CN112679482A - 一种基于伊曲康唑的Smo抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于伊曲康唑的Smo抑制剂及其制备方法和应用，该Smo抑制剂的结构式如式(Ⅰ)所示；本发明还公开了其制备方法和应用。本发明以对伊曲康唑为先导化合物，并在其基础上进行优化改造，并获得良好抑制活性的Smo抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及Smo抑制剂，尤其涉及一种基于伊曲康唑的Smo抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术
Hedgehog信号通道在人类胚胎发育和成体组织稳态中起着关键作用，它包含几个关键成分(1)Hh配体；(2)Patched受体(Ptch)；(3)Smoothened受体(Smo)；(4)胶质细胞相关癌基因同源物(Gli)。Hedgehog信号通道的异常会导致包括癌症在内的许多人类疾病，最典型的有基底细胞癌(BBC)、瘤母细胞瘤等。利用针对Smo蛋白的抑制剂来抑制Hh信号通路是目前最为活跃的研究领域。目前已有三个针对Smo蛋白的小分子抑制剂被FDA批准上市，Vismodegib(GDC-0449)、Sonidegib(NVP-LDE-225)和Glasdegib(PF-04449913)，这些小分子抑制剂在癌症治疗过程中取得了一定的成果，但也逐渐产生了耐药性，例如Smo受体D473H突变，因此迫切需要开发新型的具有良好抑制活性的抑制剂。伊曲康唑(Itraconazole)是一种广谱性的抗菌药物，其结构如下所示。由于其独特的生物性质，已经作为Smo抑制剂进入临床Ⅱ期试验，用于治疗基底细胞癌、急性髓系白血病、前列腺癌、肺癌等。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种基于伊曲康唑的Smo抑制剂。本发明的另一个目的是提供该伊曲康唑的Smo抑制剂的制备方法。本发明还有一个目的是提供该伊曲康唑的Smo抑制剂在制备治疗骨肉瘤、基底细胞瘤药物中的应用。
技术方案：本发明所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂，包含结构如(Ⅰ)所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中，Y为碳原子数为n(n＝0-5)的烷基链，Z为未取代或取代的芳香环。
所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂，所述化合物选自下述化合物H-1～H-11：
所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂的制备方法，包含如下步骤(1)(2)(3)或(1)(2)(4)：
(1)化合物3和化合物4通过取代反应制备化合物5，具体为将化合物3和化合物4溶于有机溶剂中，加入碱，反应时间为5-7小时，反应温度为60-90℃；有机溶剂选择二甲基亚砜，碱选自氢氧化钠或碳酸铯；
(2)化合物5通过还原反应制备化合物6，具体为将化合物5溶于有机溶剂中，加入催化剂，反应温度为70-90℃，加热10-30min后，加入还原剂，反应3-4小时，用乙醇重结晶，制得化合物6；有机溶剂选择乙醇，催化剂为钯碳，还原剂为80％水合肼；
(3)化合物6通过酰胺反应生成化合物H-(1-11)，制备时将羧酸与缚酸剂、缩合剂、催化剂溶于有机溶剂中，搅拌，再加入溶有化合物6的有机溶剂，反应时间为10-12小时；有机溶剂选择N,N-二甲基甲酰胺，缚酸剂选自N-甲基吗啉，缩合剂选自HATU、HBTU、DCC、EDCI/HOBT，催化剂选自DMAP；
(4)化合物6通过酰氯反应生成化合物H-(1-11)，制备时将苯甲酸溶于有机溶剂，然后将酰氯逐滴加入，并滴加DMF，低温搅拌，室温搅拌，加入化合物6，冷却，然后将酰氯逐滴加入，随后加入缚酸剂，在室温下反应；有机溶剂选择二氯甲烷，缚酸剂选自三乙胺、DIPEA。
药物组合物，包含所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂。
所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂在制备Smo抑制剂中的应用。
所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂在制备治疗骨肉瘤、基底细胞瘤药物中的应用。
