CN112755036A - 通过调节mypt1改变平滑肌性质的试剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供调节MYPT1的试剂在制备用于改变平滑肌收缩性或治疗受益于平滑肌收缩性改变的疾病的药物中的应用。本发明还提供治疗受益于平滑肌松弛或收缩的疾病的方法。本发明还提供治疗受益于平滑肌松弛或收缩的疾病的试剂盒，该试剂盒包含调节MYPT1的试剂以及将所述试剂给予对象所需的其他试剂。本发明还提供筛选改变平滑肌收缩性的试剂的方法。

Description

通过调节MYPT1改变平滑肌性质的试剂及其用途

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及改变平滑肌性质的试剂及其用途。

背景技术

平滑肌分布在人体动脉和静脉血管壁、膀胱、子宫、男性和女性生殖道、消化 道、呼吸道、眼睛的睫状肌和虹膜，负责体内中空器官的收缩，例如胃肠道，气道， 淋巴管，胆囊，胆管，膀胱，血管，阴茎，眼睛和子宫等。正常的平滑肌收缩力对于 维持稳态和对病理性疾病所施加应激的适应性反应至关重要。一般来讲，平滑肌收缩 至少有两种信号调节通路，即：去极化途径和G蛋白偶联受体(GPCR)途径。去极 化作用通过L型Cav1.2调节的钙内流、激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、引起肌 球蛋白轻链(RLC)磷酸化、启动肌球蛋白粗丝与肌动蛋白细丝的横桥运动，由此产 生收缩力。GPCR激动剂通过依次激活Gαq/11和磷脂酶C(PLC)，由PLC产生的 肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)介导从肌浆网释放钙、激活MLCK活性，由此产生收缩力。 在此过程中，PKC/CPI-17/MLCP和Rho/ROCK/MLCP也被激活，由此介导钙敏性收缩。去除刺激后，钙和RLCp的下降，平滑肌被动舒张。而一氧化氮、激动剂和激酶 抑制剂也可导致钙和RLCp水平下降，平滑肌主动舒张。因此，RLCp水平或MLCK 与MLCP的相对活性决定了平滑肌的收缩状态。MLCP由三个亚基组成：MYPT1(肌 球蛋白轻链磷酸酶靶向调节亚基1)，PP1c催化亚基和功能未知的20Kd激酶。MYPT1 主要通过与PP1c催化亚基的物理相互作用来高效调节MLCP全酶的活性。

平滑肌收缩力异常导致各种疾病，包括胃肠功能障碍、哮喘、COPD、尿失禁、 肛裂、勃起功能障碍、高血压、近视和血管痉挛等。血管平滑肌细胞存在于血管内膜 内皮细胞下，用于构成血管壁组织结构及维持血管张力。在正常人体内血管平滑肌通 过收缩来维持血管壁张力，维持一定的血压。血管平滑肌的异常收缩在高血压的发作 中具有重要作用。勃起功能障碍(ED)是指无法达到或维持阴茎勃起以进行令人满 意的性交。据报道，近52％的男性年龄在40-70岁之间发生ED，预计在2025年全 球有3.2亿人。ED是一种导致人类生活质量低下的世界性疾病，其发病机制一直存 在争议。尽管ED发病原因多种多样，但阴茎体内充血是阴茎勃起的最终机制。阴茎 平滑肌主要由海绵体平滑肌(CCSM)和动脉平滑肌组成，阴茎内充血受平滑肌收缩 力的控制。由此，阴茎平滑肌的协调收缩/松弛是生理性勃起的先决条件。在受到性 刺激后，阴茎神经和内皮释放出一氧化氮(NO)，放松海绵体平滑肌和动脉平滑肌， 导致窦充血并限制静脉流出，从而导致阴茎勃起；在性刺激撤除后，阴茎平滑肌在神 经和局部因素作用下，表现出持续性或强直性收缩，从而控制血流的灌注。以上过程 发生异常时，则导致阳痿的发生。但遗憾的是，上述过程是如何发生异常、机制是什 么，目前还不清楚。此外，许多疾病与平滑肌损伤相关，同时引起勃起功能障碍的风 险也极高，如：60％以上的高血压患者伴有ED、60-89％糖尿病患者有ED，临床上 常将勃起障碍作为心血管疾病、糖尿病的风险指标；另外，慢性炎症性疾病(如肠炎) 也与ED的发病率密切相关。

目前ED的药物治疗主要为PDE5抑制剂，其药理机制是抑制PDE5活性、强化 NO信号途径，从而松弛阴茎平滑肌、促进海绵体血流灌注。其缺点是对症治疗，不 能根治，且有30％的患者对该类药物无效。而且，该类药物对重症心血管疾病、糖尿 病等的患者的ED也无效。此外，PDE5抑制剂并不能用于治疗其他平滑肌相关疾病。

由于上述疾病与平滑肌的关系还不完全清楚，开发新的、效果更好的药物受到 极大的限制。因此，发现分子机制、寻找新靶点是目前国际上亟待解决的技术难题。

发明内容

发明人发现平滑肌中MYPT1降低引起平滑肌收缩行为异常。本发明阐明了平 滑肌收缩行为异常的分子机制、发现了新的药物靶点、药物及其用途。这一机制还解 释了PDE5抑制剂治疗失败的原因。

本发明一方面提供调节MYPT1的试剂在制备用于改变平滑肌收缩性或治疗平 滑肌收缩性改变相关疾病或病症的药物中的应用。

本发明另一方面提供上调MYPT1的试剂在制备用于增强平滑肌松弛、改善阴 茎勃起、提高阴茎内压力、扩增血管直径或治疗受益于平滑肌松弛的疾病的药物中的 应用。

在一个或多个实施方案中，受益于平滑肌松弛的疾病包括胃肠功能障碍，哮喘，COPD，尿失禁，肛裂，勃起功能障碍，高血压，近视，血管痉挛。

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂是柴胡皂苷或苦丁皂苷。苦丁 皂苷包括苦丁茶皂苷或苦丁茶冬青苷。

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂是分离的下式I所示的化合物或 其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

其中：

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹是糖残基；

C2、C11、C12、C16和C19各自独立地任选地被-OH取代；

R^2a、R^2b和R^2c分别独立选自-H、-COOH、COOR⁵、-OH、任选被羟基取代的 C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；或R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-且R^2c选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；或R^2b和R^2c共同形成-CO₂-，且R^2a选自-H、-OH或任选被羟 基取代的C₁-C₆烷基；

R^3a和R^3b分别独立选自-H、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；

R⁴选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R⁵为糖残基。

在一些实施方案中，C11、C12、C16和C19分别独立被-OH取代。

在一个或多个实施方案中，糖残基是单糖残基，优选是阿拉伯糖(Ara)、葡萄 糖醛酸(GlcA)或2-脱氧-葡萄糖醛酸、葡萄糖(Glc)或者鼠李糖(Rha)脱氢形成 的残基。

在一个或多个实施方案中，糖残基是寡糖残基，优选是二糖残基、三糖残基或 四糖残基。优选地寡糖残基包括支链。优选地，寡糖残基是Gllc-Glc、Ara-Glc、 Rha-Ara-Glc-Glc、Ara-Glc-Glc和Rha-Ara-Glc；更优选地是-Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc 或Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc-(1-2)-Glc。

在一个或多个实施方案中，式I化合物可分离自冬青科植物或伞形科(ApiaceaeLindl.)植物。

在一个或多个实施方案中，式I化合物是分离的具有下式Ia所示结构的化合物 或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

其中：

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；R¹选自H 和糖残基；C2、C11、C12和C19上各自任选地被OH取代；R^2a及R^2b各自独立选自 H、-COOH和COOR⁵，或两者共同形成-CO₂-；R⁵为单糖残基；R^3a和R^3b共同形成-CH₂-， 或各自独立选自C_1-4烷基(如甲基)或被羟基取代的C_1-4烷氧基(如-CH₂-OH)。

在式Ia的一些实施方案中，A环和B环独自地为完全饱和环。

在式Ia的一些实施方案中，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-。

在式Ia的一些实施方案中，糖残基是本文所述的单糖残基或寡糖残基。

在式Ia的一些实施方案中，A环、B环、C环、E环为完全饱和环，D环为部 分饱和环，C12和C19各自独立被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b都为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基。在一些实施方案中，R¹¹为三糖残基，如 -Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。在一些实施方案中，R¹为四糖残基，如 -Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc-(1-2)-Glc。

在式Ia的一些实施方案中，A环、B环、C环、E环为完全饱和环，D环为部 分饱和环，C11和C19分别独自被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基。在一些实施方案中，R¹为三糖残基，如 -Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。

在式Ia的一些实施方案中，A环、B环、E环为完全饱和环，，C环、D环为部 分饱和环，C19被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b为-CH₃，R¹为单糖 残基或寡糖残基。在一些实施方案中，R¹为三糖残基，如-Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。

在一些实施方案中，式Ia化合物选自：苦丁皂苷A、苦丁皂苷B、苦丁皂苷C、 苦丁皂苷D、苦丁皂苷E、苦丁皂苷F、苦丁皂苷I、苦丁皂苷J、苦丁茶冬青苷H、 苦丁茶冬青苷I和苦丁茶冬青苷J中的一种或多种；优选为苦丁皂苷A、苦丁皂苷B、 苦丁皂苷C、苦丁皂苷I、苦丁茶冬青苷I和苦丁茶冬青苷J中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，式Ia化合物分离自冬青科植物。

在一些实施方案中，式I的化合物为分离的下式Ib所示的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

式中，

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹是糖残基；

C2、C11、C12、C16和C19各自独立地任选地被-OH取代；

R^2a和R^2b分别独立选自-H、-COOH、COOR⁵、-OH、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；或R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-；

R^3a和R^3b分别独立选自-H、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；

R⁴选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R⁵为糖残基。

式Ib中，优选地，C16被羟基取代。

式Ib中，优选地，R^3a和R^3b分别独立选自任选被羟基取代的C₁-C₆烷基，如甲 基、乙基或羟甲基。

式Ib中，优选地，R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-。

式Ib中，优选地，A环、B环、D环和E环均为完全饱和环，C环为部分饱和 环。更优选地，A环、B环、D环和E环均为完全饱和环，C环在C11和C12之间 为双键。

式Ib及Ib-1中，糖残基如本文任一实施方案所述。示例性的糖残基包括但不限于-Rha-Glc，如-Rha-(1-3)-Glc，和-Glc-Rha-Glc，如-Glc-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。

优选地，式Ib的化合物可分离自伞形科(Apiaceae Lindl.)植物。

在一些实施方案中，上调MYPT1的试剂是生物碱。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是式II所示的化合物或其立体异构体、对 映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐：

式中，

R_a和R_b各自独立选自-H、-OH或烷氧基，

R_c是任选被一个或多个选自羟基、烷基或烷氧基取代的芳基，，

R_d1和R_d2各自独立选自烷基或不存在。

在一个或多个实施方案中，式II的化合物中，R_a和R_b各自独立选自-H、-OH 或C₁-C₆烷氧基；R_c是任选被一个或多个选自羟基、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基取代 的芳基；

R_d1和R_d2各自独立选自C₁-C₆烷基或不存在。

优选地，上调MYPT1的试剂是式IIa所示的化合物或其立体异构体、对映异构 体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐：

式中，

R_a和R_b各自独立选自-H、-OH或烷氧基，

R_c1是-H或-OH，

R_d1和R_d2各自独立选自C₁-C₆烷基或不存在。

优选地，本文所述生物碱包括莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱(neferine)、莲心 季铵碱、甲基紫堇杷灵碱、荷叶碱、前荷叶碱、去甲基衡州乌药碱和非晶性生物碱 Nn-9，优选是莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱。

