CN112689680B - 一氧化碳和二氧化碳生物转化方法 - Google Patents

一氧化碳和二氧化碳生物转化方法 Download PDF

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Abstract

提供用于一氧化碳和二氧化碳的生物转化的方法。更具体地，所述方法包括用产乙酸菌发酵含有一氧化碳和二氧化碳的底物。所述方法提供高水平的一氧化碳和二氧化碳的转化率以及氢气的利用。

Description

一氧化碳和二氧化碳生物转化方法
本申请要求美国临时申请号62/716,083(2018年8月8号提交)、62/716,071(2018年8月8号提交)、62/716,053(2018年8月8号提交)、62/741,871(2018年10月5号提交)以及62/741,797 (2018年10月5号提交)的权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。
提供用于一氧化碳和二氧化碳的生物转化的方法。更具体地，所述方法包括将含有一氧化碳和二氧化碳的气流提供给产乙酸菌。所述方法提供高水平的一氧化碳和二氧化碳的转化率以及氢气的利用。
背景技术
二氧化碳和一氧化碳产生由自然过程以及包括燃烧化石燃料(诸如煤、石油和天然气)的工业过程发生。部分地归因于工业过程，大气的二氧化碳和一氧化碳的浓度持续增加。这些二氧化碳和一氧化碳的浓度增加可能会导致大气变化，大气变化造成气候变迁与全球变暖。二氧化碳由于其高的氧化态而难以在生物过程中利用。
除了二氧化碳和一氧化碳以外，许多工业过程也会导致氢气产生。氢气具有高水平的还原电位。然而，氢气由于其非常易燃的性质而难以储存和利用。
鉴于所产生的大量二氧化碳和一氧化碳，需要能够利用一氧化碳和二氧化碳两者的细菌发酵系统。
发明内容
方法包括将气态底物Gx提供到生物反应器Bx中，所述气态底物Gx包含CO2并且含有约5摩尔%至约90摩尔%的CO2。将产乙酸菌Mx提供到所述生物反应器Bx中。所述产乙酸菌Mx包含钠转位ATP酶，在生物反应器Bx中所述钠转位ATP酶在发酵期间是活化的。所述方法包括通过一种或多种钠离子源将钠离子提供到所述生物反应器Bx中，以及在包含所述产乙酸菌Mx和所述一种或多种钠离子源的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mx发酵所述气态底物Gx，产生一种或多种有机酸。所述发酵培养液包含少于约0.01克/升酵母提取物、少于约0.01克/升糖类，并且其中钠离子以约290至约8750 µg/克细胞/分钟的钠进料速率提供。所述方法包括将发酵培养液维持在约4至约6.9的范围内的pH。将所述一种或多种有机酸的至少一部分提供到生物反应器Bi中。所述方法还包括将气态底物Gi提供到生物反应器Bi中，所述气态底物Gi包含CO并且含有约5摩尔%至约90摩尔%的CO。将产乙酸菌Mi提供到生物反应器Bi中。所述产乙酸菌Mi包含质子转位ATP酶，在生物反应器Bi中所述质子转位ATP酶在发酵期间是活化的。所述方法还包括在包含产乙酸菌Mi的发酵培养液中用产乙酸菌Mi来发酵生物反应器Bi中的气态底物Gi，产生包含一种或多种醇的液流和包含CO2的气流Gp。
方法包括将气态底物Gx提供到生物反应器Bx中，所述气态底物Gx包含CO2和H2并且含有约5摩尔%至约90摩尔%的CO2。将产乙酸菌Mx提供到所述生物反应器Bx中。所述产乙酸菌Mx包含钠转位ATP酶，在生物反应器Bx中所述钠转位ATP酶在发酵期间是活化的。所述方法包括通过一种或多种钠离子源将钠离子提供到所述生物反应器Bx中，以及在包含所述产乙酸菌Mx和所述一种或多种钠离子源的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mx发酵所述气态底物Gx，产生一种或多种有机酸。所述发酵培养液包含少于约0.01克/升酵母提取物、少于约0.01克/升糖类，并且其中钠离子以约290至约8750 µg/克细胞/分钟的钠进料速率提供。所述方法包括将发酵培养液维持在约4至约6.9的范围内的pH。将所述一种或多种有机酸的至少一部分提供到生物反应器Bi中。所述方法还包括将气态底物Gi提供到生物反应器Bi中，所述气态底物Gi包含CO并且含有约5摩尔%至约90摩尔%的CO。将产乙酸菌Mi提供到生物反应器Bi中。所述产乙酸菌Mi包含质子转位ATP酶，在生物反应器Bi中所述质子转位ATP酶在发酵期间是活化的。所述方法还包括在包含产乙酸菌Mi的发酵培养液中用产乙酸菌Mi来发酵生物反应器Bi中的气态底物Gi，产生包含一种或多种醇的液流和包含CO2的气流Gp。
方法包括将气态底物Gx提供到生物反应器Bx中，所述气态底物Gx包含CO2并且含有约5摩尔%至约90摩尔%的CO2。将产乙酸菌Mx提供到生物反应器Bx中，其中所述产乙酸菌Mx包含钠转位ATP酶，在生物反应器Bx中所述钠转位ATP酶在发酵期间是活化的。所述方法包括通过一种或多种钠离子源将钠离子提供到所述生物反应器Bx中，以及在包含所述产乙酸菌Mx和所述一种或多种钠离子源的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mx发酵所述气态底物Gx，产生一种或多种有机酸。所述发酵培养液包含少于约0.01克/升酵母提取物、少于约0.01克/升糖类，并且其中钠离子以约290至约8750 µg/克细胞/分钟的钠进料速率提供。所述方法包括将发酵培养液维持在约4至约6.9的范围内的pH。将所述一种或多种有机酸的至少一部分提供到生物反应器系统Bi-s中。所述方法还包括将气态底物Gi提供到所述生物反应器系统Bi-s中，所述气态底物Gi包含CO并且含有约5摩尔%至约90摩尔%的CO。将产乙酸菌Mi提供到生物反应器系统Bi-s中，其中所述产乙酸菌Mi包含质子转位ATP酶，在生物反应器系统Bi-s中所述质子转位ATP酶在发酵期间是活化的。所述方法还包括在包含产乙酸菌Mi的发酵培养液中用产乙酸菌Mi发酵生物反应器系统Bi-s中的气态底物Gi，产生包含一种或多种醇的液流和包含CO2的气流Gp。
附图简述
因此，可以详细理解本公开的上述特点的方式为，可以通过参考实施方案(其中的一些在附图中说明)来获知上面简单概述的本公开的更具体描述。然而，要注意的是，由于本公开可以容许其他等效的实施方案，附图仅说明本公开的典型实施方案，并且因而不被视为对其范围的限制。
图1说明使用两个生物反应器用于由发酵方法产生一种或多种氧化的含烃化合物的系统的示意图。
图2说明水再循环系统的示意图。
图3显示使用多个生物反应器用于由发酵方法产生一种或多种氧化的含烃化合物的系统的示意图。
图4显示在生物反应器中由伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)实现的CO2转化率和H2转化率的图。
图5说明由伍氏醋酸杆菌实现的乙酸产生。
图6显示比乙酸生产力。
图7显示由伍氏醋酸杆菌实现的CO、CO2和H2利用。
图8说明在pH 5.2下在生长培养基中在没有螯合剂的情况下伍氏醋酸杆菌的CO2转化率、H2转化率和细胞密度。
图9描述在生长培养基中使用乙二胺二乙酸(EDDA)作为螯合(络合)剂的伍氏醋酸 杆菌的生长。
图10说明钼对于由伍氏醋酸杆菌实现的乙酸产生的影响。
图11说明钼对于所需气体流速和伍氏醋酸杆菌的细胞密度的影响。
图12说明在各种乙酸浓度下杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的比气体摄取量。
图13显示在使用杨氏梭菌和伍氏醋酸杆菌的两阶段生物反应器系统中CO和CO2使用量。
具体实施方式
下列描述不应被理解为限制性意义，而仅仅是为了描述示例性实施方案的一般原理。本公开的范围应参考权利要求书来确定。
定义
除非另有定义，否则本公开的整个说明书中使用的以下术语如下定义，并且可以包括以下定义的单数或复数形式：
修饰任何量的术语“约”是指在真实世界条件(例如在实验室、中试工厂或生产设施)中遇到的量的变化。例如，混合物或量中采用的成分或测量值的量在用“约”修饰时包括在生产工厂或实验室中的实验条件下测量时通常采用的变化和谨慎程度。例如，产物的组分的量在用“约”修饰时包括在工厂或实验室中的多个实验中各批次之间的变化和分析方法中固有的变化。无论是否用“约”修饰，这些量都包括其等效量。本文所述且由“约”修饰的任何量也可以作为未由“约”修饰的量而用于本公开中。
术语“发酵罐”包括由一个或多个容器和/或塔或管路布置组成的发酵装置/生物反应器，其包括批次反应器、半批次反应器、连续反应器、连续搅拌釜反应器(CSTR)、气泡塔反应器、外循环回路反应器、内循环回路反应器、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、移动床生物膜反应器(MBBR)、气升反应器、膜反应器(诸如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))、静态混合器、气升发酵罐，或者适于气液接触的其他容器或其他装置。
术语“发酵”、“发酵方法”或“发酵反应”等意欲涵盖所述方法的生长期和产物生物合成期两者。在一个方面，发酵是指将CO2转化为乙酸。在另一方面，发酵是指将CO转化为醇。
