CN112750509A - 一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法 - Google Patents

一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法 Download PDF

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CN112750509A CN201911035327.1A CN201911035327A CN112750509A CN 112750509 A CN112750509 A CN 112750509A CN 201911035327 A CN201911035327 A CN 201911035327A CN 112750509 A CN112750509 A CN 112750509A
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朱常成
刘暘
杨兆祥
李修齐
李宁
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Kunming Pharmaceutical Corp
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Abstract

本发明涉及UPLC‑Orbitrap HRMS技术领域，特别涉及一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法。该方法为：取供试品和对照品，利用UPLC‑Orbitrap HRMS进行分离和鉴定；供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并进行化合物推断；利用Database Manager建立数据库。本发明对血塞通注射剂的物质基础进行系统性研究，为血塞通的进一步开发利用提供基础性研究资料，并对其系统研究皂苷类成分的药效物质基础并明确与功能主治的相关性，对血塞通中有效成分的二次开发具有指导意义。

Description

一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法
技术领域
本发明涉及UPLC-Orbitrap HRMS技术领域，特别涉及一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法。
背景技术
中药化学成分复杂，如何快速、全面地鉴定中药化学成分、阐明中药药效物质基础以及建立稳定全面的质量控制方法是中药现代研究和国际化面临的重要难题。目前，中药的物质基础与质量控制研究尚不能全面反映中药复杂物质体系的内涵与特征性，缺乏高效、精确鉴定化学物结构的方法是一个重要原因。传统的中药化学成分研究方法为：通过利用反复柱层析等手段从原料中提取、纯化单体物质，再利用UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS等方法进行结构鉴定。这不仅需要花费大量的人力、物力和财力，而且中药中含量低的成分也大多损失殆尽，无法获取药材全面的信息特征。
血塞通注射液是以三七总皂苷为原料精制而成的中药注射剂。近年来有关血塞通注射剂的不良反应时有报道，其临床安全性引起社会关注。究其原因，血塞通注射剂的化学成分复杂、药效物质不甚明确可能是影响血塞通注射液临床安全性的主要因素。至今为止，关于血塞通注射剂发挥药效作用的化学成分以及作用机制的研究报道较少。
因此，对血塞通注射液中的皂苷类药效物质化学结构及其药理作用进行了系统研究，对保证血塞通注射液的质量稳定、用药安全以及血塞通注射液中有效成分的二次开发均具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法。该方法对血塞通注射剂的物质基础进行系统性研究，为血塞通的进一步开发利用提供基础性研究资料，并对其系统研究皂苷类成分的药效物质基础并明确与功能主治的相关性，对血塞通中有效成分的二次开发具有指导意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，包括如下步骤：
分别取供试品溶液和对照品溶液，利用UPLC-Orbitrap HRMS进行分离和鉴定，UPLC-Orbitrap HRMS的色谱条件和质谱条件如下：
色谱条件：Brige Shield RP18色谱柱；流动相A为0.08vt％～0.12vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B；
质谱条件：
工作模式：ESI-，FullMS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z 150～2000，分辨率60000～80000；
离子源参数：鞘气流速60～70arb，辅助气流速15～25arb，吹扫气流速3～5arb，喷雾电压2.0～3.0kV，毛细管温度280～320℃，S-lens电压45～55V，加热温度450～550℃；
根据CID裂解所产生的中性丢失碎片，判断对照品所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；
供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与已知化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为比对，进行化合物推断；
所得质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和未知化合物特性的自定义库利用Database Manager建立数据库。
