CN112724130A - 抗流感病毒化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗流感病毒的药物化合物，其制备方法和应用。本发明提供的化合物为前药，相对于母体药物具有显著改善的生物利用度和抗病毒活性，适合用作治疗/预付流感病毒感染相关的疾病，并且本发明提供的化合物具有改善的药代动力学特性，特别适合开发成为口服制剂。

Description

抗流感病毒化合物及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于药物制剂技术领域，具体涉及一种抗流感病毒的药物化合物，其制备方法和应用。

背景技术

流行性感冒病毒，即流感病毒(influenzavirus,IFV)，是一种能够导致人和动物患流行感冒的分节状单链反义RNA病毒。流感、人患禽流感的大流行已成为全球关注的社会问题和威胁人类健康的重大公共卫生问题。根据世界卫生组织估计，每年流感的季节性流行可导致全球300万例到500万例的重症病例，25万例到50万例的死亡。我国是流感的多发地且多次都是流感首先袭击的地区，每年流感发病数估计可达上千万人。流感和人患禽流感不仅严重危害人体健康甚至危及生命，大流行时也容易引起人群恐慌继而影响社会稳定。流感肆虐也带来很大的经济负担，仅美国，每年成人流感疾病造成的经济损失达800亿美元，成人流感药物市场总额接近100亿美元。

目前的流感治疗选择包括接种疫苗和用抗病毒药物进行治疗。流感病毒具有突变率高，病毒间重组现象多的特点，现有的抗流感药物耐药性日趋严重，疫苗作用也常被流感病毒逃逸。

化合物Z是一种小分子RNA聚合酶抑制剂。临床前研究结果表明，化合物Z具有很强的体外广谱抗甲型流感病毒活性，对多种甲型流感病毒的抑制能力明显优于同靶点化合物以及神经氨酸酶抑制剂奥司他韦。体内药效试验也较同靶点参考化合物和奥司他韦有更佳的保护动物、降低动物肺部病毒滴度的药效。

CN201780054195.X公开了一类抗流感病毒化合物，其中也公开了化合物Z在细胞水平抑制流感病毒复制试验中展示出积极效应EC50为0.013nM；在在甲型流感病毒H1N1小鼠感染模型中的药效试验研究中显示在第9天可以实现保护动物体重下降率为4.8％，存活率为100％的效果。

虽然化合物Z体现了良好的抗流感病毒活性，但仍然需要对化合物做进一步的研究和改进，以期望提高其成药性，特别是希望得到能够适合口服使用的具有较高体内生物利用度的新化合物。

作为增强药物的实践应用的方式之一，可将具有某一药物活性的化合物转化为前药，使用前体药物策略可用来改善化合物的稳定性、提高靶向性、克服首过效应、改进生物利用率等。尽管前体药物的概念是已知的且对于制备许多化合物存在许多策略，但是本领域普通技术人员仍不能推知或明显的预料到化合物Z的前体药物可能具有的口服生物利用率并因此可以发展成为可口服使用。已知口服生物利用率不仅仅与在胃粘膜中的稳定性有关系。例如，即使具有提高的稳定性，也仍然不知道其是否能够被运输穿过粘膜屏障。例如尽管磷丙泊酚解决了丙泊酚难溶于水的问题，但实验结果证明磷丙泊酚在体内会代谢出毒性较大的甲醛，这注定会对患者造成不必要的伤害；且从公布的数据得知，磷丙泊酚的用药剂量大大高于丙泊酚，并且潜伏期与持续时间大大长于丙泊酚。

发明内容

本发明的目的在于提供更加优越的新型化合物，其可用于作为预付和/或治疗流感病毒感染的哺乳动物的药物。

首先第一方面，本发明提供了如结构式I所示的化合物或其药学可接受的盐，

其中，R为-OC_1-12，-O(CH)nOCOR₁，-NR₂R₃，或者下式代表的基团：

n为1～3的整数，R₁为C_1-12烷基；

R₂和R₃各自独立的选自H，C_1-12烷基；

R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自氢，C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_3-12环烷基、C_5-12芳基、C_5-12杂环基；所述C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_5-12环烷基、C_5-12芳基、C_5-12杂环基任选的被一个或多个取代基取代，所述取代基独立的选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氨基、CN和羟基。

进一步的优选，上述式I所示的化合物或其药学可接受的盐，其中R为-OC_1-12，-O(CH)nOCOR₁，或-NR₂R₃，

所述-OC_1-12为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、叔丁基氧基、正丁基氧基，2-甲基丁基氧基，环丙基甲氧基或环己基甲氧基；

n为1，2或3，R₁为甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、正丁基，2-甲基丁基，环丙基甲基或环己基甲基；

R₂和R₃各自独立的选自H，甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、正丁基，2-甲基丁基，环丙基甲基或环己基甲基。