术语“细胞密度”意指每单位体积的发酵培养液的微生物细胞的质量，例如，克/升。
术语“比CO2摄取量”意指每单位时间(以分钟计)被单位质量的微生物细胞(g)所消耗的CO2量(以毫摩尔计)，即毫摩尔/克/分钟。术语“比CO摄取量”意指每单位时间(以分钟计)被单位质量的微生物细胞(g)所消耗的CO量(以毫摩尔计)，即毫摩尔/克/分钟。
如本文所用，生产力是以STY表示。在这方面中，醇生产力可以STY(以g乙醇/(L•天)或g乙酸/(L•天)表示的时空产率)表示。
如本文所用，“氧化的含烃化合物”可以包括含有碳、氢和氧的化合物，例如乙醇和丁醇。
CO/CO2转化系统
本公开的实施方案提供用于产生和获得醇产物以及在厌氧细菌发酵过程之后的微生物细胞生物质衍生的细菌蛋白质的方法、系统和组合物。在一个实施方案中，提供增加碳捕获效率、减少二氧化碳足迹并且增加醇产物生产力的系统和方法。
如图1中所示，所述系统可以包括适于用产乙酸菌Mi来发酵气态底物Gi 186的生物反应器Bi 120。所述气态底物Gi 186可以包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)。
在一个方面，在生物反应器Bi 120中气态底物Gi 186的发酵产生气流Gp 184。气流Gp 184包含二氧化碳(CO2)并且可以包括选自一氧化碳(CO)、氢气(H2)、甲烷(CH4)、氮气(N2)及其组合的一种或多种气体。在这方面，来自生物反应器Bi 120的气流Gp可以包含约0.5摩尔%至约50摩尔% CO；在另一方面，约0.5摩尔%至约40摩尔%；在另一方面，约0.5摩尔%至约30摩尔%；在另一方面，约0.5摩尔%至约20摩尔%；以及在另一方面，约0.5摩尔%至约10摩尔% CO。另外，在另一方面，来自生物反应器Bi 120的气流Gp可以包含约5摩尔%至100摩尔% CO2，在又另一方面，约5摩尔%至90摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至80摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至70摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至60摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至50摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至40摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至30摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至20摩尔% CO2；以及在另一方面，5摩尔%至10摩尔% CO2。
如图1中所示，所述系统可以包括适于用产乙酸菌Mx来发酵气态底物的生物反应器Bx 110。气态底物Gx经气体管线187提供到生物反应器Bx 110中。在这方面，来自生物反应器Bi 120的气流Gp 184可以直接提供到生物反应器Bx 110中。在另一方面，所述系统可以包括气体供给管线112以提供额外的气态底物，所述额外的气态底物与气流Gp 184共混以提供气流Gx 187，所述气流Gx 187被输送到生物反应器Bx 110中。来自生物反应器Bx110的废气可以通过排放管线207排放。对两个生物反应器供给来自营养物供给罐196的营养物。营养物供给罐196可以包括多个亚单位来将相同或不同的营养物供给到每个生物反应器。
此外，所述系统还可以包括将生物反应器Bx 110连接到生物反应器Bi 120的流体管线182，以将来自生物反应器110 Bx的一种或多种酸化合物递送到生物反应器Bi 120。由生物反应器Bx 110产生的一种或多种酸化合物包括C1至C10有机酸。C1至C10有机酸的实例包括乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸(缬草酸)、己酸、庚酸、癸酸及其组合。在一个方面，来自生物反应器Bx 110，递送到生物反应器Bi 120的酸化合物有效增加生物反应器Bi 120中的醇产生。在其中有机酸是乙酸的方面中，将气态底物Gi 186提供到生物反应器Bi 120中以将生物反应器Bi 120中的乙酸浓度维持为约5 g/L或更低。当提供气态底物Gi以降低乙酸浓度时，丁酸浓度也会被降低。因此，将乙酸用作标志物以将生物反应器Bi中的有机酸维持在适当的量。在另一方面，有机酸进料速率用来将生物反应器Bi 120中的乙酸浓度保持为约5g/L或更低。
如图1中进一步说明，细胞渗透物管线192设置成将渗透物递送到用于从渗透物中分离出产物190的蒸馏塔188。产物可以包括含醇产物，所述含醇产物包含乙醇、丁醇及其组合。水(塔底馏出物)可以通过回水管线202回到生物反应器Bx 110中和/或通过回水管线203回到生物反应器Bi 120中。
图2说明水再循环系统的更详细方面。在这方面，将生物反应器Bx 110中产生的有机酸输送通过微过滤314并且进一步通过流体管线182提供到生物反应器Bi 120中。至少一部分的细胞可以通过细胞再循环管线318从微过滤314回到生物反应器Bx 110中。来自生物反应器Bi 120的培养液通过管线194输送到微过滤301中。至少一部分的细胞可以通过细胞再循环管线317从微过滤301回到生物反应器Bi 120中。在一些任选的方面，来自管线194的液体可以前往超过滤307，并且至少一部分的细胞可以从超过滤307回到生物反应器Bi 120中。将来自超过滤307的液体输送到蒸馏进料罐311中，接着输送到蒸馏塔188中。水(塔底馏出物)可以通过回水管线202回到生物反应器Bx 110中和/或通过回水管线203回到生物反应器Bi 120中。
在另一方面，如图3中所示，方法可以包括适于用产乙酸菌Mx发酵气态底物Gx 187的生物反应器Bx 110。除了CO2之外，气态底物Gx 187可以包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)。如图3中所示，可以将气态底物Gx从包括两个或更多个生物反应器Bi-n的生物反应器系统Bi-s供给到生物反应器Bx中。如图3中所示，Bi-n包括两个生物反应器Bi 120。
气态底物Gx 187经一个或多个气体管线提供到生物反应器Bx 110中。在这方面，来自生物反应器系统Bi-s的两个或更多个生物反应器Bi 120的气流Gp 184可以直接提供到生物反应器Bx 110中。在另一方面，系统可以包括气体供给管线112以提供额外的气态底物，所述额外的气态底物与气流Gp 184共混以提供气流Gx 187，所述气流Gx 187被输送到生物反应器Bx 110中。来自生物反应器Bx 110的废气可以通过排放管线207排放。可以对每个生物反应器供给营养物，所述营养物是来自一个或多个供给罐196的营养物。营养物供给罐196可以包括多个亚单位来将相同或不同的营养物供给到每个生物反应器。
生物反应器系统Bi-s可以包括适于用产乙酸菌Mi来发酵气态底物Gi 186的两个或更多个生物反应器Bi 120。所述气态底物Gi 186可以包含一氧化碳(CO)和氢气(H2)。生物反应器系统Bi-s的生物反应器Bi 120中的气态底物Gi 186的发酵产生一种或多种气流Gp 184。气流Gp 184包含二氧化碳(CO2)并且可以包括选自一氧化碳(CO)、氢气(H2)、甲烷(CH4)、氮气(N2)及其组合的一种或多种气体。在这方面，来自生物反应器Bi 120的气流Gp可以包含约0.5摩尔%至约50摩尔% CO；在另一方面，约0.5摩尔%至约40摩尔%；在另一方面，约0.5摩尔%至约30摩尔%；在另一方面，约0.5摩尔%至约20摩尔%；以及在另一方面，约0.5摩尔%至约10摩尔% CO。另外，在另一方面，所述来自生物反应器Bi 120的气流Gp可包含约5摩尔%至100摩尔% CO2，在又另一方面，约5摩尔%至90摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至80摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至70摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至60摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至50摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至40摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至30摩尔% CO2；在另一方面，5摩尔%至20摩尔% CO2；以及在另一方面，5摩尔%至10摩尔% CO2。在一个方面，将气态底物Gi 186提供到两个或更多个生物反应器Bi 120 (统称作为Bi-n)中以达到有效产生每小时约10%或更低的培养物体积的表观气体速度来起泡沫。
