CN112730821B - 一种受体拮抗剂长效性分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种受体拮抗剂长效性分析方法，属于受体拮抗剂长效性分析方法领域。之前受体拮抗剂长效性评价主要通过放射性配体的竞争性结合试验来确认，但此方法存在一定的局限性，如需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低。本发明基于无标记细胞整合药理学技术，无需放射性标记，降低试验难度，有效的缩短试验周期，提高试验效率。本发明中的方法评价的化合物噻托溴铵和雷芬那辛均为M3受体长效拮抗剂，格隆溴铵为M3受体中长效拮抗剂，异丙托溴铵为M3受体短效拮抗剂，这一结果与放射性标记方法的结论一致。本发明提到的受体拮抗剂长效性分析新方法具有检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高及操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及长效性分析方法技术领域，具体涉及一种受体拮抗剂长效性分析方法领域。
背景技术
G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族。目前确定的M 受体有5种亚型，即M1～M5，其中M1、M2和M3受体存在于人类肺脏，与COPD的发生发展密切相关。其中M3主要表达于气道平滑肌细胞、黏膜下腺体、肺血管中。M3在肺部呼吸道平滑肌的量虽然很少，但M3可联合M1主要通过Gq蛋白作用于磷脂酸肌醇系统激活磷脂酶C，生成IP3和DAG，增加细胞质中的Ca2+水平，导致支气管平滑肌收缩。气道平滑肌细胞上分布有高密度的KCA通道，平滑肌细胞收缩时，胞质内Ca2+浓度升高可激活该通道，K+外流使细胞复极化，平滑肌舒张。该通道是舒张的重要环节。M3在黏膜下腺体，调控气道水、黏液和电解质的分泌，也能开放肺泡上皮钠通道，增加肺泡上皮液体转运。在肺血管，当迷走神经受到刺激后，M3可能调节胆碱产生血管的舒张反应，其机制是由于激动血管内皮细胞M3亚型，导致内皮依赖性舒张因子即一氧化氮释放，从而引起邻近平滑肌细胞松弛。
受体拮抗剂长效性分析方法，具体地说是M3受体拮抗剂长效性分析新方法的发明及应用，所述的M3受体的拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵。长效抗胆碱药物以选择性阻断 M3受体的噻托溴铵为代表，是一种新型、高效、长效的季铵类吸入型抗胆碱药，目前已被广泛应用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的临床治疗中。
现有技术评价受体M3拮抗剂的长效性的方法存在以下问题：目前主要通过放射性配体的竞争性结合试验来确认，但此方法存在一定的局限性，如需要洗涤和过滤、试验周期长及筛选通量低等不足等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种新的、更方便、更简易且更高效的评价M3受体拮抗剂长效性的方法。
本发明的技术方案为：
1)基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；
2)对激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；
3)利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；
4)根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。
进一步的，所述步骤1)中无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅(RWG)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。
进一步的，所述步骤1)中已知的激动剂包括卡巴胆碱，拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵。
进一步的，所述步骤2)中拮抗剂的拮抗活性的检测步骤具体如下：
[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种 HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；
[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的卡巴胆碱激动剂以浓度为0.1～ 10000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR 特征信号谱；
[3]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为0.01～100000nM加入到接种 HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[4]再向已加入了噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱；
[5]获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的，并计算每个拮抗剂的IC80值或者IC50 值。
进一步的，所述拮抗剂的拮抗活性的检测步骤[2]、步骤[3]、步骤[4]中检测DMR特征信号谱使用的检测平台为康宁第三代成像仪，步骤[2]和步骤[3]检测的信号是细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移，步骤[4]检测的信号是药物作用于细胞引起的共振波长的变化值。
进一步的，所述步骤3)中拮抗剂的长效性分析步骤如下：
[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种 HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；
