CN112708664A - 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒 - Google Patents
肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112708664A CN112708664A CN201911024112.XA CN201911024112A CN112708664A CN 112708664 A CN112708664 A CN 112708664A CN 201911024112 A CN201911024112 A CN 201911024112A CN 112708664 A CN112708664 A CN 112708664A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- gene
- primer
- sequence
- aiming
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 61
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 20
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 150
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 119
- 101150023956 ALK gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150054472 HER2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150105382 MET gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150100676 Map2k1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150111783 NTRK1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150117329 NTRK3 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150063858 Pik3ca gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150077555 Ret gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150035397 Ros1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 claims description 9
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 claims description 9
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 6
- 101150101798 NARS gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150048834 braF gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 21
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 15
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 abstract description 6
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 abstract description 6
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 abstract description 5
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 abstract description 5
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 abstract description 5
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 abstract description 5
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 abstract description 5
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 abstract description 5
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 abstract description 4
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 abstract description 4
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 abstract description 4
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 abstract description 4
- -1 MET Proteins 0.000 abstract description 4
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 abstract description 4
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 abstract description 4
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 abstract description 4
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 abstract description 3
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 abstract description 3
- 108010068342 MAP Kinase Kinase 1 Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 abstract description 2
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102000002576 MAP Kinase Kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012308 immunohistochemistry method Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- JTBBWRKSUYCPFY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydro-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound O=C1NCNC=C1 JTBBWRKSUYCPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150071661 SLC25A20 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001686 afatinib Drugs 0.000 description 1
- ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N afatinib Chemical compound N1=CN=C2C=C(O[C@@H]3COCC3)C(NC(=O)/C=C/CN(C)C)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 101150102633 cact gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960001602 ceritinib Drugs 0.000 description 1
- VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N ceritinib Chemical compound CC=1C=C(NC=2N=C(NC=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)C(C)C)C(Cl)=CN=2)C(OC(C)C)=CC=1C1CCNCC1 VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 description 1