此外，系统还可以包括两个或更多个将生物反应器Bx 110连接到生物反应器系统Bi-s的流体管线182，以将来自生物反应器Bx 110的一种或多种酸化合物递送到生物反应器系统Bi-s中。在这方面，生物反应器系统Bi-s可以包括两个或更多个生物反应器Bi 120(显示了两个生物反应器Bi 120)。由生物反应器Bx 110产生的一种或多种酸化合物包括C1至C10有机酸。C1至C10有机酸的实例包括乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸(缬草酸)、己酸、庚酸、癸酸及其组合。在一个方面，来自生物反应器Bx 110，递送到生物反应器系统Bi-s的酸化合物有效增加生物反应器系统Bi-s中的醇产生。
如图3中进一步说明，细胞渗透物管线192设置成将渗透物递送到用于分离产物190的蒸馏塔188。产物可以包括含醇产物，所述含醇产物包含乙醇、丁醇及其组合。水(塔底馏出物)可以通过回水管线202回到生物反应器Bx 110中和/或通过回水管线203回到生物反应器Bi 120中。
用于CO转化的生物反应器Bi
含CO的底物：含CO的底物(描述为气态底物Gi 186)可以包括任何包含CO的气体。在这方面，含CO的气体可以包括合成气、工业气体及其混合物。在一个相关的方面，除了CO之外，提供到生物反应器Bi 120中的气态底物可以包括氮气(N2)、二氧化碳(CO2)、甲烷气(CH4)、合成气及其组合。
合成气可以由任何已知的源提供。在一个方面，合成气可以源自碳质材料的气化。气化涉及生物质在受限的供氧下的部分燃烧。所得气体可以包括CO和H2。在这方面，合成气将含有至少约10摩尔% CO；在一个方面，至少约20摩尔%；在一个方面，约10摩尔%至约100摩尔%；在另一方面，约20摩尔%至约100摩尔% CO；在另一方面，约30摩尔%至约90摩尔% CO；在另一方面，约40摩尔%至约80摩尔% CO；以及在另一方面，约50摩尔%至约70摩尔% CO。合适的气化方法和装置的一些实例提供在美国序号61/516,667、61/516,704和61/516,646(上述所有都在2011年4月6日提交)中，以及在美国序号13/427,144、13/427,193和13/427,247(上述所有都在2012年3月22日提交)中，并且其全部通过引用并入本文中。
在另一方面，所述方法适用于支持从气态底物(例如大量含CO的工业气体)产生醇。在一些方面中，含CO的气体衍生自含碳废弃物(例如，工业废气)或衍生自其他废弃物的气化。据此，所述方法代表捕获碳的有效方法，否则碳会被排放到环境中。工业气体的实例包括在下列期间产生的气体：铁金属制品制造、非铁制品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产、焦炭制造以及气体重整。
在另一方面，H2可以由工业废气或其他废弃物的气化供给。据此，所述方法代表捕获氢的有效方法，否则氢会排放到环境中。工业气体的实例包括在下列期间产生的气体：铁金属制品制造、非铁制品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。其他的氢气源可以包括，例如，H2O电解以及生物产生的H2。
根据含CO的底物的组成，可以将所述含CO的底物直接提供到发酵方法中，或者可以将其进一步改进到包括适当的H2与CO的摩尔比。在一个方面，提供到发酵罐中的含CO的底物具有约0.2或更高的H2与CO的摩尔比；在另一方面，约0.25或更高；以及在另一方面，约0.5或更高。在另一方面，提供到发酵罐中的含CO的底物可以包括约40摩尔百分比或更高的CO加H2以及约30摩尔百分比或更低的CO；在另一方面，约50摩尔百分比或更高的CO加H2以及约35摩尔百分比或更低的CO；以及在另一方面，约80摩尔百分比或更高的CO加H2以及约20摩尔百分比或更低的CO。
在一个方面，所述含CO的底物包含CO和H2。在这方面，所述含CO的底物将含有至少约10摩尔% CO；在一个方面，至少约20摩尔% CO；在一个方面，约10摩尔%至约100摩尔%；在另一方面，约20摩尔%至约100摩尔% CO；在另一方面，约30摩尔%至约90摩尔% CO；在另一方面，约40摩尔%至约80摩尔% CO；以及在另一方面，约50摩尔%至约70摩尔% CO。
在一个方面，气体分离器设置成明显分离出所述气流的至少一部分，其中所述部分包含一种或多种组分。例如，气体分离器可以从包含下列组分的气流中分离出CO2：CO、CO2、H2，其中可以将CO2输送到CO2储存器中并且可以将所述气流的剩余部分(包含CO和H2)输送到生物反应器中。可以利用本领域中已知的任何气体分离器。在这方面，提供到所述发酵罐中的合成气将具有约10摩尔%或更低的CO2；在另一方面，约1摩尔%或更低的CO2；以及在另一方面，约0.1摩尔%或更低的CO2。
某些气流可以包含高浓度的CO以及低浓度的H2。在一个方面，为了达到较高效率的醇产生和/或整体碳捕获，可能需要优化底物流的组成。在另一方面，在流输送到生物反应器之前，可以增加底物流中的H2浓度。
根据本公开的具体方面，可以将来自两个或更多个源的流组合和/或共混以产生所需的和/或优化的底物流。例如，可以将包含高浓度CO的流(例如来自轧钢厂转化器的废气)与包含高浓度H2的流(例如来自轧钢厂炼焦炉的废气)组合。
根据含CO的气态底物的组成，可能还需要在将其引入发酵之前，对其进行处理以去除任何非所需的杂质(例如粉尘粒子)。例如，可以使用已知方法对气态底物进行过滤和净化。
生物反应器设计和操作：发酵罐设计的描述描述在美国序号13/471,827和13/471,858 (这两者都在2012年5月15日提交)以及美国序号13/473,167 (2012年5月16日提交)中，其全部都通过引用并入本文中。
根据一个方面，发酵方法通过将培养基添加到反应器容器中来启始。培养基组成的一些实例描述在美国序号61/650,098和61/650,093(2012年5月22日提交)以及美国专利号7,285,402 (2001年7月23日提交)中，其全部都通过引用并入本文中。可以将培养基灭菌以去除非所需的微生物，并且将反应器用所需的微生物接种。可能不总是需要灭菌。
供使用产乙酸菌Mi的生物反应器Bi 120使用的各种培养基组分的浓度如下：
某些产乙酸菌利用CO的能力部分地来自质子泵或氢泵(也称为质子转位ATP酶)的存在。质子转位ATP酶和钠转位ATP酶两者都描述在Muller, “Energy Conservation inAcetogenic Bacteria”, Appl. Environ. Microbiol. 2003年11月，第69卷，第11期，第6345-6353页中，其通过引用并入本文中。术语质子转位ATP酶可以与术语质子依赖型ATP酶交替使用，并且术语钠转位ATP酶可以与术语钠依赖型ATP酶交替使用。因此，在一个方面，所述方法包括在发酵生物反应器中用包含质子转位ATP酶的产乙酸菌Mi进行发酵。可用的产乙酸菌Mi的实例包括梭菌属(genus Clostridium)中的产乙酸菌，例如：杨氏梭菌的菌株，包括在WO 2000/68407、EP 117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO1998/00558以及WO 2002/08438中描述的那些；自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)的菌株(德国DSMZ的DSM 10061和DSM 19630)，包括在WO 2007/117157和WO 2009/151342中描述的那些；和拉格利梭菌(Clostridium ragsdalei)(P11, ATCC BAA-622)和巴奇嗜碱菌(Alkalibaculum bacchi)(CP11, ATCC BAA-1772)，包括在美国专利号7,704,723和“Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas”,Hasan Atiyeh，呈现在2010年4月29日Oklahoma EPSCoR年度国家会议中分别描述的那些；以及Clostridium carboxidivorans (ATCC PTA7827)，描述在美国专利申请号2007/0276447中。其他合适的微生物包括穆尔氏菌属(genus Moorella)的微生物(包括穆尔氏菌(Moorella sp.) HUC22-1)，以及氧化碳嗜热菌属(genus Carboxydothermus)的微生物。这些参考文献中的每一个都通过引用并入本文。可以使用两种或更多种微生物的混合培养物。