进一步优选地，上述式I所示的化合物或其药学可接受的盐，其中，R为下式代表的基团：

其中R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自氢，或C_1-6烷基，所述C_1-6烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、2-甲基丙基、环己基，或环丙基。

更进一步，上述式I所示的化合物或其药学可接受的盐，其中R为-OC_1-12，所述-OC_1-12为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、或叔丁基氧基；

或者，R为-O(CH)nOCOR₁，其中n为1，R₁为甲基、乙基、丙基、异丙基、或叔丁基；

或者R为-NR₂R₃，其中R₃和R₄各自独立的选自H，甲基、乙基、丙基、异丙基、或叔丁基。

在本发明的另一个优选实施方式中，上述式I所示的化合物或其药学可接受的盐，为具有下式Id或Ie所示结构的化合物，或其药学可接受的盐：

其中R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自H，甲基，乙基，丙基，异丙基、正丁基、环丙基、叔丁基或三氟甲基。

更优选地，本发明所述的化合物或其药学可接受的盐，其为具有下式结构的化合物，或其药学可接受的盐：

本发明所述的式I所示的化合物或其药学可接受的盐，包括式I所示的化合物的外消旋体、对映异构体、非对映异构体、立体异构体、活互变异构体及其盐。

本发明所提到的“芳基”是指具有一个或两个芳环的单环或多环碳环系统，所述C_5-12芳基含有5～12个碳原子的芳基，包括但不限于苯基，萘基，四氢萘基，茚满基，茚基，呋喃基，吡咯基，噻吩基等。所述被一个或多个取代基取代的C_5-12芳基在其芳香环例如苯环上任意位置，被一个或多个卤素(如F，Cl，或Br)，C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、CN和羟基取代。

术语“C112烷基”是指饱和的、直链或含有支链的烃基基团，分别包含一到十二个碳原子，优选一到六个碳原子。C1-12烷基基团的例子包括，但不仅限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基和正己基、辛基、癸基、十二烷基等。

术语“环烷基”表示一种通过除去单一氢原子产生的单环或多环饱和碳环化合物的单价基团，所述“C_3-12环烷基”是指包含3～12个碳原子的环烷基。例子包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2.2.1]庚基、和二环[2.2.2]辛基。

术语“杂环基”是指一种5-元、6-元或7-元的非芳香族环或二或三环基团融合的系统，其中(i)每个环包含一到三个杂原子，独立的选自氧、硫和氮，(ii)每个5-元环具有0到1个双链且每个6-元环具有0到2个双链，(iii)氮和硫杂原子可以任选地被氧化，(iv)氮杂原子可以任选地被季铵化，(iv)上述任何一种环可以任选地与一种苯环融合，和(v)其他的环原子是可以被任选氧取代的碳原子。典型的杂环烷基基团包括，但不仅限于，[1，3]二氧戊环、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉酮、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑啉基、喹喔啉基、哒嗪基、和四氢呋喃。这种杂环基团可以进一步被取代。

所述“C_1-12烷氧基”是指含有1～12个碳原子的烷氧基，优选C_1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙基氧基，叔丁基氧基。

所述C_1-6烷基包括甲基，乙基，丙基，异丙基，环丙基，叔丁基，正丁基，正丙基，环己基和正己基，所述卤素为F，Cl，Br或I，优选为F或Cl。

当本化合物I存在光学异构体时，这样的单个光学异构体及其混合物当然包括在本发明范围内。

化合物I可以是结晶，并可以是单晶或多种结晶的混合形式。根据已知的结晶方法通过结晶可以制备晶型。

化合物I可以是溶剂化物(如水合物等)，溶剂化物和非溶剂化物都包含在本发明范围内。

本发明所述的化合物I的可药学接受的盐，包括任何一种药学上可接受的盐，比如，化合物I与无机碱如钠、钾等，碱土金属如钙，镁等，有机碱如有机胺如三乙胺，三甲胺，叔丁胺，吡啶等，碱性氨基酸如精氨酸，赖氨酸，鸟氨酸等，以及氨等形成的盐；酸性盐，如磷酸盐，盐酸盐，硫酸盐，优选的为磷酸盐。

本发明第二方面，还提供了一种制备式I所述化合物或其药学可接受的盐的方法，包括使化合物Z或其盐的反应活性衍生物(如混合酸酐、酰卤等)与含有R基团的化合物或其盐反应，

其中R定义如前述。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，其包含本发明所述结构如式I所示的化合物或其药学可接受的盐，以及药学可接受载体。

本发明第四方面还提供了所述化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗和/或预防哺乳动物被流感病毒感染相关的药物中的用途。

