CN112666240A - 一种基于超微电极阵列电化学发光的单分子蛋白检测芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于超微电极阵列电化学发光的单分子蛋白检测芯片及方法，具体公开了所述单分子蛋白检测芯片具有ITO电极的基底和所述ITO电极上具有三维内凹的倾斜微阱阵列；倾斜微阱阵列横向方向的两端分别具有与电源正极和负极连接的电线。本发明的单分子蛋白检测芯片制备简单，电化学发光检测体系进一步放大信号，能够实现痕量蛋白的高灵敏单分子检测。

Description

一种基于超微电极阵列电化学发光的单分子蛋白检测芯片及 方法

技术领域

本发明主要涉及电分析化学及微流控领域，提出一种微芯片上微珠的阵列化方法、及其匹配的超微电极阵列电化学发光方法，并据此开发一套集成化仿生微流控芯片，以实施单分子蛋白检测。该微流控芯片通过设计超微电极阵列获得快速灵敏的响应信号，其次利用电化学发光提高检测性能，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低的优势，尤其适用于单分子蛋白检测，具备潜在的经济价值。

背景技术

随着现代医疗领域对蛋白检测灵敏度要求的不断提高，发展先进的蛋白检测技术是提高医疗仪器诊断能力的必由之路。传统检测方法包括免疫层析，放射免疫分析，酶联免疫吸附(ELISA)、荧光、电化学、化学发光和电化学发光等，但传统技术仍存在检测灵敏度低、时间窗口滞后、检测成本高等问题，因此无法满足日益增长的临床诊断需求。

据此，相关学者提出了单分子蛋白检测思想，其是通过数字化绝对定量降低批内、批间及不同实验室间检测差异。其核心思路是当蛋白质分子及由此产生的免疫复合物与微珠的比例较小时，含有免疫复合物的微珠的百分比遵循泊松分布，则微珠携带单一或无免疫复合物。然后，将大量的微珠离散化或分隔化到反应微孔或微液滴阵列中，则每个单元中有一个或零个靶蛋白，将蛋白含量信号转换为对含靶蛋白反应单元的计数，最终实现数字化绝对定量。单分子蛋白检测关键技术在于微芯片上微珠的阵列化方法和超微电极阵列电化学发光方法，前者目的是将传统基于溶液平均化的分子信号与参照模板的比对分析，转变为高通量离散信号的绝对计数和定量，后者目的是提高检测灵敏度。目前单分子蛋白检测设备成本昂贵，其原因主要是磁珠阵列化的高复杂度，酶标荧光检测的高要求和磁场光路的配置，使得设备内部流体和光学模块制造成本过高。

微珠阵列化技术，主要是在芯片表面滴加一滴含微珠的样本溶液，在短时间内即可阵列化数万微珠，并可生成大规模微小液滴阵列，现有研究主要关注液体宏观运动，仿照猪笼草表面加工倒悬结构的微阵列并分析其动力学机制，可以钉扎后退角，并显著加快液体的前向输运，但该技术工艺复杂，且液体宏观运动学不适用于单分子蛋白检测的微观层面。

电化学发光技术，主要是当电解液两端施加一定直流电压，会在无线连接的电极阵列上产生感应电场从而形成正负两极，在阴极发生还原反应，阳极发生氧化反应从而使得三联吡啶钌/三丙胺(Ru(bpy)3²⁺/TPrA)体系发光。超微电极阵列电化学发光技术消除了对单个阵列元件进行欧姆接触的要求，具有无线、原位、易制备及高通量的独特优势，然而目前该技术需要精准对准，操作要求较高。

其中，专利CN201710347678.0一种电化学系统中，公开了一种只含有一个电极的电化学系统，电极具有电阻，电流通过与电解液接触的两侧电极时，一侧形成阴极，另一侧形成阳极。该系统主要设计一种结构简单、操作方便的单电极电化学发光系统。

其中，专利CN201910913923.9一种微流控芯片、蛋白检测方法、装置及系统中，公开了一种基于平面微流控芯片技术、双极性电极阵列技术和微流控芯片技术，利用电致化学发光检测来实现痕量蛋白的检测。所述的双极性电极阵列需与芯片上微阱阵列精确对准，从而实现溶液中芯片上捕获的固相载体可在加电条件下发光。

目前已经公开的单分子蛋白检测技术中，无超微电极阵列电化学发光相关技术，存在问题主要是：器件制备复杂，反应过程不稳定，且不方便进行有效控制，使得其检测的一致性和重复性较差。

目前已经公开的电化学发光免疫检测技术中，主要是集中在三电极体系或双极性电极制备和表面修饰上，芯片无法进行痕量蛋白的检测，其原因主要是：1)电极阵列数量和密度通常不高，通常数量少于1000个，远远少于数字化的痕量蛋白检测需求(电极数量至少要大于40000个)。2)无法实现高密度电极制备，制备难度较高；3)若微阱电极尺寸过大，微珠上电化学发光的强度非常弱，故无法满足采集微珠上电化学发光信号需求。

