CN112759549B - 3-取代氨基-4-((取代吡啶基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮类化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了3‑取代氨基‑4‑((取代吡啶基)氨基)环丁‑3‑烯‑1,2‑二酮类化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗和/或预防由结核分枝杆菌引起的感染性疾病中的应用。具体地说，本发明涉及式(I)所示化合物，其药学可接受的盐以及包含本发明化合物的药物组合物，其中R1、R2如说明书所述。本发明旨在制备具有抗结核分枝杆菌活性的新化合物，其作为潜在的新药物，可用于由细菌引起的感染性疾病，特别是由结核分枝杆菌引起的肺结核(TB)疾病的治疗或预防性治疗，同时可用于克服与结核分枝杆菌耐药相关的问题。

Description

3-取代氨基-4-((取代吡啶基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮类 化合物
技术领域
本发明属于医药技术领域。特别涉及通式(I)所示的3-取代氨基-4-((取代吡啶基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮类化合物，其制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗和/或预防由结核分枝杆菌引起的感染性疾病中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的肺部感染致死性传染病，由于其潜伏期较长，容易造成结核病的大面积传播。根据世界卫生组织2018年结核病研究报告显示，结核病作为十大致死性疾病之一，现已超越艾滋病成为单一致死性感染疾病之首。据估计2017年全球约有1000万新发结核病患者，130万人因病致死，另有30万人死于结核病合并艾滋病感染。新发结核病患者主要集中在印度、中国、南非等发展中国家。全球23％的人口(约17亿)具有潜伏结核感染，其发展为结核病的风险不容忽视。近年来随着耐药菌的不断涌现，以及TB/HIV共感染的增加，结核病的治疗形势越发的严峻起来，对抗结核药物的研发提出了新的挑战，研制具有新结构、新机制的抗结核新药迫在眉睫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖并具有抗结核分枝杆菌活性的3-取代氨基-4-((取代吡啶基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮类化合物。本发明人发现，3-取代氨基-4-((取代吡啶基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮类化合物具有较好的抗结核分枝杆菌作用，可用于由细菌引起的感染性疾病，特别是由结核分枝杆菌引起的肺结核(TB)疾病的治疗或预防性治疗，同时可用于克服与耐药性有关的问题。本发明基于以上发现而得以完成。
发明概述
为此，本发明第一方面提供通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R2为H、F、Cl、Br、I、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷胺基、C1-C3酰基或C1-C3酰胺基，R2代表1、2、3或4个取代基，取代基可以相同或不同；
R3为H、F、Cl、Br、I、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷胺基、C1-C6酰基、C1-C6酰胺基、C3-C6环烷基或C3-C6杂环基，R3代表1、2、3、4或5个取代基，取代基可以相同或不同；
当所述R3为C3-C6环烷基或C3-C6杂环基时，其可被单个或多个C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、C1-C3酰基或氧代基团取代；
R4为H、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基或C1-C3酰基；
R5为H、F、Cl、Br、I、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷胺基、C1-C3酰基或C1-C3酰胺基，R5代表1、2或3个取代基，取代基可以相同或不同；
R6为H、F、Cl、Br、I、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基或C1-C3酰基；
式(I)所示的化合物不包括：
在一优选例中，所述化合物结构式如(II)所示：
R2为H、F、Cl、Br、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基，R2代表1、2、3或4个取代基，取代基可以相同或不同；
R3为H、F、Cl、Br、I、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷胺基、C1-C6酰基或C1-C6酰胺基，R3代表1、2、3、4或5个取代基，取代基可以相同或不同；
或R3为 这些环烷基或杂环烷基可被单个或多个C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、C1-C3酰基或氧代基团取代；
化合物不包括：
在另一优选例中，所述化合物结构式如(I)所示：
其中，
R1为
R2为H、F、Cl、Br、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基，R2代表1、2、3或4个取代基，取代基可以相同或不同；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为H、F、Cl、Br、羟基、硝基、三氟甲基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基，R5代表1、2或3个取代基，取代基可以相同或不同；
R6为H、F、Cl、Br或C1-C3烷基。
在另一优选例中，所述化合物结构式如(I)所示：
其中，
R1为
R2为H、F、Cl、Br、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基，R2代表1、2、3或4个取代基，取代基可以相同或不同；
R5为H、F、Cl、Br、羟基、硝基、三氟甲基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基，R5代表1、2或3个取代基，取代基可以相同或不同。
本发明中所述的药学上可接受的盐为本发明化合物与选自下列的酸形成的盐：盐酸、对甲苯磺酸、酒石酸、马来酸、乳酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乙酸或三氟乙酸。
根据本发明第一方面任一项的化合物，其为实施例制备的本发明目标化合物(以结构式表示的或以系统命名描述的)及其异构体，其药学可接受的盐。
根据本发明第一方面任一项化合物，其为选自下列的化合物：
本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述化合物的方法，其包括以下步骤：
(1)
化合物A在合适的溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇)中，与化合物R1NH2，在空气或惰性气体(Ar或N2)保护下，置于室温或加热至回流反应1-24小时，其中优选室温反应8-15小时，得到式B所示化合物；
式B所示化合物在合适的溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇)中，与化合物在空气或惰性气体(Ar或N2)保护下，置于室温或加热至回流反应1-24小时，其中优选室温反应8-15小时，得到式(I)化合物；或(2)
化合物A在合适的溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇)中，与化合物在空气或惰性气体(Ar或N2)保护下，置于室温或加热至回流反应1-24小时，其中优选室温反应8-15小时，得到式C所示化合物；
式C所示化合物在合适的溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇，优选乙醇)中，与化合物R1NH2，在空气或惰性气体(Ar或N2)保护下，置于室温或加热至回流反应1-24小时，其中优选室温反应8-15小时，得到式(I)化合物。
本发明第三方面提供了一种药用组合物，其包括治疗有效量的本发明第一方面任一项所述化合物及其药学可接受的盐，以及任选的一种或多种药学可接受的辅料。
本发明第四方面提供了本发明第一方面任一项所述化合物及其药学可接受的盐，或者本发明第三方面任一项所述药物组合物在制备治疗和/或预防结核分枝杆菌引起的感染性疾病药物中的应用。
前面所述内容只概述了本发明的某些方面，但并不限于这些方面。这些方面及其他方面内容将在下面做更加具体完整的描述。
发明详述
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。下面是本发明所用多种术语的定义，这些定义适用于本申请整个说明书中所用的术语，除非在具体情况中另作说明。
一般而言，术语“取代或未取代的”表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构始终不只有一个位置能被选自具体基团得一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。