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 229960002465 dabrafenib Drugs 0.000 description 1
- BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N dabrafenib Chemical compound S1C(C(C)(C)C)=NC(C=2C(=C(NS(=O)(=O)C=3C(=CC=CC=3F)F)C=CC=2)F)=C1C1=CC=NC(N)=N1 BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960004066 trametinib Drugs 0.000 description 1
- LIRYPHYGHXZJBZ-UHFFFAOYSA-N trametinib Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC(N2C(N(C3CC3)C(=O)C3=C(NC=4C(=CC(I)=CC=4)F)N(C)C(=O)C(C)=C32)=O)=C1 LIRYPHYGHXZJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Abstract
本发明提供了一种肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒。用于扩增肺癌驱动基因的引物，其扩增产物覆盖EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、PIK3CA，HER2、RET、MET、NRAS、NTRK1‑3、MAP2K1等多个肺癌驱动基因的热点突变位点与基因融合类型，且针对NTRK1‑3基因融合，目前国内未有二代测序文库覆盖该融合类型。本发明试剂盒的引物可以有效捕获肺癌驱动基因的多基因序列，并使用多重PCR法，只需两步PCR扩增与纯化，即可构建得到肺癌驱动基因的多基因测序文库，首次实现了对NTRK1‑3基因融合的扩增及检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种用于肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒。
背景技术
肺癌每年在我国的发病约有78.1万例，死亡约有62.6万例，是目前我国发病率和死亡率均最高的癌症。基于组织病理学结果，肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中非小细胞肺癌占约80％。近年来，随着分子诊断技术不断发展与新型靶向药物陆续出现，非小细胞肺癌治疗已进入靶向治疗时代。
非小细胞肺癌驱动基因包括EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、PIK3CA，HER2、RET、MET、NRAS、NTRK1-3、MAP2K1等多个基因，与肿瘤的发生、发展、药物疗效相关。目前国内已有多种针对非小细胞肺癌的靶向药物上市，包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奥希替尼，ALK与ROS1抑制剂克唑替尼等。此外，美国FDA上市NSCLC靶向药物还包括针对ALK融合的色瑞替尼、针对BRAF突变的达拉非尼与曲美替尼、针对NTRK融合的拉罗替尼等多种药物。针对HER2外显子20插入突变、RET融合与MET外显子14跳跃突变，美国国立综合癌症网络(NCCN)也推荐相关药物作为新的治疗选择。此外还有多种靶向药物正在进行临床试验。
目前市场上用于检测基因突变的方法主要包括Sanger测序法、荧光PCR法与液相芯片法等，其中Sanger测序法与荧光PCR法难以做到多样本多位点的平行检测；而液相芯片法虽然可以一定程度上实现上述高通量检测需求，但无法检测出未知突变类型，存在漏检可能性。检测基因融合的方法主要有免疫组化法、FISH法和荧光PCR法等，这些方法均无法实现高通量的检测，且免疫组化法与FISH法无法区分融合类型，而荧光PCR法虽然可区分融合类型但无法检测出未知融合类型。下一代测序技术(NGS)可满足平行对多样本多位点进行高通量检测的需求，能大量降低检测时间与实际成本，且准确率高，灵敏度高，可以检出未知突变或融合类型，是一种能更好地适用于肺癌驱动基因突变与融合检测应用的技术手段。但目前市面上常见的测序文库构建方法为杂交捕获法，需要片段化、末端修复、加接头、纯化、扩增与纯化、杂交、捕获、PCR扩增与纯化多个步骤，总耗时需要超过24小时；且除了PCR体系与纯化磁珠外，还需要末端修复、连接反应、杂交反应与多步纯化所涉及的多种酶类和缓冲液，其操作繁琐复杂、耗时长、成本高。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种用于检测肺癌多基因体细胞突变与基因融合的方法与试剂盒。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种用于扩增肺癌驱动基因的引物，包括通用引物和特异性引物；
所述通用引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89；所述特异性引物包括如下至少一个基因的扩增引物：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的、或如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的、或如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的、或如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的、或如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的针对BRAF基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的、或如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的、或如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的、或如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.42任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.43所示的反向引物组成的针对ALK基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.53任一所示的正向引物和序列如SEQ IDNO.54-SEQ ID NO.57任一所示的反向引物组成的针对ROS1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示的、或如SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.67任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.68所示的反向引物组成的针对RET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.76任一所示的正向引物和序列如SEQ IDNO.77-SEQ ID NO.79任一所示的反向引物组成的针对NTRK1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示的、或如SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.84和SEQ ID NO.85所示的、或如SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
一种用于扩增肺癌驱动基因的引物，包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物为SEQ ID NO.90-SEQ ID NO.95中的任一种，所述测序引物对的反向引物为SEQ IDNO.96-SEQ ID NO.103中的任一种。
本发明还提供了一种试剂盒，具体技术方案如下：
一种构建肺癌驱动基因的多基因测序文库或用于肺癌驱动基因的多基因突变检测试剂盒，包括如上所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物。
本发明还提供了一种非诊断目的的捕获肺癌驱动基因序列的方法，具体技术方案如下：
一种非诊断目的的捕获肺癌驱动基因序列的方法，包括以下步骤：以如上所述的通用引物和特异性引物进行PCR扩增，得肺癌驱动基因序列的PCR产物文库。
本发明还提供了一种非诊断目的的构建肺癌驱动基因的多基因测序文库的方法，具体技术方案如下：
一种非诊断目的的构建肺癌驱动基因的多基因测序文库的方法，包括以下步骤：
以如上所述的通用引物和特异性引物进行PCR扩增，得肺癌驱动基因序列的PCR产物文库；
