53、0.8、2.6或4平方米。细胞以1,500或2,000个细胞/cm2接种并且生长到直到细胞密度达到150-200,000个细胞/cm2为止,此时在以1cm/s的连续混合的情况下经6小时添加转染试剂混合物。表2中提供了转染时和试验结束时的细胞计数。
表2:转染时和试验结束时的细胞计数
ND=未确定。N/A=不适用。
如表1中所示出的,转染试剂混合物含有20或40μg/mL的DNA与125或180mM磷酸钙,pH为7.2或7.4。在以“2×”指示的情况下,使用两倍的转染试剂混合物的体积。转染试剂和DNA在室温下或37℃下混合。转染试剂混合物在含对溶液进行缓冲的UltraSALINE A(基于HEPES的盐水溶液)的DMEM细胞培养基中制成。向反应中添加200、400、600或1,000mL的转染试剂混合物直到800或1,000mL的总体积。
6小时之后,开始培养基的采集。此时生物反应器被清空,并向生物反应器中添加800ml的预热培养基。连接灌注培养基(5L)并开始灌注。在60小时内逐步进行采集,使得总共添加4-5个反应器体积(大约2,400-6,300mL)。采集之后,将采集材料在室温(RT)或4℃下储存。
如在表2(上文)和表3-6中所汇总的,对所收集材料进行以下评估:总细胞计数;GFP+细胞百分比(GFP%)和平均荧光强度(MFI)(当使用EGFP载体时);以载体基因组(vg)测量的基于逆转录酶定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的物理滴度;基于p24水平的病毒颗粒(vp);转导单位(TU);以及载体拷贝数(VCN)。p24水平通过酶联免疫吸附测定法使用来自的Lenti-XTMp25快速滴度试剂盒测量。慢病毒颗粒的滴度是通过假设每个慢病毒颗粒(LP)有大约2000个分子的p24来确定的;因此,1LP含有2,000×24×103/(6×1023)g的p24=8×10-5pg的p24;或1ng p24=1.25×107LP。
在所执行的16个试验中,试验13产生了最高的产量。采集材料在室温或4℃下储存。
表3:根据RTqPCR(VG)的物理滴度
表4:根据p24 ELISA(VP)的物理颗粒滴度
表5:感染滴度-根据GFP的转导单位滴度(TU)
表6:感染滴度-根据qPCR的载体拷贝数(VCN)
Claims (26)
1.一种制造重组慢病毒载体的方法,所述方法包括:
a.在具有一定床高和反应器体积的粘附生物反应器中的基质上以粘附方式在培养基中培养生产细胞,直到所述生产细胞达到预定细胞密度为止,其中所述基质包括低压实度宏载体;
b.用转染试剂混合物转染所述生产细胞,其中所述转染试剂混合物包括一种或多种DNA多核苷酸、pH为中性的磷酸钙(CaPho)和缓冲盐水(任选地,HEPES缓冲盐水);以及
c.采集所述重组慢病毒载体,由此产生采集材料。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述低压实度宏载体的床高为2cm、4cm或10cm。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中在所述转染步骤前达到的所述预定细胞密度为150-300×106个细胞/cm2。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,其中所述转染试剂混合物包括约125mMCaPho并且在37℃下pH为约7.2。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法,其中所述转染试剂混合物包括约20μg/mL的所述一种或多种DNA多核苷酸。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法,其中所述转染步骤包括:对于每三体积的培养基,向所述粘附生物反应器中添加约一体积的所述转染试剂混合物。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法,其中所述方法包括在所述转染步骤之后使所述培养基再循环通过所述基质持续约5-7小时,同时将pH维持在约7.2下。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法,其中所述采集步骤包括将所述培养基的pH维持在低于约pH 7.0下。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法,其中所述采集步骤包括经约24、48、60或72小时用约4反应器体积的采集培养基灌注所述基质。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法,其中所述方法包括使用半封闭式或封闭式系统处理所述采集材料,由此产生经纯化的材料。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述处理步骤包括离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法中的一种或多种。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法,其中所述处理步骤包括通过在一个或多个离心浓缩器中离心所述采集材料将所述重组慢病毒载体浓缩。
14.根据权利要求11或权利要求12所述的方法,其中所述处理步骤包括通过切向流过滤将所述重组慢病毒载体浓缩。
15.根据权利要求11到14中任一项所述的方法,其中所述方法包括对所述经纯化的材料进行测定以确定所述重组慢病毒载体的感染滴度。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法,其中与在未优化工艺参数的情况下制造的重组慢病毒载体相比,通过所述方法制造的所述重组慢病毒载体表现出的病毒转导功效增加约20%。
17.根据权利要求1到17中任一项所述的方法,其中所述多核苷酸对慢病毒载体基因表达盒进行编码,所述慢病毒载体基因表达盒包括所关注的基因或对所关注的多肽进行编码,所述多肽任选地选自由以下组成的组:RPK、ITGB2、FANCA、FANCC、FANCG、TCIRG1、CLCN7、TNFSF11、PLEKHM1、TNFRSF11A和OSTM1。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的方法,其中当施用于受试者时,通过所述方法产生的慢病毒载体能够实现基因修饰的细胞的大于10%的移植成活率和再增。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法,其中所述慢病毒载体是HIV源性慢病毒载体。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法,其中所述生产细胞是HEK293细胞或其衍生物,任选地HEK293T细胞或其衍生物。
21.一种重组慢病毒载体,其通过根据权利要求1到20中任一项所述的方法产生。
22.一种药物组合物,其包括根据权利要求21所述的重组慢病毒载体以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
23.一种药物组合物,其包括细胞群体,其中多个细胞由慢病毒载体转导。
24.一种根据权利要求21所述的重组慢病毒载体或根据权利要求22所述的药物组合物的用途,其用于向细胞提供由所述多核苷酸编码的多肽。
25.一种根据权利要求21所述的重组慢病毒载体或根据权利要求22所述的药物组合物的用途,其用于治疗有需要的哺乳动物受试者的疾病或病症。
