CN112703020A - 用于生产接收细胞的支架的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于制备接收细胞的支架的可打印的组合物，按占所述可打印的组合物的重量，其包含约0.3wt％至约3.0wt％的一种或多种胶原蛋白；约5.0wt％至约40.0wt％的一种或多种单体；约0.5wt％至约2.0wt％的光引发剂；以及0wt％至约75wt％的包含质子溶剂的载体；其中在打印时可打印的组合物具有约100微米或更小的分辨率，具有约0.1‑5mm(Dp)和约10‑100mJ/cm2(Ec)的照相速度(Dp/Ec)，并且在干燥后具有至少约5kPa的生坯强度。本技术还包括使用打印的组合物生产接收细胞的三维支架的方法。

Description

用于生产接收细胞的支架的材料和方法
相关申请的交叉引用
本申请利用2018年8月2日提交的第62/713817号美国临时申请的优先权。
技术领域
本技术通常涉及适合用作可打印材料或油墨的组合物和方法。更具体地，而不是通过限制的，本技术涉及适于通过三维打印方法获得接收细胞的三维支架的可打印的组合物和方法。
背景技术
生物支架是在细胞加入之前的三维生物材料，其能够接收活细胞。这种支架用于为细胞提供三维支撑和几何结构。例如，这种生物支架的一个特定用途包括用作功能性人体器官的替代物。这是通过使用猪科(例如猪)来源的器官来完成的，这些器官被去细胞化，然后用相容的人类细胞重新细胞化。然而，猪科来源的支架带来了挑战，例如来自原始猪科细胞、细菌和其他污染物的污染。
虽然三维打印技术可以促进对给定主题定制的三维支架的生产，但目前使用这种打印支架的系统带来了挑战，例如，与植入细胞相容，以及达到足够高的分辨率，以确定支架里的壁或其他特征。
本发明旨在克服这些和其他的缺陷。
发明概述
在一方面，一种用于制备接收细胞的支架的可打印的组合物，按可打印的组合物的重量计算，其包含约0.3wt％至约3.0wt％的一种或多种胶原蛋白；约5.0wt％至约40.0wt％的一种或多种单体；约0.5wt％至约2.0wt％的光引发剂；以及0wt％至约75wt％的包含质子溶剂的载体，其中可打印的组合物在打印时显示约100微米或更小的分辨率，在打印时显示约0.1-5mm(Dp)和约10-100mJ/cm2(Ec)的照相速度(photo speed)(Dp/Ec)，并且在干燥后显示至少约5kPa的生坯强度。
在本技术的一个相关方面，提供一种用于制备接收细胞的三维支架的方法，所述方法使用本文在任意实施方案中描述的可打印的组合物。所述方法包括使用本文任意实施方案的可打印的组合物来制造接收细胞的三维支架。
在本技术的另一相关方面，提供了一种用于生产接收细胞的三维支架的方法，所述方法包括沉积如本文在任意实施方案中所述的可打印的组合物的层到表面以获得沉积层，辐照沉积层，以及重复沉积和辐照步骤，直到沉积层形成接收细胞的三维支架，其中可打印的组合物包括胶原蛋白，其中胶原蛋白占可打印的组合物重量的约0.3％到约3.0％；单体；光引发剂以及载体。可打印的组合物可包括如本文在任意实施例中所述的可打印的组合物。
附图说明
图1显示了描述用于制备本技术的接收细胞的三维支架的示例性方法的流程图。
图2显示了描述用于制备本技术的接收细胞的三维支架的示例性方法的流程图，该方法包括将支架与低pH溶液接触。
图3显示了人类上皮性肺癌细胞在配方B和配方C的三维支架中48小时的生存能力。
图4显示了根据配方H的可打印组合物打印的三维支架。
详细说明
下文描述各种实施方案。应当注意的是，特定实施方案的目的不是对本文所讨论的更广泛的方面进行详尽的描述或限制。结合特定实施方案描述的一个方面不一定限于该实施方案，并且可以与任何其他实施方案一起实施。
以下术语贯穿始终，定义如下。
如本文所用，“约”将由本领域的普通技术人员理解，并且在某种程度上取决于使用它的上下文。如果本领域的普通技术人员不清楚术语的使用，则鉴于其使用的上下文，“约”将意味着高达特定术语的正负10％。
术语“一个”以及“所述”和类似的引用在描述元素的上下文中(特别是在下文权利要求的上下文中)的使用应被解释为包括单数和复数，除非本文中另有说明或上下文明确矛盾。除非本文另有说明，否则本文中引用的值的范围仅旨在作为单独引用该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。本文中描述的所有方法可以任何合适的顺序来执行，除非本文中另有指示或以其他方式与上下文明确矛盾。除非另有说明，否则使用本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)仅旨在更好地说明实施方案，并且不对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何非限制的元素是必要的。
如本文所用，术语“胶原蛋白”是指结缔组织的主要蛋白质，其具有高抗拉强度，并且在大多数多细胞生物中发现。胶原蛋白是一种主要的纤维蛋白，也是基底膜中的非纤维蛋白。它含有丰富的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸。胶原蛋白遍布全身，至少有12种类型(I-XII型)。
如本文所用，术语“功能化胶原蛋白”是指经修饰以包括附着于胶原蛋白的一个或多个单体亚基的胶原蛋白。附着的单体亚基允许功能化胶原可光固化，即单体亚基在暴露于紫外线(UV)、紫色或蓝色辐射时聚合。
如本文所用，术语“非功能化胶原蛋白”是指未经修饰以包括一个或多个单体亚基的胶原蛋白。非功能化胶原蛋白在暴露于紫外线、紫色或蓝色辐射时可能不会聚合。
如本文所用，术语“光碱生成剂”是指通过提高可打印的组合物的pH值来响应辐射的添加剂。在一些实施方案中，可打印的组合物可具有初始酸性pH，其随后响应暴露于UV、紫色或蓝色辐射而基本中和。
如本文所用，术语“吸收剂”是指吸收辐射以控制“固化深度”的添加剂。其具有提高固化过程分辨率的优点。吸收剂可以是染料，如柠檬黄。
本技术通过生产方法(如3D打印)提供适于制备具有高分辨率的接收细胞的三维支架的可打印的组合物。具体而言，可打印的组合物适于立体平板打印。