有益效果：本发明的Smo抑制剂在抗菌药物伊曲康唑的结构基础上，通过药效团整合、生物电子等排、同系物衍生化等方法，配合计算机模拟对接技术，设计具有活性高、类药性的目标化合物，同时通过Gli-荧光素酶报告基因测试、BODIPY环巴胺竞争性结合测试和抑制基底细胞瘤增殖与活性实验得到了比先导物伊曲康唑活性更高的小分子，为药物的开发提供了理想的候选化合物。本发明的Smo抑制剂提供了一种克服Smoothened的耐药性突变的新型的具有良好抑制活性的Smo抑制剂。
具体实施方式
本发明中，所采用的药效学试验方法，是本领域技术人员所熟用的方法；所采用的所用原料是本领域技术人员可通过市购的途径所获得的。
实施例1
化合物H-(1-11)的合成路线如下所示：
1.化合物3即4-[4-硝基苯基]-1-哌嗪基苯酚的制备
在圆底烧瓶中加入化合物1即4-哌嗪基苯酚(7.42g)，化合物2即1-氯-4-硝基苯(6.3g)，加入无水DMSO(80ml)中。加入K2CO3(6.0g)和相转移催化剂TBAB，120摄氏度下回流10-12h，用TLC点板检测反应是否反应完全，待反应完全后，将反应冷却至RT，加入水，析出固体，将固体过滤后干燥，柱层析纯化得到纯品化合物3。
化合物3的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.91(s,1H),8.12–8.02(m,2H),7.15–7.01(m,2H),6.88–6.79(m,2H),6.73–6.65(m,2H),3.63–3.55(m,4H),3.15–3.03(m,4H).
MS calcd for C16H17N3O3[M+H]+m/z:300.1270,found 300.1343
2.化合物5即1-[4-[[(2R,4S)-2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1,3-二恶唑-4-基]甲氧基]苯基]-4-硝基哌嗪的制备
在干燥的圆底烧瓶中依次加入DMSO(20mL)、化合物3(0.5g,1.67mmol),化合物4(0.75g,1.1eq)、碳酸铯(5.44g,10eq)。在油浴锅90摄氏度下回流搅拌12h。待反应结束后，将反应液冷却至室温，缓慢加入约20mL水，剧烈搅拌，有黄色沉淀产生。用布氏漏斗进行抽滤。柱层析纯化得到纯品化合物5.
化合物5的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.40(s,1H),8.09(d,J＝9.4Hz,2H),7.86(s,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.43(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.10(d,J＝9.5Hz,2H),6.97(d,J＝9.1Hz,2H),6.86(d,J＝9.1Hz,2H),4.88–4.77(m,2H),4.39–4.32(m,1H),3.92(dd,J＝8.4,6.7Hz,1H),3.75(ddt,J＝13.0,10.3,5.1Hz,3H),3.64–3.55(m,4H),3.21–3.13(m,4H).
MS calcd for C29H28Cl2N6O5[M+H]+m/z:611.1498,found 611.1565
3.化合物6即1-[4-[[(2R,4S)-2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1,3-二恶唑-4-基]甲氧基]苯基]-4-氨基哌嗪的制备
在干燥的圆底烧瓶中加入10％钯碳(0.09g)，乙醇(60mL)，化合物(0.81g,1.32mmol),充氮气进行保护，再缓慢滴加水合肼(1.2mL),将混合液在油浴锅80摄氏度下回流搅拌3.5h。用TLC检测反应进程，待反应结束后，将反应液冷却至室温，通过硅藻土抽滤，并用乙醇清洗，确保化合物6完全洗脱，将滤液减压浓缩，得类白色固体，用乙醇重结晶得到化合物6。
化合物6的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.41(s,1H),7.87(d,J＝3.3Hz,1H),7.68(d,J＝2.1Hz,1H),7.50(t,J＝7.3Hz,1H),7.45–7.41(m,1H),6.94(d,J＝9.1Hz,2H),6.86–6.81(m,2H),6.75(d,J＝8.8Hz,2H),6.52(d,J＝8.7Hz,2H),4.84–4.78(m,2H),4.59(s,2H),4.38–4.33(m,1H),3.91(ddd,J＝11.3,8.0,6.4Hz,1H),3.80–3.69(m,3H),3.16–3.13(m,4H),3.06–3.03(m,4H).