[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为IC80值或者IC50值加入到接种 HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[3]拮抗剂与受体作用1h后在不同时间段洗净拮抗剂溶液，重新加入40μL HBSS缓冲盐；
[4]向[3]加入了新的HBSS缓冲盐的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测拮抗DMR特征信号谱；
[5]获得的所有DMR特征信号谱为每个拮抗剂在解离不同时间里剩余的拮抗作用。
进一步的，所述步骤4)中判断该拮抗剂的长效性的判断依据是在解离不同时间里每个拮抗剂的拮抗作用。
与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
1.本发明提到的受体拮抗剂长效性分析新方法利用无标记细胞整合药理学技术，与之前通过放射性配体的竞争性结合试验方法相比无需放射性标记，可以有效的缩短试验周期、降低试验难度、提高试验效率，筛选通量高及操作简便等特点。
2.本发明评价出的结果是噻托溴铵和雷芬那辛均为M3受体长效拮抗剂，格隆溴铵为M3受体中长效拮抗剂，异丙托溴铵为M3受体短效拮抗剂，这一结果与前人报道的结论一致。因此本方法具有检测结果可靠、灵敏度高的优点。
附图说明
图1A-不同浓度的卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的实时DMR 响应信号；
图1B-不同浓度的卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的浓度-响应依赖曲线；其中卡巴胆碱的浓度单位为nM；
图2A-噻托溴铵在HEK-293T-M3细胞上的DMR响应信号；
图2B-噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵预处理1h 后，200nM卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的浓度-响应依赖曲线；
图3A-噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵预处理1h 后，分别于10min、30min、60min、90min和120min洗净微孔板中的拮抗剂溶液，并重新加入40μL的HBSS缓冲盐，并保留1组不洗净拮抗剂溶液，然后分别加入200nM的卡巴胆碱作用1h的时间- 响应依赖曲线；
图3B-解离2h后每个抑制剂对卡巴胆碱的抑制率。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。
一种受体拮抗剂长效性分析方法，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，其受体拮抗剂长效性分析方法包括以下步骤：
1)基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性。
2)对激动剂卡巴胆碱和拮抗剂噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值。
3)利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析。
4)根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性。
进一步的，所述步骤1)中无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅(RWG)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。利用无标记细胞整合药理学技术与之前通过放射性配体的竞争性结合试验方法相比，无需放射性标记，可以有效的缩短试验周期、降低试验难度、提高试验效率，具有检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高及操作简便等特点。
进一步的，所述步骤2)中拮抗剂的拮抗活性的检测步骤具体如下：
[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种 HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；
[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的卡巴胆碱激动剂以浓度为0.1～ 10000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，用康宁第三代成像仪检测其DMR特征信号谱，检测的信号为细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移；
[3]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为0.01～100000nM加入到接种 HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，用康宁第三代成像仪检测其DMR特征信号谱，检测的信号为细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移；
[4]再向加入了噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，用康宁第三代成像仪检测脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱，检测的信号是药物作用于细胞引起的共振波长的变化值。
[5]获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的，并计算每个拮抗剂的IC80值或者IC50 值。
进一步的，所述步骤3)中拮抗剂的长效性分析步骤如下：
[1]在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种 HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；