本技术提供了可打印的组合物和从可打印的组合物制备接收细胞的三维支架的方法。在某些方面，本技术涉及可打印的组合物。在另一方面，本技术涉及从可打印的组合物制备三维结构的方法。
一方面，一种用于制备接收细胞的支架的可打印的组合物，按可打印的组合物的重量计算，其包含约0.3wt％至约3.0wt％的一种或多种胶原蛋白；约5.0wt％至约40.0wt％的一种或多种单体；约0.5wt％至约2.0wt％的光引发剂以及0wt％至约75wt％的包含质子溶剂的载体，其中可打印的组合物在打印时显示约100微米或更小的分辨率，在打印时显示约0.1-5mm(Dp)和约10-100mJ/cm2(Ec)的照相速度(Dp/Ec)，并且在干燥后显示至少约5kPa的生坯强度。
术语“分辨率”指从三维(3D)打印系统沉积时可打印的组合物的层厚度。可打印的组合物可具有约100微米或更小的分辨率。可打印的组合物可具有小于约100微米、小于约90微米、小于约80微米、小于约70微米、小于约60微米、小于约50微米、小于约40微米、小于约30微米、小于约20微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约1微米的分辨率，或包括和/或介于任意两个值之间的任意范围。例如，在本文的任何实施方案中，可打印的组合物可具有小于约100微米的分辨率，并且可优选具有小于约1微米的分辨率。
如本文所用，术语“照相速度”是指固化深度与曝光能量之比，并用于测定可打印的组合物的Dp/Ec。“Dp”(mm)是指可打印的组合物的固化深度，“Ec”(mJ/cm2)是指将可打印的组合物从液体转化为可打印的组合物表面上的凝胶阶段所需的临界能量。在本文的任何实施方案中，固化深度(Dp)可包括但不限于从约0.1mm到约5mm的深度。例如，合适的固化深度(Dp)可包括约0.1mm、约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1.5mm、约2.0mm、约2.5mm、约3.0mm、约3.5mm、约4.0mm、约4.5mm、约5.0mm，或包括和/或介于任意两个值之间的任何范围。在本文的任何实施方案中，曝光能量可包括但不限于约10mJ/cm2至约100mJ/cm2的量。例如，合适的曝光能量值包括约10mJ/cm2、约15mJ/cm2、约20mJ/cm2、约25mJ/cm2、约30mJ/cm2、约35mJ/cm2、约40mJ/cm2、约45mJ/cm2、约50mJ/cm2、约55mJ/cm2、约60mJ/cm2、约65mJ/cm2、约70mJ/cm2、约75mJ/cm2、约80mJ/cm2，约85mJ/cm2、约90mJ/cm2、约95mJ/cm2、约100mJ/cm2，或包括和/或介于任意两个值之间的任何范围。
术语“生坯强度”是指最初暴露于固化辐射时可打印的组合物的初始固化硬化强度。固化硬化强度可以用弹性模量和断裂前伸长率等指标来量化。在干燥或固化之后，可打印的组合物可展示至少约5kPa、约10kPa、约20kPa、约30kPa、约40kPa、约50kPa、约60kPa、约70kPa、约80kPa、约90kPa、约100kPa、约110kPa、约120kPa、约130kPa、约140kPa、约150kPa、约160kPa、约170kPa、约180千帕、约190千帕、约200千帕的生坯强度，或包括和/或在这些值中任何两个值之间的任何范围。例如，在本文的任何实施方案中，固化后，可打印的组合物可表现出约5kPa至约200kPa、约5kPa至约100kPa、约5kPa至约50kPa、约5kPa至约25kPa的生坯强度，或可优选表现出约5kPa至约10kPa的生坯强度。
在本文的任意实施方案中，一个或多个胶原蛋白可包括用单体亚基功能化的胶原蛋白。合适的单体亚基包括水溶性单体。例如，在本文的任意实施方案中，水溶性单体亚基可包括一种或多种丙烯酸单体。合适的丙烯酸单体包括丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)、甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)、丙烯酸羟乙基酯(HEA)、具有硫醇、胺、环氧化物、叠氮基、炔烃或N-羟基丁二酰亚胺反应基团的单体或其两个或多个的组合。在本文的任意实施方案中，水溶性单体亚基可包括其他不饱和单体。合适的单体包括乙烯基单体、由马来酸酐或酸形成的单体、丙烯酰吗啉(ACMO)、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、N-乙烯基己内酰胺(V-CAP)等及其组合。
一种或多种胶原蛋白可包括第一胶原蛋白和第二胶原蛋白的混合物，其中第一胶原蛋白为如本文在任意实施方案中所述的功能化胶原蛋白，第二胶原蛋白是非功能化胶原蛋白。在本文的任意实施方案中，第一胶原蛋白和第二胶原蛋白可基于胶原蛋白的干重以至少约99:1到约1:99的重量比存在。例如，在本文的任意实施方案中，第一胶原蛋白和第二胶原蛋白的重量比可包括但不限于至少约99:1、约50:1、约25:1、约10:1、约5:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:5、约1:10、约1:25、约1:50、约1:99的重量比，或包括和/或介于任意两个值之间的任何范围。
一种或多种胶原蛋白可来自哺乳动物。合适的哺乳动物来源包括但不限于马、犬、猪、牛、猫、山羊、绵羊、鼠、人或其两种或两种以上的组合。例如，在本文的任意实施方案中，一种或多种胶原蛋白可以是牛胶原蛋白、猪胶原蛋白或人胶原蛋白。
在本文的任意实施方案中，一种或多种胶原蛋白可包括重组胶原蛋白。如本文所述，术语“重组胶原蛋白”指从重组获得的胶原蛋白。重组来源可包括从植物、细菌、病毒、真菌或类似物产生的重组哺乳动物胶原蛋白以及其两种或多种的组合。例如，在本文的任意实施方案中，重组胶原蛋白可包括重组人胶原蛋白、重组牛胶原蛋白、重组猪胶原蛋白或其两种或两种以上的组合。在一些实施方案中，重组来源包括从植物(包括但不限于烟草)产生的重组哺乳动物胶原蛋白。在一些实施方案中，可打印的组合物可包括以一种或多种丙烯酸单体功能化的重组胶原蛋白，所述丙烯酸单体包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、具有硫醇、胺、环氧化物、叠氮基、炔烃或N-羟基丁二酰亚胺反应基团的单体，或其两个或两个以上的组合。
一种或多种胶原蛋白可包括任何类型的胶原蛋白。例如，在本文的任意实施方案中，一种或多种胶原蛋白可以是I型胶原蛋白。Ⅰ型胶原存在于大多数结缔组织中，是生物体内最丰富的胶原蛋白类型。体内90％以上的胶原蛋白为Ⅰ型胶原。
在本文的任意实施方案中，一种或多种胶原蛋白的可占可打印的组合物的重量的约0.3质量百分比(wt％)到约3.0wt％。因此，所述一种或多种胶原蛋白可包括约0.3wt％、约0.4wt％、约0.5wt％、约0.6wt％、约0.8wt％、约0.9wt％、约1.0wt％、约1.5wt％、约2.0wt％、约2.5wt％、约3wt％的重量、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。例如，在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括一种或多种胶原蛋白，其重量占可打印的组合物的量约0.3wt％至约3.0wt％、约0.5wt％至约3.0wt％或约0.3wt％至约0.9wt％。在一些实施方案中，可打印的组合物可包含约0.5wt％至约3.0wt％的重组胶原蛋白。在一些实施方案中，可打印的组合物可包括源自哺乳动物的约0.3wt％至约0.9wt％胶原蛋白。
可打印的组合物包括一种或多种单体。例如，在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括丙烯酸单体。合适的单体包括但不限于N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)、甲基丙烯酸2-羟乙基酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯、聚己内酯三甲基丙烯酸酯、或其两种或两种以上的混合物。在一些实施方案中，单体可为N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)。
一种或多种单体可占可打印的组合物的重量约5.0wt％到约40.0wt％。合适的量包括但不限于约5.0wt％、约10wt％、约15wt％、约20wt％、约25wt％、约30wt％、约35wt％、约40wt％、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。例如，在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括约10wt％至约40wt％、约15wt％至约40wt％、约20wt％至约40wt％或约30wt％至约40wt％的一种或多种单体。
可打印组合物包括光引发剂。光引发剂是用于至少聚合和/或交联单体辐射活化催化剂(即，暴露于UV、紫色或蓝色辐射时活化)。合适的光引发剂可包括但不限于2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙苯酮、乙基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基膦酸盐、苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦或其两种或更多种的组合。例如，在本文的任意实施例中，光引发剂可包括二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦。
光引发剂可占可打印的组合物的重量约0.5wt％到约2.0wt％。合适量包括但不限于约0.5wt％、约0.6wt％、约0.7wt％、约0.8wt％、约0.9wt％、约1.0wt％、约1.2wt％、约1.5wt％、约1.8wt％、约2.0wt％、或包括和/或在这些值中的任何两个之间的任何范围。例如，在本文的任意实施方案中，可打印的组合物包括约0.5wt％至约2.0wt％、约0.7wt％至约1.8wt％、约1wt％至约1.5wt％的光引发剂。
本技术的可打印的组合物包括包含质子溶剂的载体。本文所用的质子溶剂包括但不限于水、醇(例如甲醇(CH3OH)、乙醇(EtOH)、异丙醇(iPrOH)、三氟乙醇(TFE)、丁醇(BuOH)、乙二醇、丙二醇)、羧酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、戊酸、月桂酸、硬脂酸、脱氧胆酸、谷氨酸、葡萄糖醛酸)、氨(NH3)、一级氨基化合物(例如甲胺、乙胺、丙胺)、二级氨基化合物(例如二甲胺、二乙胺、二(正丙胺)或其任何两种或两种以上的混合物。因此，在本文的任意实施方案和方面中，质子溶剂可包括醇、羧酸、伯氨基化合物、仲氨基化合物、水、或其任何两种或更多种的混合物。在本文的任意实施方案中，质子溶剂可包括水，例如去离子水。可打印的组合物中的载体量可为0wt％、约5wt％、约10wt％、约15wt％、约20wt％、约25wt％、约30wt％、约35wt％、约40wt％、约45wt％、约50wt％、约55wt％、约60wt％、约65wt％、约70wt％、约75wt％、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。具体而言，载体中的水量可为约5wt％、约10wt％、约15wt％、约20wt％、约25wt％、约30wt％、约35wt％、约40wt％、约45wt％、约50wt％、约55wt％、约60wt％、约65wt％、约70wt％、约75wt％、约80wt％、约85wt％、约90wt％、约95wt％、约99wt％、或包括和/或介于这两个值之间的任何范围。
