CN112708593A - 一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，步骤包含：(1)将血清替代物与无血清培养基以一定的体积比配制成细胞培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(2)配制复配软骨诱导分化培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度，使用96孔板进行间充质干细胞的接种；(4)接种完成后，放置在CO2培养箱静置2～3小时后，补加0.1～0.2ml的细胞培养基；(5)放置22～26小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。该方法具有良好的干细胞培养和保护效果，软骨分化的干细胞全部为球团状且形状规则，无明显的干细胞损坏，适宜在干细胞领域推广，具有广阔的发展前景。

Description

一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法。
背景技术
间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层，其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤，临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液系统疾病、心血管疾病。
软骨细胞在诱导过程分三个阶段：第一阶段MSCs形成高密度的细胞聚集体，停止增殖，分泌丰富的透明质酸和I型胶原，组织特异性的转录因子如Sox-9和结构蛋白开始积累；第二个阶段MSCs分化为软骨前体祖细胞，聚集的细胞重新增殖，产生初期胞外基质，开始软骨分化，此过程受到Sox-9、Sox-5、Sox-6、FGF、TGF-β1信号途径的调控；第三阶段称为去分化阶段，在这个阶段会形成软骨基质，表达II胶原、IX胶原和XI胶原。
但本申请发明人在实现本申请实施例中发明技术方案的过程中，发现现有技术至少存在如下技术问题：
现有技术(CN201810182995.6)公开了一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基及制备方法；通过采用α-MEM/HG-DMEM培养基、胎牛血清、丙酮酸钠、抗坏血酸和脯氨酸等制备了一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，宣称具有较快的诱导速度，良好的诱导分化效果；但是，此申请中加入的胎牛血清生物活性较高，虽然具有良好的细胞培养效果，明显加快了干细胞诱导分化成软骨的培育时间，但是胎牛血清较高的活性，容易促使在诱导分化过程中干细胞出现细胞分化后细胞球团形状不规则或者不成球团的情况；并且较快的诱导分化成软骨的时间很可能是降低干细胞分化成软骨的质量导致的。于此同时，大量的胎牛血清的使用也过于残忍，且在胎牛血清的使用过程中由于其内在成分复杂和容易受一些外界因素的影响，容易对培养基的质量产生不利的影响，如包含有病毒等，会使得细胞的培养功亏一篑。
因此，研发一种即使不使用不稳定血清也能有效的诱导干细胞分化成软骨，且软骨分化成功后干细胞能有效的成球团，球团形状规则的间充质干细胞分化成软骨的方法是一项十分有意义的工作。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，步骤包含以下几步：(1)将血清替代物与无血清培养基以一定的体积比配制成细胞培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(2)配制复配软骨诱导分化培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种；(4)接种完成后，放置在CO2培养箱静置2～3小时后，补加0.1～0.2ml的细胞培养基；(5)放置22～26小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
作为一种优选的方案，所述血清替代物和无血清培养基的体积比为1：16～24。
作为一种优选的方案，所述复配软骨诱导分化培养基包括基础培养基和培养基补充剂。
作为一种优选的方案，所述培养基补充剂和基础培养基的体积比为1：6～14。
作为一种优选的方案，所述间充质干细胞的密度为1x105～1.5x105/10μl。
作为一种优选的方案，所述96孔板进行间充质干细胞的接种的接种密度为1x105～2x105/10μl/孔。
作为一种优选的方案，所述CO2培养箱的温度为36.0～40.0℃。
作为一种优选的方案，所述CO2培养箱的CO2浓度为3.0～7.0％。
作为一种优选的方案，所述软骨诱导分化的时间为20～25天。
本发明第二方面包括该方法在来源于人脐带、骨髓、脂肪的间充质干细胞诱导分化成软骨领域的应用。
有益效果：本发明公开了一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法；本方法在不使用任何血清的情况下为间充质干细胞提供了所需的所有营养和有益分子，并且分化成软骨的后的间充质干细胞形成了有规则的球团状，干细胞的状态良好，有利于下一步观察检测和使用。
附图说明
图1为实施例1中间充质干细胞使用本发明申请中的细胞培养基培养22小时后的状态图。