Ci-Cj表示具有整数“i”(包含i)至整数“j”(包含j)个碳原子的部分。因此，例如C1-C6烷基指具有1、2、3、4、5、6个碳原子的烷基，C1-C3烷基指具有1、2、3个碳原子的烷基。例如C3-C6杂环基指具有3至6个(包含3和6)碳原子的杂环基，包含但不限于吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、哌啶基。
如本文所述的，术语“烷基”是指具有指定数目碳原子数的烷基，其为直链或支链的烷基，并且其可包括其子基团，例如提及“C1-C3烷基”时，其还可以包括C1-C2烷基表示的子范围的基团，以及具体基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基。
如本文所述的，术语“烷氧基”和“烷胺基”属于惯用表达，是指分别通过一个氧原子或胺基连接到分子的其余部分的烷基基团，其中的烷基如本发明所述。
如本文所述的，术语“卤代烷基”表示烷基基团上的氢被一个或多个卤素原子所取代，这样的实例包含，但并不限于，单氟甲基、单氟甲氧基等。
如本文所述的，术语“卤代”表示氟(F)、氯(Cl)或溴(Br)。
本发明中“室温”指的是温度由10℃到40℃。在一些实施例中，“室温”指的是温度由20℃到30℃；在另一些实施例中，室温指的是25℃。
如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现所期望的治疗本发明所述疾病或病症的药物用量。
如本文所述的，术语“药学可接受的”例如在描述“药学可接受的盐”时，表示该盐不但是受试者生理学上可接受，而且还可指在药学上有使用价值的合成物质。
如本文所述的，术语“药物组合物”，其还可以是指“组合物”，其可用于在受试者特别是哺乳动物中实现治疗本发明所述疾病或病症。
疾病的“治疗”包括：
(1)预防该疾病，即，使暴露至或易感染该疾病但未经历或显示该疾病症状的哺乳动物不发生该疾病的临床症状，
(2)抑制该疾病，即，阻止或减少该疾病或其临床症状的进展，
(3)减轻该疾病，即，引起该疾病或其临床症状的复原。
“治疗有效量”指为了治疗疾病向哺乳动物施用时足以实现对该疾病的治疗的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、待治疗的疾病及其严重性以及哺乳动物的年龄、体重、性别等因素而变化。治疗有效量还可指足以实现所需的有益效果的化合物的任何量，该有益效果包括如以上(1)-(3)所述的预防疾病、抑制疾病或减轻疾病。例如化合物的量可以介于0.1-250mg/kg，或优选地，0.5-100mg/kg，或更优选地，1-50mg/kg，或甚至更优选地，2-20mg/kg。优选地，所述量的化合物每天两次向哺乳动物施用。更优选地，所述量的化合物每天一次向哺乳动物施用。
如本文所述的，术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。例如，本发明所述疾病和/或病症指结核杆菌感染性疾病。
如本文所述的，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明式I化合物或其药物组合物以治疗本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
本发明再一方面还涉及以本发明中的化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。
本发明中的化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助溶剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助溶剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助溶剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助溶剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
有益技术效果
本申请的发明人经过广泛的研究，合成了一系列化合物，并通过MABA(Microplatealamar blue assay)法以M.tuberculosis H37Rv菌株进行最低抑菌浓度MIC(Minimuminhibitory concentration)测定，所测试化合物显示出较强的抗结核分枝杆菌包括敏感菌和耐药菌活性。其中部分化合物的最低抑菌浓度(MIC)达到微摩尔水平，8个化合物的MIC<1μg/mL，显示出强的抗结核活性。此外，化合物对Vero细胞毒性低(IC50大于64μg/mL)显示出良好的安全性。本发明提供了结构新颖、抗结核活性强、药代性质良好的3-取代氨基-4-((取代吡啶基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮类化合物，可用于由细菌引起的感染性疾病，特别是由结核分枝杆菌引起的结核病的治疗或预防性治疗，同时也可用于克服与耐药性有关的问题。
对比文件(J.Med.Chem.2017,60,1379-1399)中公布了化合物D在治疗结核分枝杆菌方面的应用。
对比文件中公布化合物D的体外抗结核分枝杆菌(H37Rv)活性MIC值为0.175μg/mL。根据对比文件所报道的合成路线合成化合物D并测试其小鼠/人肝细胞及肝微粒体代谢稳定性。结果表明，化合物D在肝微粒体中温孵30分钟后代谢剩余量(1.21％/小鼠，18.0％/人)明显低于本发明化合物30(74.5％/小鼠，96.5％/人)。同样，化合物D在肝细胞代谢稳定性考察中，T1/2(17.1分钟/小鼠，31.7分钟/人)明显低于本发明化合物30和49(>93.2分钟/小鼠，>93.2分钟/人)，化合物D的内在清除率(40.6μL/min/million cell/小鼠，21.9μL/min/million cell/人)明显高于本发明化合物30和49(<7.4μL/min/million cell/小鼠，<7.4μL/min/million cell/人)。因此，与对比文件公布的化合物D相比，本发明的化合物具有明显改善的药代性质。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进是显而易见的。
对于以下全部实施例，可使用本领域技术人员已知的标准操作和纯化方法。化合物的结构是通过核磁共振谱(NMR)来确定的。高分辨质谱采用Thermo Exactive Plusspectrometer液质联用仪测定。
制备实施例部分
化合物的结构是通过核磁共振谱(NMR)来确定的。核磁共振氢谱及碳谱位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。耦合常数(J)以赫兹(Hz)为单位。核磁共振谱用Mercury-400或Mercury-500型核磁共振仪测定，氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)或氘代氯仿(CDCl3)作溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标。高分辨质谱采用Thermo Exactive Plus spectrometer液质联用仪测定。
柱层析一般使用300～400目硅胶为载体。
试剂均为市售分析纯。
实施例实施例1
3-(苯基氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物1)的制备
路线：
实验步骤：
第一步3-甲氧基-4-(苯基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮的制备
于25mL反应瓶中，将苯胺(186mg，2.00mmol)与3,4-二甲氧基-3-环丁烯-1,2-二酮(284mg，2.00mmol)溶解在10mL无水乙醇中，室温下搅拌12小时。浓缩，硅胶(200-300目)柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷(V：V＝1～2:100)混合液为洗脱剂。得中间体B-1，浅黄色固体380mg，收率93.5％。
第二步3-(苯基氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物1)的制备
于10mL反应瓶中，将3-甲氧基-4-(苯基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(203mg，1.00mmol)与2-氨甲基吡啶(108mg，1.00mmol)在10mL无水乙醇中，室温下搅拌12小时。浓缩，硅胶(200-300目)柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷(V：V＝1～3:100)混合液为洗脱剂。得化合物1，类白色固体210mg，收率75.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.83(brs,1H),8.60(d,J＝4.2Hz,1H),8.20(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.44(t,J＝7.5Hz,3H),7.35(dd,J＝13.4,5.8Hz,3H),7.03(t,J＝7.3Hz,1H),4.94(d,J＝4.9Hz,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H14N3O2,280.1081；实测值：280.1080.