以所述PCR产物文库为模板，以如上所述的测序引物为引物，进行PCR扩增，获得肺癌驱动基因的多基因测序文库。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明中用于扩增肺癌驱动基因的引物，其扩增产物覆盖EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、PIK3CA，HER2、RET、MET、NRAS、NTRK1-3、MAP2K1等多个肺癌驱动基因的热点突变位点与基因融合类型，且针对NTRK1-3基因融合，目前国内未有二代测序文库覆盖该融合类型。
本发明所述引物可以有效捕获肺癌驱动基因的多基因序列，并使用多重PCR法，只需两步PCR扩增与纯化，而无需传统方法中的片段化、末端修复、加接头、杂交等步骤，总耗时不到6小时，人工操作时间不超过1小时，即可构建得到肺癌驱动基因的多基因测序文库，首次实现了对NTRK1-3基因融合的扩增及检测，而且所需试剂仅包括PCR体系相关试剂与纯化磁珠，步骤少，操作简便，耗时短，试剂成本低。本发明灵敏度高，对样本DNA用量可低至10ng，远低于使用杂交捕获法所需的100ng-1μg。
附图说明
图1为构建肺癌驱动基因的多基因测序文库的流程示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一种用于扩增肺癌驱动基因的引物，包括通用引物和特异性引物；所述通用引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89；所述特异性引物包括如下至少一个基因的扩增引物：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的、或如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的、或如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的、或如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的、或如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的针对BRAF基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的、或如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的、或如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的、或如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.42任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.43所示的反向引物组成的针对ALK基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.53任一所示的正向引物和序列如SEQ IDNO.54-SEQ ID NO.57任一所示的反向引物组成的针对ROS1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示的、或如SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.67任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.68所示的反向引物组成的针对RET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.76任一所示的正向引物和序列如SEQ IDNO.77-SEQ ID NO.79任一所示的反向引物组成的针对NTRK1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示的、或如SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.84和SEQ ID NO.85所示的、或如SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
优选地，所述特异性引物包括：如上所述的针对EGFR基因的扩增引物、针对EGFR基因的扩增引物、针对BRAF基因的扩增引物、针对PIK3CA基因的扩增引物、针对NARS基因的扩增引物、针对HER2基因的扩增引物、针对ALK基因的扩增引物、针对ROS1基因的扩增引物、针对MET基因的扩增引物、针对RET基因的扩增引物、针对MAP2K1基因的扩增引物、针对NTRK1基因的扩增引物、的针对NTRK2基因的扩增引物和针对NTRK3基因的扩增引物。
可选地，所述特异性引物包括如下至少一个基因的扩增引物：序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；序列如SEQ IDNO.31-SEQ ID NO.43所示的针对ALK基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.57所示的针对ROS1基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.68所示的针对RET基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.79所示的针对NTRK1基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.80-SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；序列如SEQ ID NO.84-SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
更优选地，所述特异性引物包括：序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.43所示的针对ALK基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.57所示的针对ROS1基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.68所示的针对RET基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.71-SEQ IDNO.79所示的针对NTRK1基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.80-SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.84-SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
优选地，所述特异性引物的序列的Tm值为61-65℃，进一步优选为62℃。
进一步地，所述用于扩增肺癌驱动基因的引物：还包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物为SEQ ID NO.90-SEQ ID NO.95中的任一种，所述测序引物对的反向引物为SEQ ID NO.96-SEQ ID NO.103中的任一种。
本发明提供了一种用于扩增肺癌驱动基因的引物，包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物为SEQ ID NO.90-SEQ ID NO.95中的任一种，所述测序引物对的反向引物为SEQ ID NO.96-SEQ ID NO.103中的任一种。
本发明的一种构建肺癌驱动基因的多基因测序文库或用于肺癌驱动基因序列的多基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括如上所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物。
本发明还提供了一种捕获肺癌驱动基因序列的方法，包括以下步骤：
以提取的人基因组DNA为模板，以如上所述的通用引物和特异性引物进行PCR扩增，得肺癌驱动基因序列的PCR产物文库。
优选地，所述PCR扩增的条件为：95-100℃下处理18-22min，再95-100℃下处理10-20s以及60-64℃下处理18-22min以及65-69℃下处理1-2min以及70-75℃下处理1-2min进行8-15个循环，接着在70-75摄氏度下处理8-12min后降温至3-8℃保存。
优选地，所述人基因组DNA的来源包括但不限于新鲜组织、石蜡包埋组织蜡块或切片、血浆。
更优选地，所述人基因组DNA由以上新鲜组织、石蜡包埋组织蜡块或切片或血浆中直接提取得到，和/或由以上新鲜组织、石蜡包埋组织蜡块或切片或血浆中提取到的RNA进行反转录获得。
优选地，所述反转录体系为：以10μL体系计，包含有：样本总RNA200-1000ng，反转录缓冲液1.5-2.5μL，其余为无核酸酶水。
优选地，体系配置完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，进行反转录反应。
优选地，反转录程序为：20-30℃下处理10min，40-45℃下处理60min，80-90℃下处理5min，降温至3-8℃保存。
进一步地，所述捕获肺癌驱动基因序列的方法，还包括通过纯化柱纯化和/或磁珠纯化的方法分离提纯所述PCR产物文库的步骤。