在一个或多个实施方案中，式II化合物分离自睡莲科(Nymphaeaceae)植物， 包括莲属(Nelumbo)植物。

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂是所述各类植物的提取物，且 该提取物中含有一种或多种式I或II所示结构的化合物。在一个或多个实施方案中， 所述提取物提取自所述植物的叶、根、茎、皮、果、种子的一种或多种或其部分。在 一个或多个实施方案中，所述提取物是乙醇提取物。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是冬青科植物的提取物，优选是包含式Ia 化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐的提取 物。在一些实施方案中，所述提取物是苦丁茶提取物。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是伞形科植物的提取物，优选是包含式Ib 化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐的提取 物。在一个或多个实施方案中，所述提取物是柴胡属植物的提取物。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是睡莲科植物的提取物，优选是包含式II 化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐的提取 物。在一些实施方案中，所述提取物是莲心提取物

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂是抑制E3连接酶的试剂，例如 蛋白酶体抑制剂。优选地，所述蛋白酶体抑制剂选自以下的一种或多种：MG132或 MLN4924、MG-341、PS-341、双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、Salinosporamide A、ONX0912、CEP-18770和MLN9708等。

在一个或多个实施方案中，所述蛋白酶体抑制剂选自以下的一种或多种：Bortezomib、carfilzomib、ixazomib、Marizomib、Oprozomib、蛋白酶体组合(如，来 那度胺+地塞米松、BCL-2抑制剂Venetoclax、免疫调节剂Pomalyst、CD319抑制剂 Empliciti、PD-1抑制剂)。

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂是阻断LPS/TLR4通路的试剂。 优选地，阻断LPS/TLR4通路的试剂包括TLR4抑制剂、LPS结合剂或LPS信号通路 抑制剂。更优选地，阻断LPS/TLR4通路的试剂包括TAK242或PMB。

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂包括选自以下的一种或多种药 物：Vidarabine、Rifaximin、Ramipril、Ranolazine、Ranitidine、Acadesine、Acipimox 或Acyclovir。

在一个或多个实施方案中，上调MYPT1的试剂是MYPT1的表达载体。

本发明另一方面提供下调MYPT1的试剂在制备用于增强平滑肌收缩、抑制阴 茎勃起、缩小血管直径或治疗受益于平滑肌收缩的疾病的药物中的应用。在一个或多 个实施方案中，受益于平滑肌收缩的疾病包括尿道松弛、粪失禁、低血压、肠动力降 低、膀胱无力。

在一个或多个实施方案中，下调MYPT1的试剂包括基因编辑载体，RNA编辑 载体，MYPT1的抗体，MYPT1拮抗剂，编码MYPT1的基因的反义RNA，例如siRNA 或shRNA，E3连接酶，例如SIAH1 E3连接酶、SIAH2 E3连接酶，E3连接酶活化剂， 脂多糖(LPS)或其可激活TLR4通路的类似物，TLR4活化剂或NF-kB信号激活物 (如，IL-1、TNF-a等炎性因子等)。

在一个或多个实施方案中，下调MYPT1的表达的试剂包括选自以下的一种或 多种药物：Naloxone HCl、Etravirine、Atovaquone。

本发明另一方面提供筛选调节平滑肌收缩性的试剂的方法，包括将候选试剂与平滑肌细胞孵育，和检测细胞MYPT1表达量。本发明还提供MYPT1在筛选调节平 滑肌收缩性的试剂中的应用。

本发明另一方面提供本文所述方法筛选的试剂在改善平滑肌收缩性中的用途。优选地，所述试剂作为上调或下调MYPT1的试剂改善平滑肌收缩性。

本发明另一方面提供药物组合物，包含本文所述调节MYPT1的试剂和/或本文 所述方法筛选的试剂，和药学上可接受的辅料。

在一个或多个实施方案中，本文所述试剂或药物组合物可与其他改变平滑肌收缩性的试剂联用。所述其他改变平滑肌收缩性的试剂包括PDE5抑制剂、酚妥拉明、 罂粟碱、前列腺素E1、组织胺、ROCK抑制剂、钙通道抑制剂或氯通道抑制剂。

本发明另一方面提供治疗受益于平滑肌松弛的疾病的方法。该方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的本文所述的上调MYPT1的试剂或本文方法筛选的上 调MYPT1的试剂或本文所述的药物组合物。

本发明另一方面提供治疗受益于平滑肌收缩的疾病的方法。该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的下调MYPT1的试剂或本文方法筛选的下调 MYPT1的试剂或本文所述的药物组合物。

在一个或多个实施方案中，本文所述治疗方法包括向对象给予治疗有效量的本文所述试剂。优选地，所述试剂通过注射、口服、透皮吸收的方式给予。

本发明另一方面提供治疗受益于平滑肌松弛的疾病的试剂盒，该试剂盒包含上调MYPT1的试剂以及将所述试剂给予对象所需的其他试剂。

本发明另一方面提供治疗受益于平滑肌收缩的疾病的试剂盒，该试剂盒包含下调MYPT1的试剂以及将所述试剂给予对象所需的其他试剂。

本发明另一方面提供检测MYPT1的试剂在制备用于诊断平滑肌收缩性改变相 关疾病或病症的试剂盒中的应用。在一个或多个实施方案中，所述平滑肌收缩性改变 相关疾病包括本文所述的受益于平滑肌收缩的疾病和受益于平滑肌松弛的疾病。优选 地，所述检测MYPT1的试剂是检测MYPT1蛋白的试剂或检测MYPT1编码序列或 mRNA的试剂。

本发明另一方面提供诊断平滑肌收缩性改变相关疾病的方法，包括：检测对象 样品中MYPT1编码序列、MYPT1 mRNA和/或MYPT1蛋白的含量，通过与正常样 品的相应含量比较进行诊断。

附图说明

图1显示MYPT1和收缩相关蛋白在海绵体中的表达。从五例顽固性ED患者和 三例阴茎癌患者中收集海绵体活检样品，并进行Western印迹检测。β-肌动蛋白被用 作上样量内标。A，海绵体蛋白的蛋白质印迹结果。B，基于β-肌动蛋白水平的相对 定量。C，糖尿病小鼠(db/db)海绵体的免疫学染色显示MYPT1的表达降低，而背 动脉(左图)和海绵体(右图)中eNOS表达均量相当。柱代表平均值±SEM；*P ＜0.05，t检验。

图2显示缺少MYPT1的阴茎对电刺激的ICP响应降低，动脉腔减小。A，在 5V，12Hz刺激1min后，ICP的代表性曲线，分别对应于Mypt^+/+；SMA-Cre⁺(左)、 Mypt1^f/+；SMA-Cre⁺(中)和Mypt1^f/f；SMA-Cre⁺(右)阴茎。B，定量三组的ICP值(每组 n＝6)。C-E，H-E染色显示阴茎动脉直径和面积减少。定量分析背侧和中央动脉的 直径(D)和面积(E)。柱代表平均值±SEM；*P<0.05，***P<0.001(单向方差分 析)。n＝3。比例尺＝250μm(左图)和50μm(中和右图)。

图3显示缺乏MYPT1的背动脉和海绵体产生的最大力。A-C，用(A)124mM KCl、(B)梯度PE(1nM至10μM)和(C)U46619(1nM至3μM)分别刺激Mypt1^+/+；Cre⁺ (左)、Mypt1^f/+；Cre⁺(中)和Mypt1^f/f；Cre⁺(右)的小鼠背动脉，所产生的代表性收缩。D-F， 定量分析KCl(D)产生的最大拉力、定量分析小鼠背动脉对PE(E)和U46619(F) 的响应灵敏度。G-1，80mM KCl刺激Mypt1^+/+；Cre+(左图)、Mypt1^f/+；Cre+(中图)和 Mypt1^f/f；Cre+(右图)小鼠海绵体，产生收缩力的响应示踪图。J-L，由KCl(G)产生 的最大拉力的定量以及对PE(H)和U46619(I)的响应灵敏度。柱代表平均值±SEM； *P＜0.05，**P＜0.01，#P＜0.05。单向方差分析。

图4显示MYPT1缺失的背动脉中响应于PE刺激的RLC磷酸化。收集MYPT1 KO(Mypt1^{f /f}；Cre+)和对照(Mypt1^+/+；Cre+)小鼠的背动脉，并用10μMPE刺激。 采样刺激的动脉，用尿素-SDS PAGE测定RLC磷酸化水平。A，刺激后RLC磷酸化 的典型图示。B，RLC磷酸化的定量。pRLC水平用其占总RLC的百分比来表示。柱 代表平均值±SEM；*P<0.05；N＝4；t检验。

图5显示SNP对MYPT1缺失的背动脉和海绵体的由PE引起的收缩的松弛作 用。A和C，使用10μM PE预收缩，然后加入SNP(1nM至100nM)的背动脉(A) 或海绵体(C)的代表性力曲线。B和D，由试剂释放的力的相对比例定量。张力的 相对比例通过以下公式计算：力％＝(F_载剂–F_抑制剂)/F_载剂，F＝力。柱代表平均值±SEM； N＝6；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(t检验)。

图6显示H1152和GF109203x对PE引起的背动脉收缩的松弛作用。A和C， 使用10μMPE预收缩然后加入于H1152(1nM至3μM)(A)或GF109203X(10μM 至3μM)(C)的背动脉代表性示踪。B和D，对由试剂释放的力的相对比例定量。 柱代表平均值±SEM；N＝6；*P＜0.05，***P＜0.001(t检验)。

图7显示H1152和GF109203x对PE诱发的海绵体收缩的松弛作用。A和C， 使用10μMPE预收缩然后加入于H1152(1nM至3μM)(A)和GF109203X(10μM 至3μM)(C)的背动脉的代表性示踪图。B和D，对试剂所释放的力的相对比例定 量。柱代表平均值±SEM；N＝6；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(t检验)。

图8显示莲心季胺碱对MYPT1表达的上调。将A7r5细胞接种在96孔板中24 小时，然后更新含有不同浓度的莲心季胺碱和生物碱的新培养基。培养基更新后48 小时收获处理的细胞，并进行Western印迹分析。莲心季胺碱的浓度用微摩尔表示。 CTR：DMSO载剂对照。

图9显示通过莲心季胺碱处理，体内和体外MYPT1表达增加。A，A7R5细胞 与不同剂量的莲心季胺碱孵育后显示正常形态，没有细胞毒性。B-C，A7R5细胞在 体外用莲心季胺碱处理24小时，然后通过Western印迹(B)对细胞裂解液进行MYPT1 测量(n＝4)。C，C57/B6小鼠体内注射了莲心季胺碱(5mg/kg)，并通过Western 印迹法测定阴茎中的MYPT1蛋白。蛋白质上载有β-肌动蛋白内部对照。柱代表平均 值±SEM；*p＜0.05，**p＜0.01(t检验)。

图10显示在杂合性MYPT1 KO小鼠中，莲心季铵碱改善了对电刺激的阴茎ICP 反应。A，免疫荧光染色显示，经莲心季铵碱处理后，阴茎背动脉管腔大小增加，B 中显示了直径的定量。SMA(红色)：平滑肌肌动蛋白，一种平滑肌的特殊标记物； MYPT1(绿色)。比例尺＝250μm。C，定量不同组小鼠的阴茎重量。D-F，MYPT1 缺陷小鼠对海绵状神经的电刺激显示ICP响应降低。D-E，不使用(D)或使用(E) 莲心季铵碱处理的Mypt1^+/+；Cre+(左),Mypt1^f/+；Cre+(中),and Mypt1^f/f；Cre+(右)中 ICP响应的代表性跟踪。F，不同组小鼠的MAP值的定量。G，不同组小鼠的ICP值 的定量。*P<0.05；**P<0.001；***P<0.001，单向方差分析。

图11显示莲心季铵碱处理导致MYPT1表达升高和海绵体中心动脉直径增大。 A，免疫荧光染色显示，经莲心季铵碱处理后，MYPT1和阴茎中央动脉直径增加。B， 定量中心动脉的直径。SMA(红色)；MYPT1(绿色)。柱代表平均值±SEM；*P<0.05； t检验。