可打印的组合物包括含有水的载体。所述载体可进一步包括水溶性丙烯酸单体。例如，在本文的任意实施方案中，水溶性丙烯酸单体包括但不限于丙烯酸羧乙酯、聚(亚烷基)(甲基)丙烯酸酯(例如，聚(乙二醇)二丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA))、HEAA、HEMA、HEA、ACMO、NVP、V-CAP、或其两个或更多的组合。所述载体可进一步包括如本文所述的羧酸。例如，在本文的任意实施方案中，羧酸可包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、月桂酸、硬脂酸、脱氧胆酸、谷氨酸、葡萄糖醛酸、或其两种或多种的组合。在特定实施方案中，羧酸可为乙酸。羧酸的浓度可在约5mM到约200mM之间。例如，在本文的任意实施方案中，羧酸的浓度可为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM，约180mM、约190mM、约200mM、或包括和/或在这些值中任何两个值之间的任何范围。
在本文的任意实施方案中，可打印的组合物的pH值可约为2。可打印的组合物的合适pH值可包括但不限于约2、约3、约4、约5、约6、约7或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。
可打印的组合物可进一步包括一个或多个光碱生成剂。合适的光碱生成剂可包括但不限于氨基甲酸酯、O-酰氧基肟、铵盐、磺胺、甲酰胺、硝苯地平、过渡金属络合物、茂金属、氨基酰亚胺或α-氨基酮。例如，在本文的任意实施方案中，光碱生成剂可包括但不限于9-蒽甲基-N,N-二乙基氨基甲酸酯、(E)-1-哌啶-3-(2-羟基苯基)-2-丙烯-1-酮、1-(蒽醌-2-基)乙基咪唑羧酸盐、2-硝基苯基甲基-4-甲基丙烯酰氧基哌啶-1-羧酸盐、1，2-二异丙基-3-[双(二甲氨基)亚甲基]胍-2-(3-苯甲酰基苯基)丙酸盐、1,2-二环己基-4,4,5,5-四甲基双胍正丁基三苯基硼酸盐、(Z)-{[双(二甲氨基)亚甲基]氨基}-N-环己基(环己基氨基)甲铵四(3-氟苯基)硼酸盐、或其两种或多种组合。
在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括功能化胶原蛋白、丙烯酸酯单体、光引发剂、载体和光碱生成剂，其中功能化胶原蛋白包括以甲基丙烯酸酯功能化的胶原蛋白。光碱生成剂可以0wt％到约10wt％的量存在。例如，在本文的任意实施方案中，光基发生器可呈现0wt％、0.01wt％、约0.1wt％、约0.5wt％、约1wt％、约2wt％、约3wt％、约4wt％、约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、约9wt％、约10wt％的量、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。合适量的光碱生成剂包括约0wt％到约10wt％、约0wt％到约9wt％、约0wt％到约7wt％、0wt％到约3wt％、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。
在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括非功能化胶原蛋白、丙烯酸酯单体、光引发剂、载体和光碱生成剂。在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括功能化胶原蛋白、非功能化胶原蛋白、光引发剂、载体和光碱生成剂，其中功能化胶原蛋白包括以甲基丙烯酸酯功能化的胶原蛋白。
可打印的组合物可进一步包括一种或多种吸收剂。例如，在本文的任意实施方案中，吸收剂包括但不限于在约300nm到约450nm之间的波长处具有大于0.1个吸光度单位的吸收剂。例如，在本文的任意实施方案中，吸收剂可在约300nm至约450nm波长处具有约0.1至约0.7吸光度单位、约0.1至约0.5吸光度单位或约0.1至约0.3吸光度单位的吸光度。合适的吸光度值包括约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7的吸光度单位，或包括和/或在其中任何两个值之间的任何范围。在本文的任意实施方案中，吸收剂可包括在约300nm至约405nm波长处具有大于0.1个吸光度单位的吸收剂。例如，在本文的任意实施方案中，吸收剂可包括但不限于柠檬黄。吸收剂可以0wt％到约1.0wt％的量存在。例如，在本文的任意实施方案中，吸收剂的量为0wt％至约1.0wt％、约0.1wt％至约0.8wt％或约0.3wt％至约0.7wt％。
在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括功能化胶原蛋白、丙烯酸酯单体、光引发剂、载体和吸收剂，其中功能化胶原蛋白包括以甲基丙烯酸酯功能化的胶原蛋白。在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括非功能化胶原蛋白、丙烯酸酯单体、光引发剂和吸收剂。在本文的任意实施方案中，可打印的组合物可包括功能化胶原、非功能化胶原、丙烯酸酯单体、光引发剂、载体和吸收剂，其中功能化胶原包括以甲基丙烯酸酯功能化的胶原蛋白。
在一些实施方案中，可打印的组合物可包括功能化胶原、丙烯酸酯单体、光引发剂、载体、光碱生成剂和吸收剂，其中功能化胶原蛋白包括用甲基丙烯酸酯功能化的胶原。在一些实施方案中，可打印的组合物可包括非功能化胶原蛋白、丙烯酸酯单体、光引发剂、光碱生成剂和吸收剂。在一些实施方案中，可打印的组合物可包括功能化胶原蛋白、非功能化胶原蛋白、丙烯酸酯单体、光引发剂、载体、光碱生成剂和吸收剂，其中功能化胶原蛋白包括以甲基丙烯酸酯功能化的胶原蛋白。
在本技术的一个相关方面中，提供了一种使用本文在任意实施方案中描述的可打印的组合物制备接收细胞的三维支架的方法。该方法包括使用本文任意实施方案的可打印的组合物来制造接收细胞的三维支架。例如，在本文的任意实施方案中，该方法可包括制造患者器官的接收细胞的三维支架。如本文所用，术语“受试者”或“患者”为哺乳动物，例如猫、狗、啮齿动物或灵长类动物。典型地，受试者或患者为人类，并且优选地需要用于组织再生的移植或植入物。术语“受试者”和“患者”可以互换使用。
装配接收细胞的三维支架可包括注射成型、旋转成型、正模、负模、减法生产、或三维(3D)打印方法。在本文的任意实施方案中，装配接收细胞的三维支架可包括3D打印方法。3D打印方法可以包括额外的生产方法。合适的额外的生产方法包括喷墨打印、挤压打印或逐层打印。在本文的任意实施方案中，制造接收细胞的三维支架可包括逐层打印方法。
在本技术的另一相关方面中，提供了一种用于制备接收细胞的三维支架的方法，该方法包括将如本文在任意实施方案中所述的可打印的组合物的层沉积到表面以获得沉积层，辐照沉积层，以及重复沉积和辐照步骤，直到沉积层形成接收细胞的三维支架，其中可打印的组合物包括胶原蛋白，其中胶原蛋白占可打印的组合物重量的约0.3％到约3.0％；单体；光引发剂；以及载体。可打印的组合物可包括如本文在任意实施方案中所述的可打印的组合物。
所述方法包括将可打印的组合物沉积到表面。在本文的任意实施方案中，所述表面可包括但不限于用于如本文在任意实施方案中所述的3D打印方法的系统的表面。此类系统包括用于3D打印方法的3D打印系统，所述3D打印方法包括但不限于喷墨打印、挤压打印或逐层打印。在本文的任意实施方案中，该方法可进一步包括在沉积之前将可打印的组合物加热至0℃至约30℃的温度。例如，在本文的任意实施方案中，可将可打印的组合物加热至0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃的温度、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。
本技术的方法包括照射沉积层以固化可打印组合物。可通过暴露于紫外线(UV)、紫色或蓝色辐射来辐照沉积层以固化沉积层。例如，在本文的任意实施方案中，辐照沉积层包括暴露于波长从约240nm到约405nm的辐射。合适波长可包括但不限于约240nm至约405nm、约240nm至约355nm、约240nm至约340nm、约240nm至约270nm、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。例如，在本文的任意实施方案中，波长可为约270nm或355nm。
在本文的任意实施方案中，辐照后的沉积层具有至少100微米的分辨率。在辐照以固化可打印的组合物的沉积层之后，沉积层可具有小于约100微米、小于约90微米、小于约80微米、小于约70微米、小于约60微米、小于约50微米、小于约40微米、小于约30微米的分辨率，小于约20微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约1微米、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。例如，在本文的任意实施方案中，沉积层可具有小于约100微米的分辨率，且可优选具有小于约1微米的分辨率。
在沉积和辐照步骤之后，所述方法包括重复沉积和辐照步骤，直到沉积层形成接收细胞的三维支架。在重复沉积和辐照步骤之前，可在沉积和辐照可打印的组合物的后续层之前移除沉积层的任何未固化部分。例如，在本文的任意实施方案中，该方法还包括在辐照沉积层之后并且在重复沉积和辐照步骤之前移除未固化的可打印的组合物。
在本文的任意实施方案中，该方法可进一步包括将接收细胞的三维支架与低pH溶液接触。在不受理论约束的情况下，低pH溶液水解固化的可打印的组合物中的酯键以改善接收细胞的三维支架的细胞化。因此，接收细胞的三维支架的生坯强度降低，使得支架更适合后续的细胞化过程。在本文的任意实施方案中，低pH溶液的pH小于约7。低pH溶液的合适pH值可包括但不限于小于约6、小于约5.5、小于约5、小于约4.5、小于约4.0、小于约3.5、小于约3.0、小于约2.5、小于约2.0、或包括和/或在这些值中的任何两个值之间的任何范围。
在本文的任意实施方案中，所述方法可进一步包括将接收细胞的三维支架与细胞、组织、生长因子、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖、透明质酸、多糖或其两种或两种以上的混合物接触。例如，在本文的任意实施方案中，三维支架可与硫酸软骨素蛋白多糖、硫酸肝素蛋白多糖、硫酸化多糖、卡拉胶、琼脂糖、聚葡聚糖、基质凝胶、或其两种或多种的组合接触。合适的细胞、组织或生长因子可包括但不限于转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子样(EGF样)结构域、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PGDF)、Wnt家族蛋白、基质细胞衍生因子1、血管细胞、上皮细胞、间充质细胞细胞或两个或多个细胞的组合。在至少一个实施方案中，本技术的方法为根据图1所示的步骤的方法。在至少另一实施方案中，本技术的方法为根据图2所示的步骤的方法。
通过参考以下示例，可以更容易地理解本发明，这些示例是作为说明提供的，并不非意为限制本发明。
实施例
实施例1：可打印的组合物的配方。
根据配方A-F制备示例性可打印的组合物。表1提供了每个配方中包括的胶原蛋白、单体、光引发剂和载体的量。N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA 600)和柠檬黄购自Aldrich公司。甲基丙烯酸酯功能化牛胶原蛋白购自ABM公司。来自转基因烟草的人类重组胶原蛋白购自CollPlant Ltd。二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦光引发剂购自IGN树脂公司，产品名称为Omnirad TPO-L。所有重量百分比均基于与油墨配方总重量相比的干重测定。
配方A：配方A通过组合(1)100mg甲基丙烯酸酯功能化牛胶原蛋白和10mg 20mM乙酸溶液的混合物，(2)100mL HEAA，(3)3.38g柠檬黄与96g HEAA，(4)1L PEGDMA600和二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(光引发剂)来制备。配方A的约60wt％为在20mM乙酸溶液中的甲基丙烯酸酯功能化的胶原蛋白，其约为1％重量的胶原蛋白。因此，配方A包含约0.6％干重的胶原蛋白。配方A包括约10-15％重量的HEAA单体。配方A具有提供高生坯强度的优点，同时仍然具有大量的胶原蛋白成分。当用作可打印的组合物时，配方A产生1-15cm三维物体，其展示出在1-50kPa范围内的生坯强度。
就重量百分比(wt％)而言，配方A包括溶于20mM乙酸的59.7wt％甲基丙烯酸-牛胶原蛋白、0.71wt％柠檬黄、36.91wt％HEAA、1.49wt％PEGDMA和1.19wt％二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦。组分(1)可以表示为子组分，包括(1A)59.11wt％20mM乙酸和(1B)0.59wt％甲基丙烯酸-牛胶原蛋白。
配方B：配方B通过将60.59wt％的溶于丙烯酸羧乙酯水溶液的甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白混合物、(2)38.20wt％的HEAA和1.21wt％的二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦光引发剂组合而制备。甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白的干重百分比为0.6wt％。这种配方的优点是照相速度快，生坯强度高。配方B的照相速度足以允许在不到3s的时间内在80cm2的面积上进行z层打印，并且配方B展现出20kPa的生坯强度。
配方C：配方C通过59.88wt％的溶于丙烯酸羧乙酯水溶液的甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白混合物、16.6wt％的I型牛胶原蛋白溶液与乙酸、22.5wt％的HEAA和1wt％的2-二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦组合而制备。甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白的干重百分比为0.59wt％。相对于配方B，由于添加了非功能化的牛胶原蛋白，该配方可改善某些细胞生长过程。
配方D：配方D通过将71.4wt％的溶于丙烯酸羧乙酯水溶液的的甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白混合物、17.9wt％溶于乙酸的I型牛胶原蛋白溶液、7.14wt％的PEGDMA600、2.86wt％的HEAA和0.71wt％的二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦组合而制备。甲基丙烯酸-牛胶原蛋白的干重百分比为0.71％。较高的胶原蛋白含量可能有利于某些细胞的生长过程。
配方E：配方E通过将61.35wt％的溶于20mM乙酸中的甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白、23.31wt％的溶于乙酸的I型牛胶原蛋白溶液与(3)14.11wt％的HEAA和1.22wt％的二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦组合而制备。甲基丙烯酸酯-牛胶原蛋白的干重百分比为0.61wt％。
配方F：配方F由61.35wt％的重组人胶原蛋白(烟草厂生产)溶液、23.31wt％的I型牛胶原蛋白醋酸溶液、14.11wt％的HEAA和1.22wt％的二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦组合而成。
配方G：20mM醋酸中的94.34wt％的重组人胶原蛋白、(2)4.53wt％的甲醇和(3)1.13wt％的2-二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦。胶原蛋白的干重为1.39wt％。
表1
Figure BDA0002930206480000151
Figure BDA0002930206480000161
所有数字都是占可打印的组合物的总重量的重量百分比。
实施例2：细胞活力评估。
使用人上皮肺癌细胞(A549、ATCC、CCL-185)来评估细胞活性。细胞保存在添加10％FBS、50μg mL–1青霉素、50μg mL–1链霉素的F-12K培养基(Kaighn's modification，ATCC)中。配方的制备如上所述配方B和C，并使用紫外线烘箱在96孔板中固化。每个孔接种6000个细胞，并在37℃、5％CO2中培养。在每个指定的打印配方中培养48小时后，用PBS轻轻清洗细胞三次，并根据制造商的说明(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific)使用PicoGreen分析进行细胞毒性评估。配方C在细胞接种48小时后显示出80％的细胞活力(图3)。
实施例3：制备接收细胞的三维支架。
使用通过配方H的酸性可打印的组合物来制备接收细胞的三维支架。配方H根据实施例1中所述和下表2中所述的制备方法制备。
表2
Figure BDA0002930206480000162
将一层未固化的可打印的组合物沉积到垂直放置的表面以接收油墨层。以355nm的波长辐照可打印的组合物的沉积层，其具有<100微米的分辨率。重复沉积和辐照步骤，直到支架完全成形。图4显示从通过配方H的可打印的组合物的打印获得的三维支架。
虽然已经说明和描述了某些实施方案，但是应当理解，可以根据本领域的普通技术对其进行更改和修改，而不偏离以下权利要求中定义的更广泛方面的技术。
