CN112675821A - 基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用，该磁性共价有机框架材料由Fe₃O₄纳米磁球、包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的共价有机框架层构成；制备方法的工艺步骤为：采用外延生长方式在高分子聚合物中间层包覆Fe₃O₄纳米磁球的纳米粒子表面再包裹上COF层。该磁性共价有机框架材料在糖肽富集方面表现出特异性高、结合能力强、富集效率高、回收效率好等优势，在研究生理行为糖基化过程中具有十分重要的意义，且制备方法简化。

Description

基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其 制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及磁性共价有机框架材料及其制备方法与糖肽富集中的应用。

背景技术

现有磁性共价有机框架材料是由磁性纳米球及包裹在磁性纳米球表面的共价有机框架(covalent organic frameworks，COFs)构成，在具有良好磁响应性能的同时，兼具了COFs的孔隙率高、高度有序介孔、有机配体丰富以及结构稳定等独特性质。因此，近年来磁性共价有机框架材料备受关注，已经被广泛应用于生物医学领域，尤其是蛋白或多肽分离、药物传递、磁共振成像等方面。

目前磁性共价有机框架材料对于糖肽的富集应用主要是采用亲水作用色谱方法，即主要利用共价有机框架的亲水性来对于糖肽进行富集。

Chunhui Deng等公开了一种共价有机框架修饰的磁性复合材料的制备方法，并给出了该复合材料在糖肽富集方面的应用，该共价有机框架修饰的磁性复合材料以纳米磁球为基底材料，然后通过溶胶凝胶法在纳米磁球表面包裹上修饰了氨基的二氧化硅层，最后再在表面修饰一层以2，4，6-三羟基-1，3，5-苯三甲醛和联苯胺为有机配体的共价有机框架层，即获得该共价有机框架修饰的磁性复合材料，该磁性复合材料基于共价有机框架的亲水性能用于糖肽的富集(Construction of Magnetic Covalent Organic Frameworkswith Inherent Hydrophilicity for Efficiently Enriching EndogenousGlycopeptides in Human Saliva，ACS Appl.Mater.Interfaces 2020，12，9814-9823，Chunhui Deng等)。然而，由于亲水作用色谱方法对于糖肽富集的特异性较差，使得上述基于共价有机框架复合材料对于糖肽的富集性能并不是十分理想。

专利申请号为CN201910952400.5公开了一种用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，其由Fe₃O₄纳米磁球、包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的共价有机框架层、接枝于共价有机框架层上的谷胱甘肽(GSH)构成；共价有机框架层是由1，3，5-三(4-氨苯基)苯和2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛经加成反应得到，谷胱甘肽经巯烯点击反应修饰于共价有机框架层上。该磁性共价有机框架材料是通过修饰于有机框架上的亲水的两性离子GSH来提高共价有机材料的亲水性能，以实现对糖肽的富集。虽然这样能够有效改善共价有机框架的亲水性能。然而，需要经过后续繁琐的巯烯点击反应才能将GSH修饰到共价有机框架上，从而难以在生物医药领域内推广。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用，以便在简化制备方法的同时，实现共价有机框架材料对于糖肽富集的特异性和高效性。

本发明提供的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，由Fe₃O₄纳米磁球、包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的共价有机框架层构成；所述高分子聚合物中间层为聚乙烯吡咯烷铜和聚乙烯亚胺的混合物，聚乙烯吡咯烷铜和聚乙烯亚胺的混合物包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面形成球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子；所述共价有机框架层是由1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸按照物质的量之比1：1.5：0.3～1.5经加成反应得到的刺状结构。

上述基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，呈现完整的球形，表面是刺状结构，粒径均匀且分布较窄，平均粒径为260～390nm左右，这种形状规整、尺寸均匀的纳米粒子比较适合用于蛋白和多肽的富集与分离应用。