图12显示莲心季铵碱可改善db/db小鼠对电刺激的ICP响应。A和B，经莲心 季铵碱处理后，阴茎的重量和长度没有变化。C和D，免疫荧光染色和Western印迹 显示MYPT1在阴茎中增加(n＝9)。E，分别用(左图)或未用(右图)莲心季铵 碱处理的db/db小鼠中ICP的代表性示踪。F，不同组小鼠的ICP值的定量。*P<0.05； ***P<0.001，t检验。Lot表示该组接受了莲心季铵碱处理。

图13显示莲心季铵碱通过抑制MYPT1泛素化上调MYPT1的表达。A，经Q-PCR 测量的经或未经莲心季铵碱处理的A7R5细胞的Mypt1 mRNA水平未改变(n＝3)。 B，将A7R5细胞分别用MG132(50μm)和莲心季铵碱(0.5μm)处理24h，然后将 所得裂解物用抗MYPT1抗体进行免疫沉淀(IP)分析，并进行免疫印迹(IB)以检 测下拉颗粒中泛素化的MYPT1、SIAH2和SIAH2(D)(n＝3)。

图14显示柴胡皂苷对MYPT1表达的上调。将A7r5或HT29细胞接种在96孔 板中24小时，然后更新含有不同浓度柴胡皂苷的新培养基。培养基更新后48小时收 获处理的细胞，并进行Western印迹分析。一抗是抗MYPT1抗体。β-肌动蛋白用作 加载对照。S-A代表柴胡皂苷A。S-C代表柴胡皂苷C；S-D代表柴胡皂苷D。S-A 和S-C的浓度用微摩尔表示。S-D的浓度用纳摩尔表示。CTR：DMSO载剂对照。

图15显示苦丁皂苷对MYPT1表达的上调。在A7r5平滑肌细胞中加入不同浓 度的KE，24小时后收集细胞、裂解，用Western印迹检测MYPT1表达量。上图：Western印迹分析图；下图：MYPT1增加倍数统计图。CTR：对照组，N/A：DMSO 溶剂。

图16显示LPS通过TLR受体通过SIAH1/2-/泛素-蛋白酶体蛋白降解过程降低MYPT1。A，通过RT-PCR测定TLR4 mRNA的表达。SMC，平滑肌细胞；NC，阴 性对照。B，将来自C57BL/6小鼠的结肠平滑肌用MG132(50μm)和剂量增加的LPS 处理，持续24h，并收获用于免疫印迹(IB)分析(n＝3)。C-D，来自C57BL/6小 鼠的结肠平滑肌在有或没有LPS(0.1mg/ml)和MG132(50μm)的情况下处理24 小时，收获以通过IB分析检测MYPT1、SIAH1和SIAH2的组成型表达(C)；收集 裂解物，用MYPT1，MYPT1-泛素，SIAH2和SIAH2进行免疫沉淀(IP)，然后进行IB分析(D)(n＝4)。E，用递增浓度LPS处理C3H/HeJ小鼠的结肠平滑肌24 小时后的蛋白量(n＝4)。柱代表平均值±SEM；*P<0.05，**P<0.01(单向方差分析)。

图17显示通过Western印迹检测的候选药物对MYPT1表达的上调。上图：S1782:Azacitidine(Vidzaza)、S1784:Vidarabine(Vira-A)、S1786:Verteporfin(Visudyne)、S1787:Teniposide(Vumon)、S1790:Rifaximin(Xifaxan)、S1793:Ramipril(Altace)、S1794:Fenofibrate(Tricor,Trilipix)；下图：S1799:Ranolazine(Ranexa)、S1801:Ranitidine(Zantac)、S1802:Acadesine、S1805:Acetylcholine chloride、S1806:Acipimox、 S1807:Acyclovir(Aciclovir)、S1808:Nifedipine(Adalat)。

图18显示通过Western印迹检测的候选药物对MYPT1表达的下调。上图：S3066:Naloxone HCl、S3073:Caspofungin acetate、S3075:Dexmedetomidine、S3078:Beclomethasone dipropionate、S3079:Atovaquone(Atavaquone)、S3080: Etravirine(TMC125)、S3081:Ulipristal、S3083:Indacaterol Maleate；下图：S2524: Phenytoinsodium(Dilantin)、S2525:Phenytoin(Lepitoin)、S2528:Ciclopirox(Penlac)、 S2536:Mixonazole(Monistat)、S2537:Secnidazole(Flagentyl)、S2552:AzelastineHydrochloride(Astelin)、S2566:Isoprenaline hydrochloride、S2567:Medroxyprogesterone acetate、S2569:Phenylephrine HCl、S3066:Naloxone HCl、S3078:Beclomethasone dipropionate、S3079:Atovaquone(Atavaquone)、S3080:Etravirine(TMC125)、S3081: Ulipristal。

具体实施方式

发明人发现：患者的平滑肌中MYPT1表达降低导致对GPCR激动剂更敏感， 而对一氧化氮的敏感度更低；MYPT1表达的缺失会导致收缩行为的显著改变，而MYPT1磷酸化位点的突变会稍微影响收缩；这意味着完整的MYPT1蛋白质水平而 非MYPT1磷酸化是收缩行为的主要机制；在小鼠中，平滑肌特异性MYPT1缺失引 起动脉管腔变窄、海绵体内压力(ICP)对电刺激的响应降低和不育性降低，导致勃 起功能异常。因此，MYPT1的减少增强平滑肌收缩，参与了ED发生，解释了PDE5 抑制剂治疗失败的原因。

如本文所用，术语“烷基”单独或与其它术语组合使用，是指饱和脂肪族烷基， 包括1-20个碳原子的直链或支链烷基。优选地，烷基是指含有1-10个碳原子的中等 烷基，如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基及类似烷基。 更优选地，是指含有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、 正丁基、异丁基、叔丁基及类似烷基。烷基可以被取代也可不被取代。当被取代时， 取代基个数为1个或多个，优选1-3个，更优选1个或2个，取代基团独立地选自包 括卤素、羟基、低级烷氧基、芳基。

如本文所用，术语“芳”、“芳基”单独或与其它术语组合使用，是指含有6-14个 碳原子的芳香环基团(例如六元单环、十元双环或十四元三环体系)，示例性的芳基 包括苯基、萘基、联苯基、茚基及蒽基。芳基可选地被一个或多个取代基取代，取代 基独立地选自卤素、烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-氨基、单或二烷基胺基、 羧基或N-磺酰胺基。

如本文所用，术语“烷氧基”是指-O-(无取代烷基)和-O-(无取代环烷基)。代 表性例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环 戊氧基、环己氧基以及类似结构。

如本文所用，术语“环烷基”是指三到八元全碳单环、全碳五元并六元或六元并 六元双环或多并环(“并”环体系是指体系中每两个环共用相邻的一对碳原子)，其中 一个或多个环可能含有一个或多个双键，但任一环都不具有完整的耦合pi电子体系。

如本文所用，术语“糖”是指含有1个或多个单糖残基的化合物。单糖是指多羟 基醛(例如D-葡萄糖)或多羟基酮(例如D-果糖)。单糖可以根据其所含的碳原子 个数分类：有3个碳的单糖为丙糖，有4个碳的为丁糖，有5个碳的为戊糖，有6 个碳的为己糖，有7个碳的为庚糖。例如，六碳多羟基醛如D-葡萄糖是己醛糖，六 碳多羟基酮如D-果糖是己酮醣。单糖具有不同的对映异构体，例如α或β异构体、D 或L异构体。在一些实施方案中，单糖可以包括无取代的糖例如葡萄糖或半乳糖，修 饰的糖，其中1个或多个羟基被氢或取代的碳原子修饰或取代(如唾液酸)。

“寡糖”是指共价连接的单糖单元的短链(如2-9个单糖)。例如，寡糖包括二糖(含两个单糖)、三糖(含三个单糖)、四糖(含四个单糖)。“多醣”是指共价连接 的单糖单元的长链(如10单糖以上)。寡糖和多醣可以包含多种单糖组合的直链或 支链。在特定的实施方案中，直链或支链是由葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、葡 萄糖醛酸(GlcA)、鼠李糖(Rha)的多种组合。

如本文所用，术语“取代”，是指一个化合物具有取代基，该取代基至少包含一 个带有一个或多个氢原子的碳原子、氮原子、氧原子或硫原子。如果一个取代基被描 述为被“取代”，是指一个非氢取代基占据了一个碳、氮、氧、或硫上的一个氢的位置。 举例来说，一个取代的烷基取代基是指其中至少有一个非氢取代基占据了烷基上一个 氢的位置。进一步说明，单氟烷基是指被一个氟取代的烷基，二氟烷基是指被两个氟 取代的烷基。

发明人发现，调节MYPT1的试剂可用于改变平滑肌收缩性。本文所述“平滑 肌”是非横纹肌的肌肉组织，包括动脉和静脉血管平滑肌、胃肠平滑肌、阴茎平滑肌、 子宫平滑肌、输尿管平滑肌、消化道平滑肌、呼吸道平滑肌、睫状肌和虹膜肌等。平 滑肌通过收缩和松弛来行使功能。平滑肌收缩性/收缩力改变可引起各种疾病或病症。

本文所述“调节MYPT1的试剂”包括上调或下调MYPT1的试剂。本文所述 “MYPT1”、“MYPT1亚基”、“MYPT1蛋白”或“肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1”可互换使 用，表示肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的主要调控单位，它通过与PP1c催化亚基 的物理相互作用来调节MLCP单独酶的活性。MYPT1蛋白包含约1029个氨基酸残 基，由Ppp1r12a基因(4.6Kb)编码。小鼠MYPT1蛋白的GenBank登录号为AAI37631.1， 序列如SEQ ID NO:1所示，小鼠Ppp1r12a基因的Gene ID为17931，其中编码MYPT1 亚基的序列如SEQ ID NO:2所示。人MYPT1蛋白的GenBank登录号为AAI11753.1， 人Ppp1r12a基因的Gene ID为4659。本文所述MYPT1蛋白包含与小鼠或人MYPT1 蛋白具有至少70％相同性的同源物，所述同源物具有前述调节MLCP酶活性的功能。 所述同源物可源自哺乳动物，例如Bos taurus、Rattus norvegicusden等。本文所述斜 体“MYPT1”或“Mypt1”表示编码MYPT1的基因。

本文中，上调MYPT1的试剂可为分离的下式I所示的化合物或其立体异构体、 对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

其中：

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹是糖残基；

C2、C11、C12、C16和C19各自独立地任选地被-OH取代；

R^2a、R^2b和R^2c分别独立选自-H、-COOH、COOR⁵、-OH、任选被羟基取代的 C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；或R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-且R^2c选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；或R^2b和R^2c共同形成-CO₂-，且R^2a选自-H、-OH或任选被羟 基取代的C₁-C₆烷基；

R^3a和R^3b分别独立选自-H、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；

R⁴选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R⁵为糖残基。

式I所示的化合物有一个五环中心核，分别命名为A、B、C、D、E。为了方便， 中心核1号位碳原子表述为C1，其它与此类似并依次编号。除非另有说明，式I化 合物中的A环、B环、C环、D环、E环独立地为饱和环、部分饱和环或完全非饱和 环。也就是说，为了使A环、B环、C环、D环、E环成为非饱和环，1-22位任何碳 原子上相连的氢可以被去除。此外，应理解的是，上述各基团的存在应满足键价理论， 换言之，当某个环上具有双键时，为满足键价理论，上述取代基中的一个或多个可能 不存在。例如当C13和C18之间为双键时，C13上的R^2a不存在；；类似的，当C16 和C17之间为双键，或C17和C18之间为双键时，R^2b不存在。

在一些实施方案中，C11、C12、C16和C19分别独立被-OH取代。

本文中，糖残基可以是单糖残基，也可以是寡糖残基。单糖残基可以是阿拉伯 糖(Ara)、葡萄糖醛酸(GlcA)或2-脱氧-葡萄糖醛酸、葡萄糖(Glc)或者鼠李糖 (Rha)脱氢形成的残基。寡糖残基可以是二糖残基、三糖残基或四糖残基；寡糖残 基可包括直链或支链。示例性的寡糖残基包括但不限于Glc-Glc、Ara-Glc、Rha-Ara-Glc-Glc、Ara-Glc-Glc和Rha-Ara-Glc；进一步地，示例性的寡糖残基包括但 不限于-Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc和-Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc-(1-2)-Glc。