本发明第五方面还提供了所述化合物或或其药学可接受的盐与巴洛沙韦和/或奥司他韦组合用于制备预防或治疗流感病毒感染相关的药物中的用途。

根据本发明所述的化合物I或其药学可接受盐在预防和治疗流感病毒感染及其他由流感病毒感染所引起情况时是有效的，这里所述的由流感病毒保护甲流，乙流，所引起的情况例如甲型流感，乙型流感或混合型流感。

以及，本发明所述双核苷酸前体药物，单独或与其他试剂相结合，在制备用于治疗和/或流感病毒感染的任何病症的药物中的应用；给药过程可以是单独给药也可以与另一种或其他抗流感病毒药物结合给药，或者与另一种或其他抗流感病毒药物顺序给药，所述的其他抗流感病毒药物例如可以是奥司他韦、巴洛沙韦等。

当化合物I和另一抗病毒剂联合施用时，活性可能比单独使用增加。当治疗是联合疗法时，使用方法是同时施用或序贯施用。所述的“同时施用”包括在相同时间或在不同时间施用药剂。可通过含有两种或更多种活性成分的单一制剂或通过基本上同时施用两种或更多种含有单一活性成分的剂型来同时施用两种或更多种药剂。

制备方法

可通过下面所示的方法或其类似方法等制备化合物I。

尽管根据下面方法得到化合物I的收率可能取决于所用的反应条件而改变，但可通过常规的分离或纯化方式(如重结晶，柱层析等)方法对这些所得产物进一步纯化，以得到期望纯度的化合物I。

方法A：

化合物I中，当R为-OC_1-12，时，化合物I则具有如下通式Ia所示的结构，

其中，所述-OC_1-12为包含1～12个碳原子的烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、或叔丁基氧基；

所述化合物Ia的制备方法包括，将化合物X或其盐的反应活性衍生物(如混合酸酐、酰卤等)与C_nH2_n+1OH通过酯化反应，得到；所述酯化反应的条件为酸或碱性条件下催化，反应溶剂DMF，异丙醇，THF或DMSO等。

方法B：

当所述化合物I中，R为-O(CH)nOCOR₁，则化合物I具有如下化合物Ib所示的结构：

其中，n为1，R₁为甲基、乙基、丙基、异丙基、或叔丁基；

所述化合物Ib例如可以通过将化合物Z或其盐的反应活性衍生物(如混合酸酐、酰卤等)与X(CH)nOCOR₁在合适的反应溶剂(如DMA)中反应，得到，其中X为卤素，优选X为I或Br，反应体系中可适当的加入碱如三乙胺，碳酸钾等。

方法C：

当所述化合物I中，R为-NR₂R₃，则化合物I具有如下化合物Ic所示的结构：

其中R₃和R₄各自独立的选自H，甲基、乙基、丙基、异丙基、或叔丁基，

所述化合物Ic例如可以通过将化合物Z或其盐的反应活性衍生物(如混合酸酐、酰卤等)与HNR₂R₃在合适的反应溶剂(如DMA，DMF，异丙醇等)中反应，得到。

方法D

当所述化合物I中，R为

其中R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自氢，或C_1-6烷基，所述C_1-6烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、2-甲基丙基、环己基，或环丙基，则化合物I具有如下化合物Id或Ie所示的结构，

通式Id或Ie通过将化合物Z或其盐的反应活性衍生物(如混合酸酐、酰卤等)与相应的醇或其盐反应制备得到。

具体的方法D包括在碱存在下使化合物Z与酰化试剂(II)反应，以生成混合酸酐，在碱存在下使所得化合物与相应的醇(III)反应，以进行酯化：

其中，X是卤原子(氯，溴，碘等)，R₁₁是烷基(如C_1-6烷基，比如甲基，乙基，丙基，叔丁基等)，烷氧基(如C_1-6烷氧基，比如甲氧基，乙氧基，异丁氧基等)，或任选的被卤原子、C_1-6烷基或硝基取代的苯基等，R₁₂为

R₄、R₅、R₆、R₇如上定义。

所述方法D更具体的，相对于1mol的化合物Z，在溶剂中使用1～3mol碱和约1～3mol酰化试剂制备该混合酸酐，随后，加入相应的醇(III)以进行反应，或过滤除去盐(碱与HX的盐)后，浓缩滤液，用溶剂稀释残留物并加入相应的醇和碱以进行酯化反应。

作为碱，可以使用三乙胺，而异丙基乙胺，DBU，4-二甲基氨基吡啶，氢化钠，叔丁醇钾，碳酸钾及碳酸钠等。

作为酰化剂，可使用特戊酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯或2，4,6-三氯苯酰氯等。

作为溶剂，通常可以使用二氯甲烷，氯仿，1,2-二氯乙烷，乙酸乙酯，四氢呋喃，甲苯，乙腈，丙酮，二氧六烷，DMF，DMSO等。

尽管制备混合酸酐的反应条件取决于所用的碱，酰化剂和溶剂组合等，该方反应通常优选在-30℃至室温下进行，约1～10小时。尽管酯化反应的条件取决于所制备的混合酸酐和溶剂组合，该反应通常优选在约-30℃至溶剂回流温度进行约1-10小时。

