CN112662597B - 一株高产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌 - Google Patents
一株高产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌。本发明在一种农业害虫桔小实蝇雄虫的直肠中分离到一株可产生三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌RL3，将该菌采取改良的LB液体培养基进行发酵培养，发现该菌株可同时大量发酵生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。本发明为生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪提供了生物发酵菌株和方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌。
背景技术
2,3,5-三甲基吡嗪(TMP)是一种具有烤花生香味的物质，存在于烘烤的可可豆、食醋、白酒中。常用作食品添加剂。另外白酒中的三甲基吡嗪还具有抗炎的作用。
2,3,5,6-四甲基吡嗪(TTMP)具有烘烤和坚果的特殊香味，天然存在于乳制品、豆制品、榛子、醋、面包、酒精类饮、咖啡和中药等物质中。常用作食品添加剂，另外有研究表明，四甲基吡嗪在治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等方面具有一定疗效。
近年来，随着对TMP和TTMP的深入研究，这两种物质的应用价值不断被发掘。现有研究表明这两种物质的合成方法主要有植物提取法、化学合成法、生物合成法。相比于植物提取法和化学合成法，生物合成法同时具有反应温和、提取效率高、无污染等突出优点。1962年Kosuge等首次在发现枯草芽孢杆菌可发酵产生吡嗪类物质。现有研究证实了一些微生物发酵产生吡嗪类物质是两步反应，首先是微生物以糖为底物产生乙偶姻，然后乙偶姻与氨基酸中的铵离子或者外源添加的铵离子结合生成吡嗪类的物质，在这个反应中菌种的类型、铵离子的含量和温度都影响着吡嗪类物质的产量。因此，在实际应用中可以通过筛选优良菌株来提高吡嗪类物质的产量。
发明内容
本发明针对现有技术中微生物发酵法中生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的菌种发酵产物浓度低的问题，提供一株新分离的以葡萄糖和苏氨酸为底物高产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌，可以用此菌株发酵生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。
因此，本发明的第一个目的是提供一株短小芽孢杆菌RL3，其保藏编号为GDMCCNO:61253。
本发明的短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)的形态特征为：在LB培养基上培养，呈白色蜡状，形态为边缘整齐、凸起、表面干燥、有皱褶。菌株形态为棒杆状，长1.5-3.0微米，直径0.6-0.7微米(图1和图2)。
分子生物学分类依据：
16S rRNA序列分析：提取菌RL3基因组DNA作为模板，以细菌16S rRNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT对DNA模板进行PCR扩增，PCR产物切胶回收后，用Sanger测序法进行序列测定。测序得到16S rRNA序列如SEQ IDNO.1所示，长度为1453bp。
将所得序列在NCBI数据库中比对并下载同源序列，然后使用BLAST、MEGA等软件建立系统发育树(图3)。将该序列在NCBI的NR数据库进行Blast比对，表明其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明该菌株与Bacillus pumilus更接近，如图3所示。结合菌落形态学特征和系统发育树分析，明确该菌株为短小芽孢杆菌，将其命名为短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)。
本发明还提供所述的短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)在产吡嗪类化合物中的应用。
优选，所述的吡嗪类化合物为三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪。
本发明还提供一种三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪的制备方法，其是利用所述的短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)发酵制备得到的。
优选，所述的方法，包括以下步骤：将所述的短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilusRL3)接种到含有葡萄糖和苏氨酸的培养基中，发酵培养，纯化分离培养物制备得到三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪。
优选，所述的含有葡萄糖和苏氨酸的培养基为改良的LB液体培养基，每升含有：10克蛋白胨、5克氯化钠、5克酵母膏粉、11克葡萄糖、3克(NH4)2HPO4、5克L-苏氨酸，余量为水。
优选，所述的发酵培养温度为37℃。
本发明在一种农业害虫桔小实蝇雄虫的直肠中分离到一株可产生三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)。采取改良的LB液体培养基进行发酵培养，发现该菌株可同时大量发酵生产三甲基吡嗪(2.1μg/ml)和四甲基吡嗪(6.9μg/ml)。本发明为生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪提供了生物发酵菌株和方法。
保藏说明：
本发明的短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)于2020年10月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC No:61253。
附图说明
图1是Bacillus pumilus RL3菌落形态。
图2是Bacillus pumilus RL3菌体形态。
图3是Bacillus pumilus RL3系统发育树构建结果；括号中代码为菌株在NCBI数据库中的登录号；灰色底标记的(unknown(Query 13645))为Bacillus pumilus RL3。
图4是Bacillus pumilus RL3发酵液中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪GC-MS鉴定。