本发明式I化合物可分离自冬青科植物或伞形科(Apiaceae Liindl.)植物。

在一些实施方案中，本发明式I化合物是分离的具有下式Ia所示结构的化合物 或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

其中：

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；R¹选自H 和糖残基；C2、C11、C12和C19上各自任选地被OH取代；R^2a及R^2b各自独立选自 H、-COOH和COOR⁵，或两者共同形成-CO₂-；R⁵为单糖残基；R^3a和R^3b共同形成-CH₂-， 或各自独立选自C_1-4烷基(如甲基)或被羟基取代的C_1-4烷氧基(如-CH₂-OH)。

在式Ia的一些实施方案中，A环和B环独自地为完全饱和环。

在式Ia的一些实施方案中，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-。

在式Ia的一些实施方案中，糖残基是本文所述的单糖残基或寡糖残基。

在式Ia的一些实施方案中，A环、B环、C环、E环为完全饱和环，D环为部 分饱和环，C12和C19各自独立被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b都为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基。在一些实施方案中，R¹¹为三糖残基，如 -Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。在一些实施方案中，R¹为四糖残基，如 -Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc-(1-2)-Glc。示例性的这类化合物的结构式如下式所示：

式中，R¹为本文所述的单糖残基或寡糖残基。

在式Ia的一些实施方案中，A环、B环、C环、E环为完全饱和环，D环为部 分饱和环，C11和C19分别独自被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基。在一些实施方案中，R¹为三糖残基，如 -Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。示例性的这类化合物的结构式如下式所示：

式中，R¹为本文所述的单糖残基或寡糖残基。

在式Ia的一些实施方案中，A环、B环、E环为完全饱和环，C环、D环为部 分饱和环，C19被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b为-CH₃，R¹为单糖 残基或寡糖残基。在一些实施方案中，R¹为三糖残基，如-Ara-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。 示例性的这类化合物的结构式如下式所示：

式中，R¹为本文所述的单糖残基或寡糖残基。

在一些实施方案中，式Ia化合物选自：苦丁皂苷A、苦丁皂苷B、苦丁皂苷C、 苦丁皂苷D、苦丁皂苷E、苦丁皂苷F、苦丁皂苷I、苦丁皂苷J、苦丁茶冬青苷H、 苦丁茶冬青苷I和苦丁茶冬青苷J中的一种或多种；优选为苦丁皂苷A、苦丁皂苷B、 苦丁皂苷C、苦丁皂苷I、苦丁茶冬青苷I和苦丁茶冬青苷J中的一种或多种。

通式Ia化合物可分离自冬青科植物。冬青科植物主要包括：大叶冬青、小叶冬 青、苦丁茶冬青、毛冬青、铁冬青、浙江冬青、四川冬青、广东冬青、梅叶冬青、灰 冬青、榕叶冬青、细花冬青、毛冬青、大果冬青以及其他冬青科植物。可选用冬青科 植物部位，包括叶、根、茎、皮、果提取获得本发明的式Ia化合物。在一些实施方 案中，通式Ia化合物分离自苦丁茶。

更多的通式Ia化合物及其制备方法可参见WO 2015/158216 A1，本文将其全部 内容以引用的方式纳入本文。

在一些实施方案中，式I的化合物为分离的下式Ib所示的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

式中，

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹是糖残基；

C2、C11、C12、C16和C19各自独立地任选地被-OH取代；

R^2a和R^2b分别独立选自-H、-COOH、COOR⁵、-OH、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；或R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-；

R^3a和R^3b分别独立选自-H、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；

R⁴选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R⁵为糖残基。

式Ib中，优选地，C16被羟基取代。

式Ib中，优选地，R^3a和R^3b分别独立选自任选被羟基取代的C₁-C₆烷基，如甲 基、乙基或羟甲基。

式Ib中，优选地，R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-。

式Ib中，优选地，A环、B环、D环和E环均为完全饱和环，C环为部分饱和 环。更优选地，A环、B环、D环和E环均为完全饱和环，C环在C11和C12之间 为双键。

在式Ib的优选实施方案中，所述化合物具有下式Ib-1所示结构：

式中，

R¹是糖残基；

C16被-OH取代；

R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-；和

R^3a和R^3b分别独立选自任选被羟基取代的C₁-C₆烷基。

式Ib及Ib-1中，糖残基如本文任一实施方案所述。示例性的糖残基包括但不限于-Rha-Glc，如-Rha-(1-3)-Glc，和-Glc-Rha-Glc，如-Glc-[(1-2)-Rha]-(1-3)-Glc。

优选地，式Ib的化合物可分离自伞形科(Apiaceae Lindl.)植物，优选柴胡属(Bupleurum Linn.)植物。所述柴胡属包括：北柴胡(B.chinense DC.)、银州柴胡(B.yinchowense Shan et Y.Li)、红柴胡(B.scorzonerifolium Willd)、黑柴胡(B.smithiiH. Wolff)、马尾柴胡(B.microcephalum Diels)、锥叶柴胡(B.bicaule Helm.)。

优选地，式Ib的化合物选自：

一些实施方案中，上调MYPT1的试剂可以是生物碱。生物碱是存在于植物或 动物中的一类含氮的碱性有机化合物。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是式II所示的化合物或其立体异构体、对 映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐：

式中，

R_a和R_b各自独立选自-H、-OH或烷氧基，

R_c是任选被一个或多个选自羟基、烷基或烷氧基取代的芳基，，

R_d1和R_d2各自独立选自烷基或不存在。

在一个或多个实施方案中，式II的化合物中，R_a和R_b各自独立选自-H、-OH 或C₁-C₆烷氧基；R_c是任选被一个或多个选自羟基、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基取代 的芳基；

R_d1和R_d2各自独立选自C₁-C₆烷基或不存在。

在一个或多个实施方案中，式II的化合物中，R_a和R_b各自独立选自-OH或C₁-C₆烷氧基；

R_c是任选被一个或多个选自羟基或C₁-C₆烷基取代的苯基；

R_d1和R_d2各自独立选自C₁-C₆烷基。

优选地，上调MYPT1的试剂是式IIa所示的化合物或其立体异构体、对映异构 体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐：

式中，

R_a和R_b各自独立选自-H、-OH或烷氧基，

R_c1是-H或-OH，

R_d1和R_d2各自独立选自C₁-C₆烷基或不存在。

优选地，本文所述生物碱包括莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)、甲基 莲心碱(neferine)、莲心季铵碱(lotusine)、甲基紫堇杷灵碱(methye-corypalline)、 荷叶碱、前荷叶碱、去甲基衡州乌药碱(demethylcoclaurine)和非晶性生物碱Nn-9， 优选是莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)、甲基莲心碱(neferine)、莲心季铵 碱(lotusine)。

在一个或多个实施方案中，式II化合物如下所示，

式II化合物可分离自睡莲科(Nymphaeaceae)植物，包括莲属(Nelumbo)植 物。莲属包括美洲莲(Nelumbolutea)或亚洲莲(Nelumbonucifera)。

本发明公开的化合物或其药学上可接受的盐可以包括一个或多个非对称中心，因此会存在对映异构体、非对映异构体以及其它可以被定义的立体异构体形式，根据 立体化学可分为(R)-或(S)-、用于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明意为包括所 有这些可能的异构体，以及外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R) -和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以通过手性合成子或手性试剂制备，或用通常 的技术如使用手性柱的高效液相来分离制备。当本发明所述的化合物含有烯族双键或 其它几何不对称中心时，除非另有说明，则其意为该化合物包括E和Z几何异构体。 同样地，所有的互变异构体也包括在内。

本发明所述的试剂可以是上述式I或II所示的经分离而与其天然生境相隔离的化合物中的一种或多种，也可以是前文所述各类植物的提取物，且该类提取物中含有 一种或多种式I或II所示结构的化合物。本文所述“提取物”是以植物或其一部分为 原料，采用适当的溶剂或方法，浓集植物中的某一种或多种有效成分，而不改变其有 效成分结构而形成的产品。按照性状不同，可分为植物油、浸膏、粉、晶状体等。

更具体而言，所述试剂可以是冬青科植物的提取物。冬青科植物主要包括：大 叶冬青、小叶冬青、苦丁茶冬青、毛冬青、铁冬青、浙江冬青、四川冬青、广东冬青、 梅叶冬青、灰冬青、榕叶冬青、细花冬青、毛冬青、大果冬青以及其他冬青科植物。 可选用冬青科植物的各个部位，包括叶、根、茎、皮、果进行提取，获得本发明的提 取物，优选是包含式Ia化合物的提取物。在一些实施方案中，所述提取物是苦丁茶 提取物。

所述试剂还可以是伞形科(Apiaceae Lindl.)植物提取物，优选是柴胡属(Bupleurum Linn.)植物提取物，优选至少含有柴胡皂苷，更优选含有式Ib化合物， 更优选还有式Ib-1化合物。所述柴胡属包括：北柴胡(B.chinense DC.)、银州柴胡(B.yinchowense Shan et Y.Li)、红柴胡(B.scorzonerifolium Willd)、黑柴胡(B.smithii H.Wolff)、马尾柴胡(B.microcephalum Diels)、锥叶柴胡(B.bicauleHelm.)。

所述试剂还可以是睡莲科(Nymphaeaceae)植物的提取物，例如包含生物碱的 莲属(Nelumbo)植物的提取物。莲属包括美洲莲(Nelumbolutea)或亚洲莲(Nelumbonucifera)。所述生物碱包括莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)、甲基莲心碱(neferine)、莲心季铵碱(lotusine)、甲基紫堇杷灵碱(methye-corypalline)、荷叶碱、前荷叶碱、去甲基衡州乌药碱(demethylcoclaurine)、非晶性生物碱Nn-9。 所述提取物可提取自睡莲科植物任何部位，优选提取自莲心。莲心是睡莲科植物的成 熟种子中的幼叶和/或胚根。优选地，所述提取物是含莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)、甲基莲心碱(neferine)、莲心季铵碱(lotusine)的莲心提取物。

可采用本领域周知的各种提取方法提取上述植物，获得本发明所述的各式化合物或提取物。示例性的提取方法包括一个或多个下述步骤：醇提取、柱层析、HPLC。 优选的，本发明的提取物是乙醇提取物。优选地，可从各植物的根部、幼叶和/或胚 根提取，获得本发明的化合物或提取物。

本文所述“药学上可接受的盐”包括酸式盐和碱式盐。

“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于 盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不 限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4- 乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、 环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fiimaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、 2-氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺 丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、 1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、 丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲 苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。

“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有 机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、 铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐 以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括 天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、 三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二 环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙 苄胺、N,N'-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、 缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机 碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶剂化物”是指一种包含了一种或多种本专利公开的化合物分子与一种或多种溶剂分子的聚 合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂还可能是有机溶剂。 因此，本专利公开的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合 物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。 本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明公开的化合物 也可以是仅保有一部分水，或者是保有水与一些溶剂的混合物。

发明人发现，体内泛素连接酶与MYPT1结合，并通过泛素-蛋白酶体途径增强MYPT1的降解。因此，上调MYPT1的试剂可为泛素酶抑制剂。泛素酶包括泛素激 活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3，其中所述泛素连接酶可为SIAH1和SIAH2 E3连接酶。适用于本发明的泛素连接酶抑制剂本领域周知。示例性地，泛素连接酶 抑制剂包括蛋白酶体抑制剂，例如MG132或MLN4924、MG-341、PS-341、双硫仑、 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、Salinosporamide A、ONX0912、CEP-18770以及 MLN9708等。在一个或多个实施方案中，蛋白酶体抑制剂可为下述药物中的一种或 多种：Bortezomib、carfilzomib、ixazomib、Marizomib、Oprozomib、蛋白酶体组合(如， 来那度胺+地塞米松、BCL-2抑制剂Venetoclax、免疫调节剂Pomalyst、CD319抑制 剂Empliciti、PD-1抑制剂)。