[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵拮抗剂分别以浓度为IC80值或者IC50值加入到接种 HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[3]拮抗剂与受体作用1h后在不同时间段洗净拮抗剂溶液，重新加入40μL HBSS缓冲盐；
[4]向[3]加入了新的HBSS缓冲盐的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的卡巴胆碱，分别检测拮抗DMR特征信号谱；
[5]获得的所有DMR特征信号谱为每个拮抗剂在解离不同时间里剩余的拮抗作用。
这种分析方法能够方便快捷的评价出商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及化学修饰物的解离速率。
进一步的，所述步骤4)中判断该拮抗剂的长效性的判断依据是在解离不同时间里每个拮抗剂的拮抗作用。
实施例1：
首先第一步得到激动剂卡巴胆碱在HEK-293T-M3细胞上的激动 DMR特征信号谱：
材料卡巴胆碱、噻托溴铵购于Sigma公司；雷芬那辛和格隆溴铵购于Abmole公司；异丙托溴铵购于Coolaber公司；人胚肾细胞 HEK-293T-M3细胞来源于加州大学欧文分校。检测平台为康宁第三代成像仪，检测的信号为细胞动态质量重置(DMR)引起的波长位移和药物作用于细胞引起的共振波长的变化值。
将处于对数生长期的HEK-293T-M3细胞，接种于细胞兼容的384 微孔板中，所用培养基为DMEM(#SH30022.01B,Thermo)，每孔的接种体积为40μL，每孔接种的细胞数目为2.0×104个，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20～22h，至细胞融合度达95％左右，进行活性实验。将在微孔板中的细胞培养液换成Hank's平衡盐溶液(含 10mM的HEPES)，每孔加入体积为30μL，加入之后，放置于成像仪上平衡1h；重新扫描2min的基线，将卡巴胆碱加入微孔板中，每孔加入体积为10μL，浓度为1000nM、333.33nM、111.11nM、 37.04nM、12.35nM、4.12nM、1.37nM和0.46nM，平行3次，置于Epic仪器上实时监测DMR信号1h，基于细胞经卡巴胆碱作用的 60min内DMR最大响应值处计算卡巴胆碱的EC50值，结果见图1。研究表明卡巴胆碱呈剂量依赖的激动M3受体，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，最高的DMR响应值达800pm，对应的EC50值为31.62±4.09nM。
然后第二步得到拮抗剂噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵在HEK-293T-M3细胞上的拮抗DMR特征信号谱：
将处于对数生长期的HEK-293T-M3细胞，接种于细胞兼容的384 微孔板中，所用培养基为DMEM(#SH30022.01B,Thermo)，每孔的接种体积为40μL，每孔接种的细胞数目为2.0×104个，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20～22h，至细胞融合度达95％左右，进行活性实验。将在微孔板中的细胞培养液换成Hank's平衡盐溶液(含 10mM的HEPES)，每孔加入体积为30μL，加入之后，放置于成像仪上平衡1h；重新扫描2min的基线，将噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵分别加入微孔板中，每孔加入体积为10μL，浓度为1000nM、333.33nM、111.11nM、37.04nM、12.35nM、4.12 nM、1.37nM和0.46nM，平行3次，置于Epic仪器上实时监测DMR 信号1h，将固定浓度的卡巴胆碱加入微孔板中，每孔加入体积为10 μL，浓度为200nM，平行3次，置于Epic仪器上实时监测DMR信号 1h，基于细胞经卡巴胆碱作用的60min内DMR最大响应值处计算IC80值，结果见图2。研究表明噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵呈剂量依赖的拮抗M3受体，剂量响应曲线呈单相“S”型且都达到饱和响应，对应的IC80值分别为75.14、270.12、68.27和85.83nM。
最后对4个M3受体拮抗剂的长效性分析：
将处于对数生长期的HEK-293T-M3细胞，接种于细胞兼容的384 微孔板中，所用培养基为DMEM(#SH30022.01B,Thermo)，每孔的接种体积为40μL，每孔接种的细胞数目为2.0×104个，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20～22h，至细胞融合度达95％左右，进行活性实验。将在微孔板中的细胞培养液换成Hank's平衡盐溶液(含 10mM的HEPES)，每孔加入体积为30μL，加入之后，放置于成像仪上平衡1h；重新扫描2min的基线，将噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵和异丙托溴铵分别加入微孔板中，每孔加入体积为10μL，浓度分别为100、300、100和100nM，平行5次，置于Epic仪器上实时监测DMR信号1h后，分别于10min、30min、60min、90min 和120min洗净微孔板中的拮抗剂溶液，并重新加入40μL的HBSS 缓冲盐，并保留1组不洗净拮抗剂溶液，对应的解离时间分别为0min、 10min、40min、70min、100min和120min，然后分别加入200nM 的卡巴胆碱作用1h的DMR响应信号，结果见图3A。研究表明噻托溴铵和雷芬那辛经过2h的解离后抑制活性基本无显著降低，格隆溴铵的抑制活性则出现较显著的下降，异丙托溴铵抑制活性下降的最为显著。取解离2h后每个拮抗剂的DMR值，计算对卡巴胆碱的抑制率来判断每个化合物的解离速率，结果见图3B。研究表明，解离速率从大到小依次为噻托溴铵≈雷芬那辛＜格隆溴铵＜异丙托溴铵。放射性标记方法显示噻托溴铵和雷芬那辛均为M3受体长效拮抗剂，格隆溴铵为M3受体中长效拮抗剂，异丙托溴铵为M3受体短效拮抗剂，这一结果与我们的结论一致。