实施例2
3-((4-氟苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物2)的制备
以对氟苯胺(186mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物2，类白色固体170mg，收率57.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(brs,1H),8.60(d,J＝4.4Hz,1H),8.17(brs,1H),7.85–7.81(m,1H),7.47–7.42(m,3H),7.37–7.33(m,1H),7.21–7.16(m,2H),4.93(d,J＝5.0Hz,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H13FN3O2,298.0986；实测值：298.0986。
实施例3
3-((4-氯苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物3)的制备
以对氯苯胺(256mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物3，类白色固体170mg，收率54.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.91(brs,1H),8.60(d,J＝4.3Hz,1H),8.21(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.51–7.41(m,3H),7.37(d,J＝8.9Hz,2H),7.36–7.32(m,1H),4.93(d,J＝4.8Hz,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H13ClN3O2,314.0691；实测值：314.0690。
实施例4
3-((4-溴苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物4)的制备
以对溴苯胺(344mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物4，黄色固体210mg，收率58.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(brs,1H),8.60(d,J＝4.7Hz,1H),8.21(brs,1H),7.83(t,J＝7.7Hz,1H),7.50(d,J＝7.0Hz,2H),7.42(dd,J＝11.0,8.5Hz,3H),7.37–7.33(m,1H),4.93(d,J＝3.1Hz,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H13BrN3O2,358.0186；实测值：358.0190。
实施例5
3-((4-羟基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物5)的制备
以对羟基苯胺(218mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物5，灰色固体200mg，收率67.7％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.61(brs,1H),8.59(s,1H),8.06(brs,1H),7.82(t,J＝7.5Hz,1H),7.42(d,J＝7.7Hz,1H),7.36–7.32(m,1H),7.24(d,J＝7.9Hz,2H),6.73(d,J＝8.2Hz,2H),4.91(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H14N3O3,296.1030；实测值：296.1027。
实施例6
3-((4-硝基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物6)的制备
以对硝基苯胺(276mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物6，橙色固体168mg，收率51.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.38(brs,1H),8.61(s,1H),8.38(brs,1H),8.22(d,J＝8.5Hz,2H),7.84(s,1H),7.63(d,J＝7.6Hz,2H),7.45(d,J＝7.4Hz,1H),7.36(s,1H),4.96(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H13N4O4,325.0931；实测值：325.0930。
实施例7
3-((4-氰基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物7)的制备
以对氰基苯胺(236mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物7，黄色固体190mg，收率62.4％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.22(brs,1H),8.60(s,1H),8.38(brs,1H),7.83(s,1H),7.78(d,J＝7.7Hz,2H),7.60(d,J＝7.1Hz,2H),7.44(d,J＝7.3Hz,1H),7.36(s,1H),4.95(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H13N4O2,305.1033；实测值：305.1033。
实施例8
3-((2-甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物8)的制备
以邻甲氧基苯胺(246mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物8，类白色固体180mg，收率58.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.37(brs,1H),8.81(brs,1H),8.60(d,J＝4.5Hz,1H),7.83(t,J＝7.3Hz,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.40–7.29(m,1H),7.06–6.99(m,2H),6.95–6.90(m,1H),4.95(d,J＝5.7Hz,2H),3.88(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H16N3O3,310.1186；实测值：310.1182。
实施例9
3-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物9)的制备
以对三氟甲氧基苯胺(354mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物9，类白色固体185mg，收率50.9％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.97(brs,1H),8.60(d,J＝4.3Hz,1H),8.23(brs,1H),7.84(td,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.40–7.29(m,3H),4.94(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H13F3N3O3,364.0904；实测值：364.0902。
实施例10
3-((4-甲苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物10)的制备
以对甲基苯胺(214mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物10，类白色固体190mg，收率64.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.76(brs,1H),8.60(s,1H),8.14(brs,1H),7.83(t,J＝6.9Hz,1H),7.43(d,J＝7.4Hz,1H),7.38–7.30(m,3H),7.14(d,J＝7.3Hz,2H),4.93(s,2H),2.25(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H16N3O2,294.1237；实测值：294.1233。
实施例11
3-((4-甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物11)的制备
以对甲基苯胺(246mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物11，类白色固体200mg，收率64.7％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.72(brs,1H),8.60(d,J＝4.0Hz,1H),8.08(brs,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.39–7.33(m,3H),6.92(d,J＝8.5Hz,2H),4.92(s,2H),3.73(s,3H)HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H16N3O3,310.1186；实测值：310.1177。
实施例12
3-((4-乙酰基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物12)的制备
以对乙酰基苯胺(270mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物12，黄色固体190mg，收率59.1％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.17(brs,1H),8.62(s,1H),8.35(brs,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,2H),7.85(s,1H),7.57(d,J＝7.2Hz,2H),7.46(d,J＝7.4Hz,1H),7.37(s,1H),4.96(s,2H),2.53(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H16N3O3,322.1186；实测值：322.1186。
实施例13
3-((4-(甲基氨基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物13)的制备
以4-N-甲基苯胺(244mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物化合物13，土黄色固体165mg，收率53.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.59(brs,1H),8.61–8.58(m,1H),8.01(s,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.36–7.32(m,1H),7.18(d,J＝8.6Hz,2H),6.52(d,J＝8.8Hz,2H),5.53(d,J＝5.1Hz,1H),4.91(d,J＝5.6Hz,2H),2.65(d,J＝5.1Hz,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H17N4O2,309.1346；实测值：309.1339。