上述基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，以超顺磁性四氧化三铁(Fe₃O₄纳米磁球)作为内核，具有高的磁饱和强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能；本发明采用的Fe₃O₄纳米磁球占磁性共价有机框架材料质量的46％左右，从而使磁性共价有机框架材料的饱和磁化强度达到48emu g^-1左右。包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的COF层具有高的孔隙率、高度有序的介孔以及大的比表面积，其比表面积高达311m²/g，从而有利于糖肽的富集应用。上述高分子聚合物中间层的原料选用聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其中聚乙烯亚胺(PEI)的作用为提供氨基，可以保证共价有机框架在磁球表面外延生长，不形成游离的共价有机框架结构，而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的作用为保证磁球在反应体系中一直是处于悬浮的状态，从而保证合成出来的磁性共价有机框架材料单分散不团聚，粒径也较为均匀。上述COFs层的原料选用1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛和4-甲酰基苯硼酸三种有机配体。其中对于2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛有机配体，一方面其为合成共价有机框架的组分之一，同时其剩余的羟基提供亲水性能，赋予该材料亲水性能用于糖肽富集；而4-甲酰基苯硼酸的引入提供硼酸基团，可基于苯硼酸亲和色谱方法用于糖肽的富集，因此该磁性共价有机框架材料拥有两种对于糖肽富集的亲和位点，从而实现对糖肽的高效率富集。

本发明提供了一种基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，主要是通过外延生长的机理来实现，在比较温和的条件下通过外延生长的方法在包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的高分子聚合物中间层的表面再包裹一层共价有机框架层(三种配体通过共价键作用形成COFs层)。

本发明所述基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，步骤如下：

(1)在超声条件下，将球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸加入溶剂中，混合分散均匀形成混合液Ⅰ；所述Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、1，3，5-三(4-氨苯基)苯的质量比为5：(1～3)；所述1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸的物质的量之比1：1.5：(0.3～1.5)；

(2)向步骤(1)形成的混合液Ⅰ中滴加醋酸形成反应体系，将所得反应体系于室温下静置孵育1～4h，然后继续向反应体系滴加醋酸，并于60～80℃下静置孵育2～6h，孵育结束后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物Ⅰ，将所得固体产物Ⅰ进行洗涤除去吸附在表面未反应的物料，得到Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子上生长有共价有机框架层的复合材料，即基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料；

第一次滴加醋酸时，所述1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸质量之和与醋酸的体积比为14.5：(0.1～0.6)，第二次滴加醋酸时，所述1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸质量之和与醋酸的体积比为14.5：(0.6～2.0)，质量的单位为mg，体积的单位为mL。

上述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，所述球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子主要以Fe₃O₄纳米磁球，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯亚胺(PEI)为原料，以去离子水为溶剂在室温搅拌的条件制备。Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子的制备步骤如下：

将聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺溶解于去离子水中形成混合液Ⅱ，在超声条件下，将Fe₃O₄纳米磁球加入上述混合液Ⅱ中混合分散均匀后再于室温下搅拌至少24h，之后进行磁分离并收集分离出的固体物Ⅱ，将所得固体物Ⅱ进行洗涤除去吸附在表面的物料，干燥至恒重，得到聚乙烯吡咯烷铜和聚乙烯亚胺的混合物包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面形成的球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子；

所述聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺物质的量之比为5：1～5，所述Fe₃O₄纳米磁球与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1～4：20。所述去离子水的用量为能够完全溶解聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺。

制备Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子的具体实现方式也可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见Multi-affinity sites of magnetic guanidylfunctionalizedmetal–organic framework nanospheres for efficient enrichment of globalphosphopeptides，Nanoscale，2018，10，8391-8396，Yao Wu等。

Fe₃O₄纳米磁球的制备方法也是相对成熟，Fe₃O₄纳米磁球主要是以氯化铁、醋酸钠、柠檬酸钠为原料，以乙二醇为溶剂的水热法合成粒径大概在200nm～250nm的超顺磁性四氧化三铁纳米球；此外通过调节水热反应时间可调控磁球粒径分布。制备Fe₃O₄纳米磁球的具体实现方式可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见The design andsynthesis of a hydrophilic core-shell-shell structured magnetic metal-organicframework as a novel immobilized metal ion affinity platform forphosphoproteome research Chem.Commun.，2014，50，6228-6231，Chunhui Deng等以及Ti^{4 +}-immobilized multilayer polysaccharide coated magnetic nanoparticles forhighly selective enrichment of phosphopeptides J.Mater.Chem.B 2014，2，4473-4480，Hanfa Zou等。