通式Id或Ie，还可以使用化合物Z与SOCl₂或(COCl)₂在催化量的DMF存在下，需要时在溶剂中反应，然后浓缩，加入溶剂再加入相应的醇(HO-R₁₂)和碱进行酯化反应，得到。

通式Id或Ie，还可以使用化合物Z与HO-R₁₂在缩合剂存在下进行酯化反应。具体的，例如1mol化合物Z，在溶剂中使用约1～3mol缩合剂和约1～3mol相应的醇(HO-R12)进行酯化反应，所述缩合剂优选为DCC，WSC，Mitsunobu试剂等，所述溶剂如前述所用的相似的溶剂；所述缩合反应条件通常与所用的缩合剂和溶剂组合相关，在该反应中，优选在约-30℃至回流温度下进行约30min～24h。

通式Id或Ie，还可以使用化合物Z或其盐(如与碱金属比如纳，钾等形成的盐，与碱土金属比如钙、镁等形成盐等等)与烷基化试剂(X-R₁₂)在碱剂存在下反应以进行酯化。优选地1mol化合物在溶剂中与1～3mol碱和1～3mol的烷化剂进行该酯化反应。其中所述的碱和溶剂与前述类似，所述反应温度取决于所用的碱、烷化剂和溶剂组合，优选地，该反应通常为-30℃至回流温度下进行约30min～10h。

所述的烷基化试剂(X-R₁₂)优选地X为溴原子，其制备方法包括但不限于：

方案Da：

R₄选自如上定义。

方案Db：

反应条件：(a)KO₂CCH₂CO₂Et，MgCl₂，Et₃N/CH₃CN；(b)PhCH₂OH,DMAP(cat.)，甲苯；(c)4-N-acetyl phenylsufonyllazide,Et₃N/CH₃CN；(d)Rh₂(OAc)₄(cat.),THF/H₂O(2:1)；(e)COCl₂，iPr₂Net；甲苯或者N,N'-羰基二咪唑,iPr₂NEt(cat.)，CH₂Cl₂；(f)H₂，Pd(OH)₂,EtOH；(g)i(COCl)₂，DMF(cat.)，CH₂Cl₂；ii Bu₄NBH₄,CH₂Cl₂；(h)Ph₃P，CBr₄，CH₂Cl₂。

具体操作方法可以参考文献：Tetrahedron Letters 43(2002)1161-1164。

所述的化合物Z可通过WO2019170067、CN201780054195.X等中描述的方法制备得到。

由于本发明提供的化合物与化合物Z相比，显示出更好的稳定性，并能够降低剂量，更适合开发成为口服制剂。

作为药学上可接受的载体，可使用通常用作制剂材料的多种有机或无机载体物质。例如，可以提及用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂与崩解剂；用于液体制剂的溶剂、溶解辅剂、悬浮剂、等渗剂与缓冲剂，等等。必要时，还可使用制剂添加剂比如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等。

优选的赋形剂例如包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇、D-山梨醇、淀粉、预胶化淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、支链淀粉、轻质硅酸酐、人造硅酸铝、偏硅酸铝镁等。

润滑剂的优选实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅等等。

粘合剂的优选实例包括预胶化淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

崩解剂的优选实例包括乳糖、蔗糖、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、轻质硅酸酐、低取代的羟丙基纤维素等。

溶剂的优选实例包括注射用水、生理盐水、林格液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油、棉子油等。

溶解辅剂的优选实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷(trisaminomethane)、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等。

悬浮剂的优选实例包括表面活性剂比如硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、氨基丙酸月桂酯、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等；亲水聚合物比如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等；聚山梨酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油等。

等渗剂的优选实例包括氯化钠、甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、葡萄糖等。

缓冲剂的优选实例包括比如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等缓冲剂。

防腐剂的优选实例包括对-氧基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。

抗氧化剂的优选实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸盐等。

着色剂的优选实例包括水溶性可食用的焦油染料(如，食物色素比如Food RedNos.2和3、Food Yellow Nos.4和5、Food Blue Nos.1和2等)、水不溶性色淀类染料(如前述可使用水溶性可食用焦油染料的铝盐等)，天然色素(如，β-胡萝卜素、叶绿素氧化铁红等)等等。