其中：1：间充质干细胞；2：间充质干细胞核；3：细胞培养基。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，步骤包含以下几步：(1)将血清替代物与无血清培养基以一定的体积比配制成细胞培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(2)配制复配软骨诱导分化培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种；(4)接种完成后，放置在CO2培养箱静置2～3小时后，补加0.1～0.2ml的细胞培养基；(5)放置22～26小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
作为一种优选的方案，所述血清替代物和无血清培养基的体积比为1：16～24。
作为一种优选的方案，所述血清替代物为EliteCell生物医药集团公司出售的EliteGroTM型号的血清替代物产品。
作为一种优选的方案，所述无血清培养基为以色列BI公司出售的NutriStem XFMedium型号的无血清培养基产品。
本发明通过无血清培养基和血清替代物复配组合的细胞培养基有效的为干细胞的培养提供了全部的营养成分和有益因子，并且使得干细胞在接种和后续的诱导成软骨化过程中保持良好的形态和三系分化能力，本申请人进一步发现当血清替代物和无血清培养基的体积比为1：16～24时，培养效果达到最佳。本申请人推测为：复配细胞培养基中的血清替代物EliteGroTM作为一种无动物源性、无异源物的组分，能够同时提供激素和结合蛋白以维持细胞的指数增长和增加培养基结合、调变其它物质活性的能力；并且同时为培养基提供因子源，支撑细胞在塑料培养基上的贴壁、铺展。而无血清培养基NutriStem XF Medium同样作为无动物源性、无异源物的组分加入，能够应对骨髓、脐带等多种来源的间充质干细胞；且NutriStem XF Medium无血清培养基能够在细胞培养基中表现出更好的自我增殖和更新的能力，有效维持干细胞的正常纤维囊状细胞态，保留干细胞三系分化潜能，并使得干细胞表现出优异的核型稳定性，从而有效成团。与无血清培养基相比当血清替代物的量较少时，不能有效维持干细胞的指数增长，影响后续的软骨分化；而当血清替代物的较多时，营养物质和因子的含量较多、活性较强，干细胞的大量增殖容易彼此破坏，不易成团。
作为一种优选的方案，所述复配软骨诱导分化培养基包括基础培养基和培养基补充剂。
作为一种优选的方案，所述培养基补充剂和基础培养基的体积比为1：6～14。
作为一种优选的方案，所述培养基补充剂为以色列BI公司出售的ChondrogenicDifferentiation Supplement Mix型号的产品。
作为一种优选的方案，所述基础培养基为以色列BI公司出售的ChondrogenicDifferentiation Basal Medium型号的产品。
作为一种优选的方案，所述间充质干细胞的密度为1x105～2x105/10μl。
作为一种优选的方案，所述间充质干细胞的密度为1x105～1.5x105/10μl。
作为一种优选的方案，所述96孔板进行间充质干细胞的接种的接种密度为1x105～1.5x105/10μl/孔。
作为一种优选的方案，所述CO2培养箱的温度为36.0～40.0℃。
作为一种优选的方案，所述CO2培养箱的CO2浓度为3.0～7.0％。
作为一种优选的方案，所述软骨诱导分化的时间为20～25天。
本发明第二方面包括该方法在来源于人脐带、骨髓、脂肪的间充质干细胞诱导分化成软骨领域的应用。
实施例
以下通过实施例对本发明技术方案进行详细的说明，但是本发明的保护范围不局限于所述的所有实施例。如无特殊说明，本发明的原料均为市售。
实施例1
本实施例提供了一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，步骤包含以下几步：(1)将1mL血清替代物EliteGroTM与22mL的无血清培养基NutriStem XF Medium配制成细胞培养基，配制完成后，在5℃下保存备用；(2)将24mL基础培养基ChondrogenicDifferentiation Basal Medium和2mL培养基补充剂Chondrogenic DifferentiationSupplement Mix配制成软骨诱导分化培养基，配制完成后，5℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度为1.4x105/10μl，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种，接种密度为1.4x105/10μl/孔；(4)接种完成后，放置在40℃，3％CO2浓度的培养箱静置2小时后，补加0.1mL的细胞培养基；(5)放置22小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
本实施例中血清替代物为EliteCell生物医药集团公司出售的EliteGroTM型号的血清替代物产品。
本实施例中无血清培养基为以色列BI公司出售的NutriStem XF Medium型号的无血清培养基产品。
本实施例中培养基补充剂为以色列BI公司出售的ChondrogenicDifferentiation Supplement Mix型号的产品。