在本发明中，对照品为：从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷成分RSZG-1～RSZG-15，并分别鉴定为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、20(S)-人参皂苷Rf、20(S)-人参皂苷Rh1、20(S)-人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、20(S)-人参皂苷F1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg3，作为对照品溶液成分。
作为优选，从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷单体RSZG-1～RSZG-15具体为：
采用D101大孔树脂对血塞通注射剂样品水溶液进行分离，依次用水、30vt％乙醇水溶液、50vt％乙醇水溶液、70vt％乙醇水溶液、90vt％乙醇水溶液洗脱，得到50vt％乙醇洗脱液、70vt％乙醇洗脱液、90vt％乙醇洗脱液；
50vt％乙醇洗脱液经MDS柱色谱，用30vt％～90vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到三个部位Fr.1、Fr.2、Fr.3；
Fr.1经MCI柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到两个流分Fr.1.1、Fr.1.2，Fr1.1通过50％乙醇水溶液重结晶得RSZG-12；Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，用40vt％～65vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经Sephadex LH-20柱纯化得RSZG-11、RSZG-13；
Fr.2经硅胶柱色谱，用体积比为(100：18：0.5)～(80：20：0.1)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得2个流分Fr.2.1、Fr.2.2；Fr.2.1经Sephadex LH-20柱纯化得RSZG-10；Fr.2.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-4、RSZG-5；
Fr.3经RP-ODS反相柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得RSZG-1、RSZG-9；
70vt％乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用体积比为(100：3：0.1)～(7：3：0.5)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得Fr.4、Fr.5、Fr.6；Fr.4经反复硅胶色谱、Sephadex LH-20柱色谱纯化得到RSZG-3；Fr.5经ODS反相柱色谱，用65vt％～85vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得2个流分Fr.5.1、Fr.5.2；Fr.5.1经Sephadex LH-20柱色谱纯化得RSZG-8；Fr.5.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-6、RSZG-7；Fr.6经MDS反相柱色谱，用55vt％甲醇水溶液洗脱，再经甲醇重结晶得RSZG-2；
90vt％乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用体积比为100：(1～50)：50石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，石油醚的温度为60～90℃，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得RSZG-14、RSZG-15。
作为优选，Fr.2.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-4、RSZG-5具体为：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水溶液纯化得RSZG-4、RSZG-5。
作为优选，Fr.5.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-6、RSZG-7具体为：Fr.5.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水溶液纯化得RSZG-6、RSZG-7。
作为优选，对照品溶液为皂苷成分的甲醇溶液；供试品溶液的制备方法为：取血塞通注射剂样品，用65vt％～75vt％甲醇水溶液溶解，微孔滤膜过滤，取续滤液超声4～6分钟；以mg/mL计，血塞通注射剂样品与甲醇水溶液的比例为(3～7)：10。
优选地，对照品溶液为皂苷成分的甲醇溶液；供试品溶液的制备方法为：取血塞通注射剂样品，用70vt％甲醇水溶液溶解，微孔滤膜过滤，取续滤液超声5分钟；以mg/mL计，血塞通注射剂样品与甲醇水溶液的比例为1：2。
作为优选，Brige Shield RP18色谱柱的规格为：4.6mm×250mm，5μm。
作为优选，流动相A为0.1vt％甲酸水溶液。
作为优选，色谱条件还包括：流速为0.8～1.2mL/min；进样量8～12μL。
在本发明提供的具体实施例中，流速为1.0mL/min；进样量10μL。
作为优选，质谱条件如下：
工作模式：ESI-，Full MS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z 150～2000，分辨率70000；
离子源参数：鞘气流速65arb，辅助气流速20arb，吹扫气流速4arb，喷雾电压2.5kV，毛细管温度300℃，S-lens电压50V，加热温度500℃。
