CN112661754B - 一类抑制rna解旋酶dhx33的多环化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类抑制RNA解旋酶DHX33的多环化合物。特别地，本发明涉及式I所示的化合物或其药学上可接受的形式、包含其的药物组合物、其制备方法、及其用于预防和/或治疗DHX33相关疾病的医药用途。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及DHX33的小分子抑制剂、包含其的药物组合物、其制备方法、及其用于预防和/或治疗DHX33相关疾病的医药用途。
背景技术
DHX33属于含有DEAD/H盒的RNA解旋酶蛋白家族。其中的DEAD/H代表氨基酸的缩写Asp-Glu-Ala-Asp/His，这一序列连同其它多个保守性的氨基酸序列，出现在RNA解旋酶家族成员的蛋白序列中，高度参与核酸底物结合以及ATP水解。虽然这些家族成员共有这些相同的序列，但是每个RNA解旋酶都有各自特定的专一性和独特的生物功能。人DHX33蛋白的分子量是72kDa，具有解旋核酸的功能，它利用ATP水解所释放的生物能来驱动改变RNA和蛋白质复合物的构象，进而参与多种RNA的代谢活动，具体地，从RNA转录、剪切、编辑、翻译到降解等一系列生物过程。DHX33的功能并不仅仅局限于对RNA分子的修饰，研究表明，除了解旋RNA双链之外，DHX33蛋白也参与到DNA的代谢。具体，DHX33蛋白可以解开DNA的双链结构，并在基因表达过程中起重要作用。在体外的酶反应体系中，DHX33蛋白还被发现可以解开DNA/RNA的杂合双链结构。
研究表明，DHX33通过结合在多种癌症相关的基因启动子，影响了DNA的甲基化状态，进而在基因组水平调控多种癌症基因的表达和肿瘤发展相关的信号通路，对细胞生长、增殖、迁移、凋亡、糖代谢等多种细胞活动有至关重要的作用。此外，发现DHX33可以感受外来双链RNA分子的侵入并在细胞的先天免疫中发挥重要作用。DHX33作为十分重要的细胞生长调控基因，在多种癌症中高度表达，比如肺癌、淋巴瘤、神经胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌等。多种癌症的发生发展依赖于DHX33蛋白的高度表达。DHX33的遗传敲除可以显著抑制RAS癌基因驱动的肺癌发生发展；体内和体外实验证实，抑制DHX33蛋白后，多种癌症如乳腺癌、结肠癌、脑胶质瘤、淋巴瘤等癌症的发生发展都受到明显抑制。
研究表明，DHX33的蛋白功能依赖于其解旋酶活力。DHX33的解旋酶活力缺失突变体不具有DHX33蛋白的功能，无法替代野生型DHX33基因的功能。目前针对DHX33作为靶点的小分子抑制剂较为稀少，因此迫切需要开发一类活性高、成药性好的DHX33抑制剂药物。
发明内容
本发明通过大量的研究，发现了一系列具有抑制DHX33的RNA解旋酶活性的小分子化合物，具有预防和/或治疗DHX33相关疾病(例如脑胶质母细胞瘤等癌症)的潜在价值。
第一方面，本发明提供了一种具有式I结构的化合物或其药学上可接受的形式：
其中，
X1选自N或CR1，X2选自N或CR2，X3选自N或CR3，X4选自N或CR4，条件是X1、X2、X3和X4中至少有一个为N；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、卤素、氨基、硝基、羟基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、C1-4羟基烷基、-O-(C1-4亚烷基)-O-(C1-4烷基)、-C(＝O)-NH-(C1-4烷基)、-C(＝O)-NH-(C1-4亚烷基)-N(C1-4烷基)2、或-C(＝O)-O-(C1-4烷基)；
X5选自N或CR5，X6选自NR6或CR7R8，条件是X5和X6中至少有一个为N或含N基团；
R5选自氢或C1-4烷基；
R6选自氢、C1-4烷基或-(C1-4亚烷基)-O-(C1-4烷基)；
R7和R8各自独立地选自氢或C1-4烷基；
R10选自氢、C1-4烷基或C2-4烯基，或者R10与X6及其所连接的原子一起形成5-7元环；
R9选自氢、氰基、卤素、C1-4烷基或C2-4烯基；
环A选自吡咯环、吡唑环、咪唑环、噻唑环或噁唑环，或者环A与R9及其所连接的原子一起形成吲哚环、异吲哚环、苯并咪唑环、苯并噻唑环或苯并噁唑环；
环A任选地被一个或多个R11取代；
每个R11各自独立地选自卤素、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；
环B选自吡咯环、吡唑环、咪唑环、三唑环、呋喃环、噁唑环、异噁唑环、噁二唑环、噻吩环、噻唑环、异噻唑环、噻二唑环、苯环或吡啶环；
环B任选地被一个或多个R12取代；
每个R12各自独立地选自卤素、氰基、氨基、硝基、羟基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、C3-6环烷基、-C(＝O)-O-(C1-4烷基)、苯基、苄基、吡啶基、-C(＝O)-NH2、或-NH-C(＝O)-(C1-4烷基)，所述苯基、苄基、吡啶基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、氨基、羟基、C1-4烷基、或C1-4烷氧基的取代基取代；
所述药学上可接受的形式选自药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、氮氧化物、同位素标记物、代谢物和前药。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、氟、氯、溴、氨基、硝基、甲基、乙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、-NH(CH3)、-NH(CH2CH3)、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、-CH2OH、-CH2CH2OH、-O-(CH2)2-OCH3、-C(＝O)-NH-CH3、-C(＝O)-NH-(CH2)2-N(CH3)2、-C(＝O)-NH-(CH2)3-N(CH3)2、-C(＝O)-OCH3、或-C(＝O)-OCH2CH3。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、氟、氯、溴、氨基、硝基、甲基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-CH2OH、-O-(CH2)2-OCH3、-C(＝O)-NH-CH3、-C(＝O)-NH-(CH2)2-N(CH3)2、或-C(＝O)-OCH2CH3。