实施例2：
基于实施例1中得到的拮抗剂雷芬那辛和异丙托溴铵在 HEK-293T-M3细胞上的拮抗DMR特征信号谱，计算得到的IC50值分别为101.39±30.24nM和10.81±2.09nM。
然后对4个M3受体拮抗剂的长效性分析：
将处于对数生长期的HEK-293T-M3细胞，接种于细胞兼容的384 微孔板中，所用培养基为DMEM(#SH30022.01B,Thermo)，每孔的接种体积为40μL，每孔接种的细胞数目为2.0×104个，将接种好的细胞板置于细胞培养箱中培养20～22h，至细胞融合度达95％左右，进行活性实验。将在微孔板中的细胞培养液换成Hank's平衡盐溶液 (含10mM的HEPES)，每孔加入体积为30μL，加入之后，放置于成像仪上平衡1h；重新扫描2min的基线，将雷芬那辛和异丙托溴铵分别加入微孔板中，每孔加入体积为10μL，浓度分别为 150和20nM，平行5次，置于Epic仪器上实时监测DMR信号1h 后，分别于10min、30min、60min、90min和120min洗净微孔板中的拮抗剂溶液，并重新加入40μL的HBSS缓冲盐，并保留1组不洗净拮抗剂溶液，对应的解离时间分别为0min、10min、40min、70 min、100min和120min，然后分别加入200nM的卡巴胆碱作用1h 的DMR响应信号。研究表明雷芬那辛经过2h的解离后抑制活性基本无显著降低，异丙托溴铵的抑制活性下降显著。表明雷芬那辛的解离速率＜异丙托溴铵的解离速率，这一结果与放射性标记方法的结论一致。
本发明提供的技术方案与现有的性能数据比较如下:
| 试验周期 | 试验难度 | 试验效率 | 筛选通量 | |
| 现有技术 | 2天 | 高 | 低 | 96 |
| 本发明 | 6h | 低 | 高 | 384 |
从表中可以看出本发明拮抗剂长效性分析方法的试验周期已缩短至6H与现有技术相比明显缩短，筛选通量大幅提升，另外本发明的试验难度降低，试验效率提高。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。
Claims (5)
1.一种受体拮抗剂长效性分析方法，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，其受体拮抗剂长效性分析方法包括以下步骤：
基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达M3的细胞系HEK-293T-M3，借助于已知的激动剂和拮抗剂，评价药物分子的长效性；
利用激动剂和拮抗剂进行拮抗剂的拮抗活性的检测，得到拮抗剂的IC80值或者IC50值；在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h；将溶解在HBSS缓冲盐中的激动剂以浓度为0.1~10000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；将溶解在HBSS缓冲盐中的拮抗剂分别以浓度为0.01~100000nM加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；再向已加入了拮抗剂的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的激动剂，分别检测脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱；获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的，并计算每个拮抗剂的IC80值或者IC50值；
利用得到的拮抗剂的IC80值或者IC50值对拮抗剂进行长效性分析；在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293T-M3细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h；将溶解在HBSS缓冲盐中的拮抗剂分别以浓度为IC80值或者IC50值加入到接种HEK-293T-M3细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；拮抗剂与受体作用1h后在不同时间段洗净拮抗剂溶液，重新加入40µLHBSS缓冲盐；向拮抗剂溶液加入了新的HBSS缓冲盐的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的浓度的激动剂，分别检测拮抗DMR特征信号谱；获得的所有DMR特征信号谱为每个拮抗剂在解离不同时间里剩余的拮抗作用；
根据拮抗剂解离不同时间后的DMR信号谱判断该拮抗剂的长效性；拮抗剂的解离时间分别为0min、30min、60min、90min、120min，并保留一组不洗净拮抗剂溶液，其对应解离时间分别为0min、10min、40min、70min、100min、120min。
2.根据权利要求1所述的方法，所述无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。
3.根据权利要求1所述的方法，所述激动剂包括卡巴胆碱，拮抗剂包括噻托溴铵、雷芬那辛、格隆溴铵、异丙托溴铵。
4.根据权利要求1所述的方法，检测DMR特征信号谱使用的检测平台为康宁第三代Epic® 成像仪，DMR特征信号谱检测的信号是细胞动态质量重置引起的波长位移，脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱检测的信号是药物作用于细胞引起的共振波长的变化值。
5.根据权利要求1所述的方法，所述判断该拮抗剂的长效性的判断依据是在解离不同时间里每个拮抗剂的拮抗作用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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