上述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，三种配体是通过加成反应制备得到COF层的，其中醋酸作为催化剂，Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子作为载体。在超声条件下，将Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛和4-甲酰基苯硼酸混合分散均匀，一般超声5～10min即可。溶剂可以采用本领域常规溶剂，在本发明中，优选正丁醇和二氧六环混合溶剂，其用量只要能够将1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛和4-甲酰基苯硼酸完全溶解，并使Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子分散均匀即可，其中正丁醇和二氧六环的体积比控制为1：1。之后向混合液中加入醋酸，所得混合液在室温的条件下静置孵育1～4小时，然后继续向反应体系中加入醋酸水溶液，于60～80℃条件下反应2～6小时。第一次滴加醋酸浓度为17.5M；第二次滴加醋酸水溶液浓度为12M，经研究发现，降低第二次滴加醋酸浓度，引入一定比例的水，能够使孵育反应更加完全。孵育结束后，反应液中的固体产物即为Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子。因此将反应液进行固液分离、并对固体产物进行洗涤，即得到Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子。洗涤的目的是除去吸附在固体产物表面未反应的物料，本发明中采用的洗涤方式为：将分离出的固体产物依次用无水四氢呋喃、丙酮、乙醇、去离子水洗涤，一般每种洗液洗涤3～5遍即可。

本发明进一步提供了所述磁性共价有机框架材料在内源性糖肽富集中的应用。所述磁性共价有机框架材料对于生物样本中的糖肽具有很好的富集效果，尤其是在对于大鼠肝提取蛋白消化液中的糖肽富集过程中显现出极其优异的性能，在研究生理行为蛋白糖基化过程中具有很重要的意义。

本发明所述磁性共价有机框架材料富集糖肽的操作为：

(1)对糖肽的吸附：首先将糖基化蛋白免疫球蛋白G用胰蛋白酶消化成糖肽，并用缓冲液进行稀释，然后加入本发明所述磁性共价有机框架材料混合搅拌均匀，之后于室温下利用摇床摇动10～60min使糖肽都富集在磁性共价有机框架材料表面，再在外加磁场的作用下利用磁分离将表面吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料从溶液中分离出来；

(2)对糖肽的解吸附：将表面吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到解吸附液中将糖肽从磁性共价有机框架材料上解吸附下来。

上述对糖肽的吸附过程中，其中共价有机框架整体呈现亲水性能从而可以利用亲水作用色谱层析法原理实现对糖肽的富集，同时掺杂的配体4-甲酰基苯硼酸可利用苯硼酸亲和色谱法原理实现对糖肽的富集，所以本发明中磁性共价有机框架材料是结合亲水作用色谱层析法和苯硼酸亲和色谱法来实现对糖肽的富集。由于本发明所提供的磁性共价有机框架材料中，COFs层为高度有序的介孔材料，其孔径约为3.4nm左右，可以将大分子(蛋白，外泌体等)阻挡在材料外面，从而有利于糖肽肽段的富集应用。通过改变缓冲液的组分实现了被吸附糖肽从磁性共价有机框架材料表面脱离，从而实现了糖肽的捕获和分离。

与现有技术相比，本发明提供的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用具有以下有益效果：

1、本发明提供的磁性共价有机框架材料，以Fe₃O₄纳米磁球作为内核，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯亚胺(PEI)的混合物作为高分子聚合物中间层，在包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的高分子聚合物中间层的表面再引入由1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛和4-甲酰基苯硼酸组成的共价有机框架(COFs层)；高分子聚合物中间层的聚乙烯亚胺(PEI)的作用为提供氨基以保证共价有机框架在磁球表面外延生长，不形成游离的共价有机框架结构，而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的作用为保证磁球在反应体系中一直是处于悬浮的状态，从而保证合成出来的磁性共价有机框架材料单分散不团聚，粒径也较为均匀；COFs层中的2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛不仅参与构建共价有机框架，而且携带大量的羟基提供良好的亲水性能用于糖肽的富集；掺杂的4-甲酰基苯硼酸可提供苯硼酸用于糖肽的富集。该磁性共价有机框架材料在糖肽富集方面表现出特异性高、结合能力强、富集效率高、回收效率好等优势，在研究生理行为糖基化过程中具有十分重要的意义，且应用前景良好。