本发明的一种的构建肺癌驱动基因的多基因测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用如上所述的捕获肺癌驱动基因序列的方法，扩增得到肺癌驱动基因序列的PCR产物文库；
以所述PCR产物文库为模板，以如上所述的测序引物为引物，进行PCR扩增，获得肺癌驱动基因的多基因测序文库。其中，采用测序引物进行扩增的目的是将不同样本加上用于区分样本的标签与测序引物序列。本发明的文库构建方法所构建的文库所带有的测序引物序列与Barcord标签序列可应用于Illumina公司NextSeq 500等市面上多种常用的二代测序平台。
优选地，所述PCR扩增的条件为：95-100℃下处理18-22min，再95-100℃下处理10-20s以及65-69℃下处理1-2min以及70-75℃下处理1-2min进行15-20个循环，接着在70-75℃下处理8-12min后降温至3-8℃保存。
进一步地，所述构建肺癌驱动基因的多基因测序文库的方法，还包括通过纯化柱纯化和/或磁珠纯化的方法分离提纯所述PCR产物文库的步骤。
实施例1
一种检测肺癌多基因体细胞突变与基因融合试剂盒，该试剂盒包括反转录缓冲液、靶向扩增缓冲液、文库扩增缓冲液、正向文库扩增引物A5I、反向文库扩增引物A7I、纯化磁珠、洗脱液、质控品。
反转录缓冲液，包括反转录酶、dNTP、缓冲液、随机引物或Oligo(dT)引物、RNase抑制剂，用于将样本RNA反转录成cDNA。
靶向扩增缓冲液，包括高保真DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合物、靶向扩增引物，用于扩增待测核酸中的目的突变区域。所述靶向扩增引物(SEQ ID NO.1–SEQ ID NO.89)，其每条引物结构包括通用引物序列与特异性引物序列，扩增区域至少覆盖全部目标基因待测突变位点。
其中，所述靶向扩增引物为经过特殊修饰的引物序列，所述靶向扩增引物的修饰方法可以为磷酸化修饰、脱氧尿嘧啶修饰、间臂修饰中的一种或几种。特异性引物的Tm值为62℃。
表1靶向扩增引物
文库扩增缓冲液，包括高保真DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合物，用于进一步扩增文库并在产物两端加上测序引物序列与A5I/A7I标签序列。
正向文库扩增引物A5I，每条引物包括测序引物序列、A5I标签序列与正向通用引物序列。A5I标签序列选自SEQ ID NO.90-SEQ ID NO.95。
反向文库扩增引物A7I，其特征在于每条引物包括测序引物序列、A7I标签序列与反向通用引物序列。A7I标签序列选自SEQ ID NO.96-SEQ ID NO.103。
文库扩增引物，不同待测样品应使用不同的文库扩增引物A5I/A7I组合，用于区分文库中不同样品。
表2标签序列
| 标签名称 | 标签序列(5'—3') | SEQ ID NO. |
| A5I01 | TGAACCTT | 90 |
| A5I02 | TGCTAAGT | 91 |
| A5I03 | TGTTCTCT | 92 |
| A5I04 | TAAGACAC | 93 |
| A5I05 | CTAATCGA | 94 |
| A5I06 | CTAGAACA | 95 |
| A7I21 | GTAAGCCT | 96 |
| A7I22 | TAACTGTT | 97 |
| A7I23 | CGTGACTG | 98 |
| A7I24 | TTAGTCCG | 99 |
| A7I25 | CGAGGTTC | 100 |
| A7I26 | CTATCTAT | 101 |
| A7I27 | GAAGGCAG | 102 |
| A7I28 | GACAACGC | 103 |
纯化磁珠，用于靶向扩增产物与文库扩增产物的纯化中分选目的大小范围的DNA。
质控品，包括阳性质控品与阴性质控品。
阳性质控品，包含带有目的突变阳性的细胞株所提取的DNA与RNA混合物。
阴性质控品，包含野生型细胞株所提取的DNA与RNA混合物。
实施例2
使用实施例1所述试剂盒进行样本检测。
一、样本DNA与RNA提取：
样本使用新鲜组织或细胞，石蜡组织样本等，使用商业化公司DNA/RNA提取试剂盒，按说明书方法操作提取DNA与RNA，并用Qubit4荧光计进行浓度测定。
总RNA上样量不低于200ng，总DNA上样量不低于50ng。
二、反转录反应：对每个待测样，在0.2μl PCR管中按比例配置反应体系如表3：
表3反转录体系
| 试剂名称 | 实际用量 |
| 样本总RNA | 200-1000ng |
| 反转录缓冲液 | 2μl |
| 无核酸酶水 | 补足至10μL |
体系配置完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，进行反转录反应。反转录程序如表4所示。
表4反转录程序
| 步骤 | 温度/℃ | 时间 |
| 1 | 25 | 10min |
| 2 | 42 | 60min |
| 3 | 85 | 5min |
| 4 | 4 | Forever |
三、靶向扩增反应
对每个待测样，在0.2μl PCR管中配置反应体系，如表5所示。
表5靶向扩增反应体系
| 试剂名称 | 实际用量 |
| 样本DNA | 30-100ng |
| 上一步反转录产物 | 10μL |
| 靶向扩增缓冲液 | 10μL |
| 无核酸酶水 | 补足至25μL |
体系配置完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，进行靶向扩增反应(程序如表6)。
表6靶向扩增反应程序
四、利用纯化磁珠分别对各样品的靶向扩增产物进行纯化、回收。
五、文库扩增反应
对每个待测样，在0.2μl PCR管中配置反应体系(表7)。
表7文库扩增反应体系
| 试剂名称 | 试剂用量 |
| 正向文库扩增引物A5I## | 1μL |
| 反向文库扩增引物A7I## | 1μL |
| 上一步纯化产物 | 10μL |
| 文库扩增缓冲液 | 13μL |
| 总体积 | 25μL |
不同样本应使用不同的文库扩增引物A5I/A7I组合，
体系配置完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，进行靶向扩增反应(程序如表8)。
表8文库扩增反应程序
六、文库纯化
使用纯化磁珠对各样品文库进行纯化。
七、文库定量与分析
使用Qubit4或Agilent 2100DNA分析芯片对文库进行定量，并进行2％琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。
所述样本文库合格标准为DNA浓度>2ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测样品具有大小约为300bp的完整、均一条带，无明显拖尾。
八、文库混合
将所有合格样品(不超过96个)分别稀释至浓度为2ng/μl，并进行等体积混合，用于Illumina NextSeq 500上机测序。
九、结果检测与数据分析
本实施例针对45个来源于石蜡组织切片与新鲜组织的样品进行了分析，结果表明(见表9)：45例样本中20例带有突变，包括9例EGFR突变，4例KRAS突变，2例PIK3CA突变，1例BRAF突变，1例HER2突变，1例NRAS突变，1例ALK融合，1例ROS1融合，其余25例为野生型，与Sanger测序结果一致。
表9
实施例3不同样本核酸浓度对文库构建的影响
选择5例经Sanger测序验证突变类型不同的样本，使用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法，分别加入10ng，30ng，50ng，100ng，200ng样本DNA进行文库构建，结果表明(如表10)，构建文库的样本核酸浓度低至10ng时，使用本发明所提供的文库构建试剂盒与构建方法仍可正确检测出相应突变，且使用不同起始量的DNA所构建的文库所测得突变率接近。
表10不同核酸浓度样本文库构建检测结果
实施例4不同文库扩增引物A5I/A7I组合对文库构建的影响
选择5例经Sanger测序验证突变类型不同的样本，使用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法，分别使用3种不同的文库扩增引物A5I/A7I组合对同一样本进行标记用于文库构建，并将统一样本的3种子文库混合上机测序。结果表明(如表11)，使用不同文库扩增引物A5I/A7I组合对3个样本进行文库构建并测序，均可稳定检出相应突变，且测得突变率差异不大。同理，使用本发明其他文库扩增引物A5I/A7I组合进行文库构建并测序，均可检出相应突变类型且使用不同A5I/A7I组合测得突变率差异不大，具体结果省略。由此可见，使用不同文库扩增引物A5I/A7I组合进行文库构建，不对测序结果产生影响。
表11不同文库扩增引物A5I/A7I组合文库构建检测结果
实施例5灵敏度验证
选择5例突变类型不同的样本，用野生型样本混合成突变率为0.5％、1％、5％的样本，使用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行文库构建并上机测序，结果表明(如表12)：本发明所提供的文库构建试剂盒与构建方法可正确检出相应突变类型，且所测突变率与理论值接近。
表12灵敏度测试结果
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒
<160> 103