发明内容

本发明主要是针对当前的单分子蛋白检测技术的不足，提出一种超微电极阵列电化学发光芯片及方法，通过设计超微电极阵列获得高通量、快速、高灵敏的响应信号，其次利用电化学发光提高检测性能，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低的优势。该发明将可以实现单分子的痕量蛋白的高灵敏、快速检测。

本发明一个方面提供了一种单分子蛋白检测芯片，所述单分子蛋白检测芯片具有ITO电极的基底和所述ITO电极上的具有三维内凹的倾斜微阱阵列；倾斜微阱阵列横向方向的两端分别具有与电源正极和负极连接的导线，

所述的倾斜微阱的形状为，上下两截面均为半椭圆形的同尺寸的凹陷倾斜槽，所述半椭圆形为短轴与弧线形成的半椭圆形，上截面为与ITO基底平行的平面，下截面为ITO电极与倾斜微阱阵列的接触平面；所述上截面与下截面的半椭圆形长轴的延伸方向与倾斜微阱阵列横向方向一致，上截面上的半椭圆形长轴的延长线在下截面所在平面的垂直投影与下截面的半椭圆形长轴重合；每个倾斜微阱中截面的半椭圆形中弧线指向电源负极方向，半椭圆形短轴靠近电源正极方向。

在本发明的技术方案中，半椭圆形的半长轴长度为a，a²＝4R²/sin²ɑ，半椭圆形的半短轴长度为b，b²＝4R²/3，倾斜微阱的倾斜角度为ɑ，R为用于检测用的定位颗粒中微珠的半径，R的范围为0.5-1.5μm，α为30°-80°。优选地R＝1.3-1.5μm，α＝45°-60°。

在本发明的技术方案中，倾斜角为上截面与下截面的半椭圆形短轴形成的平面与上截面所形成的小于90°夹角。

在本发明一个具体的实施例中，cosα＝52/77。

在本发明的技术方案中，所述的半椭圆形截面的尺寸符合以下公式；

x和y为半椭圆形上任意一点的坐标，半椭圆形的半长轴长度为a，半短轴长度为b，倾斜微阱的倾斜角度为α，R为用于检测用的微珠的半径，R的范围为1.3-1.5μm，优选为1.4μm，cosα＝52/77。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的a为9-11μm，b为1.4-1.8μm，倾斜微阱倾斜部分的垂直高度为4-5μm。

在本发明的一个优选的具体实施方案中，所述的a为10μm，b为1.6μm，倾斜微阱倾斜部分的垂直高度为4.5μm。

在本发明的技术方案中，所述的倾斜微阱阵列表面上具有条状墙壁结构，所述条状墙壁结构沿着横向方向直线延伸，所述条状墙壁结构在每横行倾斜微阱之间设置，不穿过微阱内凹部分。在本发明一些具体实施方案中，条状墙壁结构的高度为5-20μm，优选为8-12μm，例如10μm。

在本发明的技术方案中，倾斜微阱阵列上表面上具有亲水性，其与水溶液的液固界面杨氏接触角5°-60°。

在本发明的技术方案中，所述三维内凹的倾斜微阱的阵列通过以下方法制成；

i)在洁净ITO电极基底上旋涂光刻胶，然后覆盖第一掩模板后进行斜光刻；

ii)固化后去除未固化光刻胶，获得内凹的三维微阱阵列；

优选地，还包括步骤iii)在步骤ii)所得产品的基础上再加入光刻胶，光刻胶的高度高于步骤ii)所得产品的高度，并覆盖第二掩模板后进行垂直光刻。

在本发明的技术方案中，步骤iii)的光刻胶的高度高于步骤ii)所得产品的高度5-20μm。优选为8-12μm。

在本发明的技术方案中，所述三维内凹的倾斜微阱的阵列的材质选自SU-8,PI(聚酰亚胺)。

在本发明的技术方案中，所述三维内凹的倾斜微阱制备完成后内表面会进行修饰，所述修饰选自纳米材料的修饰，优选地，所述纳米材料选自金纳米线、银纳米线、金纳米颗粒、银纳米颗粒。

在本发明的技术方案中，所述三维内凹的倾斜微阱的内表面的修饰是通过电化学循环伏安法进行纳米材料的表面沉积。

在本发明的技术方案中，所述单分子蛋白检测芯片还包括电源，所述电源能够给予引起三维内凹的倾斜微阱中溶液进行电化学发光的电势差。

在本发明的技术方案中，所述电源能够提供每个倾斜微阱以1.3V-1.8V的电势差，优选为1.3-1.6V的电势差。

在本发明的技术方案中，所述ITO电极与所述三维内凹的倾斜微阱阵列的倾斜微阱接触位置形成超微电极。

在本发明的技术方案中，所述单分子蛋白检测芯片上倾斜微阱的阵列的数量为m×n个，电压施加在的半椭圆的半长轴方向，其中m代表倾斜微阱的行数，n代表倾斜微阱阵列的列数，其中m值大于5，优选为1000-10000；n值大于3，优选为5-50。优选地微阱数量不低于4000个。

本发明另一个方面提供了一种单分子蛋白检测系统，所述单分子蛋白检测系统包括上述单分子蛋白检测芯片，报告颗粒以及定位载体；

所述定位载体为第一抗体修饰的微珠，微珠材质优选为磁珠。

所述报告颗粒为表面修饰了电化学发光标记物和第二抗体的微球；

所述第一抗体和第二抗体为针对待测的同一种蛋白或者抗原的不同表位的抗体。

在本发明的技术方案中，所述的定位载体中的第一抗体通过化学键与微珠表面修饰基团偶联，例如，采用表面具有羧基或氨基的微球，并通过酰胺键与第一抗体偶联。

在本发明的技术方案中，所述的定位载体中的免疫活性结合位点已进行封闭，优选采用BSA进行封闭。

在本发明的技术方案中，所述的定位载体中微珠的半径为1μm-1.5μm，优选为1.35μm-1.45μm，例如1.4μm磁珠，借助外置磁铁系统可多次洗涤磁珠以除去任何非特异性结合的蛋白质。

在本发明的技术方案中，所述报告颗粒的微球为负载电化学发光标记物的二氧化硅微球。优选地，所述微球的粒径在100nm-3000nm；优选地为500-700nm。

在本发明的技术方案中，所述报告颗粒中的电化学发光标记物选自Ru(bpy)₃ ²⁺。优选地，所述的微球表面负载10⁴个以上电化学发光标记物，电化学发光标记物通过静电力等吸附力吸附在微球表面。

本发明再一个方面提供了一种单分子蛋白检测平台，所述检测平台包括上述单分子蛋白检测系统、图像采集部件以及图像处理分析部件；

所述图像采集系统选自EMCCD相机、显微镜、图像捕获软件。

所述图像处理分析部件能实现对于未通电前包含微珠的微阱位置及数量、通电后包含发光微珠的微阱位置及数量的统计分析及图像拼接处理。

在本发明的技术方案中，所述的图像处理分析部件进行统计分析的方法为按照泊松分布概率公式计算得到发光微珠的概率密度。优选地，所述的发光微珠数量为未通电前分布于微阱中，且在通电后进行发光的微球数量。所述的总微珠数量为未通电前微阱中的所有微球的数量。

进一步地，所述的图像处理分析部件能够获得被检测对象对应的浓度值。

本发明第四个方面提供了一种单分子蛋白检测方法，所述方法采用本发明上述单分子蛋白检测芯片、单分子蛋白检测系统，或单分子蛋白检测平台中的至少一种。

在本发明的技术方案中，所述的单分子蛋白检测方法包括以下步骤：

1)将单分子蛋白检测系统中的定位载体与报告颗粒先后与待检测蛋白孵育培养，得到待检测的包含免疫复合物修饰微珠的溶液；

2)将待检测溶液和三丙胺混合溶液共同分散在所述单分子蛋白检测芯片上，使倾斜微阱芯片对免疫复合物修饰微珠进行分散和捕获；

3)采用单分子蛋白检测平台中的图像采集系统分别对未通电和通电后的单分子蛋白检测芯片进行图片采集；

4)采用单分子蛋白检测平台中的图像处理分析部件，对于步骤3)获得的图片进行分析计算。

在本发明的技术方案中，步骤1)所述的定位载体的数量为预估待检测蛋白数量的10倍以上。

在本发明的技术方案中，步骤1)中先将定位载体与待检测蛋白进行孵育，随后与报告颗粒进行孵育，获得免疫复合物修饰微珠；

在本发明的技术方案中，步骤2)中三丙胺溶液的浓度为0.05M-0.5M，优选为0.1M。

在本发明的技术方案中，步骤2)中每个倾斜微阱至多捕获一个免疫复合物修饰微珠。

在本发明的技术方案中，步骤2)中利用芯片放置时与水平面夹角-30°～30°，对微阱液滴产生的拉普拉斯压差的不同在芯片上实现液滴输运及铺展。

在本发明的技术方案中，步骤3)中先采用图像采集系统对未通电的单分子蛋白检测芯片进行图片采集，得到在所有包含定位载体的微阱位置及数量；然后对单分子蛋白检测芯片进行通电，使单分子蛋白检测芯片中每个倾斜微阱的电势差达到电化学发光所需的电势差，并对通电后的单分子蛋白检测芯片进行图片采集。

在本发明的技术方案中，步骤3)中每个倾斜微阱的电势差为1.3-1.8V，优选为1.3-1.6V。

在本发明的技术方案中，步骤4)中图像处理分析部件进行统计分析的方法为结合芯片本征参数及两次图像中获取的电化学发光微珠数量，按照泊松分布概率公式计算浓度值，具体为统计通电前包含定位载体的微阱，和在这些微阱中通电后发光的微阱的数量，按照泊松分布概率公式计算蛋白浓度。

有益效果

1)本发明通过对微珠进行表面修饰，修饰上与待检测蛋白或抗原特异性结合的抗体，实现微珠与待检测蛋白的特异性结合，并通过控制微珠的数量实现每个微珠至多结合一个单分子蛋白；此外通过极大地增加报告颗粒上报告分子的数量提高了电化学发光强度；

2)本发明设计了特定的微阱阵列及微流控芯片，能够提高片上免疫复合物修饰微珠捕获率及均匀性；本发明的微阱阵列制备方法简单，制备精度高，能够实现高通量的制备。

3)本发明设计了微阱阵列单元的特定尺寸，能够实现免疫复合物修饰微珠的定点捕获以获得高电势；

4)搭建的超微电极阵列电化学发光(UMEA-ECL)检测平台能够提高单分子蛋白检测灵敏度；

5)图像与蛋白浓度分析模型能够实现自适应蛋白检测分析。

基于上述优势，本发明能够获得快速灵敏的响应信号，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低的优势，尤其适用于单分子蛋白检测，具备潜在的经济价值。

附图说明

图1为免疫复合物修饰微珠及钌标功能化方法原理图，主要包括以下四步：1)预估样本中待测蛋白摩尔数，采用至少10倍(依据泊松分布，在此比例下单个微珠至多携带单个蛋白)数量的修饰有羧基的2.8μm磁珠(10mL溶液含有6～7×10⁸个珠子)为载体在芯片外部进行充分的反应和孵育；2)用磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4)配制N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，与碳二亚胺(EDC)混合溶液EDC-NHS(40mM EDC,10mM NHS)活化羧基，结合待测蛋白一抗后在37℃温育15min；3)采用3～5％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭免疫活性位点；4)采用三联吡啶钌(Ru(bpy)₃ ²⁺)为电化学发光报告分子，将其负载于二氧化硅球，极大地增加报告分子数(因二氧化硅球尺寸的不同可达不同量级)。将羧基化的负载Ru(bpy)₃ ²⁺二氧化硅球，先使用EDC-NHS溶液活化其羧基，偶联二抗生成钌标二抗，再和待测蛋白在37℃条件下温育15min，形成免疫复合物修饰微珠。借助外置磁铁多次洗涤磁珠以除去任何非特异性结合的蛋白质及游离的钌标二抗。

图2为制备的羧基化负载Ru(bpy)₃ ²⁺二氧化硅球及局部放大图，其粒径尺寸在600纳米左右，粒度均匀分布，单个纳米球表面粗糙，均匀负载满Ru(bpy)₃ ²⁺分子。

图3为半椭圆形的斜槽微阱结构示意图。首先将含特异性结合免疫复合物修饰微珠的液滴以一定浓度稀释，滴加于倾斜的仿猪笼草微阱阵列微流控芯片上，在蒸发条件下进行微珠阵列化。其中用于能且仅能容纳单个2.8μm微珠的基本微阱结构单元为半椭圆形的斜槽微阱，其几何模型如图所示。所述半椭圆形的半长轴为a，半短轴为b，斜槽的倾斜角度为α，根据计算得其尺寸要求需满足标准椭圆方程：

其中R为具有一定尺寸分布的微球的最大半径。在R＝1.4μm及cosα＝52/77条件下，取合适的不同a,b组合值。

图4为微流控芯片MEMS加工工艺流程图。首先在ITO玻璃基上旋涂su-8光刻胶，采用斜光刻(倾角cosα＝52/77)及垂直光刻工艺在ITO基底上制备三维内凹的倾斜微阱结构及其上的条状墙壁结构，构建以ITO超微电极阵列为基底的SU-8三维微阱阵列。垂直墙壁结构可增大液滴铺展过程中微珠所受拉普拉斯压力，更易于微珠在流道及微阱结构中高密度均匀快速分散。三维内凹的倾斜微阱结构可利用仿生猪笼草单方向液体驱动的毛细作用力实现液滴单方向自发输运及无死区铺展，而液滴中免疫复合物修饰微珠也在表面能梯度作用下被捕获至微阱结构中。

图5为超微电极阵列电化学发光检测原理示意图。以ITO电极上制备的10行6列的SU-8微阱阵列为例，在ITO电极两端施加外部电压且微阱阵列中存在溶液的条件下，就会因为电阻而产生电势梯度。由于微阱阵列中溶液的电阻显著大于ITO电极的电阻，绝大部分的电流都会经由ITO电极通过，溶液中的电场则是均匀分布的。单个微阱两端的电势差取决于微阱长度与环氧导电银胶固定的两导线间距的比例，当该电势差足够大时，在微阱两端的电极表面就会同时发生氧化或还原反应，引起电化学发光。

图6为Maxwell电场仿真图及电化学发光影像图。由ITO,SU-8及磷酸缓冲液的电导率及相对介电常数等参数对超微电极阵列进行Maxwell电场仿真，结果显示电场在溶液中均匀分布。实际实验中电极数量至少要大于40000个，在ITO基底上设计20×4000微阱阵列，具有结构简单，操作方便的优势。Ru(bpy)₃ ²⁺电化学发光氧化电位在1.3V左右，加电后单个ITO大尺寸电极阳极表面发生氧化反应，电化学发光区域明显可见。

图7为微阱结构尺寸示意图。当微珠落点位置靠近半短轴一侧时，可获得最高氧化电势。经计算取半长轴a＝10μm，半短轴b＝1.6μm，在此尺寸下，2.8μm微珠落点被限制在斜微阱半短轴附近，从而获得高氧化电势。而在高浓度TPrA的Ru(bpy)₃ ²⁺/TPrA体系，微珠直径在4μm以内时，微珠尺寸越小越靠近电极表面，ECL强度呈指数型增大。考虑到微加工工艺尺寸分辨率限制，同时尺寸在3μm的微珠发光并不局限于珠子与电极的接触表面，整个微珠都有电化学发光而且珠子的中心部位发光最强。故采用2.8μm微珠，在加电条件下可观测到微珠发光亮点。

图8为金纳米线修饰超微电极上微珠阵列化原理图。电极修饰材料的表面形貌、表面积等特性会对电极/溶液界面过电位造成改变，进而影响对阳极端微珠上三联吡啶钌ECL信号的增强效果。滴加微珠及0.1M三丙胺溶液至ITO电极，利用不同的平面倾斜角及杨氏接触角组合对微阱产生的液面压力差的不同在芯片上实现液滴输运及铺展，每个微阱至多捕获一个微珠。

图9为UMEA-ECL成像检测示意图。UMEA-ECL成像检测平台用于对微流控芯片进行光学成像检测，主要包括上位机、微流控芯片、可调开关电源、显微镜及EMCCD相机。EMCCD相机具有数据传输时放大光学信号而不增加噪声的优点，故在超暗的光线不需要较长的曝光时间。首先在上电前拍摄明场下芯片上微珠图像，并将所采集到的不同位置的扫描图像进行拼接和分析，得到在明场环境下所有包含微珠的微阱位置及数量。然后上电拍摄暗场下芯片上ECL图像，依次完成所有位置的图像扫描，将扫描的图像再次进行拼接处理，设计基于机器学习算法的图像分析软件，计算得到暗场下所有发光微珠的总数量。最后按照泊松分布概率公式计算得到发光微珠的概率密度，从而得到被测对象的浓度值。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

在本发明中，术语“第一”、“第二”等用于描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开，并不表示特定的顺序或者重要程度。实际上，“第一”、“第二”等表述完全可以互换使用。例如，在不脱离本公开范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。

在本发明中，术语“横行”、“行”、“行数”为与倾斜微阱长边延伸方向相同的方向，术语“纵列”、“列”、“列数”为与倾斜微阱短边延伸方向相同的方向。

在本发明中，术语“横向”指ITO电极上与电源正极和负极连接的电线之间连线平行的方向，纵向指与所述横向垂直，且与ITO电极平面平行的方向。

实施例1制备免疫复合物修饰微珠及钌标功能化

为保证每个微珠至多结合一个单分子蛋白并提高电化学发光强度，设计了免疫复合物修饰微珠及钌标功能化方法。主要包括羧基化微珠经碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)活化偶联一抗，牛血清白蛋白(BSA)封闭免疫活性位点后，捕获样本中目标蛋白并结合钌标二抗形成免疫复合物修饰微珠：

具体为：

1)修饰有羧基的2.8μm磁性微珠(10mL溶液含有6×10⁸～7×10⁸个微珠)为载体在芯片外部进行充分的羧基化；

用磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4)配制N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，与碳二亚胺(EDC)混合溶液EDC-NHS(40mM EDC,10mM NHS)活化磁性微珠表面羧基，结合待测蛋白的一抗后在37℃温育15min；

采用3～5％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭免疫活性位点；获得定位颗粒。

2)采用三联吡啶钌(Ru(bpy)₃ ²⁺)为电化学发光报告分子，将其负载于二氧化硅球，极大地增加报告分子数，在10⁴以上。将羧基化的负载Ru(bpy)₃ ²⁺二氧化硅球，先使用EDC-NHS溶液活化其羧基，偶联待测蛋白的第二抗体生成钌标二抗。

3)将待检测蛋白与定位颗粒混合孵育。预估样本中待测蛋白摩尔数，采用至少10倍(依据泊松分布，在此比例下单个微珠至多携带单个蛋白)数量定位颗粒与待检测蛋白进行孵育。钌标二抗再和固定待测蛋白的微珠在37℃条件下温育15min，形成免疫复合物修饰微珠。(示意图见图1)

实施例2设计和制备单分子蛋白检测芯片

设计单分子蛋白检测芯片的具体结构(见图3)：用于容纳2.8μm微珠的基本微阱结构单元为半椭圆形的斜槽微井，为满足单个微阱能且仅能容纳单个微珠，设计半椭圆形的半长轴、半短轴、斜槽的倾斜角度等，以构建标准椭圆方程；所述半椭圆形的半长轴为a，半短轴为b，斜槽的倾斜角度为α，根据计算得其尺寸要求需满足标准椭圆方程：

x和y为半椭圆形上任意一点的坐标，半椭圆形的半长轴长度为a，则根据公式计算可知a²＝4R²/sin²α，半短轴长度为b，则根据公式计算可知b²＝4R²/3倾斜微阱的倾斜角度为α，R为用于检测用的定位颗粒中微珠的半径。在这个实施例中采用了2.8μm粒径的磁珠，即R＝1.4μm半径的微珠，且倾斜角度为cosα＝52/77。通过计算可知a、b值。a为1.6μm，b为10μm。

设计微流控芯片的微机电系统(MEMS)加工工艺：首先在ITO玻璃基上旋涂SU-8光刻胶，其次采用斜光刻(倾角cosα＝52/77)及垂直光刻工艺在ITO基底上制备三维内凹的微阱结构(微阱高4.5μm)及其上的条状墙壁结构(墙高10μm)，最后构建以ITO超微电极阵列为基底的SU-8三维微阱阵列。微加工工艺见图4。具体为在ITO基底上旋涂光刻胶，然后覆盖第一掩模板后进行斜光刻，斜光刻的倾角为cosα＝52/77，固化后去除未固化光刻胶，获得内凹的三维阵列；在前述产品的基础上再次旋涂光刻胶，光刻胶的高度高于前述步骤所得产品的高度10μm，并覆盖第二掩模板后进行垂直光刻；垂直光刻所得的固化部分在前述步骤所得光刻胶横行位置之上，即在之前得到的微阱结构上加筑了条状墙壁结构。制备获得的单分子蛋白检测芯片表面可以进行亲水化处理，使之与含免疫复合物修饰微珠溶液接触时，具有至少60°以下的杨氏接触角。

将特异性结合免疫复合物修饰微珠的液滴以稀释浓度，与0.1M的三丙胺共同滴加于倾斜的单分子蛋白检测芯片上，在蒸发条件下进行微珠阵列化；将液体分散在单分子蛋白检测芯片时，切斜-30°-30°，以获得更好的铺展。

实施例3微阱阵列单元的特定尺寸研究

首先确定ITO电极上制备的SU-8倾斜微阱阵列为4000行×20列，单个微阱两端的电势差取决于微阱长度与两铜线间距的比例。电势差足够大时，在微阱两端的电极表面发生氧化或还原反应，引起电化学发光。当微珠落点位置靠近半短轴时，获得最高电势。因此，设计微阱阵列单元的特定尺寸为半长轴10μm，半短轴1.6μm。在ITO电极两端施加外部电压且微阱阵列中存在溶液的条件下，就会因为电阻而产生电势梯度。由于微阱阵列中溶液的电阻显著大于ITO电极的电阻，绝大部分的电流都会经由ITO电极通过，溶液中的电场则是近似相等的，所以本发明微阱阵列两侧(即椭圆微阱长边延伸方向)设置导电银胶并引出电源。经测试在本实施例的条件下，每个倾斜微阱的电势差为1.3V以上可以实现电化学发光报告分子的发光。

实施例4搭建的UMEA-ECL成像平台进行蛋白浓度测试和参数优化

为提高单分子蛋白检测灵敏度，搭建了超微电极阵列电化学发光(UMEA-ECL)检测平台，研究了电极表面修饰材料形貌、表面积等特性对电极/溶液界面过电位的改变，以及对阳极端微珠上三联吡啶钌电化学发光信号的增强作用。

超微电极阵列电化学发光(UMEA-ECL)检测平台包括含单分子蛋白检测系统、图像采集部件EMCCD相机以及图像处理分析部件。EMCCD相机可以采集未通电前和包含微珠的微阱位置及数量、以及通电后包含发光微珠的微阱位置。所述的图像处理分析部件进行统计分析的方法为按照泊松分布概率公式计算得到发光微珠的概率密度；并进一步获得被检测对象的浓度值。在此基础上，对平台的各部分性能进行优化：

(4-1)搭建的UMEA-ECL成像平台中，微珠尺寸越小越靠近电极表面，ECL强度呈指数型增大。经计算取半长轴a＝10μm，半短轴b＝1.6μm，在此尺寸下，2.8μm微珠落点被限制在斜微阱半短轴附近，从而获得高氧化电势。而在高浓度TPrA的Ru(bpy)₃ ²⁺/TPrA体系，考虑到微加工工艺尺寸分辨率限制，同时尺寸在3μm的微珠发光并不局限于微珠与电极的接触表面，整个微珠都有电化学发光易于观察发光点。最终选择2.8μm磁珠作为定位载体进行单个免疫复合物的载体的制备；

具体检测方法如下：

1)将单分子蛋白检测系统中的定位载体与报告颗粒分别与待检测蛋白孵育培养，得到待检测的包含免疫复合物修饰微珠的溶液；所述的定位载体的数量为预估待检测蛋白数量的10倍以上。分别制备定位载体和报告颗粒，定位载体的制备方法为用磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4)配制N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，与碳二亚胺(EDC)混合溶液EDC-NHS(40mMEDC,10mM NHS)活化磁性微珠表面羧基，结合待测蛋白的一抗后在37℃温育15min。采用3～5％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭免疫活性位点。报告颗粒的制备方法为采用三联吡啶钌(Ru(bpy)₃ ²⁺)为电化学发光报告分子，通过物理吸附将其负载于二氧化硅球，负载数量为10⁴个以上Ru(bpy)₃ ²⁺。步骤1)中先将定位载体与待检测蛋白进行孵育，随后与报告颗粒进行孵育，获得免疫复合物修饰微珠。通过磁珠进行免疫复合物修饰微珠的纯化。

2)将待检测溶液和三丙胺溶液共同分散在所述单分子蛋白检测芯片上，使倾斜微阱对免疫复合物修饰微珠进行分散和捕获；三丙胺溶液浓度为0.1M，所述浓度为待检测溶液和三丙胺溶液混合溶液中三丙胺溶液浓度。分散时，液体与单分子蛋白检测芯片表面的杨氏接触角为小于60°，并利用芯片放置时与水平面夹角-30°～30°，对微阱产生的液面压力差的不同在芯片上实现液滴输运及铺展。铺展后每个倾斜微阱至多捕获一个免疫复合物修饰微珠。

3)采用单分子蛋白检测平台中的图像采集系统分别对未通电和通电后的单分子蛋白检测芯片进行图片采集；具体为，先采用图像采集系统对未通电的单分子蛋白检测芯片进行图片采集，得到在所有包含微珠的微阱位置及数量；然后对单分子蛋白检测芯片进行通电，使单分子蛋白检测芯片中每个倾斜微阱的电势差达到电化学发光所需的电势差，并对通电后的单分子蛋白检测芯片进行图片采集。在通电过程中赋予单分子蛋白检测芯片的电势差能够满足每个倾斜微阱的具有足够的电势差使电化学报告分子发光，在本实施例中为1.3V以上的电势即可实现报告分子的发光。

4)采用单分子蛋白检测平台中的图像处理分析部件，对于步骤3)获得的图片进行分析计算。具体为，结合电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)图像，提出了图像与蛋白浓度分析模型，利用机器学习算法对EMCCD图像进行拼接和分析，通过泊松分布概率公式计算待测蛋白的相对浓度值。所述的发光微珠数量为未通电前微阱中，且在通电后进行发光的微球数量。所述的总微珠数量为未通电前微阱中的所有微球的数量。如果需要计算绝对中，还需要进行已知蛋白浓度的检测，获得已知蛋白浓度的蛋白检测获得的相对浓度值，并将待测蛋白的相对浓度值进行对比或回归，以获得实际浓度值。

(4-2)搭建的UMEA-ECL成像平台中，单个超微电极基于电压降具有不同的电势，通过优化Ru(bpy)₃ ²⁺/TPrA反应体系电化学发光检测参数，如施加电压、电解质溶液浓度、检测时间参数等，获得最佳的实验参数；

(4-3)搭建的UMEA-ECL成像平台中，单个超微电极基于电压降便可在两端发生氧化还原反应，结构简单、操作方便；

(4-4)搭建的UMEA-ECL成像平台中，利用负载三联吡啶钌二氧化硅球进行电化学发光信号的放大；

(4-5)搭建的UMEA-ECL成像平台中，利用金纳米线修饰超微电极，以增大比表面积及电化学发光信号强度。

Claims (10)

1.一种单分子蛋白检测芯片，所述单分子蛋白检测芯片具有ITO电极的基底和所述ITO电极上具有三维内凹的倾斜微阱阵列；倾斜微阱阵列横向方向的两端分别具有与电源正极和负极连接的电线，

所述的倾斜微阱的形状为，上下两截面均为半椭圆形的同半径的凹陷倾斜槽，上截面为与ITO基底平行的平面，下截面为电极与倾斜微阱阵列的接触平面；所述上截面与下截面的半椭圆形长轴的延伸方向与倾斜微阱阵列横向方向一致，上截面上的半椭圆形长轴的延长线在下截面所在平面的垂直投影与下截面的半椭圆形长轴重合；且下截面半椭圆形比上截面半椭圆形更靠近与电源负极连接的电线；每个倾斜微阱中截面的半椭圆形中弧线指向电源负极方向，半椭圆形为短轴靠近电源正极方向。