实施例14
3-((4-(N,N-二甲基氨基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物14)的制备
以4-N,N-二甲基苯胺(272mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物14，黄色固体200mg，收率62.0％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.63(brs,1H),8.61–8.58(m,1H),8.03(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.3,5.0Hz,1H),7.27(d,J＝8.8Hz,2H),6.73(d,J＝9.0Hz,2H),4.92(d,J＝5.5Hz,2H),2.85(s,6H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H19N4O2,323.1503；实测值：323.1497。
实施例15
3-((4-(N,N-二乙基氨基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物15)的制备
以4-N,N-二乙基苯胺(328mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物15，黄色固体190mg，收率54.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.63(brs,1H),8.59(ddd,J＝4.9,1.7,0.9Hz,1H),8.04(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(ddd,J＝7.5,4.8,1.0Hz,1H),7.24(d,J＝8.9Hz,2H),6.65(d,J＝9.1Hz,2H),4.91(d,J＝5.6Hz,2H),3.29(q,J＝7.0Hz,4H),1.06(t,J＝7.0Hz,6H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H23N4O2,351.1816；实测值：351.1808。
实施例16
3-((4-(N-甲基(N-乙基)氨基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物16)的制备
以4-N-甲基-N-乙基苯胺(300mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物16，黄色固体200mg，收率59.5％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.61(brs,1H),8.59(s,1H),8.01(brs,1H),7.83(s,1H),7.42(d,J＝7.3Hz,1H),7.35(s,1H),7.26(d,J＝6.8Hz,2H),6.71(t,J＝11.8Hz,2H),4.92(s,2H),3.35(d,J＝6.5Hz,2H),2.82(s,3H),1.01(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C19H21N4O2,337.1659；实测值：337.1651。
实施例17
3-((4-(吡咯烷-1-基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物17)的制备
以4-(吡咯烷-1-基)苯胺(324mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物17，黄色固体190mg，收率54.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.60(brs,1H),8.59(ddd,J＝4.8,1.6,0.8Hz,1H),8.01(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(ddd,J＝7.4,4.9,0.9Hz,1H),7.26(d,J＝8.6Hz,2H),6.52(d,J＝8.9Hz,2H),4.91(d,J＝5.5Hz,2H),3.19(t,J＝6.5Hz,4H),2.01–1.82(m,4H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H21N4O2,349.1659；实测值：349.1651。
实施例18
3-((4-(哌啶-1-基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物18)的制备
以4-(哌啶-1-基)苯胺(352mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物18，灰色固体200mg，收率55.2％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.66(brs,1H),8.59(s,1H),8.05(brs,1H),7.84(d,J＝6.5Hz,1H),7.42(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(s,1H),7.28(d,J＝7.2Hz,2H),6.91(d,J＝8.0Hz,2H),4.92(s,2H),3.06(s,4H),1.61(s,4H),1.51(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H23N4O2,363.1816；实测值：363.1808。
实施例19
3-((3-氟苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物19)的制备
以间氟苯胺(222mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物19，类白色固体200mg，收率67.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(brs,1H),8.61(d,J＝4.4Hz,1H),8.26(brs,1H),7.84(td,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.51(d,J＝10.8Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.41–7.32(m,2H),7.14(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),6.83(td,J＝8.5,2.0Hz,1H),4.95(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H13FN3O2,298.0986；实测值：298.0983。
实施例20
3-((3-溴-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物20)的制备
以3-溴-5-(三氟甲基)苯胺(480mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物20，类白色固体240mg，收率56.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.22(brs,1H),8.60(d,J＝4.7Hz,1H),8.28(brs,1H),7.92(s,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.76(s,1H),7.51(s,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝6.9,5.0Hz,1H),4.94(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H12BrF3N3O2,426.0060；实测值：426.0062。
实施例21
3-((3-羟基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物21)的制备
以间羟基苯胺(218mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物21，褐色固体130mg，收率44.0％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝9.86(brs,1H),8.60(s,1H),8.23(brs,1H),7.83(d,J＝6.7Hz,1H),7.44(d,J＝7.7Hz,3H),7.35(d,J＝6.8Hz,3H),7.03(t,J＝6.7Hz,1H),4.94(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H14N3O3,296.1030；实测值：296.1029。
实施例22
3-((3-甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物22)的制备
以间甲氧基苯胺(246mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物22，类白色固体160mg，收率51.7％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.84(brs,1H),8.60(d,J＝4.2Hz,1H),8.20(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.1,5.2Hz,1H),7.23(t,J＝8.1Hz,2H),6.92(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),6.60(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),4.94(d,J＝5.5Hz,2H),3.75(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H16N3O3,310.1186；实测值：310.1183。
实施例23
3-((3-氰基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物23)的制备
以间氰基苯胺(236mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物23，类白色固体140mg，收率46.0％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.08(brs,1H),8.61(d,J＝4.5Hz,1H),8.29(brs,1H),7.93(s,1H),7.84(td,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.66–7.62(m,1H),7.53(t,J＝7.9Hz,1H),7.47–7.42(m,2H),7.36(dd,J＝7.4,5.0Hz,1H),4.94(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H13N4O2,305.1033；实测值：305.1029。
实施例24
3-((3,4-二氯苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物24)的制备