MS calcd for C29H30Cl2N6O3[M+H]+m/z:581.1756,found 581.1815
4.化合物H-1即N-(4-(4-(4-(((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)甲基)-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)-4-苯基丁酰胺的制备
将4-苯基丁酸(0.102g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-1。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-1的检测数据如下：
1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.70(s,1H),8.42(s,1H),7.88(d,J＝2.2Hz,1H),7.69–7.65(m,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.48(d,J＝9.0Hz,2H),7.44–7.41(m,1H),7.32–7.29(m,2H),7.21(dd,J＝16.5,7.6Hz,4H),6.96(dd,J＝10.7,9.3Hz,4H),6.89–6.86(m,2H),4.84(t,J＝5.1Hz,2H),4.37(p,J＝5.6Hz,1H),3.95–3.91(m,1H),3.81–3.74(m,3H),3.22(d,J＝5.7Hz,4H),3.18(d,J＝5.3Hz,4H),2.63(d,J＝7.7Hz,2H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),1.92(dd,J＝15.2,7.6Hz,2H).
MS calcd for C38H38Cl2N6O4[M+H]+m/z:713.2332,found 713.2336
5.化合物H-2即N-(4-(4-(4-(((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)甲基)-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)-3-苯基丙酰胺的制备
将3-苯基丙酸(0.093g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-2。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-2的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.71(s,1H),8.41(s,1H),7.88(d,J＝3.3Hz,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),7.50(dd,J＝8.8,5.1Hz,1H),7.46(d,J＝9.0Hz,2H),7.44–7.41(m,1H),7.31–7.24(m,4H),7.19(t,J＝7.1Hz,1H),6.95(dd,J＝12.6,9.1Hz,4H),6.84(t,J＝11.4Hz,2H),4.89–4.76(m,2H),4.40–4.32(m,1H),3.96–3.88(m,1H),3.82–3.68(m,3H),3.24–3.13(m,8H),2.91(t,J＝7.7Hz,2H),2.59(t,J＝7.8Hz,2H).
MS calcd for C37H36Cl2N6O4[M+H]+m/z:713.2332,found 713.2396
6.化合物H-3即N-(4-(4-(4-(((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)甲基)-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)-5-苯基戊酰胺的制备
将5-苯基戊酸(0.111g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-3。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-3的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.21(d,J＝5.3Hz,1H),7.93–7.85(m,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.46(t,J＝7.4Hz,1H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.28(d,J＝6.4Hz,1H),7.23(d,J＝4.0Hz,2H),7.17(d,J＝7.2Hz,3H),6.92(t,J＝7.3Hz,4H),6.79(d,J＝8.7Hz,2H),4.92–4.70(m,2H),4.36(dd,J＝10.9,5.4Hz,1H),3.93(dd,J＝27.1,19.3Hz,1H),3.85–3.73(m,2H),3.55–3.43(m,1H),3.27(d,J＝4.4Hz,4H),3.22(d,J＝4.1Hz,4H),2.65(t,J＝7.3Hz,2H),2.33(t,J＝7.2Hz,2H),1.76(dd,J＝14.5,7.3Hz,2H),1.71(dd,J＝14.7,7.6Hz,2H).
MS calcd for C40H42Cl2N6O4[M+H]+m/z:741.2695,found 741.2687
7.化合物H-5即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-2-)(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)戊酰胺的制备
将正戊酸(0.0634g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-5。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-5的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),8.39(d,J＝17.7Hz,1H),7.87(d,J＝3.3Hz,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),7.51(dd,J＝9.7,4.8Hz,1H),7.47(d,J＝9.0Hz,2H),7.44–7.40(m,1H),6.95(dd,J＝15.7,9.1Hz,4H),6.85(dd,J＝7.4,5.4Hz,2H),4.86–
4.76(m,2H),4.38–4.32(m,1H),3.94–3.88(m,1H),3.80–3.69(m,3H),3.25–3.19(m,4H),3.18–3.11(m,4H),2.26(t,J＝7.5Hz,2H),1.61–1.51(m,2H),1.37–1.30(m,3H).