发明人还发现，体内泛素连接酶与MYPT1的结合由LPS/TLR4诱导。因此，上 调MYPT1的试剂还可为阻断LPS/TLR4通路的试剂，例如TLR4抑制剂、LPS结合 剂或LPS信号通路抑制剂。适用于本发明的阻断LPS/TLR4通路的试剂本领域周知。 示例性地，TLR4抑制剂可为TAK242，LPS结合剂可为PMB。

上调MYPT1还可通过在宿主或宿主细胞中过表达MYPT1而实现其表达的上调。 因此，上调MYPT1的表达的试剂为MYPT1的表达载体。例如，可利用本领域常规 的技术构建适于在宿主细胞中表达MYPT1的表达载体，并通过常规方法转入宿主细 胞中，使得表达载体在宿主细胞中表达所述分子，从而实现其表达的上调。所述表达 载体包含在宿主细胞中表达MYPT1所需的其他组件，并且本领域技术人员知晓这些 组件。在某些实施方案中，可调控这些分子的上游基因的表达，从而提高这类分子的 表达。例如，在某些实施方案中，可给予对象表达MYPT1的病毒载体(如慢病毒载 体)，从而提高MYPT1在对象细胞中的表达水平。在一个或多个实施方案中，MYPT1 的表达载体表达SEQ ID NO:1所示的序列。在一个或多个实施方案中，MYPT1的表 达载体包含SEQ ID NO:2所示的序列。

本文中，上调MYPT1的试剂可用于治疗受益于平滑肌松弛的疾病。示例性地， 受益于平滑肌松弛的疾病包括胃肠功能障碍，哮喘，COPD，尿失禁，肛裂，勃起功 能障碍，高血压，近视，血管痉挛。此外，上调MYPT1的试剂可用于增强平滑肌松 弛、改善阴茎勃起或扩增血管直径。本文所述血管可为动脉、静脉或毛细血管。

本发明还提供下调MYPT1的试剂。下调MYPT1的试剂可为基因编辑载体，RNA 编辑载体，MYPT1的抗体，MYPT1拮抗剂，编码MYPT1的基因的反义RNA，例 如siRNA或shRNA，E3连接酶，例如SIAH1 E3连接酶、SIAH2 E3连接酶，E3连 接酶活化剂，脂多糖(LPS)或其可启动TLR4通路的类似物，TLR4活化剂、NF-kB 信号激活物(如，IL-1、TNF-a等炎性因子等)。本文中，基因编辑载体可以是本领 域周知的CRISPR-CAS9基因编辑载体或TALEN基因编辑载体，用于敲除或敲低 MYPT1的表达。本文中，RNA编辑载体可以是本领域周知的CRISPR-CAS13RNA 编辑载体。

本文中，下调MYPT1的试剂可用于治疗受益于平滑肌收缩的疾病的药物中的 应用。示例性地，受益于平滑肌收缩的疾病包括：尿道松弛、粪失禁、低血压、肠动 力降低、膀胱无力。此外，下调MYPT1的试剂可用于增强平滑肌收缩、抑制阴茎勃 起或缩小血管直径。

药用组合物

本文还提供一种药物组合物，该药物组合物中含有本文所述的调节MYPT1的 试剂以及药学上可接受的辅料。本文中，“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/ 或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于： pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、 防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、 稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括 一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、 压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体 而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于植物提取成分或核酸给药的辅 料。

通常，药物组合物中含有治疗有效量的本文所述试剂。治疗有效量是指可在受 试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、 所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可 作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者 或患者通常指哺乳动物，尤其指人。

本文所述调节MYPT1的试剂或药物组合物可与其他改变平滑肌收缩性的试剂 联用。所述其他改变平滑肌收缩性的试剂例如PDE5抑制剂、酚妥拉明、罂粟碱、前 列腺素E1、组织胺、ROCK抑制剂、钙通道抑制剂、氯通道抑制剂等。本领域技术 人员可确定其他改变平滑肌收缩性的试剂的给药剂量。

方法和用途

本发明还提供筛选调节平滑肌收缩性的候选药物的方法，包括将候选药物与平滑肌细胞孵育，和检测细胞MYPT1表达量。发明人通过筛选，发现上调MYPT1的 表达的药物包括Vidarabine、Rifaximin、Ramipril、Ranolazine、Ranitidine、Acadesine、 Acipimox、Acyclovir，如图17所示；下调MYPT1的表达的药物包括Naloxone HCl、 Etravirine、Atovaquone等，如图18所示。本发明包括这些药物作为上调或下调MYPT1 的试剂在改善平滑肌收缩性中的用途。

本文所述调节MYPT1的试剂可与其他改变平滑肌收缩性的试剂联用。所述其 他改变平滑肌收缩性的试剂例如PDE5抑制剂、酚妥拉明、罂粟碱、前列腺素E1、 组织胺、ROCK抑制剂、钙通道抑制剂、氯通道抑制剂等。

本发明还涉及治疗受益于平滑肌松弛的疾病的方法。该方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的本文所述的上调MYPT1的试剂或药物组合物。示例性地， 受益于平滑肌松弛的疾病包括胃肠功能障碍，哮喘，COPD，尿失禁，肛裂，勃起功 能障碍，高血压，近视，血管痉挛。此外，上调MYPT1的试剂可用于增强平滑肌松 弛、改善阴茎勃起或扩增血管直径。

本发明还涉及治疗受益于平滑肌收缩的疾病的方法。该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的下调MYPT1的试剂或药物组合物。在一个或多个实 施方案中，所述方法包括通过口服试剂的方式向对象给予治疗有效量的试剂。示例性 地，受益于平滑肌收缩的疾病包括：尿道松弛、粪失禁、低血压、肠动力降低、膀胱 无力。此外，下调MYPT1的试剂可用于增强平滑肌收缩、抑制阴茎勃起或缩小血管 直径。

本发明还涉及治疗受益于平滑肌松弛的疾病的试剂盒，该试剂盒包含上调 MYPT1的试剂或药物组合物以及将所述试剂给予对象所需的其他试剂。本发明还涉 及治疗受益于平滑肌收缩的疾病的试剂盒，该试剂盒包含下调MYPT1的试剂或药物 组合物以及将所述试剂给予对象所需的其他试剂。

本发明还涉及检测MYPT1的试剂在制备用于诊断平滑肌收缩性改变相关疾病 或病症的试剂盒中的应用。本发明还涉及用于诊断平滑肌收缩性改变相关疾病的试剂 盒，包含检测MYPT1的试剂。所述平滑肌收缩性改变相关疾病包括本文所述的受益 于平滑肌收缩的疾病和受益于平滑肌松弛的疾病。所述检测MYPT1的试剂本领域周 知，例如可以是检测MYPT1蛋白的试剂或检测MYPT1编码序列或mRNA的试剂。 所述试剂盒基于对象样品中MYPT1编码序列、MYPT1 mRNA和/或MYPT1蛋白的 含量进行诊断。

本发明还涉及诊断平滑肌收缩性改变相关疾病的方法，包括：检测对象样品中MYPT1编码序列、MYPT1 mRNA和/或MYPT1蛋白的含量，通过与正常样品的相 应含量比较进行诊断。所述样品可为全血样品、血清样品、血浆样品、中枢脊髓液样 品、尿液样品、唾液样品或组织切片样品。

实施例

实施例1-方法和材料

临床活检：

从进行阴茎假体植入手术的ED患者中收集人海绵体组织。从阴茎癌患者中收 集对照阴茎活检组织，它们是与肿瘤相邻的正常组织。所有ED患者对PDE5抑制剂 均无效，基本信息如表1所示。

动物：

Mypt1^flox/flox、Mypt1^SMKO、db/db、C3H/HeJ、C57BL/6小鼠由南京大学模式动物 研究所和集萃药康公司提供。

雄性性行为测试：

该性行为已作为以前的报告进行了测试。手动将雄性(8-10周)和雌性(6-8 周)小鼠放入同一个房间，并在下午8:00进行45分钟的光学测量以评估其性行为。 在记录行为之前，先通过皮下注射10μg雌二醇苯甲酸酯(Sigma-Aldrich)对雌性小 鼠进行48小时的激素预处理，然后在记录前3-5小时注射500μg孕酮(Sigma-Aldrich)。 第二天上午9:00检栓。

体内腔内压(ICP)和平均动脉压(MAP)的测量：

为了评估小鼠的阴茎勃起功能，记录对电刺激海绵状神经的ICP。通过腹膜内 注射戊巴比妥(40mg/kg)麻醉小鼠，并通过耻骨上中线切口暴露膀胱和前列腺。将 睾丸和附睾复位到腹部以暴露海绵状神经。阴茎剥落了皮肤和阑尾组织，用肝素化的 (100IE/mL)25号针头插入海绵体，并用带有聚乙烯(PE)50管的压力传感器连接。 导管连接到压力传感器，压力传感器连接到PowerLab 8/SP数据采集系统(Chart 5.0 软件；ADInstruments，Colorado Springs，CO)。海绵状神经的各自电刺激参数为5V， 12Hz，脉冲宽度为1ms，持续时间为60s。使用尾袖系统测量MAP(ALC-无创血压 系统，上海艾可特生物技术有限公司，中国)。

阴茎背动脉(PDA)和海绵体平滑肌收缩力的测量：

刚从阴茎中分离出背动脉，并在37℃下用Krebs溶液(NaCl,130mM；NaHCO₃,14.9mM；右旋糖,5.5mM；KCl,4.7mM；KH₂PO₄,1.18mM；MgSO₄·7H₂O,1.17mM 和CaCl₂·2H₂O,1.6mM)平衡30分钟，然后用95％O₂/5％CO₂连续充气。将体内静 息张力调节至等于100mm Hg后，将动脉段再平衡20分钟，之后用124mM KCl-Krebs 溶液(NaCl,10.7mM；NaHCO₃,14.9mM；右旋糖,5.5mM；KCl,124mM；KH₂PO₄, 1.18mM；MgSO₄·7H₂O,1.17mM和CaCl₂·2H2O,1.6mM)或其他试剂处理。PE和 U46619用作GPCR激动剂引起平滑肌收缩；H1151用作ROCK抑制剂，GF109203x 用作PKC抑制剂。为了测量海绵体平滑肌收缩力，用预冷的Krebs溶液从阴茎中分 离出完整的白膜，然后将海绵体条安装到等距传感器上，并用37℃的Krebs溶液平 衡30分钟。将静止张力调整为0.5g后，用含80mmol/L KCl的KCl去极化缓冲液(NaCl: 52.7mmol/L；KCl:87.0mmol/L；MgCl2:1.0mmol/L；CaCl2:1.8mmol/L；HEPES:10.0 mmol/L；和D-葡萄糖:5.6mmol/L；pH 7.4)或GPCR激动剂(PE和U46619)刺激海 绵体条。

免疫组化：

在室温下，用添加有0.002％苦味酸的4％甲醛将阴茎固定4小时，然后在4℃ 下用30％蔗糖PBS脱水过夜。将固定的组织用OCT(Leica)包埋并切成10μm切片。 在室温下用0.1％Triton X-100/0.1％Tween 20/3％非免疫山羊血清在PBS中封闭切片1 小时。一抗(抗MYPT1(1:200)，Protein technology公司；抗平滑肌α-肌动蛋白(1:200)， ThermoScientific公司；抗eNOS(1:200)，BioRad公司)在4℃下孵育过夜。荧光 二抗(Invitrogen公司)在室温下孵育2小时，在共聚焦显微镜(Olympus)上检查荧 光染色。

组织学检查：

将小鼠的阴茎在4℃的4％甲醛中固定2小时，在4℃的丁醇中脱水过夜，然 后包埋在石蜡中并切成5μm的切片。用苏木精/伊红对切片进行染色，并在显微镜图 像(Dotslide，Olympus公司)下检查阴茎动脉的形态。