26.一种粘附生物反应器,其适应于在根据权利要求1到20中任一项所述的方法中使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862765112P | 2018-08-16 | 2018-08-16 | |
US62/765,112 | 2018-08-16 | ||
PCT/US2019/046890 WO2020037249A1 (en) | 2018-08-16 | 2019-08-16 | Production methods for viral vectors |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112770768A true CN112770768A (zh) | 2021-05-07 |
Family
ID=69525853
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201980054406.9A Pending CN112770768A (zh) | 2018-08-16 | 2019-08-16 | 用于病毒载体的生产方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210198695A1 (zh) |
EP (1) | EP3836956A4 (zh) |
JP (1) | JP2021533831A (zh) |
KR (1) | KR20210053285A (zh) |
CN (1) | CN112770768A (zh) |
AU (1) | AU2019321612A1 (zh) |
BR (1) | BR112021002765A2 (zh) |
CA (1) | CA3109640A1 (zh) |
IL (1) | IL280840A (zh) |
MX (1) | MX2021001890A (zh) |
SG (1) | SG11202101421RA (zh) |
WO (1) | WO2020037249A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3177401A1 (en) * | 2020-05-04 | 2021-11-11 | Agc Biologics S.P.A. | Lentiviral vector manufacturing process in packed bed bioreactor |
EP4192487A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-06-14 | Spacecraft Seven, LLC | Plakophilin-2 (pkp2) gene therapy using aav vector |
EP4346913A2 (en) * | 2021-05-26 | 2024-04-10 | Wake Forest University Health Sciences | Gene therapy for dent disease |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20170051309A1 (en) * | 2014-09-25 | 2017-02-23 | Trizell Ltd. | Seeding An Adherent Cell Bioreactor With Non-Adherent Cells Increases Seeding Density Limit And Reduces Required Expansion Time |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69434594T2 (de) * | 1993-10-25 | 2006-09-21 | Canji, Inc., San Diego | Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung |
JP3815794B2 (ja) * | 1994-09-08 | 2006-08-30 | ジェネンテク・インコーポレイテッド | リン酸カルシウムトランスフェクション法 |
US5484720A (en) * | 1994-09-08 | 1996-01-16 | Genentech, Inc. | Methods for calcium phosphate transfection |
EP1504108B1 (en) * | 2002-02-01 | 2013-04-17 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Lentiviral vector |
EP3192874B1 (en) * | 2008-06-18 | 2019-10-16 | Oxford BioMedica (UK) Limited | Virus purification |
EP2486137B1 (en) * | 2009-10-05 | 2018-05-30 | Ya-Fang Mei | Replication-competent ad11p based viral vectors |
WO2015019505A1 (ja) * | 2013-08-09 | 2015-02-12 | 永田 啓司 | レンチウイルスベクターthtd、該thtdを含有する老化材 |
US20190225956A1 (en) * | 2016-05-10 | 2019-07-25 | United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Lentiviral delivery of crispr/cas constructs that cleave genes essential for hiv-1 infection and replication |
-
2019
- 2019-08-16 KR KR1020217005402A patent/KR20210053285A/ko unknown
- 2019-08-16 JP JP2021532281A patent/JP2021533831A/ja active Pending
- 2019-08-16 CA CA3109640A patent/CA3109640A1/en active Pending
- 2019-08-16 EP EP19849869.3A patent/EP3836956A4/en not_active Withdrawn
- 2019-08-16 SG SG11202101421RA patent/SG11202101421RA/en unknown
- 2019-08-16 US US17/268,409 patent/US20210198695A1/en active Pending
- 2019-08-16 WO PCT/US2019/046890 patent/WO2020037249A1/en active Application Filing
- 2019-08-16 MX MX2021001890A patent/MX2021001890A/es unknown
- 2019-08-16 BR BR112021002765-3A patent/BR112021002765A2/pt unknown
- 2019-08-16 CN CN201980054406.9A patent/CN112770768A/zh active Pending
- 2019-08-16 AU AU2019321612A patent/AU2019321612A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-02-14 IL IL280840A patent/IL280840A/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20170051309A1 (en) * | 2014-09-25 | 2017-02-23 | Trizell Ltd. | Seeding An Adherent Cell Bioreactor With Non-Adherent Cells Increases Seeding Density Limit And Reduces Required Expansion Time |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
A J VALKAMA ET AL: "Optimization of lentiviral vector production for scale-up in fixed-bed bioreactor", 《GENE THERAPY》, vol. 25, pages 39 - 46, XP055738781, DOI: 10.1038/gt.2017.91 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20210053285A (ko) | 2021-05-11 |
WO2020037249A1 (en) | 2020-02-20 |
SG11202101421RA (en) | 2021-03-30 |
US20210198695A1 (en) | 2021-07-01 |
IL280840A (en) | 2021-04-29 |
EP3836956A1 (en) | 2021-06-23 |
CA3109640A1 (en) | 2020-02-20 |
BR112021002765A2 (pt) | 2021-07-20 |
AU2019321612A1 (en) | 2021-03-18 |
EP3836956A4 (en) | 2022-05-18 |
JP2021533831A (ja) | 2021-12-09 |
MX2021001890A (es) | 2021-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3414321B1 (en) | Vcn enhancer compositions and methods of using the same | |
CN112770768A (zh) | 用于病毒载体的生产方法 | |
WO1997021825A1 (en) | Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant | |
WO1997021825A9 (en) | Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant | |
US20200149065A1 (en) | Foamy viral vector compositions and methods for the manufacture of same | |
US20210290685A1 (en) | Methods for gene modification of hematopoietic cells | |
CN1134537C (zh) | 人原始间叶干细胞群的制备方法 | |
LU et al. | Retrovirus-mediated gene expression in hematopoietic cells correlates inversely with growth factor stimulation | |
EP0821740A1 (en) | High efficiency ex vivo transduction of hematopoietic stem cells by recombinant retroviral preparations | |
Jonuschies et al. | The human desmin promoter drives robust gene expression for skeletal muscle stem cell-mediated gene therapy | |
AU2021393010A1 (en) | Vector | |
CN109266683B (zh) | 一种包含e4bp4基因的慢病毒重组载体及其制备方法和应用 | |
KR20220049568A (ko) | 엔젤만 증후군의 치료를 위한 ube3a | |
US20100143889A1 (en) | Rhabdoviridae virus preparations | |
JP2021519069A (ja) | 遺伝子改変リンパ球の製造方法 | |
WO2024003718A1 (en) | Methods and kits for the improved fermentative production of a recombinant virus | |
WO2021097246A1 (en) | Methods and products for treating renal disease | |
WO2023083760A1 (en) | Koala retrovirus envelope glycoproteins and uses thereof | |
KR20240099439A (ko) | 코알라 레트로바이러스 외피 당단백질 및 그 용도 | |
CN111235151A (zh) | 一种CXCR4基因的shRNA及其应用 | |
JP2023537979A (ja) | 臨床グレードのレンチウイルスベクターを製造する方法 | |
CN113544279A (zh) | 包含芳基硫酸酯酶a的重组载体及其在用于治疗异染性脑白质营养不良的干细胞治疗中的用途 | |
Kotani et al. | Safe, efficient production of retroviral vectors | |
Langfield et al. | 76. Development of Multigene Lentiviral Vectors Containing the Encephalomyocarditis Virus IRES and Foot-and-Mouth Disease Virus 2A Cleavage Factor | |
EP1358342A2 (en) | Retroviral vectors for transduction into quiescent cells and packaging systems for them |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210507 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |