CN112704065B

CN112704065B - 烟草西柏烷二萜微乳剂的制备方法及其应用

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Publication number: CN112704065B
Application number: CN202011623348.8A
Authority: CN
Inventors: 肖勇; 杜咏梅; 刘雨露; 余祥文; 刘艳华; 张建会; 张鹏; 杨兴有; 侯小东
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS; China National Tobacco Corp Sichuan Branch
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS; China National Tobacco Corp Sichuan Branch
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112704065A

Abstract

本发明属于植物病害防治领域。为克服烟草西柏烷二萜在植物源农药开发过程中防治目标作物病害及其效果不明确，没有形成具有商业价值的绿色剂型配方的技术问题，提供一种烟草西柏烷二萜杀菌微乳剂的制备方法及其应用。采用以下配方：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物6‑8％、乙醇15‑20％、脂肪醇聚氧乙烯醚15‑20％、十二烷基苯磺酸钠5‑8％、正丁醇5‑8％、水补足。该微乳剂对苹果腐烂病、作物灰霉病、黑胫病、根腐病、白粉病等具有优于或相当于对照化学农药的防效，该微乳剂不含任何有毒有机溶剂，药效好，生产成本低，对作物及环境安全。

Description

烟草西柏烷二萜微乳剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物病害防治领域，具体涉及烟草西柏烷二萜微乳剂的制备方法及其应用。

背景技术

西柏烷二萜属于十四元大环二萜，是一类母体骨架具有十四元环和3个对称分布甲基与1个异丙基的天然产物，主要存在于烟草、松节油、乳香和海洋生物(主要为软珊瑚、柳珊瑚)中，具有抑菌、抗肿瘤、神经保护等多种活性。烟草西柏烷二萜类化合物种类繁多，目前报道的达125种，其中，西柏三烯二醇为烟草中含量最丰富的西柏烷二萜，占烟草其总量的70％以上。FERCHMIN等(2013)以西柏三烯二醇对实验鼠进行急性毒性以及亚慢毒性试验，测得LD₅₀均高于3g/kg，且并未引起实验鼠任何血液学特征以及器官重量的异常，因此，西柏烷二萜具有良好的毒理安全性。

西柏烷二萜在烟草尤其是大田废弃烟花中含量最为丰富，据估计，中国每年大田废弃烟花、不适用等级烟叶西柏烷二萜的生产量达3000吨以上，是一批宝贵的活性物质资源。中国发明专利ZL 201510382060.9(烟草花序中提取西柏烷二萜的方法)、ZL201711082390.1(一种烟草表面致香成分酊剂在烟草制品加香方面的应用)，分别建立了烟草西柏烷二萜的提取方法，为烟草西柏烷二萜深度开发利用提供了提取技术基础。但是烟草西柏烷二萜的应用研究比较滞后，仅有零星文献报道了在离体条件下，西柏烷二萜对少数作物病原真菌具有抑制作用，未见西柏烷二萜对其他作物病原真菌的抑制作用的报道，也未见有确切防治效果的报道。这限制了烟草西柏烷二萜在防治植物病害方面的开发和应用。

由于天然抑菌活性物质一般难溶于水，不能直接在作物上施用，需要制备成农药制剂，制剂的形态称为剂型，农药剂型是原药经加工因形态及用途不同而区分为不同剂型，可分为粉剂、可湿性粉剂、乳油、悬浮剂、水乳剂等，植物源农药的剂型加工很大部分是模仿化学农药进行的。随着人们对保护环境的重视以及可持续发展的需要，由于传统农药剂型如乳油等含有甲苯、二甲苯等有毒溶剂，存在易产生药害，且污染环境等为问题。农药微乳剂(micro-emulsions,ME)属于热力学稳定的单相体系，以水为分散质，安全性高，加工工艺较简单且成本低廉，经时稳定性好，已成为绿色剂型的重要发展方向。目前，有关以烟草西柏烷二萜提取物为原料，制备微乳剂作为杀菌剂的研究与应用还未见报道。

发明专利201310375679.8、公布了反式阿魏酸微乳剂及其制备方法和防治烟草、水稻、番茄病毒病的应用，201510993261.2公开了一种植物源杀虫剂苦皮藤素微乳剂及其制备方法，202010581475.X一种含有阿维菌素和茚虫威的微乳剂及其制备方法、应用，以上发明中，均使用了环己酮、甲醇等毒性较高的有机溶剂，且目前商品化的农药微乳剂，很少不含有环己酮等毒性较大的有机溶剂。

发明内容

为克服烟草西柏烷二萜在植物源农药开发过程中防治目标作物病害及其效果不明确，没有形成具有商业价值的绿色剂型配方的技术问题，本发明提供一种烟草西柏烷二萜杀菌微乳剂的制备方法及其应用，该微乳剂对苹果腐烂病、作物灰霉病、黑胫病、根腐病、白粉病等具有优于或相当于对照化学农药的防效，该微乳剂不含任何有毒有机溶剂，药效好，生产成本低，对作物及环境安全。

一种烟草西柏烷二萜微乳剂的制备方法，采用以下配方：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物6-8％、乙醇15-20％、脂肪醇聚氧乙烯醚15-20％、十二烷基苯磺酸钠5-8％、正丁醇5-8％、水补足；

制备方法包括以下步骤：

(1)制备油相：将烟草西柏烷二萜提取物、乙醇、脂肪醇聚氧乙烯醚、正丁醇按以上比例混合，以60-80r/min转速搅拌溶解后，继续搅拌25-40min；

(2)制备水相：将十二烷基苯磺酸钠加入到水中，搅拌溶解；

(3)搅拌条件下，将油相缓慢加入水相中，混合完成后，以60-80r/min转速继续搅拌25-40min，即得到烟草西柏烷二萜微乳剂。

进一步的，所述配方为：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物7-8％、乙醇18-20％、脂肪醇聚氧乙烯醚18-20％、十二烷基苯磺酸钠6-7％、正丁醇6-7％、水补足。

进一步的，所述配方为：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物8％、乙醇20％、脂肪醇聚氧乙烯醚20％、十二烷基苯磺酸钠5％、正丁醇6.67％、水补足。

进一步的，所述水为自来水。

本发明还提供上述烟草西柏烷二萜微乳剂在植物病害防治中的应用，所述植物病害为黑腐皮壳菌Valsa mali引起的苹果腐烂病、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的作物灰霉病、疫霉菌Phytophthora引起的茄科作物病害、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的根腐病，链格孢菌Alternaria alternate(Fries)Keisslar引起的烟草赤星病、白粉病菌Sphaerotheca fuliginea或Erysiphe cichoracearum引起的作物白粉病。

进一步的，所述疫霉菌引起的茄科作物病害为黑胫病、晚疫病。

进一步的，所述烟草西柏烷二萜微乳剂用于防治苹果树腐烂病、烟草黑胫病、三七根腐病、辣椒晚疫病、辣椒灰霉病、烟草赤星病及梢瓜白粉病。

进一步的，所述烟草西柏烷二萜微乳剂中有效成分西柏三烯二醇的浓度为150-400mg/kg。

本发明制备的微乳剂，以烟草西柏烷二萜提取物为原料，仅用乙醇作为溶剂，并选择无毒或低毒乳化剂及助乳化剂作为助剂，该配方工艺简单，便于产业化生产，对环境没有污染。

烟草西柏烷二萜微乳剂用于防治苹果树腐烂病、烟草黑胫病、三七根腐病、辣椒晚疫病、辣椒灰霉病、烟草赤星病及梢瓜白粉病，能够达到与化学药剂相当的防效，丰富了我国植物源杀菌剂类型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1烟草西柏烷二萜的抑菌实验