本文例示性描述的实施方案可在没有本文未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制的情况下适当实施。因此，例如，应扩展地且不受限制地读取术语“包括”、“包含”等。此外，本文中使用的术语和表达已被用作描述的术语而不是限制的术语，并且在使用这些术语和表达时并不打算排除所示和描述的特征或其部分的任何等价物，但是应当认识到，在该范围内可以对所声称的技术进行各种修改。此外，短语“本质由……组成”将被理解为包括那些具体叙述的元素和那些对所要求保护的技术的基本和新颖特征没有实质性影响的附加元素。短语“由……组成”不包括任何未指定的元素。
本发明不限于本申请中描述的具体实施方案。可以在不脱离其精神和范围的情况下进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员将是显而易见的。除了本文列举的那些方法之外，在本发明范围内的功能等效的方法和组合物对于本领域技术人员将从前述描述中显而易见。这些修改和变化意在落入所附权利要求的范围内。本发明仅受所附权利要求书的条款以及这些权利要求书有权获得的等价物的全部范围的限制。应理解，本发明不限于特定方法、试剂、化合物或组合物，其当然可以改变。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是旨在限制。
此外，如果本发明的特征或方面是以马库什组的形式描述的，那么本领域的技术人员将认识到，本发明也是以马库什组的任何单个成员或成员的子组的形式描述的。
本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并且使得相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为较低的三分之一、中间的三分之一和较高的三分之一等，这也将被理解本领域技术人员所使用的所有语言，例如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等，都包括所列举的数字，并且如上文所讨论的，指的是随后可以被分解为子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的数字。
本规范中提及的所有出版物、专利申请、已发布专利和其他文件均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、已发布专利或其他文件均明确且单独地指示通过引用并入其整体。通过引用合并的文本中包含的定义在与本发明中的定义相矛盾的范围内被排除在外。
权利要求中阐述了其他实施方案。

Claims (39)

1.一种用于制备接收细胞的支架的可打印的组合物，按占所述可打印的组合物的重量，其包括：
约0.3wt％至约3.0wt％的一种或多种胶原蛋白；
约5.0wt％至约40.0wt％的一种或多种单体；
约0.5wt％至约2.0wt％的光引发剂；以及
0wt％至约75wt％的包含质子溶剂的载体；
其中，在打印时，所述可打印的组合物具有约100微米或更小的分辨率，具有约0.1-5mm(Dp)和约10-100mJ/cm2(Ec)的照相速度(Dp/Ec)，并且在干燥后，具有至少约5kPa的生坯强度。
2.如权利要求1所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白为以单体亚基功能化的胶原蛋白。
3.如权利要求2所述的可打印的组合物，其特征在于，所述单体为选自由丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸羧乙酯或其两种或多种混合物组成的组的丙烯酸单体。
4.如权利要求1-3任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白为哺乳动物来源。
5.如权利要求4所述的可打印的组合物，其特征在于，所述哺乳动物来源选自由人类、牛、猪以及其两种或多种的混合物组成的组。
6.如权利要求4所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白为重组胶原蛋白。
7.如权利要求6所述的可打印的组合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白为重组人胶原蛋白、重组牛胶原蛋白、重组猪胶原蛋白或其两种或两种以上的混合物。
8.如权利要求7所述的可打印的组合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白为重组来源，所述重组来源选自由植物、细菌、病毒、真菌以及其两种或多种的组合组成的组。
9.如权利要求1-8任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白包含I型胶原蛋白。
10.如权利要求1-9任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白占所述可打印的组合物重量的约0.3％到约0.9％，且所述胶原蛋白为哺乳动物来源。
11.如权利要求1-9任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白占所述可打印的组合物重量的约0.5％到约3.0％，且所述胶原蛋白来自重组胶原蛋白。
12.如权利要求1-11任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述胶原蛋白为第一胶原蛋白和第二胶原蛋白的混合物，其中所述第一胶原蛋白为功能化胶原蛋白，所述第二胶原为非功能化胶原蛋白。
13.如权利要求12所述的可打印的组合物，其特征在于，所述第一胶原蛋白和第二胶原蛋白与所述胶原蛋白干重的重量比为约99:1到约1:99。
14.如权利要求1-13所述的可打印的组合物，其特征在于，所述单体包含N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)、甲基丙烯酸2-羟乙基酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚己内酯二甲基丙烯酸酯和聚己内酯三甲基丙烯酸酯中的一种或多种。