以3,4-二氯苯胺(324mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物24，浅黄色固体210mg，收率60.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.03(brs,1H),8.60(d,J＝4.2Hz,1H),8.25(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,2H),7.55(d,J＝8.8Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝6.8,5.0Hz,1H),7.30(dd,J＝8.8,2.7Hz,1H),4.93(s,2H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H12Cl2N3O2,348.0301；实测值：348.0306。
实施例25
3-((2-氟-6-甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物25)的制备
以2-氟-6-甲氧基苯胺(282mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物25，浅黄色固体200mg，收率61.1％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.47(s,1H),8.94(t,J＝5.8Hz,1H),8.60(d,J＝4.5Hz,1H),7.89–7.79(m,2H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.38–7.33(m,1H),7.03(dd,J＝8.9,5.1Hz,1H),6.81(td,J＝8.5,2.7Hz,1H),4.95(d,J＝6.0Hz,2H),3.88(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H15FN3O3,328.1092；实测值：328.1089。
实施例26
3-((2-甲基-4-甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物26)的制备
以2-甲基-4-甲氧基苯胺(274mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物26，类白色固体195mg，收率60.3％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.05(brs,1H),8.62–8.57(m,1H),8.24(brs,1H),7.83(ddd,J＝7.7,4.8,1.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.37–7.32(m,1H),7.26(d,J＝8.6Hz,1H),6.80(d,J＝2.7Hz,1H),6.76(dd,J＝8.7,2.9Hz,1H),4.92(s,2H),3.72(s,3H),2.26(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H18N3O3,324.1343；实测值：324.1339。
实施例27
3-((3,5-二甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物27)的制备
以3,5-二甲氧基苯胺(306mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物27，类白色固体200mg，收率58.9％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.81(brs,1H),8.60(d,J＝2.3Hz,1H),8.19(brs,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(s,1H),6.69(s,2H),6.17(s,1H),4.94(s,2H),3.73(s,6H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H18N3O4,340.1292；实测值：340.1289。
实施例28
3-((3,4,5-三甲氧基苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物28)的制备
以3,4,5-三甲氧基苯胺(366mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物28，类白色固体230mg，收率62.3％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.83(brs,1H),8.60(d,J＝2.1Hz,1H),8.14(brs,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(s,1H),6.79(s,2H),4.94(s,2H),3.77(s,6H),3.62(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C19H20N3O5,370.1397；实测值：370.1398。
实施例29
3-((4-硫代吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物29)的制备
以4-硫代吗啉苯胺(389mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物29，类白色固体260mg，收率68.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.69(brs,1H),8.60(ddd,J＝4.9,1.7,0.9Hz,1H),8.08(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(ddd,J＝7.5,4.8,1.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.9Hz,2H),6.92(d,J＝9.0Hz,2H),4.92(d,J＝5.5Hz,2H),3.46–3.41(m,4H),2.69–2.64(m,4H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H21N4O2S,381.1380；实测值：381.1372。
实施例30
3-((4-吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物30)的制备
以4-吗啉苯胺(357mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物30，黄色固体220mg，收率60.4％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.70(brs,1H),8.60(ddd,J＝4.8,1.6,0.8Hz,1H),8.09(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝6.1,1.3Hz,1H),7.32(d,J＝9.2Hz,2H),6.94(d,J＝9.0Hz,2H),4.92(d,J＝5.7Hz,2H),3.73(t,4H),3.05(t,4H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H21N4O3,365.1608；实测值：365.1604。
实施例31
3-((3-甲基-4-硫代吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物31)的制备
以3-甲基4-硫代吗啉苯胺(416mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物31，类白色固体210mg，收率53.2％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.72(brs,1H),8.66–8.52(m,1H),8.10(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.3,5.0Hz,1H),7.23(d,J＝5.5Hz,2H),7.01(d,J＝9.3Hz,1H),4.92(d,J＝5.0Hz,2H),3.04–2.99(m,4H),2.76–2.71(m,4H),2.21(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H23N4O2S,395.1534；实测值：395.1536。
实施例32
3-((3-甲基-4-吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物32)的制备
以3-甲基4-吗啉苯胺(385mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物32，类白色固体200mg，收率52.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.73(brs,1H),8.60(s,1H),8.10(brs,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(s,1H),7.24(s,2H),7.02(d,J＝8.6Hz,1H),4.93(s,2H),3.72(s,4H),2.79(s,4H),2.25(s,3H).HR-MS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H23N4O3,379.1765；实测值：379.1765。
实施例33
3-((3-(三氟甲基)-4-硫代吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物33)的制备
以3-三氟甲基4-硫代吗啉苯胺(524mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物33，白色固体240mg，收率53.5％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.03(brs,1H),8.60(d,J＝4.1Hz,1H),8.20(brs,1H),7.84(td,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.79(s,1H),7.63(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.4,4.9Hz,1H),4.94(d,J＝4.4Hz,2H),3.06–2.99(m,4H),2.73–2.66(m,4H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H20F3N4O2S,449.1254；实测值：449.1249。
实施例34
3-((3-氰基-4-硫代吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物34)的制备
以3-氰基-4-硫代吗啉苯胺(438mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物34，类白色固体210mg，收率51.8％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.94(brs,1H),8.60(d,J＝4.5Hz,1H),8.20(brs,1H),7.86–7.79(m,2H),7.55(d,J＝8.9Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.4,4.9Hz,1H),7.20(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),4.92(s,2H),3.32–3.26(m,4H),2.80–2.74(m,4H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H20N5O2S,406.1332；实测值：406.1330。