图5是Bacillus pumilus RL3发酵液中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
在一种农业害虫桔小实蝇雄虫的直肠中分离到一株可产生三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的芽孢杆菌属菌株RL3。
该菌株RL3的形态特征为：在LB培养基上培养，呈白色蜡状，形态为边缘整齐、凸起、表面干燥、有皱褶。菌株形态为棒杆状，长1.5-3.0微米，直径0.6-0.7微米(图1和图2)。
分子生物学分类依据：
16S rRNA序列分析：提取菌株RL3基因组DNA作为模板，以细菌16S rRNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT对DNA模板进行PCR扩增，PCR产物切胶回收后，用Sanger测序法进行序列测定。测序得到16S rRNA序列如SEQ IDNO.1所示，长度为1453bp。
将所得序列在NCBI数据库中比对并下载同源序列，然后使用BLAST、MEGA等软件建立系统发育树(图3)。将该序列在NCBI的NR数据库进行Blast比对，表明其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株的同源性最高，相似性大于99％，系统进化树分析表明该菌株与Bacillus pumilus更接近，如图3所示。结合菌落形态学特征和系统发育树分析，明确该菌株为短小芽孢杆菌，将其命名为短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)。
上述Bacillus pumilus RL3菌株，可用于以改良的LB液体培养基发酵生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。所述的改良的LB液体培养基配方为：每升含有：10克蛋白胨、5克氯化钠、5克酵母膏粉、11克葡萄糖、3克(NH4)2HPO4、5克L-苏氨酸，余量为水。
上述Bacillus pumilus RL3菌株，用于以改良的LB液体培养基发酵生产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪时，发酵温度为37℃，在250毫升的锥形瓶中装50毫升改良的LB液体培养基，接种量5％，置于摇床上以150转/分钟的转速培养6天后，通过安捷伦气相质谱联用仪(GC-MS:7890A-5977B)检测三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量。具体检测方法为：取1毫升发酵液放置于一个20ml的玻璃瓶中，使用一个规格为100μm的红色固相微萃取头对发酵液进行室温顶空萃取30分钟。萃取结束后，将萃取头取出于GC-MS上进样检测。GC进样口温度为：240℃，色谱柱型号为HP-5MS(长30m，内径0.25mm,厚度0.25μm)，载气为氦气，压力为110.9kPa，柱箱升温程序为：50℃保持1分钟,10℃/min升温至140℃,然后25℃/min升温至250℃，保持3分钟。质谱检测条件为：传输线路温度230℃,离子源温度:230℃,电离电压:70eV。实验中对发酵液进行3个重复检测。为了准确定量发酵液中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量采用相同的方法对浓度梯度为0，1，2，4，8mg/ml的三甲基吡嗪和四甲基吡嗪标准品进行GC-MS检测，每个浓度梯度进行3个重复检测，检测后绘制三甲基吡嗪和四甲基吡嗪标准品浓度与峰面积的标准曲线。发酵液中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量用其检测峰面积对应标准曲线进行计算。如图4和图5所示，该Bacillus pumilus RL3菌株在发酵6天后，发酵液中可大量产生三甲基吡嗪(2.1μg/ml)和四甲基吡嗪(6.9μg/ml)。
序列表
<110> 庐山市绿游生态农业开发有限公司
<120> 一株高产三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的短小芽孢杆菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌RL3(Bacillus pumilus RL3)
<400> 1
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Claims (6)
1.一株短小芽孢杆菌RL3，其特征在于，其保藏编号为GDMCC NO:61253。
2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌RL3在产三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪中的应用。
3.一种三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪的制备方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的短小芽孢杆菌RL3发酵制备得到的。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述的短小芽孢杆菌RL3接种到含有葡萄糖和苏氨酸的培养基中，发酵培养，纯化分离培养物制备得到三甲基吡嗪和/或四甲基吡嗪。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的含有葡萄糖和苏氨酸的培养基为改良的LB液体培养基，每升含有：10克蛋白胨、5克氯化钠、5克酵母膏粉、11克葡萄糖、3克(NH4)2HPO4、5克L-苏氨酸，余量为水。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养温度为37℃。
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Denomination of invention: A Bacillus subtilis strain with high yields of trimethylpyrazine and tetramethylpyrazine Effective date of registration: 20231226 Granted publication date: 20211001 Pledgee: Jiangxi Lushan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: LUSHAN LVYOU ECOLOGICAL AGRICULTURE DEVELOPMENT CO.,LTD. Registration number: Y2023980074222 |