参考ZL 201711082390.1、ZL 201510382060.9方法，以烟花、不适用等级烟叶或烟杈为原料，以80-100％乙醇作为提取溶剂，溶剂用量为提取原料体积的1.2-1.5倍，常温、常压下振荡提取或连续流动提取，提取时间2min-3min，连续提取2-3次，将提取液减压浓缩，浓缩液在2℃-8℃条件下静置，浓缩液中出现絮状沉淀，加入活性炭，搅拌吸附5min，过滤后浓缩，获得烟草西柏烷二萜提取物浸膏。

(1)西柏烷二萜对不同病原真菌抑菌率测定

将烟草西柏烷二萜提取物浸膏用95％的乙醇配制成2.56mg/mL的溶液，与培养基以1:100的体积比混合均匀，制成含药培养基，培养基中烟草西柏烷二萜的浓度为25.6μg/mL，以同体积的95％的乙醇做为空白对照。待培养基凝固后，接入生长状态一致的直径为5mm的菌饼，于28℃左右培养，待对照平板菌圈至平板约2/3处时，用十字交叉法测量菌圈直径，计算抑菌率，计算方法如下

菌圈直径＝实际测得直径-5(mm)

抑菌率＝100*(处理组菌圈直径-对照组菌圈直径)/对照组菌圈直径。

(2)西柏烷二萜对不同病原真菌抑菌EC50值测定

根据西柏烷二萜在25.6μg/mL浓度条件下对不同病原真菌菌丝生长抑制率的测定结果(表1)，选择抑制率在60％以上的病原真菌，并用95％的乙醇将西柏烷二萜配制成0.64、1.28、2.56、3.43、5.12、6.86mg/mL溶液，将以上西柏烷二萜溶液分别与培养基以1:100的体积比混合均匀，按以上方法测定不同西柏烷二萜浓度条件下对不同病原真菌的抑制率，建立烟草西柏烷二萜浓度与其对菌丝生长抑制率对数的线性方法，通过线性方程，计算西柏烷二萜对不同病原真菌菌丝生长抑制率为50％时的浓度(EC50)，结果见表1

表1西柏烷二萜(26μg/mL)对不同病原真菌抑制活性

由表1看出，烟草西柏烷二萜对不同植物病原真菌菌丝生长的抑制率存在较大差异。其中，苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Hemada)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、疫霉菌(Phytophthora parasitica、Phytophthora infestans等)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有较好抑制作用，其EC50值较小。

因此，在烟草西柏烷二萜杀菌剂开发过程中，重点选择黑腐皮壳菌引起的腐烂病、灰葡萄孢菌引起的作物灰霉病、疫霉菌引起的茄科作物病害(烟草黑胫病、辣椒晚疫病等)、尖孢镰刀菌引起的作物根腐病害作为防治目标。

实施例2制备烟草西柏烷二萜微乳剂

将烟草西柏烷二萜提取物、乙醇、脂肪醇聚氧乙烯醚、正丁醇按表1所述的比例混合，以60-80r/min转速搅拌溶解后，继续搅拌30min；将十二烷基苯磺酸钠加入到水中，搅拌溶解；搅拌条件下，将油相缓慢加入水相中，混合完成后，以60-80r/min转速继续搅拌30min，即得到烟草西柏烷二萜微乳剂。

表2烟草西柏烷二萜微乳剂配方

获得烟草西柏烷二萜微乳剂的质量参数如下：

表3 8％烟草西柏烷二萜微乳剂质量技术指标

质量技术指标	测定值	检测方法
			透明温度范围	-4℃-60℃	液氮及水浴方法
乳液稳定性(稀释100倍，30min)	合格	GB/T1603
			PH值	7.0	GB/T1601
低温稳定性(0℃±1℃下贮存7d)	合格	GB/T19137,
			热贮稳定性(54℃±2℃下贮存14d)	合格	GB/T19136

实施例3西柏烷二萜微乳剂的抑菌活性

分别以草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果腐烂病菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae(Breda de Hean)Tucker)为供试菌株，采用体外培养基菌丝生长速率法，分别测定烟草西柏烷二萜及其微乳制剂对供试菌株的活性，建立烟草西柏三烯二醇浓度与其对菌丝生长抑制率对数的毒力方法，根据毒力方程，计算西柏三烯二醇对不同病原真菌菌丝生长抑制率为50％时的浓度(EC₅₀)。

根据试验结果，烟草西柏三烯二醇抑制草莓灰霉病菌、苹果腐烂病菌、烟草黑胫病菌菌丝生长的EC₅₀值分别为：10.75、10.64、23.77，将烟草西柏烷二萜提取物制备成微乳剂后，其EC₅₀值大大降低，分别为：3.94、2.74、5.4，因此，该工艺制备获得的微乳剂，显著提高了烟草西柏烷二萜的抑菌活性。

表4微乳剂制备前后西柏烷二萜抑菌活性比较

实施例4西柏烷二萜微乳剂在作物真菌病害防治中的应用

1.对苹果树腐烂病的田间防治

1.1试验条件

(1)试验对象、作物和品种的选择

防治对象为苹果树腐烂病，有性世代(Valsa mali)，无性世代(Cytosporamandshurica)。试验树为26年生苹果津轻品种。

(2)环境条件

试验在辽宁省兴城市中国农科院果树所砬子山试验农场进行，试验园为山地，该地区年平均气温9.0℃；8月份气温平均23.3℃；1月份气温平均-5.5℃；全年大于10℃积温为3497.2℃；试验园管理条件一般，树势中庸，株行距6m×6m。

1.2试验设计与小区安排

(1)供试药剂试验设计

本试验以3％甲基硫菌灵糊剂(thiophanate_methyl，山西北方果康宝农药有限公司生产。)为药剂对照，清水作为空白对照，烟草西柏烷二萜微乳剂及3％甲基硫菌灵糊剂稀释倍数设置如下表：

表5供试药剂试验设计

(2)小区排列

逐株检查标记病疤并刮除腐烂部位，每8块病疤以上作为一个试验小区，试验共设7个处理，每个处理4个试验小区，共计28个试验小区，随机排列。

表6试验小区排列

处理-重复	处理-重复	处理-重复	处理-重复
				3-3	4-2	6-1	5-4
6-3	7-2	1-1	4-4
				5-3	3-2	2-1	1-4
7-3	5-2	4-1	2-4
				4-3	6-2	7-1	3-4
2-3	1-2	3-1	7-4
				1-3	2-2	5-1	6-4

1.3施药方法

从试验树上选没刮过的新生病疤，按常规方法刮治后，统一编号，记录编号病疤行株号及所在位置。对编号病疤随机区组设计。然后，按各处理的药剂及浓度(空白对照喷清水)，对刮治后的病疤用3-4cm宽毛刷进行涂药，于2019年4月18日涂药1次。生长期常规管理。

1.4调查、记录和测量方法

共调查2次，第一次于2019年4月18日进行施药前小区病疤基数调查；第二次于2020年春季发病扩展后(3月21日)调查次年防治效果和病疤愈合宽度。按农药田间药效试验准则国家标准(GB/T 17980.116-2004)要求，调查各小区全部试验病疤，记录复发块数，药害情况及其对其它生物的影响，第二年春季调查，小区病疤复发率和对病疤复发的防治效果，测量每小区前3块病疤两侧愈合组织最宽部位的愈合宽度。

药效计算方法

1.5结果

由下表看出，烟草西柏烷二萜微乳剂(稀释2倍-10倍)，对苹果树腐烂病疤复发有一定的防治效果，无药害发生，且有促进病疤愈合作用，对有益生物无不良影响。供试药2倍防效与对照药3％甲基硫菌灵糊剂13.3倍防效相当，差异不显著；供试药4倍、6倍防效不如对照药3％甲基硫菌灵糊剂13.3倍防效，差异不显著；供试药10倍防效不如对照药3％甲基硫菌灵糊剂13.3倍防效，差异显著。