本发明提供了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，该方法包括：分别取供试品溶液和对照品溶液，利用UPLC-Orbitrap HRMS进行分离和鉴定，UPLC-OrbitrapHRMS的色谱条件：Brige Shield RP18色谱柱；流动相A为0.08vt％～0.12vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B；质谱条件：ESI-，Full MS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z 150～2000，分辨率60000～80000；鞘气流速60～70arb，辅助气流速15～25arb，吹扫气流速3～5arb，喷雾电压2.0～3.0kV，毛细管温度280～320℃，S-lens电压45～55V，加热温度450～550℃；根据CID裂解所产生的中性丢失碎片，判断对照品所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与已知化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为比对，进行化合物推断；所得质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和未知化合物特性的自定义库利用Database Manager建立数据库。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明采用FullMS/dd-MS2(TopN)扫描结合动态排除法对注射用血塞通(冻干)中皂苷类成分进行检测。动态排除法及质谱信号的动态采集方法，可将已采集过多级质谱信息的母离子排除，从而实现其他信号强度较弱母离子的采集，最大程度地保证每次质谱信息的采集效率。
(2)本发明利用了HRLC-ESI-MS/MS分析手段，建立了较为完整的数据库。通过本实验数据验证，确定了所建立的数据库的检索功能具有良好的可信度，可作为注射用血塞通(冻干)快速鉴定方法。该方法的应用对于企业中的内控产品的快速分析检索具有很好的实际意义。
(3)本发明选择乙腈-0.1％甲酸水溶液系统作为流动相，以降低溶剂系统带来的背景和基质干扰；使谱库的建立规范化。
(4)本发明建立MS2方法分别分析未知化合物和标准品，观察保留时间是否相同，再分别提取三七皂苷中的化合物和标准品的MS2的ESI图，并找出定性离子对(母离子与子离子组成)是否相同，这样使得同分异构体也可以通过MS2进行鉴别。
(5)本发明在建库的过程中，不改变MS方法中的离子源参数以及二级质谱中的参数，以提高最终结果的匹配度以及操作性。
附图说明
图1-1化合物RSZG-1在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图1-2化合物RSZG-1在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图2-1化合物RSZG-2在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图2-2化合物RSZG-2在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图3-1化合物RSZG-3在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图3-2化合物RSZG-3在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图4-1化合物RSZG-4在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图4-2化合物RSZG-4在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图5-1化合物RSZG-5在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图5-2化合物RSZG-5在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图6-1化合物RSZG-6在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图6-2化合物RSZG-6在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图7-1化合物RSZG-7在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图7-2化合物RSZG-7在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图8-1化合物RSZG-8在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图8-2化合物RSZG-8在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图9-1化合物RSZG-9在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图9-2化合物RSZG-9在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图10-1化合物RSZG-10在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图10-2化合物RSZG-10在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图11-1化合物RSZG-11在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图11-2化合物RSZG-11在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图12-1化合物RSZG-12在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图12-2化合物RSZG-12在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图13-1化合物RSZG-13在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图13-2化合物RSZG-13在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图14-1化合物RSZG-14在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图14-2化合物RSZG-14在吡啶-d5中的13C-NMR谱；