甜味剂的优选实例包括糖精钠、甘草酸二钾、阿司帕坦、stevia等。

药物组合物的剂型例如包括口服剂比如片剂、胶囊(包括软胶囊和微囊)、颗粒剂、粉剂、糖浆、乳剂、悬浮液、缓释制剂、干混悬剂等，其各自可安全口服。

根据药物制造技术领域的常规方法可制备药物组合物，比如中国药典中所述的方法等。

例如，通过将赋形剂(如，乳糖、蔗糖、淀粉、D-甘露醇等)、崩解剂(如，羧甲基纤维素钙等)、粘合剂(如，预胶化淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)、润滑剂(如，滑石粉、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等)等加至活性成分，压制成型，以及必要时，为了掩蔽异味、肠溶或缓释的目的，根据本身已知的方法使用本身已知的包衣基质进行包衣。

胶囊可被制成装填粉末或颗粒药剂的硬胶囊，或装填液体或悬浮液的软胶囊。制备硬胶囊时，混合和/或制粒活性成分与例如将赋形剂(如，乳糖、蔗糖、淀粉、结晶纤维素、D-甘露醇等)、崩解剂(低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钙、玉米淀粉、交联羧甲基纤维素钠等)、粘合剂(羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等)、润滑剂(硬脂酸镁等)，并将该混合物或颗粒装入由前述明胶、羟丙基甲基纤维素等所形成的胶囊中。制备软胶囊时，将活性成分溶解或悬浮于基质(大豆油、棉籽油、中链脂肪酸甘油三酯、蜂蜡等)并例如使用旋转填充仪等在明胶层中密封所制备的溶液或悬浮液。

化合物I在药物组合物中的含量相对于整个制剂通常约为0.01-约99.9wt％，优选约0.1-约50wt％。

考虑到年龄、体重、一般的健康情况、性别、饮食、给药时间、给药方法、清除率、药物组合、患者所被治疗的疾病的严重程度化合物以及其它因素确定化合物I的剂量。

虽然剂量取决于目标疾病、病情、给药受试者、给药方法等而不同，对于口服给药作为抗流感病毒感染的药物，优选以单剂量或2或3份给药的日剂量为0.1-100mg。

具体实施方式

参照下面的实施例、制备实施例和试验实施例详细说明了本发明。但是，这些实施例仅是实践中的实施方案而非对本发明的限制。只要不偏离本发明的范围可以修改本发明。

实施例1、化合物Iaa的制备方法

将7.00g(16.0mmol)化合物Z溶解于50mL DMF中，在10℃下加入3.94g DCC(19.1mmol)，在此温度下搅拌1小时，然后加入3.66g乙醇。10℃下继续搅拌30分钟后，升温至常温再搅拌4小时。反应结束后将反应液浓缩至干，加入60mL二氯甲烷，经水洗，无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到产物5.66g，收率76％。MS Calcd:467.21；MS Found:468.35[M+H]⁺。

采用类似实施例1的方法制备化合物Iab和Iac；

其中，化合物Iab，MS Calcd:453.20；MS Found:454.31[M+H]⁺

化合物Iac，MS Calcd:481.23；MS Found:482.40[M+H]⁺。

实施例2、化合物Iba的制备方法

在反应瓶中加入二氯甲烷200ml和水5ml，化合物Z(61.8mmol)，AE活性酯23.4g，控温0～10℃，滴加三乙胺7.5g(74.1mmol)，滴完后，反应2h，向料液中加入水400mL，分层，0～20℃水相加入固体氯化钠100g，析晶，过滤得到化合物Z的钠盐。

在反应瓶中投入水300mL和二氯甲烷120ml，控温0～25℃，投入上述化合物Z的钠盐，搅拌后加入四丁基溴化铵2g，特戊酸碘甲酯17.95g(74.2mmol)，搅拌反应2h，分层，有机相浓缩后滴加水500ml结晶，得到化合物Iba，收率90％，MS Calcd:553.25；MS Found:554.25[M+H]⁺。

实施例3、化合物Ibb的制备方法

化合物IIa的制备：

化合物IId(45g，0.17mol)于搅拌小加入到二氯甲烷(60ml)中，溶解后，冰盐浴冷却下地基吡啶2ml与二氯甲烷20ml的混合物，滴入乙醛17.65g，于0℃以下反应20h，同温减压抽气1h，残留液于20℃减压整除二氯甲烷，继续收集60-70℃/8kPa馏分，得到无色液体IIc，直接投入下一步反应。

IIc(38g，0.266mol)和异丙醇(24.3g，0.404mol)于搅拌下加入到80ml的二氯甲烷中，于0℃以下滴入吡啶(25.8g，0.327mol)，滴加完毕，室温搅拌30min。反应液一次用5％硫酸氢钾溶液洗至pH3～4、水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液加圧蒸留除去溶剂，剩余物继续减压收集84～85℃/5kPa馏分，得到无色液体IIb，bp 68～82℃/13.3kPa。

化合物IIb(41.7g，0.25mol)、碘化钠(45g，0.3mol)和18-冠醚-6(2g，0.0075mol)加入到380ml甲苯中，110℃反应4h，冷却至10℃，一次用硫代硫酸钠溶液150ml，20％盐水100ml洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，得到无色液体IIa。