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttgaagga aactgaattc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcccagccca gaggcctgtg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgaga aagttaaaat tcc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaagcagaa actcacatcg ag 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catgcgaagc cacactgacg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggcagatgc ccagcaggc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggcatctgc ctcacctcca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggtactgg gagccaatat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgaaaacac cgcagcatgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctccttactt tgcctccttc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgctgaaaa tgactgaata 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagatttacc tctattgttg 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttcctacagg aagcaagtag ta 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccagtcctc atgtactggt cc 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agagttaagg actctgaaga 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aggaattcca taacttcttg c 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gatccagaca actgttcaaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttgcaatct ctgaagatca 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gactagctag agacaatgaa t 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atagaaaatc tttctcctgc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctagcctta gataaaactg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctgtttaat tgtgtggaag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggtgtgaaat gactgagtac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcatattca tctacaaagt 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tacagaaaac aagtggttat ag 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agccttcgcc tgtcctcatg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agactcggat gatgtaccta 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaatcccgta actcttggcc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cagcgtaccc ttgtccccag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
accagctgca ccgtggatgt 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcaaaaatgt caactcgcga a 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaactgcaga caagcataaa 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acctgggaaa ggacctaaag 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttctgtggga tcatgatctg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ataggaacgc actcaggcag 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cattaaaaaa tgtggaatgc tg 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctatccaca cagacgggaa t 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccttgactgg tccccagac 19
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaaataggaa ttgctgtggg aa 22
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccctcagtga agaactagtc c 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tcaggtcaaa gaatatggcc a 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agggctctgc agctccatct 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tatatttctt catgaagacc tc 22
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
actccttgga gcaaaagcc 19
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccctggatat tcttagtagc g 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aggctcctga gacctttgat 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctgtctggct ctggagatct 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cagggcagca acatctttga 20
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cggctgcagg actatgagg 19
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttcttaccac aacatgacag 20
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gctggaaaag acaattgatg ac 22
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tggataagga actggcagga 20
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gacacaagtg gggaaatcaa ag 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gctttctccc actgtattga at 22
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cttctatgcc agacaaaggt ca 22
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