图15-1化合物RSZG-15在吡啶-d5中的1H-NMR谱；
图15-2化合物RSZG-15在吡啶-d5中的13C-NMR谱。
具体实施方式
本发明公开了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过利用UPLC-Orbitrap HRMS进行分离和鉴定注射用血塞通(冻干)中三七皂苷的含量并对其三七皂苷的色谱行为和质谱的裂解规律进行全面的分析。充分利用质谱的高能碰撞解离参数，对二级碎片进行解析、归属并总结质谱的裂解规律和已知的文献对比，从而判断未知化合物的结构特征。本发明对血塞通注射剂的物质基础进行系统性研究，为血塞通的进一步开发利用提供基础性研究资料，并对其系统研究皂苷类成分的药效物质基础并明确与功能主治的相关性，对血塞通中有效成分的二次开发具有指导意义。
本发明物质基础数据库建立方法包括以下步骤：
1)三七皂苷的提取与分离
取实验药材样品10g，用纯化水溶解上D101大孔树脂，用水、30％、50％、70％、90％Me2OH洗脱，分别得到50％的乙醇部位(4.1g)，70％的乙醇部位(2.3g)，90％的乙醇部位(2.0g)。50％的乙醇部位经MDS柱色谱，甲醇水(30％-90％)梯度洗脱得三个部位(Fr.1-Fr.3)；Fr.1经MCI柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱得两个流分(Fr.1.1-1.2)。Fr1.1通过50％乙醇反复重结晶得结晶体12；Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，甲醇水(40％-65％)梯度洗脱，再经Sephadex LH-20柱纯化得化合物11、化合物13和化合物15；Fr.2经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：18：0.5-80：20：0.1)梯度洗脱得2个流分(Fr：2.1-2.2)；Fr.2.1经Sephadex LH-20柱纯化得化合物10：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物4和5；Fr.3通过RP-ODS反相柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得结晶体1和9；
70％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：3：0.1-7：3：0.5)梯度洗脱得Fr.4-Fr.6；Fr.4经反复硅胶色谱分离和Sephadex LH-20柱色谱纯化得到化合物3；Fr.5经ODS反相柱色谱，甲醇水(65％-85％)梯度洗脱得2个流分(Fr.5.1-5.2)；Fr.5.1经Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物8：Fr.5.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物6和7。Fr.6经MDS反相柱色谱，55％甲醇-水溶液洗脱，再经甲醇反复重结晶得结晶体2；90％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(100：1-50：50)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物14和15；
2)皂苷单体的结构鉴定
从项下2中分离得到RSZG-1～RSZG-15的15种皂苷成分，对13C NMR、1H NMR进行分析，分别鉴定为三七皂苷R1(RSZG-1)、人参皂苷Rg1(RSZG-2)、人参皂苷Re(RSZG-3)、20(S)-人参皂苷Rf(RSZG-4)、20(S)-人参皂苷Rh1(RSZG-5)、20(S)-人参皂苷Rg2(RSZG-6)、人参皂苷Rb1(RSZG-7)、20(S)-人参皂苷F1(RSZG-8)、人参皂苷Rb2(RSZG-9)、人参皂苷Rc(RSZG-10)、人参皂苷Rb3(RSZG-11)、人参皂苷Rd(RSZG-12)、人参皂苷Rk3(RSZG-13)、人参皂苷Rh4(RSZG-14)、人参皂苷Rg3(RSZG-15)；
3)液质分析方法的建立
3.1色谱条件
色谱条件：色谱柱(Brige Shield RP18(4.6mm×250mm，5μm))；流动相：0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B。流速为1mL/min；进样量10μL；
3.2质谱条件
工作模式：ESI-，Full MS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围：m/z 150～2000，分辨率：70000；
离子源参数：鞘气流速(Sheath gas flow rate)65arb，辅助气流速(Aux gasflow rate)20arb，吹扫气流速(Sweep gas flow rate)4arb，喷雾电压(Spray voltage)2.5kV，毛细管(离子传输管)温度(Capillary temperature)300℃，S-lens电压(S-lens RFlevel)50V，加热温度(Heater temperature)500℃；
4)分析用溶液的制备
4.1对照品溶液的制备
分别称取以上15个对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度约为100μg/mL的储备液：分别精密吸取各储备液适量，加入甲醇定容于5mL容量瓶中；
4.2样品制备