Western印迹检测：

为了确定收缩相关蛋白，将患者的海绵体在裂解缓冲液(2％SDS；10％甘油；10mmol/L DTT；50mmol/L Tris-HCl；pH 7.4)中匀浆。在85℃下孵育5分钟后， 将样品以10,600×g离心10分钟。用二辛可宁酸蛋白质测定试剂(Thermo Scientific Pierce公司，Rockford，IL)测量蛋白质浓度。通过8-12％SDS-PAGE分离等量的蛋 白质，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。然后用一抗和二抗探测该膜。为了可视化印 迹信号，将膜在Super SignalWest Pico化学发光底物(Thermo Scientific Pierce公司， Rockford，IL)中孵育，然后暴露于胶片中。用于Western印迹的一抗是：抗β-肌动 蛋白抗体(IB：1:10000，Sigma公司)，抗MYPT-1抗体(IP：1:50；IB：1:2000，Millipore公司，抗ROCK-2抗体(IB：1:1000，Santa Cruz公司)，抗PP1cδ抗体(IB： 1:500，Millipore公司)，抗PKC抗体(IB：1:1000，Millipore公司)。

肌球蛋白轻链磷酸化的测量：

用尿素/甘油PAGE测量阴茎动脉的肌球蛋白轻链磷酸化。简而言之，用10uM PE刺激后，立即在指定的时间点用液氮冷冻动脉，并在-80℃下将其储存在10％ TCA/10mM DTT的丙酮溶液中。然后通过在水中的10％TCA/10mM DTT研磨组织 以溶解。将混合物以3000g离心3分钟，然后丢弃上清液。沉淀物用丙酮洗涤2次， 用乙醚洗涤1次，除去乙醚后在室温下干燥，然后溶解在8M尿素样品缓冲液中。抗 RLC抗体被用作Western印迹的一抗。计算磷酸化的RLC相对于总RLC的相对比例。

统计：

数据表示为平均值±SEM。两组之间的差异通过配对或非配对t检验进行评估。 通过单向方差分析和Tukey检验进行多组比较。P≤0.05被认为具有统计学意义。所 有统计分析均通过使用GraphPad软件进行。

实施例2-ED阴茎平滑肌中的MYPT1蛋白下调

为了确定MYPT1是否调节阴茎功能，检测了海绵体的MYPT1蛋白量。Western 印迹分析显示，对照组的海绵体具有明显的MYPT1表达，而来自5名顽固性ED患 者的所有海绵体(表1)平均表达MYPT1低于15.9％(图1A和B)。五分之二的 ED活检没有显示可检测的MYPT1表达。其他信号分子在ED活组织中的表达量与 在正常组织中的表达量基本相当，其中包括CPI-17，ROCK，RLC，MLCK，PDE5， PKC和PP1c。有趣的是，五例ED阴茎活检显示二例有eNOS显著减少，三例活检 则无明显差别(图1A和B)。通过免疫荧光染色测定db/db糖尿病小鼠背动脉和海 绵体中MYPT1和eNOS蛋白的表达量，发现MYPT1蛋白显著降低，但eNOS并未 降低(图1C)。该结果表明MYPT1表达与ED表型的密切相关联。

表1，临床数据

IIEF：勃起功能国际指数

AVSS：视听性刺激

实施例3-平滑肌MYPT1缺失导致勃起功能障碍

然后，通过分析具有MYPT1平滑肌特异性缺失的小鼠系(Mypt1^SMKO)评估了 MYPT1在ED中的作用。野生型、敲除(KO)动物的杂合子和纯合子的幼仔产量显 著不同。野生型C57BL/6小鼠的所有8只雌性与野生型C57BL/6小鼠的8个雄性交 配，共产仔52窝288只。8只雌性野生型C57BL/6小鼠与8只雄性Mypt1^SMKO杂合 子交配，在44窝中产生246头幼崽。分别与Mypt1^SMKO纯合子交配的6只野生型 C57BL/6雌性在2窝中产生了10只幼崽(表2)。这些结果表明，Mypt1^SMKO雄性小 鼠表现出生育力降低、窝数和幼仔数少。为了测试这种不育是否是由性欲的改变引起 的，评估了他们在45分钟内的嗅探，坐骑、梳理、射精的性行为。野生型、杂合子 和纯合子小鼠的性行为频率相当(表3)。与纯合子交配时，未观察到野生型雌性阴 栓形成。因此，KO雄性的不育不是由性欲的改变引起的。

表2.野生型和突变小鼠数量

表3.野生型和突变小鼠的性行为

然后，测量`了阴茎ICP对电刺激的反应，以评估KO小鼠的阴茎勃起功能。用 电刺激(5V，12Hz，1ms的脉冲宽度持续60s)处理后，对照组小鼠的ICP迅速增 加，并在55秒内达到55.49±4.89mmHg的峰值；杂合子的ICP以类似的方式增加， 但最大压力(42.30±3.68mmHg)低于对照鼠(p<0.05)。正如预期的那样，纯合子 对刺激的ICP反应消失，其最大ICP值明显低于其他组(所有p<0.001)(图2A和 B)。观察结果表明，MYPT1的缺失可导致小鼠勃起功能障碍的发生。

实施例4-MYPT1表达缺失导致阴茎平滑肌的收缩行为改变。

组织学检查显示，Mypt1^SMKO小鼠的所有野生型、杂合子和纯合子阴茎的大小和 重量基本相当(均p>0.05)(图2C)，苏木精-伊红染色显示出背动脉、背静脉、阴 茎动脉、海绵体、白膜、尿道和窦的典型结构(图2C)。然而，KO突变背动脉的直 径显著减小(野生型：98.90±4.69μm，而杂合子：85.14±2.59μm，p<0.05vs纯合子： 58.94±0.92μm，p<0.05)(图2D)。由于肌肉层面积是呈比例减小(野生型： 2283.00±36.42μm²，杂合子：1782.00±142.50μm²，纯合子：1299.00±14.99μm²)(图 2E)，上述动脉管腔变窄不太可能是由平滑肌肥大引起的。

然后，分别测量了背动脉和海绵体肌肉对KCl去极化和GPCR激动剂的收缩反 应。经124mM KCl去极化处理后，KO杂合子动脉的最大力张力增加了114.44～ 144.63％(对照1.50±0.17N/mm²，杂合KO 2.17±0.16N/mm²，纯合KO 1.70±0.30N/mm²) (图3A和D)。然后，评估了突变体肌肉对GPCR激动剂的响应敏感性，如图3B 和C所示。当用浓度低至3-30nM的PE处理时，突变体平滑肌开始收缩，而对照背 动脉直到100nM才开始收缩(图3B和E)。在30nM PE时，杂合子背动脉平滑肌 产生的力为0.41±0.10N/mm²，而纯合子背动脉为0.36±0.07N/mm²，均高于对照组(p <0.05)(图3B和E)。令人惊奇的是，MYPT1敲除后，阴茎背动脉对PE的初始反 应剂量降低了约10倍，其IC50值为89.31±7.91nM，也显著低于对照(206.80±13.74 nM)(图3B)。该结果表明：缺乏MYPT1的背动脉对PE的反应表现出高敏感性， 尤其是在低剂量PE时更是如此。但是，U46619在突变型背动脉中未显示出增强的 收缩反应，反应敏感性似乎也没有改变(图3C和F)。

测量海绵体平滑肌的收缩特性。用80mM KCl刺激后，野生型、杂合子和纯合 子组之间的收缩起始峰没有差异(图3G和J)。在增加剂量的PE刺激下，0.3μMPE 引起的纯合子肌肉的收缩力高于杂合子肌肉的收缩(图3H和K)，而对U46619的 收缩反应相当(p>0.05)(图3I和L)。该结果表明海绵体平滑肌也表现出对GPCR 激动剂的高反应性。

RLC磷酸化与力的产生以及与MYPT1调控的MLCP活性紧密相关。为了测试 上述收缩行为改变是否归因于收缩信号传导的改变而不是肌肉重塑，通过尿素/甘油PAG和Western印迹检测了阴茎背动脉的RLC磷酸化水平。用PE刺激后，突变平 滑肌的单磷酸化RLC明显高于对照(图4)，这表明以RLCp为中心的信号参与了 阴茎平滑肌的自然变化。

实施例5-MYPT1的减少抑制了一氧化氮介导的阴茎平滑肌的松弛效应。

本实施例评估了突变背动脉对一氧化氮供体SNP的反应。PE引起的对照和杂合 子背动脉收缩在添加小于10nM的SNP时开始松弛，而当浓度大于30nM时，纯合 子背动脉开始松弛(图5A)，显示初始松弛剂量增加了3倍。对照组、杂合子和纯 合子组的松弛50％的收缩力所需SNP剂量(IC50)分别为26.94±3.32nM， 40.49±6.63μM和185.60±60.89μM(图5A和B)。在10nM SNP时，三组平滑肌的 舒张程度分别为82.07±6.14％，83.31±8.73％(p>0.05)和106.00±3.03％(p<0.05)； 在30nM SNP时，各自的舒张程度分别为55.77±11.81％，60.18±12.80％(p>0.05) 和83.88±9.27％(p<0.05)。该结果表明突变型背动脉中一氧化氮介导的松弛机制受 到损害。还评估了ROCK(H1152)和PKC抑制剂(GF109203)的松弛作用。施用 H1152后，对照、杂合子和纯合子背动脉的松弛减少(图6A和B)，但对于GF109203 则没有(图6C和D)。有趣的是，在海绵体平滑肌中也观察到了类似的松弛效果。用SNP处理后，对照海绵体平滑肌在30nM时开始松弛，而杂合子海绵体平滑肌为 1μM，纯合子海绵体平滑肌为10μM。对照、杂合子和纯合子海绵体平滑肌在100μM SNP处理后，其收缩力分别降低了约53.60％，43.28％和31.23％(图5C和D)。突 变体海绵体平滑肌对3μMH1152的松弛响应也降低了(图7A和B)。海绵体平滑肌 的所有组均显示出与GF109203相当的响应(图7C和D)。这些结果显示，MYPT1 缺陷型肌肉的松弛受损，尤其是一氧化氮介导的松弛效应。

实施例6-生物碱调节MYPT1表达并恢复ED小鼠的阴茎功能

生物碱是莲子胚胎中最重要的活性成分。为了找到具有上调MYPT1表达活性 的生物碱，使用A7r5平滑肌细胞系和Coco26结肠癌细胞系作为细胞模型筛选生物 碱，并通过Western印迹检测MYPT1。结果表明，莲心季铵碱(简写为LOT1)剂量 依赖性地增加MYPT1的表达，显示出对Coco26培养细胞中MYPT1表达有强调节 活性(图8)。在低至0.05μM的浓度下，莲心季铵碱可将A7r5细胞中的MYPT1 表达增加约2倍，而当浓度达到5μM时，MYPT1表达增加约3倍，而无明显的细 胞毒性(图9A和B)。莲心季铵碱对MYPT1的调节活性还可以通过体内实验(腹 腔内注射)证实。注射LOT1(5mg/kg体重)后，C57/BL6小鼠阴茎平滑肌中的MYPT1 表达提高了1.3倍，杂合子小鼠的MYPT1表达提高了2倍(图9C)。LOT1未显示 上调纯合子中MYPT1的表达，因为两条Mypt1等位基因业已缺失。