2.根据权利要求1所述的单分子蛋白检测芯片，半椭圆形的半长轴长度为a，a²＝4R²/sin²α，半椭圆形的半短轴长度为b，b²＝4R²/3，倾斜微阱的倾斜角度为α，R为用于检测用的定位颗粒中微珠的半径，优选地，R的范围为1-2μm，α为30°-80°。

3.根据权利要求1所述的单分子蛋白检测芯片，所述单分子蛋白检测芯片上倾斜微阱的阵列的数量为m×n个，电压施加在的半椭圆的半长轴方向，其中m代表倾斜微阱的行数，n代表倾斜微阱阵列的列数，其中m值大于5，优选为1000-10000；n值大于3，优选为5-50；更优选地，微阱数量不低于40000个。

4.根据权利要求1所述的单分子蛋白检测芯片，所述的倾斜微阱阵列表面上具有条状墙壁结构，所述条状墙壁结构的沿着横向方向直线延伸，所述条状墙壁结构在每横行倾斜微阱之间设置，不穿过微阱内凹部分，优选地，条状墙壁结构的高度为5-20μm。

5.根据权利要求1所述的单分子蛋白检测芯片，所述倾斜微阱的内表面具有修饰，所述修饰选自纳米材料的修饰，优选地，所述纳米材料选自金纳米线、银纳米线、金纳米颗粒、银纳米颗粒；更优选地，所述三维内凹的倾斜微阱的内表面的修饰是通过电化学循环伏安法纳米材料的修饰进行表面沉积。

6.一种单分子蛋白检测系统，所述单分子蛋白检测系统包括权利要求1-5任一项所述的单分子蛋白检测芯片，报告颗粒以及定位载体；

所述定位载体为第一抗体修饰的微珠；

所述报告颗粒为表面修饰了电化学发光标记物的微球，并与第二抗体偶联；

所述第一抗体和第二抗体为针对待测的同一种蛋白不同表位的抗体。

7.根据权利要求6所述的单分子蛋白检测系统，所述的定位载体中微珠的半径为1μm-1.5μm，优选为1.35μm-1.45μm，微珠材质为磁珠；更优选地，所述的第一抗体通过化学键偶联至微珠表面，且微珠表面其他免疫活性位点已被封闭。

8.根据权利要求6所述的单分子蛋白检测系统，所述报告颗粒的微球为二氧化硅微球；所述微球的粒径在100nm-3000nm；更优选地，所述报告颗粒中的电化学发光标记物选自Ru(bpy)₃ ²⁺。

9.一种单分子蛋白检测平台，所述检测平台包括权利要求6-8任一项所述的单分子蛋白检测系统、图像采集部件以及图像处理分析部件；

所述图像采集系统选自EMCCD相机、显微镜、图像捕获软件；

所述图像处理分析部件能实现对于未通电前包含微珠的微阱位置及数量、通电后包含发光微珠的微阱位置及数量的统计分析；

优选地，所述的图像处理分析部件进行统计分析的方法为统计通电前包含定位载体的微阱和在这些微阱中通电后发光的微阱的数量，并进行计算。

10.一种单分子蛋白检测方法，所述方法采用权利要求1-5任一项所述的单分子蛋白检测芯片、权利要求6-8任一项所述的单分子蛋白检测系统，或权利要求9所述的单分子蛋白检测平台中的至少一种；

优选地，所述的单分子蛋白检测方法包括以下步骤：

1)将单分子蛋白检测系统中的定位载体与报告颗粒分别与待检测蛋白孵育培养，得到待检测的包含免疫复合物修饰微珠的溶液；

2)将待检测溶液和三丙胺混合溶液滴加在所述单分子蛋白检测芯片上，使倾斜微阱对免疫复合物修饰微珠进行分散和捕获；

3)采用单分子蛋白检测平台中的图像采集系统分别对未通电和通电后的单分子蛋白检测芯片进行图片采集；

4)采用单分子蛋白检测平台中的图像处理分析部件，对于步骤3)获得的图片进行分析计算；

优选地，步骤1)所述的定位载体的数量为预估待检测蛋白数量的10倍以上；

优选地，步骤2)中在待检测溶液和三丙胺溶液共同分散在所述单分子蛋白检测芯片上以后，倾斜单分子蛋白检测芯片，使之水平面夹角为-30°～30°；

优选地，步骤3)中先采用图像采集系统对未通电的单分子蛋白检测芯片进行图片采集，得到在所有包含微珠的微阱位置及数量；然后对单分子蛋白检测芯片进行通电，使单分子蛋白检测芯片中每个倾斜微阱的电势差达到电化学发光所需的电势差，并对通电后的单分子蛋白检测芯片进行图片采集；

优选地，步骤4)中图像处理分析部件进行统计分析的方法为统计通电前包含定位载体的微阱和在这些微阱中通电后发光的微阱的数量，并进行计算。

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