MS calcd for C34H38Cl2N6O4[M+H]+m/z:665.2332,found 665.2396
8.化合物H-6即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-2-)(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)丁酰胺的制备
将正丁酸(0.054g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-6。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-6的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.65(s,1H),8.41(s,1H),7.87(s,1H),7.67(d,J＝2.0Hz,1H),7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.46(d,J＝8.9Hz,2H),7.42(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),6.96–6.92(m,4H),6.85(d,J＝9.0Hz,2H),4.87–4.76(m,1H),4.38–4.34(m,1H),3.91(d,J＝6.8Hz,1H),3.79–3.71(m,4H),3.22–3.19(m,4H),3.16–3.15(m,4H),2.25(d,J＝7.5Hz,2H),1.56(d,J＝7.5Hz,2H),1.33(dd,J＝14.7,7.1Hz,2H),0.90(d,J＝7.4Hz,3H).
MS calcd for C33H36Cl2N6O4[M+H]+m/z:651.2247,found 651.2239
9.化合物H-7即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-2-)(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)丙酰胺的制备
将丙酸(0.046g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-7。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-7的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.63(s,1H),8.41(s,1H),7.86(s,1H),7.67(d,J＝1.9Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.46(d,J＝8.9Hz,2H),7.43(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),6.94(dd,J＝14.5,9.0Hz,4H),6.87–6.81(m,2H),4.85–4.78(m,2H),4.36(dd,J＝11.3,5.6Hz,1H),3.91(dd,J＝16.4,9.6Hz,1H),3.81–3.67(m,3H),3.23–3.18(m,4H),3.16(d,J＝3.1Hz,4H),2.27(q,J＝7.5Hz,2H),1.07(t,J＝7.6Hz,3H).
MS calcd for C32H34Cl2N6O4[M+H]+m/z:637.2091,found 637.2072
10.化合物H-8即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)甲基)-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)噻吩-2-羧酰胺的制备
将2-甲基噻吩酸(0.080g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-8。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-8的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.07(s,1H),8.41(s,1H),7.98(d,J＝3.2Hz,1H),7.87(d,J＝3.3Hz,1H),7.82(d,J＝5.0Hz,1H),7.66(t,J＝9.4Hz,1H),7.59(d,J＝8.9Hz,2H),7.53–7.47(m,1H),7.45–7.40(m,1H),7.21(dd,J＝4.7,3.9Hz,1H),7.00(d,J＝9.0Hz,2H),6.96(d,J＝9.0Hz,2H),6.85(dd,J＝8.8,4.6Hz,2H),4.88–4.76(m,2H),4.36(dt,J＝11.3,5.6Hz,1H),3.91(dt,J＝11.8,7.7Hz,1H),3.80–3.67(m,3H),3.28–3.22(m,4H),3.20–3.13(m,4H).
MS calcd for C34H32Cl2N6O4S[M+H]+m/z:691.1583,found 691.1579
11.化合物H-9即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)甲基)-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)-2-(噻吩-2-基)乙酰胺的制备
将2-噻吩乙酸(0.089g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-9。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-9的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.00(s,1H),8.41(s,1H),7.86(d,J＝3.3Hz,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),7.52–7.49(m,1H),7.47(d,J＝9.0Hz,2H),7.44–7.41(m,1H),7.37(dd,J＝8.4,5.5Hz,1H),6.99–6.97(m,2H),6.95(dd,J＝9.2,3.0Hz,4H),6.84(dd,J＝8.9,4.6Hz,2H),4.85–4.78(m,2H),4.38–4.33(m,1H),3.94–3.89(m,1H),3.82(s,2H),3.79–3.70(m,3H),3.21(dd,J＝6.4,3.1Hz,4H),3.18–3.13(m,4H),2.18(t,J＝7.4Hz,1H).