可用的产乙酸菌Mi的额外实例包括凯伍产醋菌(Acetogenium kivuii)、潮湿厌氧 醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11 (ATCC BAA-1772)、产 生性布劳特氏菌(Blautia producta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous)、太平洋地下嗜 热厌氧菌(Caldanaerobacter subterraneous pacificus)、生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮丁醇梭 菌(Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌P262 (德国DSMZ的DSM 19630)、自产乙 醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)(德国DSMZ的DSM 19630)、自产乙醇梭菌(德国DSMZ的DSM 10061)、自产乙醇梭菌(德国DSMZ的DSM 23693)、自产乙醇梭菌(德国DSMZ的DSM24138)、Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827)、Clostridium coskatii(ATCC PTA-10522)、Clostridium drakei、杨氏梭菌PETC (ATCC 49587)、杨氏梭菌ERI2(ATCC 55380)、杨氏梭菌C-01 (ATCC 55988)、杨氏梭菌O-52 (ATCC 55889)、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)(德国DSMZ的DSM 525)、拉 格利梭菌P11 (Clostridium ragsdalei P11)(ATCC BAA622)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridium ultunense)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球 菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热醋 穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica)、Oxobacter pfennigii、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、斯氏梭菌(Clostridium Stick-landii)及其混合物。
期望地应在使所需发酵(例如，CO-至-乙醇)发生的适当条件下进行发酵。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用搅拌釜反应器)、接种物水平、确保液相中的CO不会成为限制的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。
启始(startup)：在接种时，建立有效供给初始微生物群的初始进料气体供给速率。分析排出气体以确定排出气体的含量。使用气体分析的结果来控制进料气体速率。在这方面，所述方法提供约0.2至约0.9；在另一方面，约0.5至约0.9；在另一方面，约0.6至约0.8；在另一方面，约0.5至约0.7；在另一方面，约0.2至约0.5；以及在另一方面，约0.5至约0.6的计算的CO量(毫摩尔)与初始细胞密度(克/升)的比率。
在另一方面，发酵方法包括将合成气提供到发酵培养基中，所述合成气的量有效地提供约0.05 mM至约0.10 mM；在另一方面，约0.15 mM至约0.50 mM；在另一方面，约0.15mM至约0.35 mM；在另一方面，约0.20 mM至约0.30 mM；以及在另一方面，约0.23 mM至约0.27 mM的发酵培养液中的初始计算的CO浓度。溶解的CO是使用亨利定律和反应器的kLa来计算。所述方法有效地增加细胞密度(相较于启始细胞密度)。
如本文所用，目标细胞浓度意指约至约2.0克/升或或更高；在另一方面，约2克/升至约30克/升；在另一方面，约2克/升至约25克/升；在另一方面，约2克/升至约20克/升；在另一方面，约2克/升至约10克/升；在另一方面，约2克/升至约8克/升；在另一方面，约3克/升至约30克/升；在另一方面，约3克/升至约6克/升；以及在另一方面，约4克/升至约5克/升的细胞密度。
启始后(Post-startup)：在达到所需的水平时，从反应器中取出液相和细胞材料并补充培养基。在启始后中，细胞密度将保持恒定水平。
用于CO2转化的生物反应器Bx
含CO2的底物：在一个方面，所述方法包括将含CO2的底物(描述为气态底物Gx 187)提供到生物反应器中。含CO2的底物可以包括任何包含CO2的气体。在这方面，含CO2的气体可以包括工业气体、发酵罐气流(包括，例如，发酵罐废气)及其混合物。在一个相关的方面中，含CO2的底物可以包括氢气，或者其可以与氢气源共混以提供所需水平和H2与CO2的比率。
工业气体：在一个方面，所述方法包括将含CO2的底物提供到生物反应器中，其中所述含CO2的底物自工业气体产生。工业气体的一些实例包括轧钢厂气体、工业气体以及焚化炉废气。工业气体的实例包括在下列期间产生的气体：铁金属制品制造、非铁制品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。氢气源可以包括化石燃料、蒸气重整、甲烷氧化、煤气化和水电解。
根据含CO2的气态底物的组成，可能还需要在将其引入发酵之前，对其进行处理以去除任何非所需的杂质(例如粉尘粒子)。例如，可以使用已知方法对气态底物进行过滤和净化。此外，根据含CO2的气态底物的组成，所述方法可以包括调整含CO2的底物以增加或减少CO2和/或H2的浓度，使其落入所需的范围内。
发酵罐气流：在一个方面，所述方法包括将含CO2的底物提供到生物反应器中，其中所述含CO2的底物是发酵罐气流。发酵罐气流的一些实例包括合成气发酵产生的发酵罐废气。合成气发酵的一些实例描述在2001年7月23日提交的美国专利号7,285,402中，其通过引用并入本文中。
在一个方面，所述方法适用于支持从气态底物(例如大量含CO的工业气体)产生醇。在一些方面中，含CO的气体衍生自含碳废弃物(例如，工业废气)或衍生自其他废弃物的气化。含CO的气体的发酵可以产生在发酵罐废气中的CO2。据此，所述方法代表捕获碳的有效方法，否则碳会被排放到环境中。在这方面，来自含CO的气体的发酵的废气可以包含约0.5摩尔%至约50摩尔% CO。
气流的共混：根据具体的方面中，可以将来自两个或更多个源的流组合和/或共混以产生所需的和/或最佳的底物流。例如，可以将含有高浓度CO2的流(例如轧钢厂的废气)与含有高浓度H2的流(例如轧钢厂炼焦炉的废气)组合。
根据含CO2的底物的组成，可以将所述含CO2的底物直接提供到发酵方法中，或者可以将其进一步改进到包括适当的H2与CO2的摩尔比。所述含CO2的底物可以包含约5摩尔%至约90摩尔%的CO2和约5摩尔%至约90摩尔%的H2。在一个方面，含CO2的气流包含约5%至约66.6%的CO2。
在另一方面，提供到生物反应器Bx 110中的含CO2的底物可以包含约0摩尔%至约50摩尔%的CO；在另一方面，约0.5摩尔%的CO至约50摩尔%的CO；在另一方面，约0.5摩尔%的CO至约5摩尔%的CO；以及在另一方面，约2摩尔%的CO至约5摩尔%的CO。
在一个方面，所述产乙酸菌消耗H2与CO2的摩尔比将为约4:1至约1:2的比率。因此，可以利用任何包含H2和CO2的提供到生物反应器中的底物气体。然而，最佳水平的提供到生物反应器中的底物气体将具有约4:1至约1:1；在另一方面，约2:1；以及在另一方面，约3.5:1至约1.5:1的H2与CO2的比率。
生物反应器设计和操作：发酵罐设计的描述描述在美国序号13/471,827和13/471,858 (这两者都在2012年5月15日提交)以及美国序号13/473,167 (2012年5月16日提交)中，其全部都通过引用并入本文中。
期望地应在使所需发酵(例如，CO2-至-乙酸)发生的适当条件下进行发酵。要考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、搅拌速率(如果使用搅拌釜反应器)、接种物水平以及避免产物抑制的最大乙酸浓度。在这方面，所述方法包括在下列范围中的反应条件：
压力：约0 psi至约500 psi；在另一方面，约0 psi至约200 psi；
温度：约30℃至约42℃；
培养基pH：约4至约6.9；
搅拌速率：约100 rpm至约2000 rpm；
如本文所述的营养物供给。
产乙酸菌：在一个方面，所利用的微生物包括包含钠泵的厌氧产乙酸菌Mx，所述钠泵也可以被描述为钠转位ATP酶(对于膜生物能学)。钠转位ATP酶描述在Muller, “EnergyConservation in Acetogenic Bacteria,” Appl. Environ. Microbiol. 2003年11月，第69卷，第11期，第6345-6353页中，其通过引用并入本文中。包含钠转位ATP酶的产乙酸菌需要约500 ppm的NaCl在其生长培养基中生长。为了确定产乙酸菌是否包含钠转位ATP酶，将所述产乙酸菌接种到含有约30 ml至约50 ml的生长培养基和约0 ppm至约2000 ppm的NaCl的血清瓶中。在约500 ppm或更高的NaCl浓度下正常生长意指所述产乙酸菌包含钠转位ATP酶。
在这方面，合适的产乙酸菌Mx包括醋酸杆菌(Acetobacterium bacteria)、凯伍产 醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11 (ATCC BAA-1772)、热醋穆尔氏菌、热 自养穆尔氏菌、产生瘤胃球菌、凯伍产醋菌及其组合。在另一方面，所述微生物是伍氏醋酸 杆菌。