化合物Ibb的制备：

化合物Z(0.117mol)于搅拌下溶于二甲基乙酰胺(DMA，360ml)中，0℃缓慢加入化合物IIa(0.14mol)和三乙胺(0.14mol)，搅拌40min，加入600ml乙酸乙酯，过滤，滤液依次用稀盐酸，5％碳酸氢钠，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液加压蒸出溶剂，残留液经硅胶分离纯化，收集所需要的部分，蒸出溶剂，干燥后得到目标化合物Ibb，MS Calcd:569.24；MS Found:570.25[M+H]⁺。

实施例4、化合物Ica的制备方法

将11.00g化合物Z(25mmol)和2.78g三乙胺(27.5mmol)溶解于150mL二氯甲烷中，在0-5℃下向反应液中缓慢滴加3.58g氯甲酸异丁酯(26.3mmol)。滴加完成后在此温度下搅拌1小时。然后加入3.06g二甲胺盐酸盐(37.5mmol)和3.79g三乙胺(37.5mmol)，常温下搅拌3小时。反应液经水洗，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩至干。剩余物经硅胶柱色谱纯化，得到产物10.5g，收率90％。

MS Calcd:466.23；MS Found:467.28[M+H]+

采用类似实施例4的方法制备化合物Icb和Icc；

其中，化合物Icb，MS Calcd:452.27；MS Found:453.23[M+H]⁺。

化合物Icc，MS Calcd:494.40；MS Found:495.25[M+H]⁺。

实施例5、化合物Ida的制备方法

氮气保护下，反应瓶中，依次加入化合物Z(10mmol)、DMF(100ml)、二异丙基乙胺(11mmol)、碘化钠(7.5mmol)、4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮(11mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，反应液经柱层析，纯化得化合物Ida约3.5g，纯度98％。

采用类似实施例5的方法制备化合物Idb和Idc和Idd；

其中，化合物Idb，MS Calcd:565；MS Found:566.22[M+H]⁺。

化合物Idc，MS Calcd:579；MS Found:580.23[M+H]⁺。

化合物Idd，MS Calcd:537；MS Found:538.19[M+H]⁺。

实施例6、化合物Iea的制备方法

取100g甲基碳酸乙烯酯，加入引发剂过氧化二苯甲酰(BPO),搅拌溶解澄清。紫外线光照，通入氯气(流量120ml/min)，控温80-90℃，搅拌反应4.5h。经蒸馏纯化得无色油状物81g，气相纯度98％。

氮气保护下，反应瓶中，依次加入化合物Z(10mmol)、DMF(100ml)、二异丙基乙胺(11mmol)、碘化钠(7.5mmol)、甲基氯代碳酸乙烯酯(12mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，反应液经柱层析，纯化得化合物Iea 0.65g，纯度98.58％。MS Calcd:553.21；MSFound:554.22[M+H]+。

实施例7、化合物Ied的制备方法

氮气保护下，反应瓶中，依次加入化合物Z(10mmol)、DMF(110ml)、二异丙基乙胺(25mmol)、碘化钠(7.5mmol)、4-氯-5,5-二甲基碳酸乙烯酯(20mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，反应液经柱层析，纯化得化合物Ied1.93 g，纯度99％。MS Calcd:567；MS Found:568.12[M+H]⁺。

采用类似实施例6的方法制备化合物Ieb和Iec和Ied；

其中，化合物Ieb，MS Calcd:539；MS Found:540.22[M+H]⁺；

化合物Iec，MS Calcd:567；MS Found:568.23[M+H]⁺；

实施例8：受试化合物抗流感病毒活性研究

小鼠经滴鼻感染甲型流感病毒H1N1(Virapur公司)，感染后36小时开始用化合物处理，口服给药，连续7天，每天两次。通过观察小鼠体重变化及存活率，来评价化合物在该模型中的抗甲型流感病毒H1N1作用。

实验选用SPF级别的BALB/c小鼠，6-8周，雌性。小鼠到达BSL-2动物房后适应至少3天后开始实验。将感染当天设为实验第0天。小鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(75mg/kg，10ml/kg)，待动物进入深麻状态后，经滴鼻感染流感病毒A/WSN/33(H1N1)，感染体积为50ul。从第1天至第7天，每天口服给予待测化合物，每天两次，其中化合物Z，化合物Iaa,化合物Iba，化合物Ibb，化合物Ida每日剂量分别设有为10mg/kg，8mg/kg组，其他化合物均设置10mg/kg/天。首次给药时间为感染后36小时。每天观察小鼠状态，并记录小鼠体重及存活率。在第14天时，将所有存活动物进行安乐死。