实施例35
3-((4-硫代吗啉苯基)氨基)-4-(((5-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物35)的制备
以4-硫代吗啉苯胺(389mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物35，类白色固体215mg，收率54.5％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.36(s,1H),7.59(s,1H),7.45–7.36(m,1H),7.31(s,2H),6.91(d,J＝7.0Hz,2H),4.88(s,2H),3.48(s,4H),2.76(s,4H),2.37(s,3H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H23N4O2S,395.1536；实测值：395.1538。
实施例36
3-((4-硫代吗啉苯基)氨基)-4-(((6-甲基吡啶-2-基)甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物36)的制备
以4-硫代吗啉苯胺(389mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物36，黄色固体230mg，收率58.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.66(brs,1H),8.01(brs,1H),7.71(t,J＝7.7Hz,1H),7.30(d,J＝8.9Hz,2H),7.20(d,J＝7.7Hz,2H),6.92(d,J＝9.0Hz,2H),4.85(d,J＝4.9Hz,2H),3.46–3.42(m,4H),2.69–2.64(m,4H),2.49(s,3H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H23N4O2S,395.1536；实测值：395.1538。
实施例37
3-((3-硫代吗啉苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物37)的制备
以3-硫代吗啉苯胺(389mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物37，类白色固体220mg，收率57.8％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.74(brs,1H),8.60(s,1H),8.18(brs,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝7.1Hz,1H),7.35(s,1H),7.16(dd,J＝17.6,9.5Hz,2H),6.67(d,J＝6.0Hz,1H),6.59(d,J＝6.2Hz,1H),4.93(s,2H),3.59(s,4H),2.64(s,4H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H21N4O2S,381.1380；实测值：381.1380。
实施例38
3-((2,3-二氢-1H-茚-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物38)的制备
以2,3-二氢-1H-茚-5-胺(266mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物38，类白色固体200mg，收率62.6％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(brs,1H),8.60(d,J＝4.8Hz,1H),8.13(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.6,5.0Hz,2H),7.16(s,2H),4.93(d,J＝5.5Hz,2H),2.81(dt,J＝14.9,7.4Hz,4H),2.00(p,J＝7.3Hz,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C19H18N3O2,320.1393；实测值：320.1391。
实施例39
3-((2,3-二氢苯并呋喃-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物39)的制备
以2,3-二氢苯并呋喃-5-胺(270mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物39，类白色固体190mg，收率59.1％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.65(brs,1H),8.59(s,1H),8.06(brs,1H),7.83(s,1H),7.42(d,J＝6.4Hz,1H),7.35(s,2H),7.09(d,J＝5.4Hz,1H),6.72(d,J＝7.6Hz,1H),4.92(s,2H),4.50(s,2H),3.16(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H16N3O3,322.1186；实测值：322.1188。
实施例40
3-((1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物40)的制备
以1,3-二氢异苯并呋喃-5-胺(270mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物40，类白色固体195mg，收率60.7％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.88(brs,1H),8.60(s,1H),8.17(brs,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝7.4Hz,1H),7.40(s,1H),7.35(s,1H),7.28(d,J＝15.5Hz,2H),4.97(s,2H),4.95(s,4H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H16N3O3,322.1186；实测值：322.1189。
实施例41
3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物41)的制备
以苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(274mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物41，类白色固体200mg，收率61.9％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.76(brs,1H),8.61(d,J＝13.0Hz,1H),8.12(brs,1H),7.84(d,J＝6.9Hz,1H),7.42(d,J＝6.8Hz,1H),7.35(s,1H),7.25(s,1H),6.88(d,J＝7.5Hz,1H),6.75(s,1H),6.02(d,J＝15.9Hz,2H),4.93(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H14N3O4,324.0979；实测值：324.0983。
实施例42
3-((2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物42)的制备
以2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-胺(302mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物42，类白色固体180mg，收率53.3％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.68(brs,1H),8.59(d,J＝4.8Hz,1H),8.11(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.0,5.1Hz,1H),7.12(s,1H),6.81(s,2H),4.92(s,2H),4.21(ddd,J＝11.5,3.8,1.7Hz,4H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H16N3O4,338.1135；实测值：338.1126。
实施例43
3-((3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯-7-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2二酮(化合物43)的制备
以3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯-7-胺(330mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物43，类白色固体190mg，收率54.1％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.73(brs,1H),8.60(d,J＝2.3Hz,1H),8.12(brs,1H),7.83(s,1H),7.42(d,J＝7.2Hz,1H),7.35(s,1H),7.19(s,1H),6.93(s,2H),4.92(s,2H),4.12(s,2H),4.06(s,2H),2.08(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C19H18N3O4,352.1292；实测值：352.1296。
实施例44
3-((3-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物44)的制备
以6-氨基异苯并呋喃-1(3H)-酮(298mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物44，黄色固体185mg，收率55.2％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.09(brs,1H),8.61(s,1H),8.25(brs,1H),7.96(s,1H),7.84(s,1H),7.69(d,J＝5.1Hz,1H),7.63(s,1H),7.45(s,1H),7.36(s,1H),5.36(s,2H),4.95(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H14N3O4,336.0979；实测值：336.0980。
实施例45
3-((3-氧代-2,3-二氢-1H-茚-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物45)的制备