caactctttg tcttcgttta ta 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccacttccca gcaagagacg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cataaaaccc atgagttctg 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tagcgaacta attcactgcc c 21
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gatgcaagag tacacactc 19
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ctgaaatata ccttctgga 19
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gaaataggaa ttgctgtggg a 21
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggagttagca gcatgtcagc 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cacaacctgc gcaaactctt t 21
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cagctcacta aagtgcacaa ac 22
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cctggagaag agaggctgta 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gacctgcgca aagccagcgt 20
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gttgccttga ccacttttcc a 21
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gagcttgatg agcagcagcg 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
attgccagcc cccagctcac 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gtcttctggg ctgggtgtga 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ggagaagtcc cctgacagtg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gctggagggc gagctgcatg 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tgttatgtca gcgtttggct 20
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
aaactcatgt tcaagacaga a 21
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gaaaagacaa ttgatgacc 19
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ccaccgagac cccaaaagg 19
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
gacagggagc tgccaccca 19
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gcagagacgg tgccggctgc c 21
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gaagccgctg gacagccggg 20
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
catcaatcct tgagtatcct at 22
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gagagatgtt cccgaccggt 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ggccaccttc cgaagaagat 20
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
cagccggagg tcatactgca t 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gtctccccgc ctgaagagca c 21
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tccagtgacg agggcgtggt 20
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ctgaggttgt agcactcgg 19
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
attatgtatt ctagtctagt cact 24
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tcaccatctt tgtggtctgc ac 22
<210> 90
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tgaacctt 8
<210> 91
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tgctaagt 8
<210> 92
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tgttctct 8
<210> 93
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
taagacac 8
<210> 94
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ctaatcga 8
<210> 95
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
ctagaaca 8
<210> 96
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gtaagcct 8
<210> 97
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
taactgtt 8
<210> 98
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
cgtgactg 8
<210> 99
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ttagtccg 8
<210> 100
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cgaggttc 8
<210> 101
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ctatctat 8
<210> 102
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gaaggcag 8
<210> 103
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gacaacgc 8
Claims (10)
