CN112675199B

CN112675199B - 一种药物联用物及其应用

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Publication number: CN112675199B
Application number: CN202110023631.5A
Authority: CN
Inventors: 范伟; 范兵; 吴旭英
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-01-08
Also published as: CN112675199A

Abstract

本发明提供了一种药物联用物，包括如下物质作为活性成分：盐酸二甲双胍以及银；将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。其联合用药合理、高效，既可提高抗菌疗效，又可降低不良反应，减少毒副反应，有单独使用其中一种药物不可比拟的优越性。并且，其在高糖环境中抗菌效果好，毒副作用小。本发明还提供一种上述的药物联用物在制备抗菌药物中的应用，尤其是在制备预防或治疗糖尿病、高血糖患者细菌感染性疾病药物中的应用。

Description

一种药物联用物及其应用

技术领域

本发明专利涉及药物技术领域，尤其是指一种药物联用物及其应用，具体是指盐酸二甲双胍和银联用制剂及其在制备抗菌药物中的应用以及在制备治疗糖尿病伴随的高血糖药物中的应用。

背景技术

双胍盐是一种广谱的杀菌剂，可分为烷基双胍盐(盐酸二甲双胍、双胍辛乙酸盐)、芳基双胍盐(氯己定)和聚合双胍盐(聚六亚甲基双胍盐酸盐)等，被广泛用于化学医疗、食品、日化等领域。双胍化合物的构型及烷基链长度对杀菌性能有显著影响。N¹、N⁵端由芳烷烃取代的化合物具有更广泛有效的杀菌作用，比如氯己定(简称：CHX)，具有对一系列革兰氏阳性、阴性菌的高效抑制作用，被广泛应用于临床治疗，但其高毒性始终制约它的应用。盐酸二甲双胍由于其有限的抑菌活性，很少作为抗菌药物使用，而是一种有效的降血糖药。另外，盐酸二甲双胍还具有抗炎及促进骨组织修复的作用。

抗菌金属离子，例如银离子(Ag⁺)有广谱抗菌活性。然而，银离子的高细胞毒性和潜在变色性严重制约了它在临床医学中的广泛应用。

糖尿病患者局部高血糖环境为感染病原菌提供充足的养分，降低了宿主对细菌感染的抵抗力，同时加重了炎症反应对机体的破坏，降低了组织修复再生能力。糖尿病患者感染病原菌耐药性高，治疗效果差，导致愈合延迟或感染反复发作。血糖控制情况是影响患者预后的重要因素之一。然而，现有技术中，并未见有效地治疗糖尿病或高血糖患者伴随的细菌感染性疾病。

综上所述，现有技术中，盐酸二甲双胍、银的抗菌应用有待进一步改善和挖掘，提供一种抗菌效果好、毒性低的新型抗菌剂显得很有必要，另外，研发一种有效地治疗糖尿病或高血糖患者伴随的细菌感染性疾病的药物也显得很有必要。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为了克服上述不足，发明人经过无数次实验，尝试将银离子或纳米银与其他金属离子、杀菌剂等材料结合复配使用，惊奇地发现，将银离子或纳米银和盐酸二甲双胍联合使用，具有协同作用，并且其在高糖环境下也具有优良的抗菌性能，抗菌效果好，副作用少。其有望为预防及治疗糖尿病、高血糖患者伴随细菌感染性疾病提供新的治疗途径。

在本发明的第一方面，本发明提供一种药物联用物，包括如下物质作为活性成分：

盐酸二甲双胍以及银；

将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。

在本发明的技术方案中，所述药物联用物中，活性成分盐酸二甲双胍和银具有协同抗菌作用。

在本发明的技术方案中，所述银为银离子或者纳米银。

在本发明的技术方案中，所述药物联用物为单剂量单位形式，所述盐酸二甲双胍浓度小于等于6.4(w/v)％，所述银离子或者纳米银浓度小于等于40μg/mL。优选地，所述盐酸二甲双胍浓度为3.2～6.4(w/v)％,所述银离子或者纳米银浓度为40μg/mL。更优选地，所述盐酸二甲双胍浓度为6.4(w/v)％。

在本发明的技术方案中，所述银离子来源于硝酸银或磺胺嘧啶银。

在本发明的技术方案中，将所述活性成分，添加药剂学可接受的载体，制备成药物制剂，所述药剂学可接受的载体形态为液体、凝胶或固体。

在本发明的技术方案中，所述凝胶包括胶原凝胶、甲基纤维素凝胶，所述固体包括壳聚糖支架、高分子聚合物支架、纤维织物。

在本发明的技术方案中，所述药物制剂选自颗粒剂、片剂、丸剂、贴剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂中的一种。