MS calcd for C35H34Cl2N6O4S[M+H]+m/z:705.1739found 705.1736
12.化合物H-10即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-2-)(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)呋喃-2-羧酰胺的制备
将2-糠酸(0.07g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-10。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-10的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.71(s,1H),8.41(s,1H),7.88(d,J＝3.3Hz,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),7.50(dd,J＝8.8,5.1Hz,1H),7.46(d,J＝9.0Hz,2H),7.44–7.41(m,1H),7.31–7.24(m,4H),7.19(t,J＝7.1Hz,1H),6.95(dd,J＝12.6,9.1Hz,4H),6.84(t,J＝11.4Hz,2H),4.89–4.76(m,2H),4.40–4.32(m,1H),3.96–3.88(m,1H),3.82–3.68(m,3H),3.24–3.13(m,8H),2.91(t,J＝7.7Hz,2H),2.59(t,J＝7.8Hz,2H).
MS calcd for C34H32Cl2N6O5[M+H]+m/z:675.1811,found 675.1820
13.化合物H-11即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-2-)(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)-5-甲基呋喃-2-羧酰胺的制备
将5-甲基-2-糠酸(0.078g)和HATU(0.385g)加入圆底烧瓶中，用无水DMF溶解，再加入NMM(0.207g)，混合后在室温下搅拌20-30min，将化合物6(0.3g)溶于无水DMF中再加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌10-12h。用TLC检测反应进程，待反应完成后，加入大量水，有固体析出，用布氏漏斗过滤得到固体，干燥后柱层析得到纯化合物H-11。
也可以用HBTU、DCC、EDCI/HOBT替换HATU，添加催化剂DMAP，其他反应条件不变。
化合物H-11的检测数据如下：
1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.87(s,1H),8.42(s,1H),7.88(d,J＝3.5Hz,1H),7.67(d,J＝2.1Hz,1H),7.62(d,J＝9.0Hz,2H),7.53–7.49(m,1H),7.44–7.40(m,1H),7.19(d,J＝3.2Hz,1H),6.97(dd,J＝13.1,9.1Hz,4H),6.85(dd,J＝9.0,4.3Hz,2H),6.32–6.28(m,1H),4.87–4.77(m,2H),4.38–4.32(m,1H),3.94–3.89(m,1H),3.79–3.67(m,3H),3.23(d,J＝5.3Hz,4H),3.16(d,J＝4.8Hz,4H),2.38(s,3H).
MS calcd for C35H34Cl2N6O5[M+H]+m/z:689.1968,found 689.1976
14.化合物H-4即N-(4-(4-(4-((((2S，4R)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-2-)(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)苯基)-2-氯-4-(三氟甲基)苯甲酰胺的制备
将3-氯-4-三氟甲基苯甲酸(0.037g)溶于DCM(10mL)中，然后加入草酰氯(2mol/Lin DCM,1.5mL)和DMF(1滴)，混合物在0℃下搅拌20min。然后反应混合物在室温下搅拌2小时直至气泡停止，然后减压浓缩，得到的产物溶于干燥的DCM(2mL)，并与氮气下保持酰化。
将化合物6(0.244g)溶于2.6mL上述溶有产物的DCM中，冷却至0℃，然后将酰氯逐滴加入，时候加入DIPEA(0.06g)，在室温下反应，用TCL检测直至反应完全，柱层析纯化得到化合H-4。
也可以用三乙胺替换DIPEA。其他反应条件不变。
化合物H-4的检测数据如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,1H),8.40(s,1H),7.86(s,1H),7.78(d,J＝3.1Hz,1H),7.76–7.73(m,1H),7.70–7.59(m,2H),7.56–7.49(m,3H),7.42(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.03–6.94(m,4H),6.85(dd,J＝9.1,2.3Hz,2H),4.82(d,J＝4.1Hz,2H),4.35(q,J＝5.5Hz,1H),3.92(dd,J＝8.4,6.5Hz,1H),3.79–3.69(m,3H),3.25(dd,J＝6.8,3.2Hz,4H),3.18(d,J＝5.3Hz,4H).
MS calcd for C37H32Cl3F3N6O4[M+H]+m/z:787.1503,found 787.1521
实施例2
目标化合物的体外活性评价
以下体外活性评价方法为常规方法，本领域技术人员可按照常规手段自行检测，也可以委托生物公司进行检测。
(1)Hh信号通道的抑制活性一Gli荧光素酶报告基因测试
操作步骤：
1.将NIH3T3细胞置于10％FBS和1％青霉素链霉素溶液的DMEM培养液中培养；
2.待上述细胞生长到定浓度时，用Lipo2000试剂将Gli-lucifePase reporter和TK--Renilla luciferase reporter载体转染上述细胞；
3.用Sonic Hedgehog(SHHN)刺激转染Gli-luciferase报告基因的ASZ细胞，将转染后的细胞接种到80uL96孔板(每孔1x 101个)培养基中，在5％C02、37℃下孵育18-48h；
4.加入不同浓度化合物(0.1-10000nM，10倍稀释，共6个浓度)，继续培养48h，并设置空白对照组(不加样品，其余各操作相同)；
5.培养完成后，利用双荧光素酶报告检测试剂盒(供应商haoranbio)测定细胞内的荧光素酶活性，根据荧光素酶活性，判断化合物抑制活性。如果抑制活性较强(抑制率大于50％)，则根据四参数法计算IC50。
(2)BODIPY环巴胺竞争性结合测试
操作步骤:
1、用Smo高表达的U20S细胞，转染SM0-HA-PLVX(供应商上海机纯实业有限公司)，并用嘌呤霉素筛选稳定克隆的U2OS--SMO细胞，保存于L谷氨酰胺4mM,NaHCO31.5g/L，嘌呤霉素100ng/ml，10％胎牛血清，葡萄糖4.5g/L培养液中。
2、将U20S-SM0细胞接种于96孔板中，150ul/孔(含细胞6000个/孔)。在37℃下培养48h。
3、使用4％的多聚甲醛固定U20S-SM0细胞20min，除去多聚甲醛缓冲液，用DAPI(5μg/ml)培养细胞10min，再用磷酸盐缓冲液冲洗2次。冲洗完之后，将细胞置于含有100nMBODIPY-环巴胺和一系列浓度梯度的化合物的磷酸缓冲液中，室温下孵育2h。
4、使用PBST缓冲液冲洗细胞三次，然后用酶标仪检测荧光强度，抑制率抑制率(％)由与空白组比值来计算，采用GraphPadPrism5.0软件计算IC50值。
所有实验结果均经统计处理，实验结果如下表1：
表1.Li荧光素酶报告基因测试以及BODIPY环巴胺竞争性结合测试数据IC50(uM)
| 化合物 | Gli-lucrepoter IC<sub>50</sub>(uM) | Smo-BCB IC<sub>50</sub>(uM) |
| 伊曲康唑 | 0.94 | 0.76 |
| H-1 | 0.56 | 0.44 |
| H-2 | 0.82 | 0.71 |
| H-3 | 0.98 | 0.82 |
| H-9 | 0.21 | 0.33 |
| H-10 | 0.11 | 0.09 |
结果分析：经过改造后的衍生物基本能取得与先导化合物伊曲康唑相近或更优的抑制活性。其中化合物H-1、H-9和H-10表现优越，尤其化合物H-9、H-10优于对照伊曲康唑。这一结果显示了，以对Smo具有活性的伊曲康唑为先导化合物，并在其基础上进行优化改造制备新型的Smo抑制剂的可行性。
(3)抑制ASZ肿瘤增殖与活性实验
采用MTT比色法检测待测化合物对小鼠BCC细胞系ASZ-001细胞增殖及毒性。用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值(OD值)可定量显示活细胞比例。若实验测得的OD值越大，说明活细胞数量越多(或表示药物毒性越小)。实验所用细胞均为指数生长期。
操作步骤：
1、用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液(含2000mg/L葡萄糖，300mg/L谷氨酰胺，25mMHEPES(5958mg/L)，2000mg/L碳酸氢钠，5mg/L酚红，双抗，培养ASZ细胞，并将培养基置于37℃含5％CO2的潮湿环境中。
2、将ASZ细胞以1×105细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板上。培养36h后,将ASZ细胞接种于浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.10μg/ml、0.01μg/ml的含待测化合物和对照药物奈必洛尔溶液中(DMSO为溶剂)。在37℃、5％CO2的潮湿空气中培养48h。