本实施例中基础培养基为以色列BI公司出售的Chondrogenic DifferentiationBasal Medium型号的产品。
实施例2
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：无血清培养基NutriStem XFMedium为16mL。
实施例3
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：基础培养基ChondrogenicDifferentiation Basal Medium为12mL。
实施例4
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：无血清培养基NutriStem XFMedium为40mL。
实施例5
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：无血清培养基NutriStem XFMedium为10mL。
实施例6
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：基础培养基ChondrogenicDifferentiation Basal Medium为6mL。
实施例7
本实施例的具体实施方式同实施例1，不同之处在于：细胞培养基为市售的胎牛血清干细胞培养基。
性能评价
观察对象：所有实施例诱导分化完成软骨细胞；
观察方法：将所有实施例的诱导分化完成的软骨细胞放置在显微镜下进行观察拍照，每天观察一次，记录超95％的间充质干细胞诱导分化成软骨的时间；分辨分化后的干细胞是否成团，并且干细胞球团的成型形状是否规则，是否有破裂或其他现象。记录和观察结果记入表1。
表1
实施例 诱导分化完成的软骨细胞形貌 软骨化时间(天)
1 全部成球团状、形状规则、无明显破裂细胞 20
2 全部成球团状、形状规则、无明显破裂细胞 21
3 全部成球团状、形状规则、无明显破裂细胞 23
4 少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞 28
5 少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞 29
6 少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞 31
7 少部分非球团状、形状不规则、有明显破裂细胞 17
通过实施例1～7和表1可以得知，本发明提供的一种体外诱导人间充质细胞分化成软骨的方法，具有良好的干细胞培养和保护效果，诱导分化完成后的软骨细胞全部为球团状且形状规则，无明显的细胞损坏，适宜在干细胞领域推广，具有广阔的发展前景。其中实施例1在具有最佳的复配培养基体积比等因素下获得了最佳性能数据。
最后指出，以上所述实施例仅为本发明较佳的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：步骤包含以下几步：(1)将血清替代物与无血清培养基以一定的体积比配制成细胞培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(2)配制复配软骨诱导分化培养基，配制完成后，2～8℃下保存备用；(3)使用细胞培养基将间充质干细胞重悬，调整间充质干细胞的密度，并使用96孔板进行间充质干细胞的接种；(4)接种完成后，放置在CO2培养箱静置2～3小时后，补加0.1～0.2ml的细胞培养基；(5)放置22～26小时后，将培养基更换为软骨诱导分化培养基，进行软骨诱导分化。
2.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述血清替代物和无血清培养基的体积比为1：16～24。
3.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述复配软骨诱导分化培养基包括基础培养基和培养基补充剂。
4.根据权利要求3所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述培养基补充剂和基础培养基的体积比为1：6～14。
5.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述间充质干细胞的密度为1x105～1.5x105/10μl。
6.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述96孔板进行间充质干细胞的接种的接种密度为1x105～2x105/10μl/孔。
7.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述CO2培养箱的温度为36.0～40.0℃。
8.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述CO2培养箱的CO2浓度为3.0～7.0％。
9.根据权利要求1所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法，其特征在于：所述软骨诱导分化的时间为20～25天。
10.一种根据权利1～9任意一项所述的体外诱导人间充质干细胞分化成软骨的方法的应用，其特征在于：包括该方法在来源于人脐带、骨髓、脂肪的间充质干细胞诱导分化成软骨领域的应用。
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