培养基组成以及培养基进料速率的控制：根据一个方面，所述发酵方法通过将合适的培养基添加到反应器容器中来启始。反应器容器中所含的液体可以包括任何类型的合适营养培养基或发酵培养基。所述营养培养基将包含有效地容许所用的微生物生长的维生素和矿物质。可能不总是需要灭菌。
供使用产乙酸菌Mx的生物反应器Bx 110使用的各种培养基组分的浓度如下：
方法操作将pH维持在下列范围内：约4至约6.9；在另一方面，约5至约6.5；在另一方面，约5.1至约6；以及在另一方面，约5.2至约6。培养基包含少于约0.01 g/L酵母提取物和少于约0.01 g/L糖类。
组合物还包含约40 mmol/L至约500 mmol/L的钠离子浓度；在另一方面，约40mmol/L至约250 mmol/L；以及在另一方面，约50 mmol/L至约200 mmol/L的钠离子浓度。在一个方面，钠离子浓度为约500 ppm至约8000 ppm；在另一方面，约1000 ppm至约7000 ppm；在另一方面，约3000 ppm至约6000 ppm；在另一方面，约2000 ppm至约5000 ppm的Na；以及在另一方面，约3000 ppm至约4000 ppm的Na。钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠的化合物及其混合物提供。
组合物包含钼源。在这方面，钼浓度是约3.97 µg/L至约396.5 µg/L；以及在另一方面，约7.93 µg/L至约198.25 µg/L。钼源包含Na2MoO4、CaMoO4、FeMoO4及其混合物。
组合物还可以包含络合剂。在这方面，当组合物的pH为约5.2或更高时，可以在组合物中包含络合剂。所述络合剂可以包含乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸(EDDA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)及其混合物。
组合物可以包含NH4 +、P、K、Fe、Ni、Co、Se、Zn或Mg的源中的一种或多种。这些元素中的每一种的源可以如下。
NH4 + ：氮可以由选自氢氧化铵、氯化铵、磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵及其混合物的氮源提供。
P：磷可以由选自磷酸、磷酸铵、磷酸钾及其混合物的磷源提供。
K：钾可以由选自氯化钾、磷酸钾、硝酸钾、硫酸钾及其混合物的钾源提供。
Fe：铁可以由选自氯化亚铁、硫酸亚铁及其混合物的铁源提供。
Ni：镍可以由选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍及其混合物的镍源提供。
Co：钴可以由选自氯化钴、氟化钴、溴化钴、碘化钴及其混合物的钴源提供。
Se：硒可以由Na2SeO3、C3H6NO2Se及其混合物提供。
Zn：锌可由ZnSO4提供。
W：钨可以由选自钨酸钠、钨酸钙、钨酸钾及其混合物的钨源提供。
Mg：镁可以由选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁及其混合物的镁源提供。
S：组合物还可以包含硫。所述硫可以由选自半胱胺酸、硫化钠、NaHS、NaH2S及其混合物的硫源提供。
启始：在接种时，建立有效供给初始微生物群的初始进料气体供给速率。分析排出气体以确定排出气体的含量。使用气体分析的结果来控制进料气体速率。在这方面，所述方法提供约0.1克/升的最小细胞密度。在另一方面，所述方法提供约0.05至约1以及在另一方面，约0.01至约4的每单位时间的计算的CO2量(mmol/min)与初始细胞密度(克/升)的比率。
在一个方面，可以将营养物添加到培养物中以增加细胞生长速率。合适的营养物可以包括酵母提取物的非糖类部分。
启始后：在达到所需的水平时，从反应器中取出液相和细胞材料并补充培养基。所述发酵方法有效地增加细胞密度(相较于启始细胞密度)。在这方面，所述方法提供约2克/升至约50克/升；在另一方面，约2克/升至约30克/升；在另一方面，约2克/升至约20克/升；在另一方面，约2克/升至约10克/升；在另一方面，约5克/升至约10克/升；以及在另一方面，约2克/升至约6克/升的平均细胞密度。
有机酸产生：在另一方面，所述方法提供C1至C10有机酸的源。在这方面，所述方法可以包括自所述发酵液体培养液获得一种或多种酸产物。在这方面，提供约0.2至约50克有机酸/升/天/克细胞；在另一方面，约0.2至约20克有机酸/升/天/克细胞；在另一方面，约10至约50克有机酸/升/天/克细胞；在另一方面，约14至约30克有机酸/升/天/克细胞；在另一方面，约2至约20克有机酸/升/天/克细胞；以及在另一方面，约15至约25克有机酸/升/天/克细胞的比有机酸生产力。在一个方面，所述有机酸是乙酸或丁酸或这两者的混合物。
CO2和H2的转化：所述方法有效地提供约0.05至约1.5 mmol CO2/分钟/克干燥细胞的CO2摄取量，约0.08至约1.5 mmol H2/分钟/克干燥细胞的H2摄取量。所述方法有效地提供约25%至约100%的CO2转化率；在另一方面，约50%至约100%的CO2转化率；以及在另一方面，约75%至约100%的CO2转化率。在另一方面，所述方法有效地提供约25%至约100%的H2转化率；在另一方面，约50%至约100%的H2转化率；以及在另一方面，约75%至约100%的H2转化率。
图4显示伍氏醋酸杆菌实现的CO2转化率404和H2转化率402的图。相对于时间的乙酸产生504及其移动平均值502以及细胞密度506的图示显示于图5中。
实施例
实施例1： 伍氏醋酸杆菌的制备
伍氏醋酸杆菌 的初始冻干颗粒自德国培养物保藏(German culture collection)DSMZ，菌株ID DSM-1030获得。培养物最初使用丰富培养基(果糖和酵母提取物)从冻干颗粒恢复。使用适应方法以从血清瓶培养基中去除果糖，其中在生长培养基中的果糖浓度为75%、50%、10%逐步减少。将生长速率和气体使用量用作适应的指标。(约5周)。血清瓶中的初步pH适应工作将所需的pH从7.4降至6.0 (3周)。此时，将培养物扩增并接种到反应器中。在反应器中，使培养物进一步适应以在5.2至5.7的更低pH下生长。
实施例2： 伍氏醋酸杆菌的CSTR反应器启始方法
将含有CO2和H2的合成气与如本文所述的含有维生素、微量金属、半胱氨酸(作为硫源)和盐的液体培养基一起持续引入含有伍氏醋酸杆菌的搅拌釜生物反应器中。
含有发酵培养基的New Brunswick Bioflow 310反应器用生长活跃的伍氏醋酸杆 菌启始。将反应器的搅拌速率设定为200 rpm。在整个实验期间将所述搅拌速率自200 rpm增加到600 rpm。将反应器的进料气流自初始49 ml/min增加到137 ml/min。在整个实验期间将生物反应器中的温度维持在33.5℃下。间隔取出进料到生物反应器中的气体和来自生物反应器的废气以及生物反应器中的发酵培养液的样品，例如，分别约每天、两小时一次以及四小时一次取样进料气体、废气以及发酵培养液。分析上述样品的各种气体组分的消耗或产生、培养液乙酸浓度和培养物的光学密度(细胞密度)。在整个实验期间将反应器的未唤醒体积(unaroused volume)维持在1600 ml至1750 ml之间。此外，通过使用质流控制器来将反应器的气流维持在所需的气体流速下。进料合成气组成为70% H2、25% CO2和5% N2。在达到稳定运转时，结束这个实验。
在实验启始之前将细胞再循环系统(CRS)连接到反应器。在实验期间，营养物(生长培养基)到反应器的流速如表中所指示。在整个实验期间维持培养基进料速率。用于pH控制的碱(0.5 M NaOH)进料速率为0.14-0.44 ml/min，并且通过CRS，从反应器中抽出5.1-5.4 ml/min的渗透物。
进料气体中的H2和CO2被固定到细胞材料和乙酸中。通过比较入口气体组成和排出气体组成来计算H2和CO2的去除。组分气体摄取量以由细菌所转化的气体分子的%来表示。
在这个实验中，达成下列转化率；H2：40%-54%, CO2：28%-70%。在这个实验中，乙酸生产速率为5-23 g/L/天。
结果可以如下汇总：
比CO2摄取量(mmol CO2/min/克干燥细胞) 0.17-0.33
比H2摄取量(mmol H2/min/克干燥细胞) 0.20 – 0.9
乙酸生产力(g/L/天) 5-23
比乙酸生产力(g/L/天/g细胞) 4.6 - 11.6
平均细胞密度(g/L) 1.5
实施例3： 伍氏醋酸杆菌实现的CO2 、CO和H 2 的发酵
将含有CO2和H2的气体与含有维生素、微量金属和盐的常规液体培养基一起持续引入含有伍氏醋酸杆菌的搅拌釜生物反应器中。如实施例2中所述启始发酵，接着持续到稳定运转。在这个实施例中，进料气体包含5摩尔%的CO。
图6和图7描述伍氏醋酸杆菌在5% CO存在下的生长。图6说明相对于时间的细胞密度602和比乙酸生产力604。图7说明H2转化率702、CO转化率704、CO2转化率706和细胞密度708。