具体分组及每组小鼠给药情况如下表1所示。

表1分组及每组小鼠给药情况

序号	组别	剂量(mg/kg)	给药方式
				1	生理盐水	10	灌胃
2	化合物Z	10	灌胃
				3	化合物Iaa	10	灌胃
4	化合物Iab	10	灌胃
				5	化合物Iac	10	灌胃
6	化合物Iba	10	灌胃
				7	化合物Ibb	10	灌胃
8	化合物Ica	10	灌胃
				9	化合物Icb	10	灌胃
10	化合物Icc	10	灌胃
				11	化合物Ida	10	灌胃
12	化合物Idb	10	灌胃
				13	化合物Idc	10	灌胃
14	化合物Idd	10	灌胃
				15	化合物Iea	10	灌胃
16	化合物Ieb	10	灌胃
				17	化合物Iec	10	灌胃
18	化合物Ied	10	灌胃
				19	化合物Z	8	灌胃
20	化合物Iaa	8	灌胃
				21	化合物Iba	8	灌胃
22	化合物Ibb	8	灌胃
				23	化合物Ida	8	灌胃

实验结果：

空白对照组1，动物在第二天出现死亡，而16种受试化合物的抗流感病毒A/WSN/33(H1N1)病毒效果均优于对照化合物Z，实验组和阳性对照组在高剂量(10mg/kg/天)给药条件下，存活率均为100％，并且，实验组化合物在第10天可以实现保护动物体重下降率低于3％，化合物Z组动物体重下降率约5％左右。

在高剂量组和低剂量组中，化合物Iaa、化合物Iab化合物Iba、化合物Ibb和化合物Ida都表现出显著的抗病毒效果，在第14天，动物存活率均为100％，而动物体重基本保持不变。而8mg/kg/天的化合物Z组在第10天出现体重下降超过30％，在第14天存活率80％。

实施例9：药代动力学研究和生物利用度

选取6-8周龄雄性SD大鼠，饲养在SPF动物房内。所有动物给药前禁食，禁食时间不少于12h，于给药后4h恢复给食，保持所有动物在实验过程中均可自由饮水。化合物Z和受试化合物均以0.5％CMC-Na配制灌胃制剂，每组小鼠单次给药，给药途径均为灌胃。

动物分组及给药信息详见下表。

每只大鼠于给药前、给药结束后0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h由颈静脉采血约0.15mL，置于EDTA-K2抗凝管中，存放于湿冰上，并于1h之内，离心，分离血浆和细胞成分，将所得血浆样品保存于-40～-20℃环境中。实验结束后，采用二氧化碳窒息法或者颈椎脱臼法对大鼠实施安乐死。

建立测定SD大鼠血浆中活性代谢产物化合物Z浓度测定的LC-MS/MS分析方法，用于本实验获得的生物样品的浓度测定。通过梯形法则计算药物浓度曲线下面积(AUC)和一阶矩药物浓度曲线下面积(AUMC)，并外推至无穷大。如果可能的话，通过线性回归从血浆浓度对数(log plasma concentration)-时间点的末期斜率计算在b相的消除半衰期(t1/2b)。作为F(％)＝(剂量iv×AUC口服(0→∞))/(剂量口服×AUCiv(0→∞))*100％计算口服生物利用度。

试验结果显示，SD大鼠灌胃给予本发明所述化合物后，其活性代谢产物化合物Z的药代动力学性质均优于对照化合物Z，其中化合物Iaa,化合物Iba，化合物Ibb和化合物Ida的药代动力学性质最为突出，Cmax和AUC0-t均为对照化合物Z的5倍左右。初步研究表明：本发明提供的化合物相对对照品化合物Z具有显著的改善生物利用度。

实施例10：体外细胞毒性：

用CTG方法测试化合物Z、化合物Iaa,化合物Iba，化合物Ibb和化合物Ida在人正常肺成纤维细胞(MRC-9)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞增殖50％抑制浓度(IC50)。

收集处于指数生长期的细胞并用Vi-Cell XR细胞计数仪进行活细胞计数。用各细胞相应培养基调整细胞悬液浓度。每孔加90μl细胞悬液于96-孔细胞培养板，最终细胞浓度为3000细胞/孔。以DMSO溶解各供试化合物为10mM储存液。用储存液和DMSO制备3.16X系列梯度稀释液。然后分别用培养基稀释100倍。最后每株细胞每孔分别加入10μl相应的10倍溶液，每个药物浓度各3个复孔。置于37℃,5％CO2孵箱中培养72小时。药物处理72小时后，按照CTG操作说明，每孔加入50μl(1/2培养体积)预先融化并平衡到室温的CTG溶液，用微孔板震荡器混匀2分钟，于室温放置10分钟后用Envision2104读板仪测定萤光信号值。使用非线性回归模型绘制S型剂量-存活率曲线并计算IC50值。实验结果显示化合物Z以及供试化合物Iaa,化合物Iba，化合物Ibb和化合物Ida在2个细胞系的细胞增殖IC50(μM)均＞1000；由此可以看出，本发明提供的化合物具有较低的体细胞毒性。