表7烟草西柏烷二萜微乳剂防治苹果树腐烂病试验结果

生物统计方法：根据小区防效转换值，用DMRT法进行显著性测定。

2.对烟草黑胫病的盆栽防效试验

2.1研究材料和方法

(1)试验材料

烟草黑胫病病原真菌：Phytophthora parasitica var.nicotianae(Breda deHean)Tucker

供试烟草品种为红花大金元。

供试药剂为8％烟草西柏烷二萜微乳剂；58％甲霜·锰锌水分散粒剂。

(2)试验设计

西柏烷二萜微乳剂共设3个浓度：处理1(T1，100/mg/kg)、处理2(T2，200/mg/kg)、处理3(T3，4 00/mg/kg)，处理4为化学药剂对照(58％甲霜·锰锌，1100mg/kg)，以清水作为阴性对照。每个处理4次重复，每个重复15株，随机区组排列。

(3)试验方法

菌谷培养：将500g谷子加水1L煮开至半数谷粒呈开花状，装入500mL三角瓶，于120℃灭菌30min，作为菌谷备用。无菌条件下取1cm×1cm烟草黑胫病菌菌块转接到含有菌谷的三角瓶内，28℃培养14d备用。

药剂灌根：先对植株根部进行药剂保护处理，不同浓度的供试药剂灌根(从茎基部灌淋至根部)，每株20ml药液；24h后接病原菌，常规防治药剂58％甲霜·锰锌为标准药剂对照。

病原真菌接种：将培养18d的菌谷接种烟株的茎基部,接种后立即覆土并保湿,使病圃内土壤处于饱和或过饱和状态。温室鉴定时,将苗龄50d前后的烟苗移栽至温室病圃,移栽后14d接种菌谷,接种量为0.5g/株。

(4)调查方法

定义施药当天为施药后0d，盆栽试验共施药一次。将烟草幼苗置于玻璃温室中(温度27±1℃，相对湿度95％)。于施药0d、7d、14d、21d观察记录作物生长情况，记录烟烟草黑胫病病级，计算烟草黑胫病的病情指数和杀菌剂的防治效果。药效计算公式如下：

病情指数＝[∑(各病级株数×病级数)/(最高病级×总株数)]×100；

防治效果(％)＝(对照发病率﹣处理发病率)/对照发病率×100。

(5)病害分级标准

按烟草行业标准GBT23222-2008进行病害分级，

0级：全株无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的三分之一，或三分之一以下叶片凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围的三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。

5级：茎部病斑超过茎围的二分之一，但未全部环绕茎围，或二分之一至三分之二叶片凋萎。

7级：茎部病斑全部环绕茎围，或三分之二以上叶片凋萎。

9级：病株基本枯死。

2.2结果

由下表可知，供试药剂对烟草黑胫病具有较好防效。药后7d调查表明，清水空白对照CK的病情指数为11.53，发病率为30.43％；甲霜·锰锌药剂对照T4的病情指数为5.32，发病率为14.58％，防治效果为53.82％；处理T3的病情指数最低，防效最好，病情指数为3.70，发病率为8.51％，相比清水空白对照CK防效达75.90％，与常用药剂甲霜锰锌相比，防效提高了41.04％。

药后12d调查表明，清水空白对照CK的病情指数为22.18，发病率为36.96％；甲霜·锰锌药剂对照T4的病情指数为10.88，发病率为31.25％，防治效果为50.94％；处理T3的病情指数最低，防效最好，病情指数为2.78，发病率为8.51％，相比清水空白对照CK防效达83.30％，与常用药剂甲霜锰锌相比，防效提高了63.52％。

表8西柏烷二萜微乳剂对烟草黑胫病的防效

3.对三七根腐病的盆栽防效

3.1材料与方法

供试药剂及菌株：红大烟花提取物制备的杀菌剂，三七根腐病致病真菌—尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。

试验设计：试验设置与云南省昆明市海口镇云南省农科院三七试验基地，采用钢架棚避雨模式，以盆栽方式(直径×高33×20cm)，3株/盆三七苗。以农用链霉素150ug/mL灌根作为阳性为对照，红大烟花提取物杀菌剂设置2个浓度梯度处理(T1、T2西柏三烯二醇的浓度分别为：150、300ug/mL)，以清水处理为对照，每个处理10盆，3次重复。