实施例4： 在生长培养基中在没有螯合剂(EDTA)下在pH 5.2下的伍氏醋酸杆菌培 养物的生长和维持
将含有CO2和H2的气流与如本文所述的生长培养基一起持续引入含有伍氏醋酸杆 菌的搅拌釜生物反应器中。
含有发酵培养基的New Brunswick Bioflow 115反应器用生长活跃的伍氏醋酸杆 菌(AW)启始。将反应器的搅拌速率设定为600 rpm。在整个实验期间将所述搅拌速率保持不变。将反应器的进料气流维持在36.6 ml/min至44.4 ml/min下。在整个实验期间将生物反应器中的温度维持在33℃下。将Na+水平维持在3500 ppm至4000 ppm下。间隔取出进料到生物反应器中的气体和来自生物反应器的废气以及生物反应器中的发酵培养液的样品，例如，分别约每天、两小时一次以及四小时一次取样进料气体、废气以及发酵培养液。分析上述样品的各种气体组分的消耗或产生、培养液乙酸浓度和培养物的光学密度(细胞密度)。在整个实验期间将反应器的未唤醒体积维持在1900 ml至2275 ml之间。此外，使用质流控制器来将反应器的气流维持在所需的气体流速下。这个实验的进料合成气组成为70% H2、25% CO2和5% N2。
在实验启始之前将细胞再循环系统(CRS)连接到反应器。在实验期间，将反应器的营养物(生长培养基)的流速维持在2.8 ml/min下。在整个实验期间维持培养基进料速率。维持pH在5.2下所需的碱(NaOH)的平均速率为0.075 ml/min，并且通过CRS，从反应器中抽出2.9 ml/min渗透物。
进料气体中的H2和CO2被固定到细胞材料和乙酸中。通过比较入口气体组成和排出气体组成来计算H2和CO2的去除。组分气体摄取量可以由细菌转化的气体分子的%来表示。
达成下列转化率：
H2：28%至54%
CO2：40%至59%
乙酸生产速率为0.7949 (g/L/天)
培养物的平均细胞密度为1.9 g/L
CO2转化率802、H2转化率804和细胞密度806显示在图8中。
实施例5： EDDA在生长培养基中的使用
如实施例2中所述启始发酵，并且发酵包括使用乙二胺二乙酸(EDDA)作为螯合(络合)剂。由于在AW培养基中采用的一些金属的溶解度随着pH增加而降低，采用螯合剂将金属保持在溶液中。如果反应器培养液的pH高于pH 5.2，则采用螯合剂提供足量的营养物到AW中。图9显示实验的代表性的96小时时期，其说明维持细胞密度902同时产生增加的乙酸浓度904的能力。
实施例6： 钼去除和重新添加对于细胞代谢的影响
如实施例2中所述启始发酵，接着持续到稳定运转。将钼从培养基中去除，接着在乙酸生产力降到其启始浓度的75%之后将钼重新添加到生长培养基中。
图10说明乙酸生产力903对其培养基流速905作图，其中红线指示钼去除和重新添加到生长培养基中。随着在约795累积小时进行钼去除，从约810累积小时开始，观察到HAc的下降趋势。这种下降趋势减少，达到平稳，接着反转为上升趋势，与在约900小时之时将钼重新添加到培养基中相对应。
图11说明细胞密度906与气体流速(GFR)901对时间作图，其中红线表示将钼去除和重新添加至生长培养基中。相较于在约795累积小时进行钼去除之前，从约840累积小时开始，所需的GFR较低。在约900小时之时，这种下降趋势反转为上升趋势，与钼回到培养基中相对应。所需的气体流速通过培养物的CO2和H2转化率来确定。
实施例7： 用于用杨氏梭菌转化CO的连续方法
将含有CO和/或CO2/H2的合成气或废气与如本文所述的含有维生素、微量金属和盐的发酵培养基一起持续引入含有杨氏梭菌菌株的搅拌釜生物反应器中。
将含有合适培养基的New Brunswick BioFlow 310反应器用0.38 g/L的生长活跃的杨氏梭菌接种。在接种之前，将反应器的搅拌速率设定为800 rpm，将反应器的气流调整为20 ml/min，并且将细胞再循环系统连接到反应器。分析以每1至4小时的间隔从反应器中取出的气体和液体样品的各种气体组分的消耗或产生、培养液乙酸浓度、培养液乙醇浓度和培养物的光学密度。此外，每日测量进料气体的组成并且通过使用质流控制器将反应器的流维持在所需的气体流速下。当H2转化率达到32%，反应器的培养基流以1 ml/min启始并且抽出0.95 ml/min的渗透物。反应器的合成气流基于培养物的H2转化率增加：如果H2转化率为32%或更高，则将气流增加10%。在反应器接种后，细胞质量随着时间而增加并且在72小时内达到3 g/L细胞质量。此时，培养物产生超过18 g/L的乙醇。使用液相色谱仪来测量培养液乙醇和乙酸浓度。使用气相色谱仪来测量合成气的组分。使用中和剂(例如NH4OH)来将培养物的pH维持在约4.5。通过调整渗透物抽出速率来将反应器的细胞密度维持在约3 g/L。布置反应器，使得渗透物的抽出速率反过来控制从反应器中清除细胞的速率。操作压力为大气压力。
当接种后细菌发酵历时数小时，CO2由CO转化而产生，并且H2随着CO而消耗。接着将生产方法和细菌发酵反应器系统维持在产生15 g/L至35 g/L乙醇和0 g/L至5 g/L乙酸盐作为产物的稳定态，仅偶尔进行少量调整以将乙酸浓度维持在上述范围并且将细胞密度维持在约3 g/L。
这种持续发酵方法允许在稳定运转条件下持续产生并维持高乙醇浓度且具有低副产物乙酸盐浓度，以增强主题细菌在工业规模上生产乙醇的使用。
实施例8： 乙酸添加对杨氏梭菌的影响
如实施例7中所述进行用 杨氏梭菌 的发酵。
每个试验在反应器培养液中在存在5 g/L NaCl以及下列量的乙酸下进行历时72小时。
对照 - 无添加
试验1 - 2 g/L乙酸
试验2 - 4 g/L乙酸
试验3 - 6 g/L乙酸
添加乙酸到培养基中对于比乙醇生产力有影响。当乙酸浓度增加时，乙醇产生也相应地增加。无论培养基中的浓度如何，乙酸生产力都没有明显改变。所有外源添加的酸似乎都被培养物转化为乙醇。当与对照比较时，在培养基中外源添加酸的培养物中在比CO摄取量方面有显著的增加，最高浓度达到约0.750 mmol/min/g细胞的最高摄取量水平。在此期间对照平均有约0.500 mmol/min/g细胞。乙酸浓度也增加氢摄取量。在稳定态下的比生产力(g/L/天/克细胞)如下。
图12说明在各种乙酸浓度下由 杨氏梭菌 实现的比气体摄取量。
实施例9： 使用杨氏梭菌和伍氏醋酸杆菌的两阶段反应器
如图1中所示来配置两阶段反应器。所述两阶段反应器包括搅拌釜生物反应器Bi120和搅拌釜生物反应器Bx 110。每个反应器含有如本文所述的液体培养基，所述液体培养基含有维生素、微量金属、半胱氨酸(作为硫源)和盐。生物反应器Bi 120用生长活跃的杨氏 梭菌启始，并且生物反应器Bx 110用生长活跃的伍氏醋酸杆菌启始。
在生物反应器Bx 110中，将0.5 M NaOH用作将pH保持在约6.0下的试剂。每小时每克细胞的NaOH使用量约为0.21。
将含有55% H2、12% N2、33% CO的气态底物Gi 186引入生物反应器Bi 120中。通过气流连接184将来自生物反应器Bi 120的气态排出流(Gp)提供到生物反应器Bx 110中。
所述系统中的水在“封闭”配置中并且通过渗透物/乙醇导管192从生物反应器120输送到蒸馏188。水(塔底馏出物)通过水再循环管线202回到生物反应器Bx 110中。来自生物反应器Bx 110的乙酸通过渗透物乙酸管线182输送到生物反应器Bi 120中。
从水回路封闭启始发酵进行约120小时。所述系统在前58小时内达到平衡并且在最后62小时内收集数据。约每四小时分析两个反应器的进入气流186 (Gi)和187 (Gx)以及排出气流184 (Gp)和207 (生物反应器Bx 110废气流)。使用气相色谱法进行分析。数据以%组成来表示。约每四小时使用液相色谱法(LC)进行乙醇、乙酸和丁醇的产物分析。约每4小时监测两个反应器的细胞浓度。
平均%组成和气体流速如下：
使用质流控制器(MFC)维持进入生物反应器Bi 120和Bx 110的气态进料速率。使用滴定管来测量生物反应器Bx 110和Bi 120的排出气体流速。使用生物反应器Bx 110的进入气流和排出气流的N2组成比来计算生物反应器Bx 110的气体流速。
在这个实验中，离开生物反应器Bi 120的气体中只有一部分进料到生物反应器Bx110中。在一个实例中，来自生物反应器Bi 120的51%的排出气体进料到生物反应器Bx 110中。在另一实例中，来自生物反应器Bi 120的60%的排出气体进料到生物反应器Bx 110中。乙醇生产力如下。
两个反应器系统的比乙醇生产力值使用生物反应器Bi 120的生产力计算。在这些实验中伍氏醋酸杆菌产生零至可忽略量的乙醇。在这个表中使用的杨氏梭菌比乙醇生产力(当不与生物反应器110组合时)在两个反应器连接之前测量。如果将来自生物反应器Bi120的100%废气供给到生物反应器Bx 110，则预计比乙醇生产力为24.4 g/L/g梭菌细胞/天。
系统的平均碳捕获如下。
CO2通过水煤气转化反应在生物反应器120中产生。
图13显示当与生物反应器120偶联时生物反应器110中的CO使用量1207和CO2使用量1206。转化率使用排出气体/进入气体的摩尔%计算。
实施例10： 使用杨氏梭菌和醋酸杆菌的两阶段反应器