以6-氨基-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(294mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物45，类白色固体170mg，收率51.0％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.99(brs,1H),8.60(s,1H),8.20(brs,1H),7.84(s,1H),7.68(d,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝7.4Hz,1H),7.45(d,J＝7.2Hz,1H),7.36(s,1H),4.94(s,2H),3.05(s,2H),2.65(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C19H16N3O3,334.1186；实测值：334.1188。
实施例46
3-((1-氧代-2,3-二氢-1H-茚-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物46)的制备
以5-氨基-2,3-二氢-1H-茚-1-酮(294mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物46，类白色固体180mg，收率54.0％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.27(s,1H),8.61(s,1H),8.42(s,1H),7.84(s,1H),7.66(s,1H),7.58(d,J＝7.9Hz,1H),7.45(d,J＝7.1Hz,1H),7.40(d,J＝7.0Hz,1H),7.36(s,1H),4.95(s,2H),3.06(s,2H),2.59(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C19H16N3O3,334.1186；实测值：334.1188。
实施例47
3-((5-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物47)的制备
以6-氨基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(322mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物47，黄色固体190mg，收率54.7％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.13(brs,1H),8.60(s,1H),8.33(brs,1H),7.82(d,J＝7.7Hz,2H),7.48–7.38(m,2H),7.36(s,2H),4.94(s,2H),2.89(s,2H),2.53(s,2H),2.01(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H18N3O3,348.1343；实测值：348.1342。
实施例48
3-(苯并[d]噻唑-6-基氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物48)的制备
以苯并[d]噻唑-6-胺(300mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物48，黄色固体180mg，收率53.5％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.07(brs,1H),9.24(d,J＝12.0Hz,1H),8.60(brs,1H),8.23(s,2H),8.01(d,J＝9.4Hz,1H),7.83(s,1H),7.56(s,1H),7.40(d,J＝43.8Hz,2H),4.95(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H13N4O2S,337.0754；实测值：337.0753。
实施例49
3-(苯并[d]噻唑-5-基氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物49)的制备
以苯并[d]噻唑-5-胺(300mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物49，黄色固体170mg，收率50.5％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.04(brs,1H),9.39(s,1H),8.61(brs,1H),8.26(s,2H),8.10(d,J＝7.7Hz,1H),7.84(s,1H),7.51(d,J＝6.8Hz,1H),7.45(d,J＝7.1Hz,1H),7.36(s,1H),4.96(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H13N4O2S,337.0754；实测值：337.0753。
实施例50
3-(苯并[b]噻吩-5-基氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物50)的制备
以苯并[b]噻吩-5-胺(298mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物50，灰白色固体200mg，收率59.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.91(brs,1H),8.61(d,J＝4.4Hz,1H),8.22(brs,1H),7.95(d,J＝8.8Hz,2H),7.84(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.78(d,J＝5.4Hz,1H),7.45(t,J＝6.8Hz,2H),7.40(d,J＝5.4Hz,1H),7.35(dd,J＝7.1,5.2Hz,1H),4.95(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H14N3O2S,336.0801；实测值：336.0800。
实施例51
3-((1H-吲哚-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物51)的制备
以1H-吲哚-5-胺(264mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物51，灰白色固体210mg，收率66.0％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.06(s,1H),9.76(brs,1H),8.60(d,J＝4.1Hz,1H),8.08(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.63(s,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.38–7.32(m,3H),7.16(d,J＝6.7Hz,1H),6.38(s,1H),4.94(s,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H15N4O2,319.1190；实测值：319.1191。
实施例52
3-((1H-吲哚-6-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物52)的制备
以1H-吲哚-6-胺(264mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物52，灰白色固体200mg，收率62.8％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H),9.82(brs,1H),8.61(d,J＝4.7Hz,1H),8.14(brs,1H),7.84(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.69(s,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.3,5.0Hz,1H),7.26(t,J＝2.4Hz,1H),7.00(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.37(s,1H),4.95(d,J＝5.1Hz,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C18H15N4O2,319.1190；实测值：319.1191。
实施例53
3-((2H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物53)的制备
以2H-苯并[d][1,2,3]三唑-5-胺(268mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物53，橙色固体190mg，收率59.3％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.06(brs,1H),8.61(d,J＝4.6Hz,1H),8.28(brs,1H),8.08(s,1H),7.94(s,1H),7.84(t,J＝7.6Hz,1H),7.45(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.2,5.1Hz,1H),7.29(s,1H),4.96(d,J＝5.0Hz,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C16H13N6O2,321.1094；实测值：321.1096。
实施例54
3-((1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物54)的制备
以1H-苯并[d]咪唑-6-胺(266mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物54，黄色固体200mg，收率62.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(brs,1H),8.61(d,J＝4.3Hz,1H),8.34(s,1H),8.18(brs,1H),7.88(s,1H),7.84(td,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.59(d,J＝8.6Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(dd,J＝7.0,5.2Hz,1H),7.21(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),4.95(d,J＝5.1Hz,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C17H14N5O2,320.1142；实测值：320.1143。
实施例55
3-((4-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物55)的制备
以4-(1,4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)苯胺(384mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物55，黄色固体210mg，收率55.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.62(brs,1H),8.60(d,J＝4.3Hz,1H),8.03(brs,1H),7.83(t,J＝7.6Hz,1H),7.42(d,J＝7.7Hz,1H),7.37–7.32(m,1H),7.26(d,J＝8.0Hz,2H),6.73(d,J＝7.8Hz,2H),4.91(s,2H),3.69(d,J＝3.2Hz,2H),3.54(d,J＝4.8Hz,6H),1.87(d,J＝4.9Hz,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C21H23N4O3,379.1765；实测值：379.1759。