2、本发明提供的磁性共价有机框架材料，在Fe₃O₄纳米磁球表面引入共价有机框架层，其具有极高的比表面积及高度有序的介孔结构，使得磁性共价有机框架材料十分适合用于蛋白或者肽段，尤其是糖肽的富集分离应用。

3、本发明提供的磁性共价有机框架材料的制备方法，采用外延生长方式在高分子聚合物层包覆Fe₃O₄纳米磁球的纳米粒子表面再包裹上COFs层，不需要合成后修饰的繁琐合成过程，一步法即完成，合成过程简单易行，反应条件温和，材料的重复性高，并且可在较短时间内制备得到磁性共价有机框架材料，因此易于在生物医药领域内推广。

附图说明

图1为本发明所述基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料制备工艺流程图以及对糖肽的富集流程图，A为磁性共价有机框架材料制备工艺流程图，B为磁性共价有机框架材料对糖肽的富集流程图；

图2为本发明实施例制备的磁性纳米材料形貌表征图，其中A为实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子的扫描电镜(SEM)图，B为实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子的透射电镜(TEM)图，C为实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子的扫描电镜(SEM)图，D为实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子的透射电镜(TEM)图；

图3为本发明实施例制备的磁性纳米材料的红外(FT-IR)谱图，其中包括实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子和实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子的FT-IR谱图；

图4为本发明实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子的氮气吸附-解吸附曲线，其中A为实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子的氮气吸附-解吸附曲线，B为实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子的介孔尺寸分布图；

图5为本发明实施例制备的磁性纳米材料在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线图谱，其中a对应实施例1制备的Fe₃O₄纳米磁球，b对应实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子，c对应实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子；

图6为本发明应用例1中免疫球蛋白G消化液的MS图谱，其中A为未经富集处理的免疫球蛋白G消化液的MS图谱，B为经实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs纳米粒子富集处理的免疫球蛋白G消化液的MS图。

具体实施方式

以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。

本发明提出的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料结构，如图1所示，该磁性共价有机框架材料从整体结构上来看，是由高分子聚合物层包覆Fe₃O₄纳米磁球的纳米粒子、生长于高分子聚合物层上的共价有机框架层构成，而高分子聚合物层包覆Fe₃O₄纳米磁球是由Fe₃O₄纳米磁球，包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯亚胺(PEI)层构成，即呈三层结构。在实施例中，是基于图1给出的工艺流程制备该磁性共价有机框架材料的，如图1A所示，首先利用水热法制备Fe₃O₄纳米磁球；然后利用物理包覆的方法在磁球表面包裹一层聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯亚胺(PEI)中间层；再依据外延生长法在制得的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子表面包覆一层COFs层，得到COFs层包覆Fe₃O₄的磁性共价有机框架材料(简称Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs)。

从理论上分析，1，3，5-三(4-氨苯基)苯和2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛两种有机配体按照物质的量的比为1：1.5通过加成反应得到如图1A中所示的以六元环为基本单元的COFs层，同时掺杂的配体4-甲酰基苯硼酸可以通过醛基和配体1，3，5-三(4-氨苯基)苯上的氨基通过加成反应引入。

实施例1水热法制备超顺磁性Fe₃O₄纳米磁球

将原料2.43g FeCl₃·6H₂O、3.6g NaAc(醋酸钠)和0.4g Na₃CT(柠檬酸钠)加入到盛有60mL乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1h使上述原料混合均匀；然后移除搅拌子，将反应釜升温至200℃，反应12小时；再将反应釜冷却至室温，对反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇、去离子水对固体产物进行洗涤(每种洗液洗涤五遍)，即得到Fe₃O₄纳米磁球。

通过该方法得到的Fe₃O₄纳米磁球能够均匀分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。对得到的Fe₃O₄纳米磁球进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析显示，所述Fe₃O₄磁球粒径在220nm左右。