实施例11：使用组织匀浆、血浆和模拟胃液的前药的体外转化的步骤和结果

因为母体药物Z是抗流感病毒活性所必需的，因此除非前药在体内快速发生水解，否则所述前药不会具有活性。通过使用小鼠小肠匀浆和肝匀浆、小鼠血浆和人工胃液在体外培养本发明化合物来评价其在体内的水解。从裸鼠中收集新鲜血浆。通过将3倍体积的盐水加入新鲜收集的小鼠组织中，并使用玻璃均质器均质来制备肝匀浆和肠匀浆。通过将80mL的1M盐酸加入800mL水中，然后补充2.0g的氯化钠和3.2g的胃蛋白酶粉末来制备胃液。用水将人工胃液的最终体积调节至1000mL(pH＝1.1)。将适当体积的本发明化合物储备溶液加入上述媒介物。在第0、2、5、15、30和60分钟收集100μL的样品。立即加入含有内标物的5倍体积的甲醇。对于从胃液中培养的样品，在注入LC/MS/MS之前，加入1倍体积的0.01M的氢氧化钠。经LC/MS/MS分析所有样品，以定量本发明化合物以及相应母体药物化合物Z的浓度。通过使用各媒介物得到的标准曲线定量本发明化合物的母体药物的浓度。结果表明：在肝匀浆和肠匀浆中，本发明化合物减少，而其各自的母体药物快速形成。所述母体药物累积至约30％以上，其保持稳定长达60分钟。本发明化合物均在血浆内稳定(在第60分钟时约90％保持不变)，而在人工胃液中的稳定性稍差(在第60分钟时约82％保持不变)，其中大部分化合物在胃液中向化合物Z的转化率低于0.5％。

然后使用组织匀浆和模拟胃液(胃蛋白酶溶液，pH 1.1)评价本发明化合物的体外转化。在胃液和血浆中发生少量的转化，而在肝匀浆和肠匀浆中均获得明显的转化。并且发现化合物Iaa和化合物Ida的转化比其他化合物如Iac，Ica，Icb更有效率，其在肝匀浆中60分钟内达到53.12％以上的转化。这些数据表明本发明提供的化合物会是最合适的前药候选。

以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.下式I所示化合物或其药学可接受的盐，

其中，R为-OC_1-12，-O(CH)nOCOR₁，-NR₂R₃，或者下式代表的基团：

n为1～3的整数，R₁为C_1-12烷基；

R₂和R₃各自独立的选自H，C_1-12烷基；

R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自氢，C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_3-12环烷基、C_5-12芳基、C_5-12杂环基；所述C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_5-12环烷基、C_5-12芳基、C_5-12杂环基任选的被一个或多个取代基取代，所述取代基独立的选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氨基、CN和羟基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其中，R为-OC_1-12，-O(CH)nOCOR₁，或-NR₂R₃，

其中所述-OC_1-12为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、叔丁基氧基、正丁基氧基，2-甲基丁基氧基，环丙基甲氧基或环己基甲氧基；

n为1，2或3，R₁为甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、正丁基，2-甲基丁基，环丙基甲基或环己基甲基；

R₂和R₃各自独立的选自H，甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、正丁基，2-甲基丁基，环丙基甲基或环己基甲基。

3.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其中，R为下式代表的基团：

其中R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自氢，或C_1-6烷基。

4.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其中，R为-OC_1-12，所述-OC_1-12为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、或叔丁基氧基；

或者，R为-O(CH)nOCOR₁，其中n为1，R₁为甲基、乙基、丙基、异丙基、或叔丁基；

或者R为-NR₂R₃，其中R₃和R₄各自独立的选自H，甲基、乙基、丙基、异丙基、或叔丁基。

5.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其为具有下式Id或Ie所示结构的化合物，或其药学可接受的盐：

其中R₄、R₅、R₆、R₇独立的选自H，甲基，乙基，丙基，异丙基、正丁基、环丙基、叔丁基或三氟甲基。

6.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其为具有下式结构的化合物，或其药学可接受的盐：

7.一种制备权利要求1所述化合物或或其药学可接受的盐的方法，包括使化合物Z或其盐的反应活性衍生物与含有R基团的化合物或其盐反应，

其中R定义与权利要求1相同。

8.药物组合物，其包含权要求1所述化合物或其药学可接受的盐，以及药学可接受载体。

9.一种权利要求1所述化合物或其药学可接受的盐在制备用于治疗和/或预防哺乳动物被流感病毒感染相关的药物中的用途。

10.一种权利要求1所述化合物或或其药学可接受的盐与巴洛沙韦和/或奥司他韦组合用于制备预防或治疗流感病毒感染相关的药物中的用途。