3.2药剂施用

供试药剂根据要求浓度(见下表)稀释完成后，采用灌根的方式施用，要求20mL/株，60mL/盆，灌根时，要求从三七茎基部淋至根部。每株三七苗用20mL(60mL/盆)，阴性对照以清水代替药剂进行灌根。

3.3接种病原菌

(1)于5月添加烟草西柏烷二萜制剂1次，1天后将真菌接种到对应三七处理植株，后按月添加烟草西柏烷二萜微乳剂制剂，累计添加制剂8次；

(2)避雨栽培采用人工浇水，浇水不采用喷淋的方法；

(3)试验处理组不施用任何化学农药，如遇根腐或严重植株病害采用清除病株的方法；常规对照管理CK(阳性对照)根据植株发病情况，并做好相关的田间工作记录。

3.4田间病害发生调查

于发病前期和初期调查病情基数，之后每次施入制剂后隔15d调查1次病情发展情况，然后根据调查结果计算各个处理的病情指数和防治效果。

3.5结果

试验实施过程中，分别于2019年5月10月、6月8日、7月3日进行病原真菌(Fusariumoxysporum)接种，并进行药剂施用试验，7月23日三七植株开始明显发病并进行病情调查，之后，分别在8月10日、9月4日、9月27日继续施药并调查发病状况，最后一次调查发病情况为10月27日。不同处理对三七根腐病害的防效见下表。

由下表看出，烟草西柏烷二萜浓度分别在150ug/mL、300ug/mL条件下，对三七根腐病的接种防效均优于农用链霉素。

表9西柏烷二萜微乳剂对三七根腐病接种防效

4.对辣椒晚疫病的盆栽接种防效

4.1研究材料和方法

(1)试验材料

供试辣椒品种为青阳。

辣椒晚疫病致病菌：(Phytophthora capsici Leonian)

(2)试验设计

西柏烷二萜微乳剂共设4个浓度：T1：100/mg/kg)、T2：200/mg/kg、T3：400/mg/kg、T4：600/mg/kg，化学药剂对照(58％甲霜·锰锌，1100mg/kg)，以清水作为阴性对照。每个处理4次重复，每个重复15株，随机区组排列。

本试验所有浓度处理均分别设置保护试验与治疗试验，保护试验是先施药病原真菌接种，治疗试验是先接种病原真菌，24小时后在进行施药。

(3)试验方法

将培养的苗龄50d前后的辣椒幼苗移栽至9cm的花盆中，至长出5-6片真叶时，进行病原菌接种及药剂灌根。

菌谷培养及接种、药剂灌根方法与烟草黑胫病同。

(4)调查方法：与烟草黑胫病同。

4.2结果

根据试验结果，在100-400mg/L范围内，烟草西柏烷二萜微乳剂对病原真菌Phytophthora capsici Leonian引起的晚疫病害具有较好的治疗和保护的双重效果，400mg/L浓度效果最好，与化学药剂甲霜锰锌效果相当。但是，在浓度600mg/L条件下，防效反而降低。因此，辣椒晚疫病防治适宜浓度200-400mg/L。

表10西柏烷二萜微乳剂对烟草黑胫病的保护防效

表11西柏烷二萜微乳剂对辣椒疫霉的治疗防效

5.对辣椒灰霉病的防效

5.1试验材料与方法

(1)供试材料

供试辣椒：青阳辣椒，种植于京博农化科技有限公司生测温室大棚(上午10:30，温度24℃，多云；试验期间白天温度平均在22℃，夜间平均温度在10℃左右)，开花诱导发病，灰霉病害盛发期。