通过调节水热反应时间10～16h，可以调节得到的Fe₃O₄纳米磁球粒径在200～300nm之间。

实施例2制备Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子

采用上述方法制备得到的粒径为220nm的Fe₃O₄纳米磁球，制备Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子的具体方法为：

1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.4g聚乙烯亚胺(PEI)溶解于25mL去离子水中，然后加入100mg Fe₃O₄磁球超声5min，接下来于室温搅拌24小时，之后将产物用去离子水清洗3遍，即得到Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子。

通过该方法得到的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子能够均匀分散在水中，形成稳定的纳米颗粒悬浮液。对得到的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析显示，所述Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子粒径在240nm左右。最后在室温真空干燥箱干燥12小时后备用。

实施例3-实施例11制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COF材料

按照表1称取原料，并结合表1中给出的工艺参数依据下述操作过程制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料：

将Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子以及1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛和4-甲酰基苯硼酸三种有机配体加入到含有正丁醇和二氧六环混合溶剂的样品瓶中(瓶子的容量为25mL)，之后在超声条件下将三种有机配体完全溶解，并使Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子完全分散得到分散均匀的混合液，继后在静置的条件下加入醋酸(17.5M)，加入完毕后将整个反应体系于室温下静置孵育一段时间。接下来，继续向反应体系中加入醋酸水溶液(12M)，加入完毕后将整个反应体系于70℃条件下静置孵育一段时间。最后，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用四氢呋喃，丙酮，乙醇、去离子水洗涤(每种洗液洗涤三次)，即得到基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，简称Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料。对得到的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料进行DLS(DynamicLight Scattering，动态光散射)分析显示，所得Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的粒径在260～390nm左右，见表1所示。

表1制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的原料及其配比和工艺参数

表1中可以看出，通过调控加入催化剂醋酸的量，孵育时间以及配体的量可以调整包裹在Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子表面的COFs层的厚度以及纳米复合材料的形貌。从COFs层包覆牢固性、尺寸大小、纳米复合材料的形貌及磁响应等因素考虑，现选择实施例6所述方法制备的330nm的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的制备条件用于考察4-甲酰基苯硼酸掺入量对于糖肽富集的影响。

实施例12-实施例16制备掺入不同4-甲酰基苯硼酸配体的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料

实施例12-实施例16制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的原料及其配比和工艺参数与实施例6制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的原料及其配比和工艺参数相比较，除4-甲酰基苯硼酸配体(Fa)加入的量不同，其余条件均相同。

按照表2称取原料，并结合表1中实施例6给出的工艺参数依据下述操作制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料：

将Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子以及1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛和4-甲酰基苯硼酸三种有机配体加入到含有正丁醇和二氧六环混合溶剂的样品瓶中(瓶子的容量为25mL)，之后在超声条件下将三种有机配体完全溶解，并使Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子完全分散得到分散均匀的混合液，继后在静置的条件下加入醋酸(17.5M)，加入完毕后将整个反应体系于室温下静置孵育一段时间。接下来，继续向反应体系中加入醋酸水溶液(12M)，加入完毕后将整个反应体系于70℃条件下静置孵育一段时间。最后，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用四氢呋喃，丙酮，乙醇、去离子水洗涤(每种洗液洗涤三次)，即得到Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料。对得到的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析显示，所得Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的粒径在260～360nm左右，见表1所示。

表2制备Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料时配体的加入量和富集性能

从表2中可以看出，通过调控掺杂的4-甲酰基苯硼酸配体(Fa)的量会影响包裹在Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子表面的COFs层的厚度以及最终Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的富集性能。从材料的最终应用性能考虑，现选择实施例14所述方法制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料对其结构特征、性能以及对糖肽的富集等方面进行分析。

(一)结构表征

为了探究COFs是否成功复合到Fe₃O₄纳米磁球上，对实施例1制备的Fe₃O₄纳米磁球、实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的形貌尺寸和微观结构进行了表征，如图2至图4所示。

对实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子和实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料采用扫描电镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌分析，结果如图2所示。从图2可以看出，制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子以及Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料均成大小均一、形貌规整的球形。此外，从图2D看出，纳米粒子表面呈现一层很厚的晕状结构且表面呈现刺状，表明COFs层已经成功包裹在Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子表面。