在本发明的第二方面，本发明还提供一种上述的药物联用物在制备抗菌药物中的应用。所述药物联用物可以显著降低银离子或纳米银的使用量，减少其伴随的高细胞毒性及潜在变色性问题，同时增强抗菌作用，在高糖环境下仍有显著的抗菌效果，具有重要研究及临床意义。

本发明还提供一种上述的药物联用物在制备预防或治疗糖尿病、高血糖患者细菌感染性疾病药物中的应用。

优选地，所述抗菌药物包括抗粪肠球菌药物。

本发明还提供一种上述的药物联用物在高血糖环境中抗菌、抗炎、降血糖和促进修复中的应用，所述应用为非临床、非诊断方面的应用。

在本发明的技术方案中，所述药物联用物作为抗菌药物可用于粘膜给药、皮肤外用、体内植体、牙科给药，所述粘膜给药采用溶液剂、喷雾剂、气雾剂；皮肤外用给药采用贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂；牙科给药采用溶液剂、凝胶、糊剂；体内植体给药采用支架、填充材料、缓释体。

本发明中，盐酸二甲双胍简称为Met。氯己定简称为CHX。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种药物联用物，包括盐酸二甲双胍和银两种活性成分，其联合用药合理、高效，既可提高抗菌疗效，又可降低不良反应，减少毒副反应，有单独使用其中一种药物不可比拟的优越性。

2、本发明提供一种药物联用物，包括盐酸二甲双胍和银两种活性成分，盐酸二甲双胍的联用可以显著提升银离子或纳米银的抑菌效果，两种活性成分具有显著的协同抗菌作用，其在高糖环境中仍具有很好的抗菌效果，并且毒副作用小。具有重要研究及临床意义。

3、本发明提供一种药物联用物，包括盐酸二甲双胍和银两种活性成分，联合用药可以有效减少银离子或纳米银的使用量，从而显著降低其伴随的高细胞毒性和潜在变色性缺陷。同时，所含盐酸二甲双胍成分在高血糖环境中同时发挥抗菌、抗炎、降血糖和促进修复的复合作用。

4、本发明还提供一种上述的药物联用物在制备抗菌药物中的应用，尤其是在制备预防或治疗糖尿病、高血糖患者细菌感染性疾病药物中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例2中传统BHI培养基中不同实验组作用24小时对粪肠球菌菌落形成的影响；

图中，A-D分别表示未进行处理的传统BHI组、40μg/mL AgNO₃、3.2(w/v)％Met、6.4(w/v)％Met组分别稀释10⁵倍后的细菌菌落形成图；E-G分别表示40μg/mL AgNO₃+3.2(w/v)％Met、40μg/mL AgNO₃+6.4(w/v)％Met、2(w/v)％CHX组别未稀释的细菌菌落形成图；H表示所有组别的细菌菌落数量(其中，“*”表示：与BHI对照组相比有显著差异，P<0.05；“^#”表示：与2(w/v)％CHX阳性对照组相比有显著差异，P<0.05)；

图2为本发明实施例2中BHIG培养基(额外添加25mM葡萄糖的BHI培养基)中不同实验组作用24小时对粪肠球菌菌落形成的影响；

图中，A-D分别表示未进行处理的BHIG组、40μg/mL AgNO₃、3.2(w/v)％Met、6.4(w/v)％Met组别分别稀释10⁵倍后的细菌菌落形成图；E-G分别表示40μg/mL AgNO₃+3.2(w/v)％Met、40μg/mL AgNO₃+6.4(w/v)％Met、2(w/v)％CHX组未稀释的细菌菌落形成图；H表示所有组别的细菌菌落数量(其中，“*”表示：与BHIG对照组相比有显著差异，P<0.05；“#”表示：与2(w/v)％CHX阳性对照组相比有显著差异，P<0.05)；

图3为本发明实施例3中传统BHI培养基和BHIG培养基(额外添加25mM葡萄糖的BHI培养基)中不同实验组对粪肠球菌影响的动态抗菌曲线；

图中，A表示在BHI培养基中不同实验组对粪肠球菌影响的动态抗菌曲线；B表示在BHIG培养基(额外添加25mM葡萄糖的BHI培养基)中不同实验组对粪肠球菌影响的动态抗菌曲线；

图4为本发明实施例4中不同实验组对MC3T3细胞的细胞毒性(其中，“*”表示：与2％CHX阳性对照组相比有显著差异，P<0.05；“#”表示：与阴性对照组相比有显著差异，P<0.05)。

附图中，CON表示未进行处理的实验组；Ag40表示40μg/mL AgNO₃处理的实验组；Met3.2表示3.2(w/v)％盐酸二甲双胍处理的实验组；Met6.4表示6.4(w/v)％盐酸二甲双胍处理的实验组；AM3.2表示40μg/mL AgNO₃+3.2(w/v)％Met处理的实验组；AM6.4表示40μg/mL AgNO₃+6.4(w/v)％Met处理的实验组；CHX(2％)表示2(w/v)％氯己定处理的实验组；BKG表示不加细胞和药物的纯培养基液体背景。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。以下通过具体实施例结合附图对本发明中的盐酸二甲双胍-银联用物及其应用作进一步说明，实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。盐酸二甲双胍又名1,1-二甲基双胍盐酸盐。

实施例1：最低抑菌浓度(MIC)和杀菌浓度(MBC)试验

测试溶液为含有0、3.2(w/v)％、6.4(w/v)％Met的硝酸银(AgNO₃)溶液(AgNO₃溶液浓度为0、5、10、20、40、80、160、320、640μg/mL)。用灭菌双蒸水制备2.56mg/mL的AgNO₃母液和25.6％(w/v)的Met母液。单独测试AgNO₃或Met的MIC时，将50μL AgNO₃母液或Met母液与50μL灭菌双蒸水加入96孔板并用灭菌双蒸水进行连续二倍稀释。取600nm处吸光度值为1的粪肠球菌(ATCC)悬液，分别在双倍浓度的BHI培养基/BHIG培养基(BHI培养基中额外添加25mM葡萄糖)中梯度稀释至10⁶CFUs/mL，分别取100μL已稀释的菌液加入到上述96孔板中，37℃避光厌氧孵育24小时。用酶标仪(Power Wave XS2,BioTek Instruments,VT,USA)读取600nm处吸光度值，数值最接近空白培养基的吸光度值，且AgNO₃溶液或Met溶液浓度最低的组别即为MIC。测试含有Met的AgNO₃溶液的MIC时，将50μL AgNO₃母液加入96孔板并用灭菌双蒸水进行连续二倍稀释，每孔添加50μL Met母液或其二倍稀释液(即12.8(w/v)％Met溶液)，并添加100μL上述已稀释的菌液，37℃避光厌氧孵育24小时。用酶标仪读取600nm处吸光度值，数值最接近空白培养基的吸光度值，且AgNO₃溶液浓度最低的组别即为在该浓度Met作用下AgNO₃的MIC。从AgNO₃溶液或Met溶液浓度大于等于MIC的组中(至少3组)各取100μL混合液，涂布于BHI琼脂板上并计算菌落形成单位个数，当小于初始菌液量的1％即为MBC。操作均在避光无菌条件下进行。重复六次。结果如表1所示：

表1在不同浓度Met作用下AgNO3的MIC和MBC

结果表明，在高葡萄糖含量的BHIG培养基中，单独使用AgNO₃或Met药物的作用效果相对较差。Met的复配添加(3.2(w/v)％、6.4(w/v)％)，能使AgNO₃的MIC与MBC得到明显下降，AgNO₃的抑菌效果得到极大提升；并且随着Met浓度增加，AgNO₃的MIC与MBC逐渐下降。

实施例2：菌落形成单位计数实验

在双倍浓度BHI培养基/BHIG培养基(培养基中各成分的浓度加倍)中，取600nm处吸光度值为1时的粪肠球菌悬液稀释至2×10⁴CFUs/mL，将500μL稀释后的粪肠球菌悬液与500μL含AgNO₃与Met的溶液混合，使AgNO₃的终浓度为40μg/mL，Met的终浓度为3.2(w/v)％、6.4(w/v)％。混合均匀后于37℃避光孵育24小时。24小时后，10倍梯度稀释后各取10μL均匀涂布于BHI琼脂培养皿，于37℃避光厌氧培养24小时。阴性对照组为菌液与灭菌双蒸水共孵育，阳性对照组为菌液与CHX共培养，终浓度为2(w/v)％CHX。以上操作均在避光无菌条件下进行。重复6次。

结果如图1及图2所示，由图中可以看出，经过24小时，相较于阴性对照组和AgNO₃及Met单独作用组，所有AgNO₃、Met联合使用实验组都取得了意想不到的显著的抗菌效果，表现出协同作用，并且随着AgNO₃及Met浓度的增加，其抗菌效果更加显著。无论在BHI培养基或高糖BHIG培养基中，40μg/mL AgNO₃+6.4(w/v)％Met组都能取得稳定的抗菌作用，并且其抗菌效果与阳性对照2(w/v)％CHX组别无明显差别。