如图1中所示来配置两阶段反应器。所述两阶段反应器包括搅拌釜生物反应器120(Bi)和搅拌釜生物反应器110 (Bx)。每个反应器含有如本文所述的液体培养基，所述液体培养基含有维生素、微量金属、半胱氨酸(作为硫源)和盐。生物反应器120 (Bi)用生长活跃的杨氏梭菌启始，并且生物反应器110 (Bx)用生长活跃的伍氏醋酸杆菌启始。
在生物反应器Bx 110中，将0.5 M NaOH用作将pH保持在约5.5下的试剂。每小时每克细胞的NaOH使用量约为0.13 ml/min。
将含有56% H2、11% CH4、33% CO的气态底物186 (Gi)引入生物反应器Bi 120中。通过气流连接184将来自生物反应器120的气态排出流(Gp)提供到生物反应器Bx 110中。
所述系统中的水在“封闭”配置中并且通过渗透物/乙醇导管192从生物反应器Bi120输送到蒸馏塔188。水(塔底馏出物)通过水再循环管线202回到生物反应器Bx 110中。来自生物反应器Bx 110的乙酸通过渗透物乙酸管线182输送到生物反应器Bi 120中。
从水回路封闭启始发酵进行约96小时。所述系统在前48小时内达到平衡并且在最后48小时内收集数据。约每四小时分析两个反应器的进入气流186 (Gi)和187 (Gx)以及排出气流184 (Gp)和207 (排放流)。使用气相色谱法进行分析。数据以%组成来表示。约每四小时使用GC进行乙醇、乙酸和丁醇的产物分析。约每4小时监测两个反应器的细胞浓度。
平均%组成和气体流速如下：
使用质流控制器(MFC)维持进入生物反应器Bi 120和Bx 110的气态进料速率。使用滴定管来测量生物反应器Bx 110和Bi 120的排出气体流速。使用生物反应器Bx 110的进入气流和排出气流的CH4组成比来计算生物反应器Bx 110的气体流速。
在这个实验中离开生物反应器Bi 120的气体中只有一部分进料到生物反应器Bx110中。进料到生物反应器Bx 110的气体为生物反应器Bi 120的总废气的22.5%。
乙醇生产力如下。
两个反应器系统的比乙醇生产力值使用生物反应器Bi 120的生产力计算。在这些实验中伍氏醋酸杆菌产生零至可忽略量的乙醇。在这个表中显示的杨氏梭菌比生产力(当不与生物反应器Bx 110组合时)在两个反应器连接之前测量。如果将来自生物反应器Bi120的100%废气供给到生物反应器Bx 110，则预计系统的比乙醇生产力为36.4 g/L/g梭菌细胞/天。
丁醇生产力如下。
丁酸是由伍氏醋酸杆菌产生。这个实验显示杨氏梭菌具有将丁酸转化为丁醇的能力。如果将来自生物反应器Bi 120的100%废气供给到生物反应器Bx 110，则预计比丁醇生产力为8.2 g/L/g梭菌细胞/天。
系统的平均碳捕获如下。
CO2通过水煤气转化反应在生物反应器120中产生。
虽然本文公开的本公开已经通过特定实施方案、实施例及其应用来描述，但本领域技术人员可以对其进行许多改进和变化而没有背离权利要求书中陈述的本公开的范围。

Claims (32)

1.方法，其包括：
将气态底物Gx提供到生物反应器Bx中，所述气态底物Gx包含CO2并且含有5摩尔％至90摩尔％的CO2和0至50摩尔％的CO；
将产乙酸菌Mx提供到所述生物反应器Bx中，其中所述产乙酸菌Mx包含钠转位ATP酶(sodium translocating ATPase)，在所述生物反应器Bx中所述钠转位ATP酶在发酵期间是活化的；
通过一种或多种钠离子源将钠离子提供到所述生物反应器Bx中；
在包含所述产乙酸菌Mx和所述一种或多种钠离子源的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mx发酵所述气态底物Gx，产生一种或多种有机酸，其中所述发酵培养液包含少于0.01克/升酵母提取物、少于0.01克/升糖类，其中所述钠离子以290至8750μg/克细胞/分钟的钠进料速率提供，并且其中将所述发酵培养液维持在4至6.9的范围内的pH，并且其中用所述产乙酸菌Mx的所述气态底物Gx的发酵提供50-100％的CO2转化；
将所述一种或多种有机酸的至少一部分提供到生物反应器Bi中；
将气态底物Gi提供到所述生物反应器Bi中，所述气态底物Gi包含CO并且含有5摩尔％至90摩尔％的CO；
将产乙酸菌Mi提供到所述生物反应器Bi中，其中所述产乙酸菌Mi包含质子转位ATP酶，在所述生物反应器Bi中所述质子转位ATP酶在发酵期间是活化的；以及
在包含所述产乙酸菌Mi的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mi来发酵所述生物反应器Bi中的所述气态底物Gi，产生包含一种或多种醇的液流和包含CO2的气流Gp，其中将所述气流Gp的至少一部分提供到生物反应器Bx。
2.权利要求1所述的方法，其中将包含一种或多种有机酸的另外的流提供到所述生物反应器Bi中。
3.权利要求1所述的方法，其中所述气态底物Gx包含H2。
4.权利要求1所述的方法，其中所述气态底物Gx和所述气态底物Gi选自工业气体、发酵罐气流及其混合物。
5.权利要求1所述的方法，其中所述产乙酸菌Mx选自凯伍产醋菌(Acetogeniumkivui)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴奇嗜碱菌CP11(Alkalibaculum bacchi CP11)ATCC BAA-1772、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)及其组合。
6.权利要求5所述的方法，其中所述产乙酸菌Mx是伍氏醋酸杆菌。
7.权利要求1所述的方法，其中所述钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠的化合物及其混合物提供。
8.权利要求1所述的方法，其中所述有机酸为一种或多种C1至C10有机酸。
9.权利要求8所述的方法，其中所述有机酸为乙酸。
10.权利要求1所述的方法，其中所述产乙酸菌Mi选自丙酮丁醇梭菌P262德国DSMZ的DSM 19630、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)德国DSMZ的DSM 19630、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 10061、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 23693、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 24138、Clostridium carboxidivorans P7 ATCC PTA-7827、Clostridiumcoskatii ATCC PTA-10522、Clostridium drakei、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)PETC ATCC 49587、杨氏梭菌ER12 ATCC 55380、杨氏梭菌C-01 ATCC 55988、杨氏梭菌O-52ATCC 55889、大梭菌(Clostridium magnum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)德国DSMZ的DSM 525、拉格利梭菌P11(Clostridium ragsdalei P11)ATCC BAA622、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、热醋酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、突那梭菌(Clostridium ultunense)、凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11ATCC BAA-1772、产生性布劳特氏菌(Blautia producta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、地下嗜热厌氧菌(Caldanaerobactersubterraneous)、生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculum kuznetsovii)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、Oxobacter pfennigii、产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus)、产生瘤胃球菌(Ruminococcus productus)、凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、斯氏梭菌(Clostridium Stick-landii)及其组合。
11.权利要求10所述的方法，其中所述产乙酸菌Mi是杨氏梭菌C-01 ATCC 55988。
12.方法，其包括：
将气态底物Gx提供到生物反应器Bx中，所述气态底物Gx包含CO2和H2并且含有5摩尔％至90摩尔％的CO2和0至50摩尔％的CO；