3、向每孔中加入20μL MTT溶液(6mg/ml，pH＝7.4，PBS为溶剂))继续培养5h。
4、将96孔板进行离心处理，去除培养液。向每孔中加入150μLDMSO，振荡12min使晶体溶解。用酶标仪在波长570nm下测量每孔的光密度(OD)。细胞增殖抑制率计算如下：抑制率(％)＝[1-OD570(处理)/OD570(对照组)]×100％。
采用中值效应法对数据进行分析，计算抑制细胞增殖50％的药物剂量IC50值。所有实验结果均经统计处理，实验结果如下表2：
表2.化合物抑制ASZ肿瘤细胞增殖实验数据(uM)
| 化合物 | ASZ cells IC<sub>50</sub>(uM) |
| 伊曲康唑 | 0.85 |
| H-1 | 0.34 |
| H-2 | 0.93 |
| H-3 | 0.87 |
| H-9 | 0.15 |
| H-10 | 0.11 |
结果分析：经过对改造后的衍生物进行抑制小鼠BCC细胞系ASZ-001肿瘤细胞增殖实验，其中化合物H-1、H-9、H-10表现较好，均优于对照伊曲康唑，对基底细胞瘤有抑制作用。综合以上结果可知，以伊曲康唑为先导化合物，并在其基础上进行优化改造制备新型的Smo抑制剂的可行性。
Claims (7)
1.一种基于伊曲康唑的Smo抑制剂，其特征在于，包含结构如(Ⅰ)所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中，Y为碳原子数为n(n＝0-5)的烷基链，Z为未取代或取代的芳香环。
2.根据权利要求1所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂，其特征在于，所述化合物选自下述化合物H-1～H-11：
3.一种权利要求1所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)化合物3和化合物4通过取代反应制备化合物5，具体为将化合物3和化合物4溶于有机溶剂中，加入碱，反应时间为5-7小时，反应温度为60-90℃；有机溶剂选择二甲基亚砜，碱选自氢氧化钠或碳酸铯；
(2)化合物5通过还原反应制备化合物6，具体为将化合物5溶于有机溶剂中，加入催化剂，反应温度为70-90℃，加热10-30min后，加入还原剂，反应3-4小时，用乙醇重结晶，制得化合物6；有机溶剂选择乙醇，催化剂为钯碳，还原剂为80％水合肼；
(3)化合物6通过酰胺反应生成化合物H-(1-11)，制备时将羧酸与缚酸剂、缩合剂、催化剂溶于有机溶剂中，搅拌，再加入溶有化合物6的有机溶剂，反应时间为10-12小时；有机溶剂选择N,N-二甲基甲酰胺，缚酸剂选自N-甲基吗啉，缩合剂选自HATU、HBTU、DCC、EDCI/HOBT，催化剂选自DMAP。
4.一种权利要求1所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(a)化合物3和化合物4通过取代反应制备化合物5，具体为将化合物3和化合物4溶于有机溶剂中，加入碱，反应时间为5-7小时，反应温度为60-90℃；有机溶剂选择二甲基亚砜，碱选自氢氧化钠或碳酸铯；
(b)化合物5通过还原反应制备化合物6，具体为将化合物5溶于有机溶剂中，加入催化剂，反应温度为70-90℃，加热10-30min后，加入还原剂，反应3-4小时，用乙醇重结晶，制得化合物6；有机溶剂选择乙醇，催化剂为钯碳，还原剂为80％水合肼；
(c)化合物6通过酰氯反应生成化合物H-(1-11)，制备时将羧酸溶于有机溶剂，然后将草酰氯逐滴加入，并滴加DMF，低温搅拌，室温搅拌，生成酰氯；加入化合物6，冷却，然后将酰氯逐滴加入，随后加入缚酸剂，在室温下反应；有机溶剂选择二氯甲烷，缚酸剂选自三乙胺、DIPEA。
5.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-2中任意一项所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂。
6.如权利要求1所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂在制备Smo抑制剂中的应用。
7.如权利要求1所述的基于伊曲康唑的Smo抑制剂在制备治疗骨肉瘤、基底细胞瘤药物中的应用。
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|---|
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