尽管Mypt1^SMKO杂合子小鼠的阴茎功能受损，但不足以影响动物生育能力。由 于该小鼠阴茎对电刺激所引起的ICP反应及其组织学改变方面表现出中等的ED表型， 所以将其用作一种ED疾病模型。用LOT1连续注射Mypt1^SMKO杂合子小鼠及同窝对 照鼠28天，结果发现：与溶剂对照组相比，经LOT1治疗后的突变鼠阴茎大小并没 有明显改变(图10C)，但令人惊讶的是，突变型背动脉腔的大小得到了显著恢复(图 10A和B)，阴茎海绵体中心动脉直径也得到恢复(图11)。然后，测量了阴茎响 应电刺激的海绵体内压力。当5V/12Hz刺激后，用LOT1处理的对照组阴茎的最大 ICP较未治疗组增加了110％，但无统计学差异(p＝0.49)(图10D，E和G)。但 是，杂合子的阴茎在LOT1处理后，其最大ICP压力显著增加(处理组：53.81±1.83， 未处理组：45.88±2.05，p<0.05)，压力值与野生型小鼠的ICP相当(p>0.05)(图 10D，E和G)。LOT1治疗后，杂合子和纯合子的平均血压(MAP)略有降低(图 10F)。该结果表明，LOT1的治疗显著恢复了阴茎勃起功能和组织学改变。由于LOT1 治疗不能恢复Mypt1^SMKO纯合子(两条Mypt1等位基因均缺失)的阴茎功能，以上结 果还表明：LOT1治疗的功效是通过调控MYPT1这一靶点完成的。

同时，用5mg/kg LOT1处理db/db小鼠28天，与PBS处理的小鼠相比，MYPT1 表达上调了2倍(图12C和D)。阴茎的重量和长度没有变化(图12A和B)。经 LOT1处理的db/db小鼠的ICP高达36.15±6.32mmHg，而经PBS处理的db/db小鼠 的ICP值为19.23±5.11mmHg(图12E和F)。这些结果表明LOT1改善了ED小鼠 的勃起功能。

实施例7-Lot通过抑制蛋白泛素化途径诱导MYPT1表达增加。

为了研究莲心碱的调节机制，比较了有无LOT1处理的A7r5细胞的Mypt1 mRNA水平。提取细胞中总mRNA进行逆转录得到cDNA，然后用Q-PCR方法扩增 Mypt1，所用引物对为：5-CCAATGTGGACGGACTCACC-3(SEQ ID NO:3)和 5-GCTGCATGGAGTGGTATCCAG-3(SEQ ID NO:4)，PCR试剂盒购于罗氏公司。结 果表明，用0.5μm LOT1处理不会影响Mypt1 mRNA水平(p>0.05)(图13A)，表 明LOT1作用于翻译后途径。然后，用抗MYPT1抗体从用5μM MG132和0.5μMLOT1 处理24小时的A7r5细胞的裂解物中提取MYPT1蛋白，并对沉淀混合物进行不同蛋 白的免疫印迹。MG132和LOT1处理后，泛素化的MYPT1显著降低(图13B)。同 时，在下拉的裂解物中检测到SIAH1和SIAH2，它们都是含有MYPT1结合基序的 E3连接酶。以上结果表明，LOT1是通过抑制蛋白泛素化途径来增加MYPT1表达量。

实施例8-萜类化合物调节平滑肌细胞中MYPT1的表达

构建了天然萜类化合物的文库，其中大多数萜类都是五环三萜。将化合物以 1mg/ml的浓度溶解在DMSO中，然后进行A7r5平滑肌细胞和Coco26结肠上皮细胞 的培养。孵育48小时后，对细胞取样以进行SDS-PAGE和Western印迹测定MYPT1 蛋白量。一抗是小鼠抗MYPT1抗体(Santa Cruz公司)。如图14和15所示，五环 三萜类化合物柴胡皂苷A(S-A)，柴胡皂苷C(S-C)和柴胡皂苷D(S-D)、苦丁 茶皂苷(苦丁皂苷A，KE)具有上调MYPT1表达的有效活性。而柴胡皂苷B(S-B)、 柴胡皂苷G(S-G)、柴胡皂苷H(S-H)和人参皂苷几乎不具有活性。

实施例9-通过E3连接酶介导的蛋白酶体途径降解MYPT1

编码MYPT1的基因是一个管家基因，在转录水平表达相对恒定。发明人发现 (如实施例7所示)，LOT1可以降低MYPT1的泛素化水平，提示翻译后修饰可能 是MYPT1表达的主要调节方式。蛋白结构分析也提示，MYPT1具有两个E3连接酶 SIAH1和SIAH2的结合位点。为了确定MYPT1蛋白是否被泛素-蛋白酶体蛋白降解 途径下调、是何种因素启动这一调节途径的，经筛选发现LPS是一个重要的启动因 子。具体地：平滑肌细胞(SMC)中有Mypt1 mRNA的表达，而空白对照(NC)未检 测到mRNA信号(图16A)。当同时用LPS和MG132处理平滑肌细胞时，MYPT1 蛋白量下降不明显(图16B)，但单独加LPS可导致MYPT1的显著下降(图16C)。 还测试了SIAH1和/或SIAH2连接酶是否在有或没有LPS和MG132(Selleck)处理 的结肠平滑肌中表达(图16C)。结果表明，SIAH1和SIAH2均在平滑肌中表达。 通过使用抗MYPT1抗体，从平滑肌裂解物中提取了MYPT1蛋白复合物，然后测量 了所得复合物中的SIAH1和SIAH2蛋白。为了确定MYPT1降解是否由泛素介导， 先用抗MYPT1抗体从LPS处理的平滑肌中下拉了MYPT1蛋白，然后用抗泛素抗体 做免疫印迹。结果与预期一致，检测到了泛素化的MYPT1(图16D)。在肌肉的下 拉裂解液中，虽然LPS处理过的肌肉组织的裂解液中MYPT1信号相当，但SIAH1 和SIAH2信号的信号强度要强得多(图16D)。当用LPS加MG132处理肌肉时， 检测到的SIAH1和SIAH2信号更强(图16D)。为了测试LPS是否通过Toll样受体 调节MYPT1降解，对C3H/HeJ小鼠(具有突变的TLR4的品系)进行了LPS处理， 然后通过Western印迹检测MYPT1蛋白。结果如图16E所示，LPS治疗后结肠平滑 肌未显示MYPT1明显降低。结果表明，LPS/TLR4诱导SIAH1/2E3连接酶与MYPT1 结合，并通过泛素-蛋白酶体途径增强MYPT1的降解。

实施例10-植物提取物及其纯品的制备

柴胡提取物：取柴胡250g，加入10倍量65％乙醇提取2次，每次1.5h，过滤， 合并滤液，回收乙醇至无乙醇味，加水定容至1.25L，即得柴胡总皂苷提取物。精密 量取柴胡总皂苷提取物每份30.0mL，共3份，上D101大孔树脂柱，分别以0.5、1、 2BV·h^-1流速吸附，然后用5BV蒸馏水以2BV·h^-1的流速洗脱，再用5BV70％乙醇 以2BV·h^-1的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至适当浓度。最后用HPLC (C18柱)进一步纯化，得到不同皂苷纯品，纯度均在98％以上。

苦丁提取物：称取大叶冬青原料1000克，用粉碎机粉碎。按1:1-10的比例加入70％乙醇，浸泡72小时，蒸干后用按1:50-200(w/v)的比例加入蒸馏水充分溶解、 过滤。将酒精提取物以1:20-100(v/v)的比例上样与大孔树脂，20-60％酒精洗脱脱 色后，再用60-100％酒精洗脱，将洗脱液经旋转蒸发器蒸干后可得白色约50克。

莲心提取物：称取莲子心药材(产地：福建)(10.5kg)粉碎，加4倍50％乙 醇浸泡72h，收集提取液、浓缩至无醇味，1％盐酸调至pH＝3后纱布过滤。加氨水 调PH至9、浓缩得浸膏400g，即为莲子心总生物碱粗提物。用水溶解400克粗提 物，上D101大孔树脂柱，分别以0.5、1、2BV·h^-1流速吸附，然后用5BV蒸馏水 以2BV·h^-1的流速洗脱，再用5BV 30％乙醇以2BV·h^-1的流速洗脱，收集乙醇洗脱 液，回收乙醇，浓缩至适当浓度。最后用HPLC(C18柱)进行常规纯化。得到纯度 约98％的莲心季胺碱25克。

实施例11-药物筛选

将候选药物按1：1000的浓度稀释，分别加入A7r5平滑肌细胞培养基中，24 小时后收集细胞，用Western印迹检测MYPT1表达量。药物对MYPT1表达量的影 响如图17(上调MYPT1表达)和图18(下调MYPT1表达)所示。

序列表

<110> 朱敏生

<120> 通过调节MYPT1改变平滑肌性质的试剂及其用途

<130> 197611

<141> 2019-10-18

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1029

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Met Lys Met Ala Asp Ala Lys Gln Lys Arg Asn Glu Gln Leu Lys Arg

1 5 10 15

Trp Ile Gly Ser Glu Thr Asp Leu Glu Pro Pro Val Val Lys Arg Gln

20 25 30

Lys Thr Lys Val Lys Phe Asp Asp Gly Ala Val Phe Leu Ala Ala Cys

35 40 45

Ser Ser Gly Asp Thr Asp Glu Val Leu Lys Leu Leu His Arg Gly Ala

50 55 60

Asp Ile Asn Tyr Ala Asn Val Asp Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Ala

65 70 75 80

Cys Ile Asp Asp Asn Val Asp Met Val Lys Phe Leu Val Glu Asn Gly

85 90 95

Ala Asn Ile Asn Gln Pro Asp Asn Glu Gly Trp Ile Pro Leu His Ala

100 105 110

Ala Ala Ser Cys Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Glu Phe Leu Ile Gly Gln

115 120 125

Gly Ala His Val Gly Ala Val Asn Ser Glu Gly Asp Thr Pro Leu Asp

130 135 140

Ile Ala Glu Glu Glu Ala Met Glu Glu Leu Leu Gln Asn Glu Val Asn

145 150 155 160

Arg Gln Gly Val Asp Ile Glu Ala Ala Arg Lys Glu Glu Glu Arg Val

165 170 175

Met Leu Arg Asp Ala Arg Gln Trp Leu Asn Ser Gly His Ile Ser Asp

180 185 190

Val Arg His Ala Lys Ser Gly Gly Thr Ala Leu His Val Ala Ala Ala

195 200 205

Lys Gly Tyr Thr Glu Val Leu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Gly Tyr Asp

210 215 220

Val Asn Ile Lys Asp Tyr Asp Gly Trp Thr Pro Leu His Ala Ala Ala

225 230 235 240

His Trp Gly Lys Glu Glu Ala Cys Arg Ile Leu Val Asp Asn Leu Cys

245 250 255

Asp Met Glu Thr Val Asn Lys Val Gly Gln Thr Ala Phe Asp Val Ala

260 265 270

Asp Glu Asp Ile Leu Gly Tyr Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln Thr

275 280 285

Leu Leu His Ser Glu Lys Arg Asp Lys Lys Ser Pro Leu Ile Glu Ser

290 295 300

Thr Ala Asn Met Glu Asn Asn Gln Pro Gln Lys Ala Phe Lys Asn Lys

305 310 315 320

Glu Thr Leu Ile Ile Glu Pro Glu Lys Asn Ala Ser Arg Ile Glu Ser

325 330 335

Leu Glu His Glu Lys Ala Asp Glu Glu Glu Glu Gly Lys Lys Asp Glu

340 345 350

Ser Ser Cys Ser Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Ser Glu

355 360 365

Ala Glu Thr Asp Lys Thr Lys Pro Met Ala Ser Val Ser Asn Ala His

370 375 380

Thr Ser Ser Thr Gln Ala Ala Pro Ala Ala Val Thr Ala Pro Thr Leu

385 390 395 400

Ser Ser Asn Gln Gly Thr Pro Thr Ser Pro Val Lys Lys Phe Pro Ile

405 410 415

Ser Thr Thr Lys Ile Ser Pro Lys Glu Glu Glu Arg Lys Asp Glu Ser

420 425 430

Pro Ala Ser Trp Arg Leu Gly Leu Arg Lys Thr Gly Ser Tyr Gly Ala

435 440 445

Leu Ala Glu Ile Ser Ala Ser Lys Glu Ala Gln Lys Glu Lys Asp Thr

450 455 460

Ala Gly Val Met Arg Ser Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ser Ser Ser Leu