供试药剂：8％西柏烷二萜微乳剂，施华冠(50％氟啶胺SC，京博农化科技有限公司)，美辰(50％啶酰菌胺-美辰，京博农化科技有限公司)。

(2)试验设计

西柏烷二萜微乳剂共设4个浓度处理：T1：106/mg/kg)、T2：160/mg/kg、T3：213/mg/kg，化学药剂对照：①50％氟啶胺SC稀释1000倍，500mg/kg；②50％啶酰菌胺1250倍，500mg/kg。以清水作为阴性对照。

(3)试验方法

2020年10月1日，上午10：30，采用叶面喷雾方法进行药剂喷施。药前调查一次病情，药后7d、15d观察作物生长情况并调查病情。根据以下标准对病害进行分级。

0级：无病斑。

1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下。

3级：病斑面积占整个叶面积的6-10％。

5级：病斑面积占整个叶面积的11-20％。

7级：病斑面积占整个叶面积的21-40％。

9级：病斑面积占整个叶面积的40％以上。

5.2结果

表12药效调查表

以上处理在辣椒灰霉病发病期进行喷雾处理，试验期间生长正常，均未出现药害产生；试验处理15天调查发病情况，均有一定的防治效果：

(1)试验植株灰霉病的发病率在50％以上，病害达到9级，7天后跟进试验，各处理针对辣椒灰霉病无明显效果，15天后可以看出经药剂处理后相对具有一定效果。

(2)8％西柏烷二萜微乳剂施用浓度106mg/kg效果一般，160-213mg/kg单独使用整体效果与化学对照药剂施华冠(50％氟啶胺SC)、美辰(50％啶酰菌胺-美辰)400-500mg/kg防效基本一致，无显著差异。

结论：8％西柏烷二萜微乳剂在160-213mg/kg整体效果与化学药剂施华冠(50％氟啶胺SC)、美辰(50％啶酰菌胺-美辰)400-500mg/kg防效基本一致，无显著差异。

6.对烟草赤星病的大田防效

6.1材料与方法

(1)材料与方法

试验田位于山东省诸城洛庄试验站。

供试药剂：西柏烷二萜微乳剂

(2)田间试验设计

采用随机区组进行田间试验，试验田共6行，每行300烟株。田间施药设置三个有效成分浓度T1(100ppm)、T2(200ppm)、T3(400ppm)，以清水为空白对照，常规用药(菌核净)为阳性对照，共5个处理，每个处理3次重复，共12个小区。每处理6行，其中CK-1共30株烟，其他各处理均25株烟。

(3)田间调查

采用对角线5点取样法进行调查。每点选取2株有代表性的烟草，每株烟草调查所有完整烟叶(从上往下数)，剔除萎蔫、破损烟叶。分别于2020年7月29日、8月6日和8月15日施药，共3次。在第3次施药后7d调查目标烟叶赤星病的发病情况。防治效果的计算方法如下：

防治效果(％)＝(对照发病率﹣处理发病率)/对照发病率×100。

(4)病害分级标准

按烟草行业标准GBT23222-2008进行病害分级，

0级：全株无病；

1级：病斑面积占叶片面积的1％以下；

3级：病斑面积占叶片面积的2～5％；

5级：病斑面积占叶片面积的6～10％

7级：病斑面枳占叶片面积的11～20％

9级：病斑面积占叶片面积的21％以上。

6.2结果

根据试验结果，在有效成分100-400mg/L范围内，西柏烷二萜微乳剂对烟草赤星病均具有较好防效，并优于对照化学药剂多菌灵。随施用浓度增加，西柏烷二萜对烟草赤星病的防效呈明显增加的趋势，浓度400mg/L条件下，防效达74.28％。

表13西柏烷二萜微乳剂对烟草赤星病的防效

7.对梢瓜白粉病田间防效

7.1试验材料与方法

(1)供试材料

供试梢瓜：地方梢瓜品种，种植于山东滨州博兴市董杨村，田间发病，白粉病盛发期，白粉病的发病率在50％以上，病害达到9级以上。

供试药剂：8％西柏烷二萜微乳剂，30％肟菌酯悬浮剂(海鸥斯，杭州宇龙化工有限公司)，25％乙嘧酚悬浮剂(江西益禾化工股份有限公司)。

(2)试验设计

西柏烷二萜微乳剂共设4个浓度处理，不同处理西柏三烯二醇浓度如下：T1：16mg/kg)、T2：27mg/kg、T3：54mg/kg、T4：106mg/kg)、T5：160mg/kg，化学药剂对照：①30％肟菌酯悬浮剂稀释5000倍，60mg/kg；②50％啶酰菌胺5000倍，50mg/kg。以清水作为阴性对照。