称取供试品5mg至10mL容量瓶中，用70％甲醇溶解，通过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液超声5min即得；
5)三七皂苷中化合物的LC-MS的分析
根据CID裂解所产生的中性丟失碎片，判断皂苷成分所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；
6)供试品中皂苷类成分的LC-MS分析
除标准物质成分，未知成分根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与文献报道化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为等比对，进行化合物推断；
7)液相色谱-质谱-数据库(LC-MS-Database，LC-MS-DS)的建立
利用Database Manager建立数据库。
本发明提供的血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.三七皂苷的提取与分离
取实验药材样品10g，用纯化水溶解上D101大孔树脂，用水、30％、50％、70％、90％Me2OH洗脱，分别得到50％的乙醇部位(4.1g)，70％的乙醇部位(2.3g)，90％的乙醇部位(2.0g)。
50％的乙醇部位经MDS柱色谱，甲醇水(30％-90％)梯度洗脱得三个部位(Fr.1-Fr.3)；Fr.1经MCI柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱得两个流分(Fr.1.1-1.2)。Fr1.1通过50％乙醇反复重结晶得结晶体12(18mg)；Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，甲醇水(40％-65％)梯度洗脱，再经Sephadex LH-20柱纯化得化合物11(16mg)，13(15mg)；Fr.2经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：18：0.5-80：20：0.1)梯度洗脱得2个流分(Fr：2.1-2.2)。Fr.2.1经Sephadex LH-20柱纯化得化合物10(20mg)：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物4(16mg)，5(20mg)。Fr.3通过RP-ODS反相柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得结晶体1(21mg)，9(17mg)。
70％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：3：0.1-7：3：0.5)梯度洗脱得Fr.4-Fr.6；Fr.4经反复硅胶色谱分离和Sephadex LH-20柱色谱纯化得到化合物3(18mg)。Fr.5经ODS反相柱色谱，甲醇水(65％-85％)梯度洗脱得2个流分(Fr.2.1-2.2)。Fr.2.1经Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物8(17mg)：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物6(20mg)和7(16mg)。Fr.6经MDS反相柱色谱，55％甲醇-水溶液洗脱，再经甲醇反复重结晶得结晶体2(25mg)。
90％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(100：1-50：50)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物14(20mg)和15(18mg)。
2.皂苷单体的结构鉴定
分别从50％的乙醇部位经MDS柱色谱，甲醇水(30％-90％)梯度洗脱、70％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：3：0.1-7：3：0.5)梯度洗脱、90％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离得到得到RSZG-1～RSZG-15的15种皂苷成分，对13C NMR、1H NMR进行分析，分别鉴定为三七皂苷R1(RSZG-1)、人参皂苷Rg1(RSZG-2)、人参皂苷Re(RSZG-3)、20(S)-人参皂苷Rf(RSZG-4)、20(S)-人参皂苷Rh1(RSZG-5)、20(S)-人参皂苷Rg2(RSZG-6)、人参皂苷Rb1(RSZG-7)、20(S)-人参皂苷F1(RSZG-8)、人参皂苷Rb2(RSZG-9)、人参皂苷Rc(RSZG-10)、人参皂苷Rb3(RSZG-11)、人参皂苷Rd(RSZG-12)、人参皂苷Rk3(RSZG-13)、人参皂苷Rh4(RSZG-14)、人参皂苷Rg3(RSZG-15)。
3.液质分析方法的建立
3.1色谱条件
色谱条件：色谱柱(Brige Shield RP18(4.6mm×250mm，5μm))；流动相：0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B。流速为1mL/min；进样量10μL。
3.2质谱条件
工作模式：ESI-，Full MS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围：m/z 150～2000，分辨率：70000。
离子源参数：鞘气流速(Sheath gas flow rate)65arb，辅助气流速(Aux gasflow rate)20arb，吹扫气流速(Sweep gas flow rate)4arb，喷雾电压(Spray voltage)2.5kV，毛细管(离子传输管)温度(Capillary temperature)300℃，S-lens电压(S-lens RFlevel)50V，加热温度(Heater temperature)500℃。
4.分析用溶液的制备
4.1对照品溶液的制备