1.一种用于扩增肺癌驱动基因的引物，其特征在于，包括通用引物和特异性引物；所述通用引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89；所述特异性引物包括如下至少一个基因的扩增引物：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的、或如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的、或如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的、或如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的、或如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的、或如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的针对BRAF基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的、或如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的、或如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的、或如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.42任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.43所示的反向引物组成的针对ALK基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.53任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.54-SEQID NO.57任一所示的反向引物组成的针对ROS1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示的、或如SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.67任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.68所示的反向引物组成的针对RET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.76任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.77-SEQID NO.79任一所示的反向引物组成的针对NTRK1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示的、或如SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.84和SEQ ID NO.85所示的、或如SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物，其特征在于，所述特异性引物包括如下基因的扩增引物：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的、或如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的、或如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的、或如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的、或如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的、或如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的针对BRAF基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的、或如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的、或如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的、或如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.42任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.43所示的反向引物组成的针对ALK基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.53任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.54-SEQID NO.57任一所示的反向引物组成的针对ROS1基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示的、或如SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.67任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.68所示的反向引物组成的针对RET基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.76任一所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.77-SEQID NO.79任一所示的反向引物组成的针对NTRK1基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示的、或如SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；和
序列如SEQ ID NO.84和SEQ ID NO.85所示的、或如SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
3.根据权利要求1所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物，其特征在于，所述特异性引物包括如下至少一个基因的扩增引物：
序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.43所示的针对ALK基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.57所示的针对ROS1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.68所示的针对RET基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.79所示的针对NTRK1基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.80-SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；
序列如SEQ ID NO.84-SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
4.根据权利要求1所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物，其特征在于，所述特异性引物包括：序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示的针对EGFR基因的扩增引物；和序列如SEQID NO.11-SEQ ID NO.16所示的针对EGFR基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.17-SEQ IDNO.22所示的针对PIK3CA基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.28所示的针对NARS基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的针对HER2基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.43所示的针对ALK基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.44-SEQ ID NO.57所示的针对ROS1基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.61所示的针对MET基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.62-SEQ ID NO.68所示的针对RET基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示的针对MAP2K1基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.71-SEQ ID NO.79所示的针对NTRK1基因的扩增引物；和序列如SEQ ID NO.80-SEQ ID NO.83所示的针对NTRK2基因的扩增引物；和序列如SEQ IDNO.84-SEQ ID NO.87所示的针对NTRK3基因的扩增引物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物，其特征在于，还包括测序引物对，所述测序引物对的正向引物为SEQ ID NO.90-SEQ ID NO.95中的任一种，所述测序引物对的反向引物为SEQ ID NO.96-SEQ ID NO.103中的任一种。
6.一种用于扩增肺癌驱动基因的测序引物对，其特征在于，所述测序引物对的正向引物为SEQ ID NO.90-SEQ ID NO.95中的任一种，所述测序引物对的反向引物为SEQ IDNO.96-SEQ ID NO.103中的任一种。
7.一种构建肺癌驱动基因的多基因测序文库或用于肺癌驱动基因的多基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项或权利要求6所述的用于扩增肺癌驱动基因的引物。