将产乙酸菌Mx提供到所述生物反应器Bx中，其中所述产乙酸菌Mx包含钠转位ATP酶，在所述生物反应器Bx中所述钠转位ATP酶在发酵期间是活化的；
通过一种或多种钠离子源将钠离子提供到所述生物反应器Bx中；
在包含所述产乙酸菌Mx和所述一种或多种钠离子源的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mx发酵所述气态底物Gx，产生一种或多种有机酸，其中所述发酵培养液包含少于0.01克/升酵母提取物、少于0.01克/升糖类，并且其中所述钠离子以290至8750μg/克细胞/分钟的钠进料速率提供，并且其中将所述发酵培养液维持在4至6.9的范围内的pH，并且其中用所述产乙酸菌Mx的所述气态底物Gx的发酵提供50-100％的CO2转化；
将所述一种或多种有机酸的至少一部分提供到生物反应器Bi中；
将气态底物Gi提供到所述生物反应器Bi中，所述气态底物Gi包含CO并且含有5摩尔％至90摩尔％的CO；
将产乙酸菌Mi提供到所述生物反应器Bi中，其中所述产乙酸菌Mi包含质子转位ATP酶，在所述生物反应器Bi中所述质子转位ATP酶在发酵期间是活化的；以及
在包含所述产乙酸菌Mi的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mi来发酵所述生物反应器Bi中的所述气态底物Gi，产生包含一种或多种醇的液流和包含CO2的气流Gp，其中将所述气流Gp的至少一部分提供到生物反应器Bx。
13.权利要求12所述的方法，其中将包含一种或多种有机酸的另外的流提供到所述生物反应器Bi中。
14.权利要求12所述的方法，其中所述气态底物Gx和所述气态底物Gi选自工业气体、发酵罐气流及其混合物。
15.权利要求12所述的方法，其中所述产乙酸菌Mx选自凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11 ATCC BAA-1772、热醋穆尔氏菌、产生瘤胃球菌及其组合。
16.权利要求15所述的方法，其中所述产乙酸菌Mx是伍氏醋酸杆菌。
17.权利要求12所述的方法，其中所述钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠的化合物及其混合物提供。
18.权利要求12所述的方法，其中所述有机酸为一种或多种C1至C10有机酸。
19.权利要求18所述的方法，其中所述有机酸为乙酸。
20.权利要求12所述的方法，其中所述产乙酸菌Mi选自丙酮丁醇梭菌P262德国DSMZ的DSM 19630、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 19630、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 10061、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 23693、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 24138、Clostridiumcarboxidivorans P7 ATCC PTA-7827、Clostridium coskatii ATCC PTA-10522、Clostridium drakei、杨氏梭菌PETC ATCC 49587、杨氏梭菌ER12 ATCC 55380、杨氏梭菌C-01 ATCC 55988、杨氏梭菌O-52 ATCC 55889、大梭菌、巴氏梭菌德国DSMZ的DSM 525、拉格利梭菌P11(Clostridium ragsdali P11)ATCC BAA622、粪味梭菌、热醋酸梭菌、突那梭菌、凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11 ATCC BAA-1772、产生性布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、地下嗜热厌氧菌、生氢氧化碳嗜热菌、库氏脱硫肠状菌、粘液真杆菌、硫还原地杆菌、噬乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、热醋穆尔氏菌、Oxobacterpfennigii、产生消化链球菌、产生瘤胃球菌、凯伍嗜热厌氧菌及其组合。
21.权利要求20所述的方法，其中所述产乙酸菌Mi是杨氏梭菌C-01 ATCC 55988。
22.方法，其包括：
将气态底物Gx提供到生物反应器Bx中，所述气态底物Gx包含CO2并且含有5摩尔％至90摩尔％的CO2和0至50摩尔％的CO；
将产乙酸菌Mx提供到所述生物反应器Bx中，其中所述产乙酸菌Mx包含钠转位ATP酶，在所述生物反应器Bx中所述钠转位ATP酶在发酵期间是活化的；
通过一种或多种钠离子源将钠离子提供到所述生物反应器Bx中；
在包含所述产乙酸菌Mx和所述一种或多种钠离子源的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mx发酵所述气态底物Gx，产生一种或多种有机酸，其中所述发酵培养液包含少于0.01克/升酵母提取物、少于0.01克/升糖类，并且其中所述钠离子以290至8750μg/克细胞/分钟的钠进料速率提供，并且其中将所述发酵培养液维持在4至6.9的范围内的pH，并且其中用所述产乙酸菌Mx的所述气态底物Gx的发酵提供50-100％的CO2转化；
将所述一种或多种有机酸的至少一部分提供到生物反应器系统Bi-s中；
将气态底物Gi提供到所述生物反应器系统Bi-s中，所述气态底物Gi包含CO并且含有5摩尔％至90摩尔％的CO；
将产乙酸菌Mi提供到所述生物反应器系统Bi-s中，其中所述产乙酸菌Mi包含质子转位ATP酶，在所述生物反应器系统Bi-s中所述质子转位ATP酶在发酵期间是活化的；以及
在包含所述产乙酸菌Mi的发酵培养液中用所述产乙酸菌Mi来发酵所述生物反应器系统Bi-s中的所述气态底物Gi，产生包含一种或多种醇的液流和包含CO2的气流Gp，其中将所述气流Gp的至少一部分提供到生物反应器Bx；
其中所述生物反应器系统Bi-s包括两个或更多个生物反应器Bi-n。
23.权利要求22所述的方法，其中将所述气态底物Gi提供到所述两个或更多个生物反应器Bi-n中以达到有效产生每小时10％或更低的培养物体积的表观气体速度来起泡沫。
24.权利要求22所述的方法，其中所述气态底物Gx包含H2。
25.权利要求22所述的方法，其中所述气态底物Gx和所述气态底物Gi选自工业气体、发酵罐气流及其混合物。
26.权利要求22所述的方法，其中所述产乙酸菌Mx选自凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11 ATCC BAA-1772、热醋穆尔氏菌、产生瘤胃球菌及其组合。
27.权利要求26所述的方法，其中所述产乙酸菌Mx是伍氏醋酸杆菌。
28.权利要求22所述的方法，其中所述钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠的化合物及其混合物提供。
29.权利要求22所述的方法，其中所述有机酸为一种或多种C1至C10有机酸。
30.权利要求29所述的方法，其中所述有机酸为乙酸。
31.权利要求22所述的方法，其中所述产乙酸菌Mi选自丙酮丁醇梭菌P262德国DSMZ的DSM 19630、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 19630、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 10061、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 23693、自产乙醇梭菌德国DSMZ的DSM 24138、Clostridiumcarboxidivorans P7 ATCC PTA-7827、Clostridium coskatii ATCC PTA-10522、Clostridium drakei、杨氏梭菌PETC ATCC 49587、杨氏梭菌ER12 ATCC 55380、杨氏梭菌C-01 ATCC 55988、杨氏梭菌O-52 ATCC 55889、大梭菌、巴氏梭菌德国DSMZ的DSM 525、拉格利梭菌P11 ATCC BAA622、粪味梭菌、热醋酸梭菌、突那梭菌、凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11 ATCC BAA-1772、产生性布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、地下嗜热厌氧菌、生氢氧化碳嗜热菌、库氏脱硫肠状菌、粘液真杆菌、硫还原地杆菌、噬乙酸甲烷八叠球菌、巴氏甲烷八叠球菌、热醋穆尔氏菌、Oxobacter pfennigii、产生消化链球菌、产生瘤胃球菌、凯伍嗜热厌氧菌及其组合。
32.权利要求31所述的方法，其中所述产乙酸菌Mi是杨氏梭菌C-01 ATCC 55988。
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