分别称取以上15个对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度约为100μg/mL的储备液：分别精密吸取各储备液适量，加入甲醇定容于5mL容量瓶中。
4.2样品制备
称取供试品5mg至10mL容量瓶中，用70％甲醇溶解，通过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液超声5min即得。
5.三七皂苷中化合物的LC-MS的分析
由表1数据可知：
(1)在ESI-测模式下，所有标准物质与流动相中HCOO-结合，形成加合离子[M+HCOO-]-，在一级质谱作为基峰离子出现。除人参皂苷F1，人参皂苷Rk3和人参皂苷Rh4三个单糖皂苷外，其余皂苷标准物质的一级质谱中同时出现准分子离了[M-H]-：
(2)Ms2谱中，人参皂苷F1，人参皂苷Rk3，人参皂苷Rh4主要丢失加合离子HCOO-，产生基峰[M-H]-，其余皂苷则经过CID裂解产生脱去糖残基(葡萄糖，鼠李糖，木糖，阿拉伯糖)后的碎片离子和皂苷苷元(人参三醇苷元和人参二醇苷元)的碎片离子：
(3)C-20位连接糖基较C-3和C-6位连接糖链易丢失。如人参皂苷Rb2，Rb3和Rc，均先丢失C-20位所连接糖链的末端糖基，分别产生基峰离子m/z 945[M-H-Ara(p)]-，m/z 945[M-H-Xly]-，mlz 945[M-H-Ara(f)]-，表明C-20位羟基较活泼，易于糖苷键的断裂：
(4)根据CID裂解所产生的中性丟失碎片，可判断皂苷成分所连接糖基种类与数量，同时也可推断端基位糖基类别。
6.供试品中皂苷类成分的LC-MS分析
除标准物质成分，未知成分根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与文献报道化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为等比对，进行化合物推断。
7液相色谱-质谱-数据库(LC-MS-Database，LC-MS-DS)的建立
7.1色谱参数的选择
流动相的乙腈-0.1％甲酸水溶液系统，可以降低溶剂系统带来的背景和基质干扰；使谱库的建立规范化。
7.2质谱采集参数的选择
中药材中化合物结构变化较多，若将所有化合物筛选最优的条件，将会导致最终结果的匹配度且操作性差。因此，在利用Database Manager建库的过程中，MS方法中的离子源参数以及二级质谱中的参数应当不能改变。
7.3LC-MS-DS检索的可信度评价
为确保数据库检索结果的可信度，本实验的数据库的建立按以下两点判断：①建立MS2方法分别分析未知化合物和标准品，观察保留时间是否相同；②分别提取三七皂苷中的化合物和标准品的MS2的ESI图，并找出定性离子对(母离子与子离子组成)是否相同，这样即使是同分异构体也可以通过MS2进行鉴别。
本实验对已经确证的三七皂苷的化合物利用Mass Frontier 7.0将其结构式模拟敲碎得到的碎片离子与注射用血塞通(冻干)的相对应的化合物进行比对。
7.4利用Database Manager建立数据库
Database Manager模块提供数种组织和处理质谱图、化学结构和库的方法，并在电子数据表格式中包括数据。可以使用模块中高级的数据库查询和检索功能访问快速化合物识别所需的信息。本实验利用该软件的模块创建包含质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和扩展化合物特性的自定义库。将15个已有对照品的三七皂苷建立数据库。图1-15为15种化合物的1H-NMR谱、13C-NMR谱。
数据库信息如下：
表1注射用血塞通(冻干)样品中皂苷的结构鉴定
Figure BDA0002251336160000131
Figure BDA0002251336160000141
Figure BDA0002251336160000151
Figure BDA0002251336160000161
Figure BDA0002251336160000171
Figure BDA0002251336160000181
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别取供试品溶液和对照品溶液，利用UPLC-Orbitrap HRMS进行分离和鉴定，所述UPLC-Orbitrap HRMS的色谱条件和质谱条件如下：
色谱条件：Brige Shield RP18色谱柱；流动相A为0.08vt％～0.12vt％甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B；
质谱条件：
工作模式：ESI-，Full MS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z 150～2000，分辨率60000～80000；
离子源参数：鞘气流速60～70arb，辅助气流速15～25arb，吹扫气流速3～5arb，喷雾电压2.0～3.0kV，毛细管温度280～320℃，S-lens电压45～55V，加热温度450～550℃；
根据CID裂解所产生的中性丢失碎片，判断对照品所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；
供试品中未知化合物根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与已知化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为比对，进行化合物推断；
所得质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和未知化合物特性的自定义库利用Database Manager建立数据库。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述对照品为：从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷成分RSZG-1～RSZG-15，并分别鉴定为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、20(S)-人参皂苷Rf、20(S)-人参皂苷Rh1、20(S)-人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb1、20(S)-人参皂苷F1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rg3，作为对照品溶液成分。