对实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子和实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料进行红外谱图分析，分析结果如图3所示。从图3中可以看出，两种材料均具有与标准Fe₃O₄一样的Fe-O-Fe吸收峰，说明Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子和Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料保留了Fe₃O₄纳米磁球的晶体结构。另外，1613cm^-1位置的红外峰对应于碳氮双键，说明COFs结构的成功形成；同时，1177cm^-1和1100cm^-1位置的红外峰对应于硼氧键，说明4-甲酰基苯硼酸配体掺杂成功。

对实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料进行N₂吸附/解吸附测试，测试结果如图4所示，所得N₂吸附/解吸附等温曲线表明此磁性共价有机框架纳米复合材料具有较大的比表面积和孔隙率，比表面积高达311m²/g，同时孔径分布较窄，大小在3.4nm左右(与理论分析结果相近)，说明具有高度有序的介孔材料共价有机框架成功合成在了磁球表面，这有利于对于肽段的富集应用。

综上所述，Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料中的壳层具有共价有机框架结构，且该结构并没有明显影响复合纳米材料的磁晶体结构，这种独特的COFs壳层将有利于在糖肽捕获和分离中的应用。

(二)磁性能测试

对实施例1制备的Fe₃O₄纳米磁球、实施例2制备的Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)在-18000Oe到18000Oe范围内进行磁性测试，测试得到的磁滞回线如图5所示。从图5中可以看出，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe₃O₄纳米磁球、Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料都具有超顺磁性，其中Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料的饱和磁化强度达到48emu g^-1左右。

应用例

本发明进一步提供了上述Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料在富集糖肽方面的应用，Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料对于糖肽的捕获与分离过程，如图1B所示，首先将Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料加入到待处理的样本中，然后在摇床中进行捕获，时间可以根据样本数量进行调整，捕获过程结束后通过磁分离方式将固体产物分离出来，之后再用解吸附的缓冲液对表面吸附有糖肽的磁球进行解吸附，从而得到含有糖肽的缓冲液。可以对得到的含有糖肽的缓冲液进行MS(Mass Spectrometry，质谱)分析，以进一步确定Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料对糖肽的富集效果。

应用例1糖基化蛋白免疫球蛋白G消化液中糖肽的富集

取2mg免疫球蛋白G溶解在1ml 50mM pH为8.2的NH₄HCO₃缓冲液里，再加入50μg的胰蛋白酶，于37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(80％ACN/20％50mM NH₄HCO₃)稀释到10^-7M的浓度得到免疫球蛋白G消化液。取1mg实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料加入到200μl免疫球蛋白G消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温孵育45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次200μl)把非特异性吸附的多肽从磁性共价有机框架材料表面除去；最后将吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到10μl第二缓冲液(体积浓度为30％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为1％的三氟乙酸，即30％ACN-H₂O包含1％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附30min，利用磁分离分离出磁性共价有机框架材料，得到解吸附液。然后取1μl解吸附液和1μl未经富集处理的免疫球蛋白G消化液进行质谱分析，分析结果如图6所示。

从图6可以看出，未经富集处理的免疫球蛋白G消化液，用质谱几乎检测不到糖肽的信号，整个MS图基本都是杂肽段的信号【见图6A】；用Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料富集后，整个质谱图上可以检测到34条糖肽的信号，而且整个MS图都是糖肽的信号峰【见图6B，星号标记的都为糖肽的特征峰】。上述分析结果表明本发明所述的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料磁性共价有机框架材料能很好的富集糖肽，同时具有很好的选择性和很高的效率。

应用例2大鼠肝提取蛋白消化液中糖肽的富集

取200ug大鼠肝提取蛋白消化液加入到200μl第一缓冲液(80％ACN/20％50mMNH₄HCO₃)中。取1mg实施例12制备的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料加入到上述样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温孵育45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次200μl)把非特异性吸附的多肽从磁性共价有机框架材料表面除去；最后将吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到60μl第二缓冲液(体积浓度为30％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为1％的三氟乙酸，即30％ACN-H₂O包含1％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附30min，利用磁分离分离出磁性共价有机框架材料，得到解吸附液。然后将吸附液体用于LC-MS-MS分析，一共可以检测到1920条糖肽。