(3)试验方法

2020年9月10日，上午10：30，采用叶面喷雾方法进行药剂喷施。药前调查一次病情，药后7d观察作物生长情况并调查病情。根据以下标准对病害进行分级。

6.2结果

表14药效调查表

7个药剂处理对梢瓜白粉病发病期进行喷雾处理，试验期间生长正常，均未出现药害产生；试验处理7天调查发病情况，均有一定的防治效果：

(1)施药7天后，明显看出经过西柏烷二萜微乳剂浓度160mg/kg药剂处理后发病植株发病比较重的白色霉层消失，试验效果相对明显，并且与对照化学药剂25％乙嘧酚悬浮剂(有效成分60mg/kg)、30％肟菌酯悬浮剂(有效成分50mg/kg)防效相当，没有显著差异。

(2)但西柏烷二萜微乳剂浓度在16-106mg/kg时效果较差，仍有部分白色霉层，约占叶片面积的6-40％及以上，病害等级约为3-9级。

(3)对照药剂25％乙嘧酚悬浮剂30％肟菌酯悬浮剂用量在3g(有效成分)/15L时相对西柏烷二萜微乳剂30ml/15L效果相对其他处理效果较好，但三个处理间差异性较小。

结论：西柏烷二萜微乳剂有效成分浓度在160mg/kg条件下，对梢瓜白粉病的防效与化学药剂25％乙嘧酚悬浮剂(有效成分60mg/kg)、30％肟菌酯悬浮剂(有效成分50mg/kg)防效相当，没有显著差异。

综上，本发明的西柏烷二萜微乳剂用于防治苹果树腐烂病、烟草黑胫病、三七根腐病、辣椒晚疫病、辣椒灰霉病、烟草赤星病及梢瓜白粉病，能够达到优于或者相当于化学药剂的防效，具有推广应用的价值。

Claims

1.烟草西柏烷二萜微乳剂在植物病害防治中的应用，其特征在于，所述植物病害为黑腐皮壳菌Valsa mali引起的苹果腐烂病、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的作物灰霉病、疫霉菌Phytophthora引起的茄科作物病害、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的根腐病，链格孢菌Alternaria alternate(Fries)Keisslar引起的烟草赤星病、白粉病菌Sphaerotheca fuliginea或Erysiphe cichoracearum引起的作物白粉病；

所述烟草西柏烷二萜微乳剂采用以下配方：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物6-8％、乙醇15-20％、脂肪醇聚氧乙烯醚15-20％、十二烷基苯磺酸钠5-8％、正丁醇5-8％、水补足；

制备方法包括以下步骤：

(2)制备水相：将十二烷基苯磺酸钠加入到水中，搅拌溶解；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述配方为：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物7-8％、乙醇18-20％、脂肪醇聚氧乙烯醚18-20％、十二烷基苯磺酸钠6-7％、正丁醇6-7％、水补足。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述配方为：按重量百分比计，西柏三烯二萜提取物8％、乙醇20％、脂肪醇聚氧乙烯醚20％、十二烷基苯磺酸钠5％、正丁醇6.67％、水补足。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水为自来水。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疫霉菌引起的茄科作物病害为黑胫病、晚疫病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述烟草西柏烷二萜微乳剂用于防治苹果树腐烂病、烟草黑胫病、三七根腐病、辣椒晚疫病、辣椒灰霉病、烟草赤星病及梢瓜白粉病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述烟草西柏烷二萜微乳剂中有效成分西柏三烯二醇的浓度为150-400mg/kg。