3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于，所述从血塞通注射剂样品中分离出15种皂苷单体RSZG-1～RSZG-15具体为：
采用D101大孔树脂对血塞通注射剂样品水溶液进行分离，依次用水、30vt％乙醇水溶液、50vt％乙醇水溶液、70vt％乙醇水溶液、90vt％乙醇水溶液洗脱，得到50vt％乙醇洗脱液、70vt％乙醇洗脱液、90vt％乙醇洗脱液；
所述50vt％乙醇洗脱液经MDS柱色谱，用30vt％～90vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到三个部位Fr.1、Fr.2、Fr.3；
所述Fr.1经MCI柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得到两个流分Fr.1.1、Fr.1.2，所述Fr1.1通过50％乙醇水溶液重结晶得RSZG-12；所述Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，用40vt％～65vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经Sephadex LH-20柱纯化得RSZG-11、RSZG-13；
所述Fr.2经硅胶柱色谱，用体积比为(100：18：0.5)～(80：20：0.1)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得2个流分Fr.2.1、Fr.2.2；所述Fr.2.1经Sephadex LH-20柱纯化得RSZG-10；所述Fr.2.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-4、RSZG-5；
所述Fr.3经RP-ODS反相柱色谱，用40vt％～60vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得RSZG-1、RSZG-9；
所述70vt％乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用体积比为(100：3：0.1)～(7：3：0.5)氯仿-甲醇-水梯度洗脱得Fr.4、Fr.5、Fr.6；所述Fr.4经反复硅胶色谱、Sephadex LH-20柱色谱纯化得到RSZG-3；所述Fr.5经ODS反相柱色谱，用65vt％～85vt％甲醇水溶液进行梯度洗脱得2个流分Fr.5.1、Fr.5.2；所述Fr.5.1经Sephadex LH-20柱色谱纯化得RSZG-8；所述Fr.5.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-6、RSZG-7；所述Fr.6经MDS反相柱色谱，用55vt％甲醇水溶液洗脱，再经甲醇重结晶得RSZG-2；
所述90vt％乙醇洗脱液经硅胶柱色谱，用体积比为100：(1～50)：50石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，所述石油醚的温度为60～90℃，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得RSZG-14、RSZG-15。
4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述Fr.2.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-4、RSZG-5具体为：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水溶液纯化得RSZG-4、RSZG-5。
5.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述Fr.5.2经半制备液相色谱纯化得RSZG-6、RSZG-7具体为：Fr.5.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水溶液纯化得RSZG-6、RSZG-7。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述对照品溶液为皂苷成分的甲醇溶液；所述供试品溶液的制备方法为：取血塞通注射剂样品，用65vt％～75vt％甲醇水溶液溶解，微孔滤膜过滤，取续滤液超声4～6分钟；以mg/mL计，所述血塞通注射剂样品与所述甲醇水溶液的比例为(3～7)：10。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述Brige Shield RP18色谱柱的规格为：4.6mm×250mm，5μm。
8.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述流动相A为0.1vt％甲酸水溶液。
9.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流速为0.8～1.2mL/min；进样量8～12μL。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述质谱条件如下：
工作模式：ESI-，Full MS/dd-MS2(TopN)模式，扫描范围m/z 150～2000，分辨率70000；
离子源参数：鞘气流速65arb，辅助气流速20arb，吹扫气流速4arb，喷雾电压2.5kV，毛细管温度300℃，S-lens电压50V，加热温度500℃。
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