465 470 475 480

Asp Asn Lys Glu Lys Glu Lys Asp Asn Lys Gly Thr Arg Leu Ala Tyr

485 490 495

Val Thr Pro Thr Ile Pro Arg Arg Leu Ala Ser Thr Ser Asp Ile Glu

500 505 510

Glu Lys Glu Asn Arg Glu Ser Ser Ser Leu Arg Thr Ser Ser Ser Tyr

515 520 525

Thr Arg Arg Lys Trp Glu Asp Asp Leu Lys Lys Asn Ser Ser Ile Asn

530 535 540

Glu Gly Ser Thr Tyr His Arg Ser Cys Ser Phe Gly Arg Arg Gln Asp

545 550 555 560

Asp Leu Ile Ser Cys Ser Val Pro Ser Thr Thr Ser Thr Pro Thr Val

565 570 575

Thr Ser Ala Ala Gly Leu Gln Arg Ser Leu Pro Ser Ser Thr Ser Thr

580 585 590

Ala Ala Lys Thr Pro Pro Gly Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Ser

595 600 605

Thr Ser Asn Arg Leu Trp Ala Glu Asp Ser Thr Glu Lys Glu Lys Asp

610 615 620

Ser Ala Pro Thr Ala Val Thr Ile Pro Val Ala Pro Thr Val Val Asn

625 630 635 640

Ala Ala Ala Pro Ser Thr Thr Thr Leu Thr Thr Thr Thr Ala Gly Thr

645 650 655

Val Ser Glu Val Arg Glu Arg Arg Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Val Arg

660 665 670

Asp Glu Glu Ser Glu Ser Gln Arg Lys Ala Arg Ser Arg Gln Ala Arg

675 680 685

Gln Ser Arg Arg Ser Thr Gln Gly Val Thr Leu Thr Asp Leu Gln Glu

690 695 700

Ala Glu Lys Thr Ile Gly Arg Ser Arg Ser Thr Arg Thr Arg Glu Gln

705 710 715 720

Glu Asn Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Gln Asp Lys Glu

725 730 735

Lys Gln Glu Glu Lys Lys Glu Ser Glu Ala Ser Arg Glu Asp Glu Tyr

740 745 750

Lys Gln Lys Tyr Ser Arg Thr Tyr Asp Glu Thr Tyr Thr Arg Tyr Arg

755 760 765

Pro Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ser Ser Leu Ser

770 775 780

Thr Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Ser Ser Gln Leu Asn Arg Pro Asn

785 790 795 800

Ser Leu Val Gly Ile Thr Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Leu Ala Lys Glu

805 810 815

Asn Glu Arg Glu Gly Glu Lys Lys Glu Glu Glu Lys Glu Gly Glu Asp

820 825 830

Lys Ser Gln Pro Lys Ser Ile Arg Glu Arg Arg Arg Pro Arg Glu Lys

835 840 845

Arg Arg Ser Thr Gly Val Ser Phe Trp Thr Gln Asp Ser Asp Glu Asn

850 855 860

Glu Gln Glu Arg Gln Ser Asp Thr Glu Asp Gly Ser Ser Lys Arg Glu

865 870 875 880

Thr Gln Thr Asp Ser Val Ser Arg Tyr Asp Ser Ser Ser Thr Ser Ser

885 890 895

Ser Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Leu Gly Arg Ser Ala Ser Tyr Ser Tyr

900 905 910

Leu Glu Asp Arg Lys Pro Tyr Ser Ser Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ser

915 920 925

Thr Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Gln Ile Leu Ala Glu Asn Glu Lys

930 935 940

Leu Lys Ala Gln Leu His Asp Thr Asn Met Glu Leu Thr Asp Leu Lys

945 950 955 960

Leu Gln Leu Glu Lys Ala Thr Gln Arg Gln Glu Arg Phe Ala Asp Arg

965 970 975

Ser Gln Leu Glu Met Glu Lys Arg Glu Arg Arg Ala Leu Glu Arg Arg

980 985 990

Ile Ser Glu Met Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Pro Asp Leu Lys Ala

995 1000 1005

Asp Asn Gln Arg Leu Lys Asp Glu Asn Gly Ala Leu Ile Arg Val Ile

1010 1015 1020

Ser Lys Leu Ser Lys

1025

<210> 2

<211> 1492

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcttgcattg atgacaatgt tgatatggtg aagtttctgg tagaaaatgg agcaaatatc 60

aatcaacctg acaatgaagg ctggatacca ctccatgcag ctgcttcctg tggatatctc 120

gatattgcag agtgttgata tagaagcggc tcggaaagag gaggagcggg taatgctaag 180

agacgcgagg cagtggttaa acagcggcca catcagtgac gtccggcatg caaagtccgg 240

gggcacagca ctccacgtgg cggccgccaa aggctataca gaagtgttaa aggccaaaca 300

gcctttgatg tagcagatga agacattttg ggatatctag aagagttgca aaaaaaacaa 360

actctgcaag gaaacgttga ttattgagcc agagaaaaat gcatctcgca tcgagtctct 420

ggagcatgag aaggctgatg aggaggaaga aggcaagaag gacgagtcga gctgttccag 480

tgaggaggac gaggaggacg attcagagtc agaggcagag acagtttcca atatcgacta 540

caaaaatttc tcccaaagaa gaggaaagaa aagatgagtc tcctgcatcc tggaggttag 600

ggcttcgaaa gactggcagt tacggtgccc tggctgaaat cagtgcgtct aaagaagccc 660

agaaggagaa agacactgca ggggtgatgc ggtcggcttc cagtccgaga ctctcgtcct 720

ctttggataa taaagaaaag agagtcttca agtttgcgaa caagtagttc ttacacaaga 780

agaaaatggg aagatgatct taaaaagaat agttcgatca atgaaggatc cacttaccat 840

agaagtacct caaatcgttt gtgggctgag gatagtactg agaaagaaaa ggacagtgct 900

cctactgcag tgaccattcc tgtggctcca actgttgtaa atgctgcagc tccttccacc 960

accaccctga ctacaactac tgctggcact gtttccgagg tcagggagag acgcaggggg 1020

taacactgac tgatcttcag gaagctgaaa aaacaatagg aagaagtcgt tctacgagaa 1080

ccagagaaca agaaaatgaa gagaaagaaa aagaagaaaa ggaaaagcag gataaagaga 1140

aacaagaaga aaagaaggag tcagaagcat ctagagaaga tgaatataaa caaaagtatt 1200

caagaacata cgatgagagg gagagaaaaa agaagaggag aaagaagggg aagataagtc 1260

acagcctaag tcaatcagag aacgacggcg acccagagaa aagcgacggt ctactggagt 1320

ctccttctgg acacaagata cggattctgt ttccagcttt atgaacaaat tttagctgaa 1380

aatgaaaagc taaaagcaca gctacatgat acaaatatgg aactaacgga tctaaagttg 1440

cagttggaaa aggctaccca ggtggccggc aagagtcagt atcttctggg cg 1492

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccaatgtgga cggactcacc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gctgcatgga gtggtatcca g 21

Claims (10)

1.调节MYPT1的试剂在制备用于改变平滑肌收缩性或治疗平滑肌收缩性改变相关疾病的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述调节MYPT1的试剂是上调MYPT1的试剂，

所述改变平滑肌收缩性是增强平滑肌松弛、改善阴茎勃起、提高阴茎内压力或扩增血管直径，

所述平滑肌收缩性改变相关疾病是受益于平滑肌松弛的疾病。。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述上调MYPT1的试剂选自：

(1)分离的下式I所示的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐，或含有式I所示化合物、或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐的来自冬青科植物或伞形科植物的提取物：

其中：

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹是糖残基；

C2、C11、C12、C16和C19各自独立地任选地被-OH取代；

R^2a、R^2b和R^2c分别独立选自-H、-COOH、COOR⁵、-OH、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；或R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-，且R^2c选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；或R^2b和R^2c共同形成-CO₂-，且R^2a选自-H、-OH或任选被羟基取代的C₁-C₆烷基；

R^3a和R^3b分别独立选自-H、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；

R⁴选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R⁵为糖残基；

(2)分离的下式II所示的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐，或含有式II所示的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受盐的睡莲科植物的提取物：

式中，

R_a和R_b各自独立选自-H、-OH或烷氧基，

R_c是任选被一个或多个选自羟基、烷基或烷氧基取代的芳基，，

R_d1和R_d2各自独立选自烷基或不存在；

(3)抑制E3连接酶的试剂，优选是蛋白酶体抑制剂；

(4)阻断LPS/TLR4通路的试剂，优选是TLR4抑制剂、LPS结合剂或LPS信号通路抑制剂；

(5)MYPT1的表达载体；和

(6)选自以下的一种或多种药物：Vidarabine、Rifaximin、Ramipril、Ranolazine、Ranitidine、Acadesine、Acipimox或Acyclovir。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，(1)所述式I化合物选自：

(A)具有下式Ia所示结构的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

其中：

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹选自H和糖残基；

C2、C11、C12和C19上各自任选地被OH取代；

R^2a及R^2b各自独立选自H、-COOH和COOR⁵，或两者共同形成-CO₂-；

R⁵为单糖残基；

R^3a和R^3b共同形成-CH₂-，或各自独立选自C_1-4烷基或被羟基取代的C_1-4烷基；和

(B)下式Ib所示的化合物或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐：

式中，

A环、B环、C环、D环或E环各自独立为完全饱和或部分饱和环；

R¹是糖残基；

C2、C11、C12、C16和C19各自独立地任选地被-OH取代；

R^2a和R^2b分别独立选自-H、-COOH、COOR⁵、-OH、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；或R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-；

R^3a和R^3b分别独立选自-H、任选被羟基取代的C₁-C₆烷基、和C₁-C₆烷氧基；

R⁴选自-H、-OH、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R⁵为糖残基。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，

式Ia中，A环、B环、C环、E环为完全饱和环，D环为部分饱和环，C12和C19各自独立被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b都为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基；或A环、B环、C环、E环为完全饱和环，D环为部分饱和环，C11和C19分别独自被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基；或A环、B环、E环为完全饱和环，C环、D环为部分饱和环，C19被-OH取代，R^2a和R^2b共同形成-CO₂-，R^3a和R^3b为-CH₃，R¹为单糖残基或寡糖残基；优选地，式Ia化合物选自苦丁皂苷A、苦丁皂苷B、苦丁皂苷C、苦丁皂苷I、苦丁茶冬青苷I和苦丁茶冬青苷J中的一种或多种；

式Ib化合物具有下式Ib-1所示的结构：

式中，

R¹是糖残基；

C16被-OH取代；

R^2a及R^2b共同形成-CH₂O-；和

R^3a和R^3b分别独立选自任选被羟基取代的C₁-C₆烷基；

优选地，式Ib-1化合物选自：

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述调节MYPT1的试剂是下调MYPT1的试剂，

所述改变平滑肌收缩性是增强平滑肌收缩、抑制阴茎勃起或缩小血管直径，

所述受益于平滑肌收缩性改变的疾病是受益于平滑肌收缩的疾病；优选地，所述受益于平滑肌收缩的疾病包括尿道松弛、粪失禁、低血压、肠动力降低、膀胱无力。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述下调MYPT1的试剂包括基因编辑载体，RNA编辑载体，MYPT1的抗体，MYPT1拮抗剂，编码MYPT1的基因的反义RNA，E3连接酶，E3连接酶活化剂，脂多糖或其可激活TLR4通路的类似物，TLR4活化剂或NF-kB信号激活物；或

下调MYPT1的表达的试剂包括选自以下的一种或多种药物：Naloxone HCl、Etravirine或Atovaquone。

8.筛选调节平滑肌收缩性的试剂的方法，包括将候选试剂与平滑肌细胞孵育，和检测细胞MYPT1表达量。

9.MYPT1在筛选平滑肌收缩性的试剂中的应用。

10.检测MYPT1的试剂在制备用于诊断平滑肌收缩性改变相关疾病或病症的试剂盒中的应用，优选地，所述平滑肌收缩性改变相关疾病包括受益于平滑肌收缩或松弛的疾病。

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