8.一种非诊断目的的捕获肺癌驱动基因序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以提取的人基因组DNA为模板，以如权利要求1-4任一项所述的通用引物和特异性引物进行PCR扩增，得肺癌驱动基因序列的PCR产物文库。
9.根据权利要求8所述的捕获肺癌驱动基因序列的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：95-100℃下处理18-22min，再95-100℃下处理10-20s以及60-64℃下处理18-22min以及65-69℃下处理1-2min以及70-75℃下处理1-2min进行8-15个循环，接着在70-75摄氏度下处理8-12min后降温至3-8℃保存。
10.一种非诊断目的的构建肺癌驱动基因的多基因测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用如权利要求8或9所述的捕获肺癌驱动基因序列的方法，扩增得到肺癌驱动基因序列的PCR产物文库；
以所述PCR产物文库为模板，以如权利要求5或6所述的测序引物为引物，进行PCR扩增，获得肺癌驱动基因的多基因测序文库。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911024112.XA CN112708664A (zh) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911024112.XA CN112708664A (zh) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112708664A true CN112708664A (zh) | 2021-04-27 |
Family
ID=75540773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911024112.XA Pending CN112708664A (zh) | 2019-10-25 | 2019-10-25 | 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112708664A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015164432A1 (en) * | 2014-04-21 | 2015-10-29 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| CN106319042A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-11 | 上海睿昂生物技术有限公司 | 检测人egfr基因突变的微滴pcr试剂盒 |
| CN107574245A (zh) * | 2017-05-26 | 2018-01-12 | 同济大学 | 基因突变检测用引物对、试剂盒及靶向测序文库构建方法 |
| WO2018057888A1 (en) * | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Driver, Inc. | Integrated systems and methods for automated processing and analysis of biological samples, clinical information processing and clinical trial matching |
| CN109266744A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-25 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 基于umi单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重pcr引物、试剂盒及方法 |
-
2019
- 2019-10-25 CN CN201911024112.XA patent/CN112708664A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015164432A1 (en) * | 2014-04-21 | 2015-10-29 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| CN106319042A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-11 | 上海睿昂生物技术有限公司 | 检测人egfr基因突变的微滴pcr试剂盒 |
| WO2018057888A1 (en) * | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Driver, Inc. | Integrated systems and methods for automated processing and analysis of biological samples, clinical information processing and clinical trial matching |
| CN107574245A (zh) * | 2017-05-26 | 2018-01-12 | 同济大学 | 基因突变检测用引物对、试剂盒及靶向测序文库构建方法 |
| CN109266744A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-25 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 基于umi单分子标签降噪技术的靶向测序检测肺癌基因的多重pcr引物、试剂盒及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200354773A1 (en) | High multiplex pcr with molecular barcoding | |
| EP3177740B1 (en) | Digital measurements from targeted sequencing | |
| EP2802666B1 (en) | Genotyping by next-generation sequencing | |
| JP2021176302A (ja) | 腫瘍のディープシークエンシングプロファイリング | |
| WO2018112806A1 (zh) | 将线性测序文库转换为环状测序文库的方法 | |
| JP6798697B2 (ja) | Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法 | |
| EP2971087B1 (en) | Assessing dna quality using real-time pcr and ct values | |
| WO2018184495A1 (zh) | 一步法构建扩增子文库的方法 | |
| CN111321208A (zh) | 一种基于高通量测序的建库方法 | |
| CN110923325B (zh) | 用于检测EGFR基因突变的引物Blocker组、试剂盒及方法 | |
| EP3480319A1 (en) | Method for producing dna library and method for analyzing genomic dna using dna library | |
| EP2013366B1 (en) | Sequencing of the L10 codon of the HIV gag gene | |
| CN107988320A (zh) | 一种分子标签接头及其制备方法和应用 | |
| CN112301430B (zh) | 一种建库方法及应用 | |
| CN111304309A (zh) | 一种测序平台标签序列污染的检测方法 | |
| CN113840923A (zh) | 用于核酸检测的方法、系统和设备 | |
| CN114277114B (zh) | 一种扩增子测序添加唯一性标识符的方法及应用 | |
| CN113186291B (zh) | 基于多重pcr的引物组和试剂盒 | |
| CN112266963B (zh) | 一种联合检测慢性粒细胞白血病检测试剂盒 | |
| CN112708664A (zh) | 肺癌驱动基因的多基因突变测序文库构建方法与试剂盒 | |
| WO2020259303A1 (zh) | 一种快速构建rna 3'端基因表达文库的方法 | |
| CN107904297B (zh) | 用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法 | |
| CN114774522A (zh) | 一种高保真测序文库构建的方法、试剂盒及应用 | |
| WO2020005159A1 (en) | Method for detection and quantification of genetic alterations | |
| US20210180125A1 (en) | Method for the detection and quantification of genetic alterations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |