CN112763607B - 一种用于检测高温储藏大米品质劣变的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于粮食储藏技术领域的一种用于检测高温储藏大米品质劣变的标志物及其应用。本发明通过检测不同储藏条件下大米样品，获得储存期间大米样品中的差异表达蛋白质，并进一步通过KEGG通路分析从代谢途径的角度挖掘储藏大米品质劣变相关差异蛋白质，其中包括胚胎发育晚期丰富蛋白19和谷蛋白A3，这些差异蛋白质可以作为用于检测高温储藏大米品质劣变。

Description

一种用于检测高温储藏大米品质劣变的标志物及其应用

技术领域

本发明属于粮食储藏技术领域，具体涉及一种用于检测高温储藏大米品质劣变的标志物及其应用。

背景技术

大米是我国人民的重要食品之一，稻谷垄谷后，大米由于失去稻壳的保护，胚乳直接与空气接触经过，大米中的淀粉、脂肪和蛋白质等会发生各种变化，使大米失去原有的色、香、味，营养成分和食用品质下降，甚至产生有毒有害物质。

虽然与大米中含量较多的淀粉与蛋白质相比，脂类更容易导致大米陈化变质，在储藏中脂类受到空气和高温的影响，极易加速大米劣变的速度，导致大米食用品质下降，因此我国现行稻谷储存品质判定规则(GB/T 20569-2006)是以游离脂肪酸值为标准来反映粮食的劣变程度和储存品质。然而，大米储藏品质的变化是一个动态过程，由于储藏过程中各指标变化敏感性不同，各种蛋白质(酶类)也会有很敏感的变化，对大米新鲜度的影响存在着不同程度的差异，不能用一个孤立的指标来评价其储藏品质，因此寻找新的大米新鲜度的表征和检测方法，对监控和检测大米品质，满足消费者对食品质量和安全方面及企业原料充分利用效益最大化有着重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于检测高温储藏大米品质劣变的标志物，其特征在于，所述标志物为蛋白标志物，包括胚胎发育晚期丰富蛋白19和谷蛋白A3中的一种或两种。

上述标志物，还包括膜类固醇结合蛋白2、谷蛋白B、丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫酰胺乙酰转移酶组分、HBG相似蛋白、半胱氨酸蛋白酶、嘌呤霉素敏感的氨肽酶、胚胎发育晚期丰富蛋白17、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶1、酰基-[酰基载体蛋白]水解酶、醛糖1-表异构酶、60S核糖体蛋白L5-1中的一种或一种以上。

本发明的另一目的在于提供上述标志物在检测高温储藏大米品质中的应用。

本发明的第三个目的在于提供上述标志物在制备检测高温储藏大米品质产品中的应用。

本发明的第四个目的在于一种检测高温储藏大米品质的方法，包括步骤如下：

(1)提取待测大米的蛋白；

(2)检测权利要求1或2所述标志物的含量，然后判定大米的品质。

上述方法中，所述判定的方法包括：比较储藏前后大米的标志物的含量，当含量差异倍数大于等于2时或小于等于0.5时，判定为劣变大米。

上述方法中，所述检测所述标志物的含量的方法包括：超高液相色谱-质谱法、免疫组化法或酶联免疫法。

所述高温为30℃-70℃。

本发明通过检测不同储藏条件下大米样品，获得储存期间大米样品中的差异表达蛋白质，并进一步通过KEGG通路分析从代谢途径的角度挖掘储藏大米品质劣变相关差异蛋白质，其中包括胚胎发育晚期丰富蛋白19和谷蛋白A3，这些差异蛋白质可以作为用于检测高温储藏大米品质劣变，在其他大米的验证下，证明有效。

附图说明

图1为稻花香二号新鲜大米和30℃、70℃储藏大米的蛋白质丰度分布主成分分析结果；其中D为新鲜大米，D30为30℃储藏后的样品，D70为70℃储藏后的样品；后面的1，2，3代表不同的平行重复。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

实施例1高温储藏后大米蛋白质的表达量的不同

大米一般除了用于本地消费外，每年都有大量的大米需要跨地区运输。中国东北地区每年有超400万吨的粳米流出省外，占据我国大米跨省运输量的35％以上。大米的运输方式主要有海运、铁路、铁水联运、公水联运和公路直达，其中85％运输方式涉及集装箱运输。一般集装箱运输过程需要2-10个月，其中海上的集装箱内部温度甚至达到70℃以上。为了判断储藏后的大米的品质，设置了30℃和70℃储藏的条件，以便在最短的时间达到长时间储藏的效果。

(1)样品

选取大米稻花香二号，以新鲜状态的大米作为对照，在30℃下储藏300天和在70℃下储藏300天的大米作为实验组，整体分为三组，每组做三次平行。

(2)样品准备

于待裂解样品中加入裂解液(1％SDS,8M urea,1x Protease InhibitorCocktail(Roche Ltd.Basel,Switzerland)，震荡研磨3×400s，冰上裂解30min。高速离心15min(15000r/min,4℃)后取上清，得到总蛋白。

(3)蛋白酶解

从各个样本中分别取100μg总蛋白转移至新的EP管中，用8M urea调至100μL定容。加入2μL 0.5M TCEP于37℃下反应1小时，随后加入4uL 1M碘乙酰胺，室温下避光反应40min。然后，按样品：丙酮(体积比)为1:5加入-20℃预冷丙酮，并于-20℃下过夜沉淀。随后高速离心(12000g,20min,4℃)弃去上清。加入1mL-20℃预冷的90％丙酮溶液，涡旋混匀清洗样品后，再次高速离心(12000g,20min,4℃)弃上清。清洗步骤重复两次。室温干燥至沉淀表面的丙酮完全挥干后，将其重溶于100μL 100mM TEAB，按酶：蛋白(质量比)为1:50加入trypsin(Promega,Madison,WI)，37℃过夜酶解。

采用C18除盐柱除盐后，得到除盐后肽段混合物，使用肽段定量试剂盒(Pierce^TM23275)测定肽段最终浓度并冻干。

(4)建立谱图数据库

①高pH反相分离

将除盐冻干后的肽段混合物重溶于buffer A(buffer A:20mM甲酸铵水溶液,氨水调节至pH 10.0)后，用Ultimate 3000系统(Thermo Fisher scientific,MA,USA)连接反向柱(XBridge C18 column,4.6mm×250mm,5μm,(Waters Corporation,MA,USA))进行高pH分离，分离使用线性梯度，40min内5％B至45％B(B:80％ACN中加入20mM甲酸铵,氨水调节至pH10.0)。柱子在初始条件下平衡15min，柱流速维持在1mL/min，柱温维持在30℃。收集到10个馏分。各个馏分在真空浓缩仪中干燥待用。

②nano-UHPLC-MS/MS分析

将除盐冻干后的肽段混合物重溶于含0.5％甲酸的5％乙腈水溶液后，经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析。整套系统为串联EASY-nLC系统的Q Exactive^TM HF-X质谱仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)。总共上样2μL(捕集柱Thermo Fisher ScientificAcclaim PepMap C18,100μm×2cm，分析柱Acclaim PepMap C18,75μm x 25cm)，以120min梯度分离：5％-38％B(B:0.1％甲酸，80％乙腈水溶液)。柱流量控制在250nL/min，电喷雾电压2kV。

将Q Exactive^TM HF-X质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：(1)MS:scan range(m/z)＝375–1400；resolution＝120,000；AGC target＝3e6；maximum injection time＝20ms；include charge states＝2-6；dynamic exclusion＝30s；(2) HCD-MS/MS: resolution＝15,000； isolation window＝1.2； AGC target＝1e5；maximum injection time＝30ms；collision energy＝27。

③搜库

将检测得到的原始数据通过Spectronaut X(Biognosys AG)合并分析搜库(uniprot)，采用软件默认的参数建库，得到谱库。

从uniprot官方网站下载得到文件，即序列数据库。序列数据库为uniprot-proteome-oryzasativa-UP000059680.fasta及

UP000059680_indica.fasta，设置Trypsin酶解。搜库参数固定修饰：Carbamidomethyl(C)，可变修饰：methionine氧化。母离子和肽段水平的假阳性率(FDR)都设置为1％。

(5)DIA数据采集及分析

①nano-UHPLC-MS/MS数据采集

将各样品分别加入30μL solvent A(A:0.1％甲酸水溶液)中制成悬浮液，取出9μL加入1μL 10×iRT肽段，混合后用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套系统为串联EASY-nLC系统的Q Exactive^TM HF-X质谱仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)。总共上样2μL(捕集柱Thermo Fisher Scientific Acclaim PepMap C18,100μm x 2cm，分析柱Acclaim PepMap C18,75μm x 25cm)，以120min梯度分离：5％-38％B(B:0.1％甲酸，80％乙腈水溶液)。柱流量控制在250nL/min，电喷雾电压2kV。

质谱参数设置如下：(1)MS:扫描范围(m/z)：350–1250；分辨率：120,000；AGCtarget：3e6；最大注入时间：20ms；(2)HCD-MS/MS:分辨率：30,000；AGC target：1e6；碰撞能量：25.5，27，30。(3)可变窗口采集，设置了60个窗口，设置重叠串口，每个窗口重叠1m/z，总循环时间为3s。

②数据分析

采用Spectronaut默认参数(BGS Factory Settings(default))对DIA数据进行分析，根据iRT肽段软件可以自动矫正保留时间和质量窗口，自动决定理想的提取窗口。蛋白质定性标准：Precursor Threshold1.0％FDR,Protein Threshold 1.0％FDR。Decoy数据库采用mutated策略生成，类似于将随机数量(最少2个氨基酸，最多肽段总长度的一半)的氨基酸序列打乱。Spectronaut进行自动校正，所有符合筛选条件的MS1都用来计算表达量，所有的干扰碎片离子都被排除除非少于3个碎片离子。小于1.0％FDR的前3个肽段的峰面积的平均值用来进行蛋白group的定量。

差异筛选标准：Welch's ANOVATest分析后取p value<0.01，fold change>2的差异蛋白。通过KEGG通路分析从代谢途径的角度挖掘储藏大米品质劣变相关差异蛋白质。

实施例2

(1)方法学验证：对样本检测到的蛋白，通过主成分分析(Principal ComponentAnalysis,PCA)后，计算有关蛋白质表达量的主成分，在二维图中，我们取前两个主成分PC1，PC2来表示样本。若样本相似，那么他们的主成分的值也应该相近，在图上显示就应该彼此接近，以此也可以说明样本重复的好坏。由图1可知大米在不同储藏条件下产生的蛋白在同一状态下具有较好的重复性，可以显著区分开其蛋白品质。

(2)差异表达蛋白的确定：在进行蛋白质相对定量分析时，如果蛋白质表达丰度比大于2.0或者小于0.5，且统计检验p<0.01时，该蛋白就定义为差异表达蛋白，其中大于2.0的为上调蛋白，小于0.5的为下调蛋白。大米与储藏初始相比，储藏300d后，在30℃条件下，共发现157种差异表达蛋白，其中表达上调的蛋白有120种，表达下调的蛋白有37种；70℃的样品与储藏之前的样品相比较，共有395个表达差异蛋白，其中表达上调的蛋白有240种，表达下调的蛋白有155种；70℃样品与30℃相比，共有201种表达差异蛋白，其中84个表达上调，117个表达下调。可以看出，大米在70℃下储藏，比在30℃下，表达上调的蛋白增多，表达下调的蛋白减少。这些结果表明，大米储藏过程中蛋白组变化对温度敏感，高温促进了大米在储藏过程中蛋白质分子水平上生理生化变化，导致更多差异蛋白的表达，从而加速了大米的品质劣变。

(3)与品质劣变相关的差异蛋白的质谱鉴定及代谢途径分析

大米在储藏过程中的品质劣变是多种因素共同作用的结果，但主要是与蛋白质的降解、脂肪的氧化、淀粉的水解有关。因此，对大米储藏期间品质劣变相关的差异蛋白主要从这三个方面进行筛选分析。

①30℃条件下共筛选出与品质劣变相关的差异蛋白23种(见表1)。这些蛋白中差异性较强的蛋白为(Bos taurus)similar to HBG protein(与HBG蛋白相似)、Amineoxidase(胺氧化酶)、Hexokinase-7(己糖激酶-7)、ATP synthase subunit alpha,mitochondrial(ATP合成酶α亚基，线粒体)、Homoserine dehydrogenase(高丝氨酸脱氢酶)、Aspartate aminotransferase(天冬氨酸转氨酶)、Phospholipid scramblase(磷脂促翻转酶)、40S ribosomal protein S4(40S核糖体蛋白S4)、Cytokinin dehydrogenase 1(细胞分裂素脱氢酶1)、60S ribosomal protein L5-1(60S核糖体蛋白L5-1)等。

总共参与了18条代谢途径，这些代谢途径主要是与蛋白质的翻译、糖酵解过程、氨基酸的代谢、长链脂肪酸的代谢谷胱甘肽代谢、次生代谢产物的生物合成、己糖代谢、氧化还原稳态反应、乙醛酸和二羧酸酯代谢、氧化还原稳态的维持相关。

②70℃条件下共筛选出与品质劣变相关的差异蛋白56种(见表1)。这些蛋白中差异性较强的蛋白为Membrane steroid-binding protein2(膜类固醇结合蛋白2)、(Bostaurus)similar to HBG protein(与HBG蛋白相似)、Glutelin type-A3(谷蛋白A3)、Glutelin type-B 2(谷蛋白B2)、UDP-glucose:2-hydroxlavanone C-glucosyltransferase(UDP-葡萄糖：2-羟基黄烷酮C-葡萄糖基转移酶)、S-acyltransferase(S-酰基转移酶)、Phospholipid scramblase(磷脂促翻转酶)、Aldose 1-epimerase(醛糖1-表异构酶)、Cytokinin dehydrogenase 1(细胞分裂素脱氢酶1)、60Sribosomal protein L5-1(60S核糖体蛋白L5-1)等。

总共参与了36条代谢途径，这些代谢途径主要是与脂质转运、脂肪酸的生物合成、脂肪酸的氧化、细胞氧化还原稳态的维持、糖酵解过程、碳水化合物代谢、冷适应、己糖代谢过程、蛋白水解、氨基酸的代谢、对氧化应激的反应和三羧酸循环等相关。

②70℃(高温)相比30℃显著变化的差异蛋白有13种，分别为Membrane steroid-binding protein 2(膜类固醇结合蛋白2)、Glutelin type-B(谷蛋白B)、Dihydrolipoamide acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenasecomplex(丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫酰胺乙酰转移酶组分)、similar to HBG protein(相似HBG蛋白)、Glutelin type-A3(谷蛋白A3)、Cysteine protease(半胱氨酸蛋白酶)、Puromycin-sensitive aminopeptidase(嘌呤霉素敏感的氨肽酶)、Late embryogenesisabundant protein 17(胚胎发育晚期丰富蛋白17)、Late embryogenesis abundantprotein 19(胚胎发育晚期丰富蛋白19)、6-phosphogluconolactonase 1(6-磷酸葡萄糖酸内酯酶1)、Acyl-[acyl-carrier-protein]hydrolase(酰基-[酰基载体蛋白]水解酶)、Aldose 1-epimerase(醛糖1-表异构酶)和60S ribosomal protein L5-1(60S核糖体蛋白L5-1)。

表1大米在储藏过程中与品质劣变相关的差异表达蛋白

(4)高温储藏大米的差异蛋白标记物验证

选取另外一种大米(茉莉)，进行相同的储藏实验，分组为新鲜大米、30℃下储藏300天和在70℃下储藏300天，进行蛋白标志物检测，并进行蛋白质组学分析，结果发现Lateembryogenesis abundant protein 19和Glutelin type-A3和先前的实验表现出相似的变化规律，且高温后变化显著(表2)，它们可以作为高温储藏大米的差异蛋白标记物。

表2茉莉大米在储藏过程中与品质劣变相关的部分差异表达蛋白

Claims (8)

1.一种用于检测高温储藏大米品质劣变的标志物，其特征在于，所述标志物为蛋白标志物，为胚胎发育晚期丰富蛋白19、谷蛋白A3、膜类固醇结合蛋白2、谷蛋白B、丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫酰胺乙酰转移酶组分、HBG相似蛋白、半胱氨酸蛋白酶、嘌呤霉素敏感的氨肽酶、胚胎发育晚期丰富蛋白17、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶1、酰基-[酰基载体蛋白]水解酶、醛糖1-表异构酶和60S核糖体蛋白L5-1。

2.权利要求1所述的标志物在检测高温储藏大米品质中的应用。

3.权利要求1所述的标志物在制备检测高温储藏大米品质产品中的应用。

4.胚胎发育晚期丰富蛋白19和谷蛋白A3中的一种或两种在检测高温储藏大米品质中作为标志物的应用。

5.胚胎发育晚期丰富蛋白19和谷蛋白A3中的一种或两种在制备检测高温储藏大米品质产品中作为标志物的应用。

6.一种检测高温储藏大米品质的方法，其特征在于，包括步骤如下：

（1）提取待测大米的蛋白；

（2）检测权利要求1所述标志物或胚胎发育晚期丰富蛋白19和谷蛋白A3中的一种或两种的含量，然后判定大米的品质。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述判定的方法包括：比较储藏前后大米的标志物的含量，当含量差异倍数大于等于2时或小于等于0.5时，判定为劣变大米。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测权利要求1所述标志物的含量的方法包括：超高液相色谱-质谱法、免疫组化法或酶联免疫法。

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