实施例3：动态抗菌实验

取600nm处吸光度值为1的粪肠球菌悬液，在双倍浓度的BHI培养基/BHIG培养基(培养基中各成分的浓度加倍)中稀释至2×10⁸CFUs/mL。将700μL AgNO₃与Met的混合溶液加入700μL稀释后的粪肠球菌悬液，使AgNO₃与Met的终浓度与上述实施例2中一致，混合均匀后于37℃恒温培养箱避光孵育。在2，4，6，8，10小时，分别取200μL用酶标仪读取600nm处吸光度值。阴性对照组为菌液与灭菌双蒸水共孵育，阳性对照组为菌液与CHX共培养。以上操作均在避光无菌条件下进行。重复6次。

实验结果如图3所示，实验结果表明，动态抗菌评分结果进一步证实了AgNO₃+Met具有显著协同抗菌作用。在曲线形成过程中，AgNO₃与Met联用干扰了粪肠杆菌的生长。在测试时间内，即使是高糖环境下，AgNO₃+Met组粪肠球菌的生长始终被抑制，显示出稳定的协同抗菌作用。

实施例4：细胞毒试验

采用CCK-8试剂盒检测该混合物的细胞毒性。用含1％青霉素/链霉素双抗及10％胎牛血清的α-MEM培养基分别制备AgNO₃(40μg/mL)、Met(3.2(w/v)％)、Met(6.4(w/v)％)及含AgNO₃(40μg/mL)+Met(3.2(w/v)％)、AgNO₃(40μg/mL)+Met(6.4(w/v)％)的混合溶液，并使用无菌的直径为0.22μm的过滤器进行过滤除菌。在96孔板中加入200μL浓度为5×10⁴个/mL的MC3T3细胞(ATCC)悬液，37℃培养24小时使细胞贴壁。24小时后，吸取96孔板中的培养基，并添加200μL新鲜α-MEM培养基及10μL上述混合液，37℃避光共培养。同时设置阴性对照组(换液时仅添加210μLα-MEM培养基)及阳性对照组(换液时添加200μLα-MEM培养基及10μL 2(w/v)％CHX)。培养24小时后，吸去96孔板每孔中液体，并使用PBS漂洗2次，最后加入100μLα-MEM培养液、10μL CCK-8试剂，避光37℃共同孵育1小时后使用酶标仪测定450nm波长处96孔板的吸光度。以上各组重复6次。

结果如图4所示，结果表明，经过CCK-8测试，与阴性对照组比较，不同浓度的AgNO₃+Met组对细胞生长均无明显抑制作用(P>0.05)，而阳性对照组，即2(w/v)％CHX组别对细胞生长有明显抑制作用(P<0.05)。

综上所述，银离子和Met混合溶液相较于银离子或者纳米银，可以在更低剂量的药物作用下抑制高糖环境下致病菌的生长，增强抗菌效力，减少药物带来的副作用，具有协同抗菌作用；相较于传统抗菌药物氯己定，在保持和氯己定相似抗菌效果的同时，降低了药物的细胞毒性，使得银与Met添加药剂学可接受的载体，能够制备二甲双胍-银复合抗菌制剂，其具有复合优良抗菌性能，能够作为一种新型抗菌药物制剂在预防及治疗糖尿病、高血糖患者细菌感染性疾病中得到应用。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种药物联用物在制备抗粪肠球菌药物中的应用，其特征在于，所述药物联用物中，盐酸二甲双胍的浓度为3.2（w/v）%、6.4（w/v）%，银浓度为40μg/mL。

2.一种药物联用物在制备预防或治疗糖尿病、高血糖伴随抗粪肠球菌感染性疾病药物中的应用，其特征在于，所述药物联用物中，盐酸二甲双胍的浓度为3.2（w/v）%、6.4（w/v）%，银浓度为40μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述银为银离子或者纳米银。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述银离子来源于硝酸银或磺胺嘧啶银。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物联用物为将所述盐酸二甲双胍和银，添加药剂学可接受的载体，制备成药物制剂，所述药剂学可接受的载体形态为液体、凝胶或固体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述凝胶包括胶原凝胶、甲基纤维素凝胶，所述固体包括壳聚糖支架、高分子聚合物支架、纤维织物。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物制剂选自颗粒剂、片剂、丸剂、贴剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂中的一种。