15.如权利要求1-13任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述单体包括N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)。
16.如权利要求1-15任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述光引发剂选自由2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙苯酮、乙基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基膦酸酯、苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、或其两个或两个以上的组合组成的组。
17.如权利要求1-16任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述载体进一步包含水溶性丙烯酸单体。
18.如权利要求17所述的可打印的组合物，其特征在于，所述该水溶性丙烯酸单体选自由丙烯酸羧乙酯、聚(亚烷基)(甲基)丙烯酸酯、HEAA、HEMA、HEA、ACMO、NVP、V-CAP、或其两种或多种的组合组成的组。
19.如权利要求1-18任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述载体进一步包含羧酸。
20.如权利要求19所述的可打印的组合物，其特征在于，所述羧酸选自由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、月桂酸、硬脂酸、脱氧胆酸、谷氨酸、葡萄糖醛酸、或其两种或多种的混合物组成的组。
21.如权利要求20所述的可打印的组合物，其特征在于，所述羧酸以约5mM至约200mM的浓度存在。
22.如权利要求1-21任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述载体的pH值至少为2。
23.如权利要求1-22任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述可打印的组合物进一步包含选自由9-蒽甲基N,N-二乙基氨基甲酸酯、(E)-1-哌啶-3-(2-羟基苯基)-2-丙烯-1-酮、1-(蒽醌-2-基)乙基咪唑羧酸盐、2-硝基苯基甲基4-甲基丙烯酰氧基哌啶-1-羧酸盐、1,2-二异丙基-3-[双(二甲氨基)亚甲基]胍-2-(3-苯甲酰苯基)丙酸盐、1,2-二环己基-4,4,5,5-四甲基双胍正丁基三苯基硼酸酯、(Z)-{[双(二甲氨基)亚甲基]氨基}-正环己基(环己基氨基)甲铵四(3-氟苯基)硼酸酯、或其两个或两个以上的组合组成的组中的光碱生成剂。
24.如权利要求1-23任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述可打印的组合物进一步包括在约300nm到约450nm之间的波长处具有大于0.1个吸光度单位的吸收剂。
25.如权利要求1-24任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述吸收剂为柠檬黄。
26.如权利要求1-25任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述组合物以小于约1微米的分辨率可打印。
27.如权利要求1-26任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，所述组合物以约0.1mm/10mJ/cm2到约5mm/100mJ/cm2的照相速度(Dp/Ec)下可打印。
28.如权利要求1-26任一项所述的可打印的组合物，其特征在于，干燥后的生坯强度为约5kPa至约10kPa。
29.一种制备接收细胞的三维支架的方法，其特征在于，所述方法包括打印如权利要求1-28任一项的可打印的组合物用来装配所述接收细胞的三维支架。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述打印装配器官的接收细胞的三维支架，其中所述器官为哺乳动物器官。
31.如权利要求29或30所述的方法，其特征在于，所述打印包括喷墨打印、挤出打印或逐层打印。
32.一种制备接收细胞的三维支架的方法，包括：
将可打印的组合物的层沉积到表面以获得沉积层；
辐照沉积层；以及
重复沉积和辐照的步骤，直至沉积层形成接收细胞的三维支架；
其中，所述可打印的组合物包含胶原蛋白，其中所述胶原蛋白占所述可打印的组合物重量的约0.3％到约3.0％；单体；光引发剂；以及载体。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述可打印的组合物为如权利要求1-28任一项所述的可打印的组合物。
34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述沉积层在打印时具有100微米或更小的分辨率。
35.如权利要求32-34任一项所述的方法，其特征在于，以约240nm到约405nm的波长辐照所述沉积层。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述波长为约270nm或355nm。
37.如权利要求32-36任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在沉积之前将所述可打印的组合物加热至0℃至约30℃的温度。
38.如权利要求32-37任一权所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述三维支架与细胞、组织、生长因子、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖、透明质酸、多糖或其两种或两种以上的混合物接触。
39.如权利要求32所述的方法制备的接收细胞的三维支架。
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