表3给出了本发明所提供的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料与已经报道材料对大鼠肝提取蛋白消化液中糖肽富集性能比较。从表3中看出，相比已经报道的材料，本发明提供的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料可以在大鼠肝提取蛋白消化液中富集最多的糖肽。

表3 Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料与已经报道的材料在大鼠肝提取蛋白消化液中富集糖肽的性能比较

综上所述，本发明所述的Fe₃O₄/PVP/PEI/COFs材料可以实现对于糖肽的优异富集性能。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，其特征在于由Fe₃O₄纳米磁球、包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面的高分子聚合物中间层、生长于高分子聚合物中间层上的共价有机框架层构成；所述高分子聚合物中间层为聚乙烯吡咯烷铜和聚乙烯亚胺的混合物，聚乙烯吡咯烷铜和聚乙烯亚胺的混合物包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面形成球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子；所述共价有机框架层是由1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸按照物质的量之比1：1.5：0.3～1.5经加成反应得到的刺状结构。

2.根据权利要求1所述的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，其特征在于该磁性共价有机框架材料的平均粒径为260～390nm。

3.一种权利要求1或2所述的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)在超声条件下，将球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸加入溶剂中，混合分散均匀形成混合液Ⅰ；所述Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子、1，3，5-三(4-氨苯基)苯的质量比为5：(1～3)；所述1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸的物质的量之比1：1.5：(0.3～1.5)；

(2)向步骤(1)形成的混合液Ⅰ中滴加醋酸形成反应体系，将所得反应体系于室温下静置孵育1～4h，然后继续向反应体系滴加醋酸，并于60～80℃下静置孵育2～6h，孵育结束后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物Ⅰ，将所得固体产物Ⅰ进行洗涤除去吸附在表面未反应的物料，得到Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子上生长有共价有机框架层的复合材料，即基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料；

第一次滴加醋酸时，所述1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸质量之和与醋酸的体积比为14.5：(0.1～0.6)，第二次滴加醋酸时，所述1，3，5-三(4-氨苯基)苯、2，5-二羟基-1，4-苯二甲醛、4-甲酰基苯硼酸质量之和与醋酸的体积比为14.5：(0.6～2.0)，质量的单位为mg，体积的单位为mL。

4.根据权利要求3所述的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于所述球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子的制备步骤如下：

将聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺溶解于去离子水中形成混合液Ⅱ，在超声条件下，将Fe₃O₄纳米磁球加入上述混合液Ⅱ中混合分散均匀后再于室温下搅拌至少24h，之后进行磁分离并收集分离出的固体物Ⅱ，将所得固体物Ⅱ进行洗涤除去吸附在表面的物料，干燥至恒重，得到聚乙烯吡咯烷铜和聚乙烯亚胺的混合物包覆于Fe₃O₄纳米磁球表面形成的球状Fe₃O₄/PVP/PEI纳米粒子；

所述聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯亚胺物质的量之比为5：(1～5)，所述Fe₃O₄纳米磁球与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为(1～4)：20。

5.根据权利要求3所述的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于所述固体产物Ⅰ依次用四氢呋喃、丙酮、乙醇、去离子水洗涤。

6.根据权利要求4所述的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于所述固体物Ⅱ用去离子水洗涤。

7.根据权利要求3至6中任一权利要求所述的基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于所述溶剂为正丁醇和二氧六环组成的混合溶剂，正丁醇和二氧六环的体积比为1：1。

8.权利要求1或2所述磁性共价有机框架材料在糖肽富集中的应用。

9.根据权利要求8所述磁性共价有机框架材料在糖肽富集中的应用，其特征在于：富集糖肽的步骤如下：

(1)对糖肽的吸附：将糖基化蛋白免疫球蛋白G用胰蛋白酶消化成糖肽，并用缓冲液进行稀释，然后加入权利要求1或2所述磁性共价有机框架材料混合搅拌均匀，之后于室温下利用摇床摇动10～60min使糖肽都富集在磁性共价有机框架材料表面，再在外加磁场的作用下利用磁分离将表面吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料从溶液中分离出来；

(2)对糖肽的解吸附：将表面吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到解吸附液中将糖肽从磁性共价有机框架材料上解吸附下来。

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