实施例56
3-((4-(1-氧代硫代吗啉代)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物56)的制备
以4-(4-氨基苯基)硫代吗啉-1-氧化物(420mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物56，灰色固体200mg，收率54.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.73(brs,1H),8.60(d,J＝4.3Hz,1H),8.11(brs,1H),7.83(td,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.37–7.31(m,3H),7.01(d,J＝9.0Hz,2H),4.92(d,J＝5.1Hz,2H),3.76–3.66(m,2H),3.57–3.48(m,2H),2.97–2.88(m,2H),2.73–2.65(m,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H21N4O3S,397.1329；实测值：397.1328。
实施例57
3-((4-(3-氧代吗啉代)苯基)氨基)-4-((吡啶-2-基甲基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(化合物57)的制备
以4-(4-氨基苯基)吗啉-3-酮(384mg，2.0mmol)为原料，采用实施例1中第一步与第二步相似操作步骤，得到化合物57，灰色固体210mg，收率55.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.90(brs,1H),8.61(d,J＝4.4Hz,1H),8.22(brs,1H),7.84(t,J＝7.6Hz,1H),7.45(t,J＝7.7Hz,3H),7.38–7.33(m,3H),4.94(d,J＝4.5Hz,2H),4.19(s,2H),3.99–3.93(m,2H),3.73–3.68(m,2H).HRMS(ESI):m/z[M+H]+计算值：C20H19N4O4,379.1401；实测值：379.1402。
生物活性测试
实验例1、体外抗结核活性测试
测定方法：Microplate Alamar Blue Assay(MABA)法测定体外抗结核活性。
实验原理：Alamar Blue加入培养基可作为氧化还原指示剂，颜色由蓝色向红色转变，反映所研究的微生物对氧分子的消耗。Alamar Blue的颜色改变可用光度计测定，其发射波长为590nm。
实验方法：无菌96孔板(Falcon3072；Becton Dickinson,Lincoln Park,N.J.)，实验化合物以DMSO溶解，制成浓度为5mg/mL的初溶液，最高浓度孔加入199μL 7H9培养基，1μL化合物初溶液，混合均匀后，向其余各孔依次2倍稀释，化合物终浓度为：25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025μg/mL。
选取结核分枝杆菌标准株H37Rv或耐药菌株培养2～3周的培养物制成菌悬液，接种到含0.05％吐温80、10％ADC的7H9培养基中，37℃静止培养1～2周，生长至浊度为McFarland 1(相当于107CFU/mL)时，1：20稀释后，加入各孔100μL，菌液的终浓度为106CFU/mL。每板上均设2个不含抗菌药的生长对照孔，96孔板于37℃孵育。7天后加入生长对照孔20μL 10×Alamar Blue和5％Tween80 50μL的混合液，37℃孵育24小时，如果颜色从蓝色变为粉色，则在各实验药物的孔内加入上述量的Alamar Blue和Tween 80混合液，37℃孵育24小时记录各孔的颜色，并应用酶标仪测定590nm荧光值，计算MIC。
表1-1、本发明部分化合物体外抗敏感结核分枝杆菌活性
1H37Rv菌株
由表1-1数据可知，本发明的部分化合物具有良好的体外抗结核分枝杆菌活性。
表1-2、本发明部分化合物体外抗耐药结核分枝杆菌活性
1对异烟肼(INH)，链霉素(SM)，利福平(RFP)，乙胺丁醇(EMB)，利福布汀(RBT)，氨基水杨酸酯(PAS)和氧氟沙星(OLFX)耐药菌株。
2对异烟肼，链霉素，利福平，乙胺丁醇，氨基水杨酸酯，乙硫酰胺和毛霉素(CPM)耐药菌株。
由表1-2数据可知，本发明的部分化合物具有较好的体外抗耐药菌活性。
实验例2、细胞毒性测试
测定方法：MTT法
实验原理：细胞活性通过线粒体内脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶)将氧化态的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(商品名：噻唑蓝)/MTT[3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]还原为难溶的蓝色甲臜(formazan)化合物，经DMSO溶解后显色来测定，转化量与活细胞数量呈正性相关。
实验方法：1.细胞悬液的制备。将已培养至对数生长期的Vero细胞用0.25％胰酶消化2～3min，吸弃消化液，加入适量培养液，混匀后取20μL用血球计数仪在显微镜下计数，配制成合适浓度的细胞悬液，备用。同时用PBS(phosphate buffered solution)配制5g/L的MTT溶液，过滤除菌，备用。2.药物配制与细胞毒性检测。将受试药物溶于DMSO中，以培养基稀释50倍，制成受试的最高浓度，然后用培养基在96孔板上按1∶3进行系列稀释，每个化合物设6个浓度，最高浓度64μg/mL,每个浓度设6个平行孔，50μL/孔。将制备好的细胞悬液接种于96孔板内，50μL/孔，细胞浓度4×105个/mL.。同时设不含药的细胞对照孔及培养基空白对照孔。培养48小时后，加入MTT 10μL/孔，继续培养4小时。取出培养板，小心弃去孔内培养基，每孔加DMSO100μL，振荡至甲臜颗粒完全溶解后，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光密度值(OD570)。3.数据处理。细胞抑制百分率(％)＝[(细胞对照OD570值－加药组OD570值)/(细胞对照OD570值－空白OD570值)]×100％。用Origin7.0软件进行剂量－反应关系曲线拟合，计算各种化合物对细胞抑制率50％时的浓度(IC50)。
表2、本发明部分化合物细胞毒性
由表2数据可知，本发明中化合物的细胞毒性很低，表现出了很高的安全性。
实验例3、肝细胞代谢稳定性测试
实验方法：
使用来自雄性的CD-1小鼠(Bioreclamation IVT)和混合的人(Celsis)的肝细胞进行测定。在1μM浓度下测试化合物，最终肝细胞浓度为1百万个细胞/mL。通过向化合物溶液(2μM)中加入预热的肝细胞溶液(200万细胞/mL)来引发反应。将反应混合物在100转/分钟的CO2培养箱中于37℃孵育120分钟。在预定的时间点(0,15,30,60,90和120分钟)，取出30μL反应混合物，通过加入200μL含内标的冰冷的ACN/MeOH(50:50)终止反应。将样品充分混合，在4℃离心15分钟(4,000转/分)，并通过LC-MS/MS分析上清液。色谱条件：色谱柱：Kinetex C18 100A(30mm×3.0mm，2.6μm)；柱温：室温，流动相：乙腈-水(含0.1％甲酸)梯度；流速：0.7mL/min。通过测定化合物的剩余量来评估化合物在肝细胞中的代谢稳定性。
表3、部分化合物的小鼠/人肝细胞代谢稳定性
由表3数据可知，与化合物D相比，本发明的化合物30和49在小鼠和人肝细胞中均具有非常高的代谢稳定性。化合物41和46在人肝细胞中的代谢稳定性亦显著强于化合物D。
实验例4、肝微粒体代谢稳定性测试
实验方法：
使用来自雄性的小鼠(Bioreclamation IVT)和混合的人(Bioreclamation IVT)的肝微粒体进行测定。具体方法如下：分别取合成的目标化合物配制成1μM测试液。微粒体蛋白浓度为1mg/mL。通过添加NADPH(1mM)来引发反应，并将样品在振荡培养箱中于37℃孵育至多60分钟。通过添加含内标的冰冷的乙腈/甲醇(50:50)使反应终止于0,5,15和30分钟。分别于0,5,15,30和60分钟取出等份试样的反应混合物，然后加入含内标的冰冷的乙腈/甲醇(50:50，v/v)。将样品在4℃离心15分钟(4,000转/分)，并通过LC-MS/MS分析上清液。色谱条件：色谱柱：Kinetex C18 100A(50mm×3.0mm，2.6μm)；柱温：室温，流动相：乙腈-水(含0.1％甲酸)梯度；流速：0.7mL/min。通过测量在有或没有NADPH辅因子的情况下化合物的残余量来评估化合物的代谢稳定性。
表4、本发明部分化合物的小鼠/人肝微粒体代谢稳定性数据
由表4数据可知，与化合物D相比，本发明的化合物具有更强的小鼠/人肝微粒体代谢稳定性。
实验例5、hERG钾离子通道安全性测试
测定方法：手动膜片钳技术
实验原理：手动膜片钳技术对测试化合物作用于快速延迟整流钾离子通道(hERG)的潜在抑制效应进行了实验评估。尾电流的峰值为hERG电流的大小。5个不同梯度浓度的工作溶液被用于测定化合物对hERG钾离子通道的潜在抑制作用并用以拟合量效曲线和计算IC50。
实验方法：参照文献(Science 1995,269,92-95.)进行。
表5、本发明部分化合物对hERG钾离子通道的抑制作用
由表5数据可知，本发明化合物对hERG钾离子通道没有抑制作用，引起QT间期延长的风险很低，表现出了良好的安全性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.如式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1为
R2为H、C1-C3烷基；
R3为H、F、Cl、Br、I、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷胺基、C1-C6酰基、C3-C6环烷基或C3-C6杂环基，R3代表1、2或3个取代基，取代基可以相同或不同；
R4为H、C1-C3烷基；
R5为H、C1-C3烷基；
式(I)所示的化合物不包括：
2.通式(II)所示化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
R2为H、C1-C3烷基；
R3为H、F、Cl、Br、I、羟基、氨基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷胺基、C1-C6酰基，R3代表1、2或3个取代基，取代基可以相同或不同；
或R3为这些杂环烷基可被氧代基团取代；
化合物不包括：
3.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1为
R2为H；
R4为H；
R5为H。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1为
R2为H；
R5为H。
5.根据权利要求1至4任一项的化合物及其药学上可接受的盐，其选自下列化合物：
6.一种药物组合物，其包括治疗和/或预防有效量的权利要求1至5任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和媒介物。
7.权利要求1至5任一项所述化合物及其药学可接受的盐或者权利要求6所述组合物在制备治疗和/或预防由结核分枝杆菌引起的感染性疾病的药物中的应用。
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