在一些更优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、氯、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-C(＝O)-NH-CH3、或-C(＝O)-NH-(CH2)2-N(CH3)2。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R5选自氢、甲基、乙基或异丙基。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R5选自氢或甲基。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R6选自氢、甲基、乙基、异丙基、-(CH2)2-OCH3或-CH2OCH3。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R6选自氢、甲基、乙基或-CH2OCH3。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R7和R8各自独立地选自氢、甲基、乙基或异丙基。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R7和R8各自独立地选自氢或甲基。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R10选自氢、甲基、乙基或异丙基。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R10选自氢或甲基。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R10与X6及其所连接的原子一起形成5-7元环。
在一些优选的实施方案中，当R10与X6及其所连接的原子一起形成环时，
选自/>
其中，R1、R3、R4和R9如式I中所定义。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R9选自氢、氟、氯、溴、氰基、甲基、乙基或异丙基。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的R9为氰基。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的环A选自
其中m选自0、1、2或3，R11如式I中所定义。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的环A与R9及其所连接的原子一起形成
其中p选自0、1或2，R10和R11如式I中所定义。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的每个R11各自独立地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、异丙基或三氟甲基。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的每个R11各自独立地选自氯、甲基或三氟甲基。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的环B选自：
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的每个R12各自独立地选自氟、氯、溴、氰基、氨基、硝基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环戊基、环己基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、-C(＝O)-OCH3、-C(＝O)-OCH2CH3、苯基、苄基、吡啶基、-C(＝O)-NH2、-NH-C(＝O)-CH3、或-NH-C(＝O)-CH2CH3。
在一些优选的实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式中的每个R12各自独立地选自氟、氯、溴、氰基、氨基、硝基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、环丙基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、-C(＝O)-OCH3、-C(＝O)-OCH2CH3、苯基、苄基、吡啶基、-C(＝O)-NH2、或-NH-C(＝O)-CH3。
在一些实施方案中，本发明提供了一种具有式I结构的化合物或其药学上可接受的形式：
其中，
X1选自N或CR1，X2选自N或CR2，X3选自N或CR3，X4选自N或CR4，条件是X1、X2、X3和X4中至少有一个为N；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、氯、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-C(＝O)-NH-CH3、或-C(＝O)-NH-(CH2)2-N(CH3)2；
X5选自N或CR5，X6选自NR6或CR7R8，条件是X5和X6中至少有一个为N或含N基团；
R5选自氢或甲基；
R6选自氢、甲基、乙基或-CH2OCH3；
R7和R8各自独立地选自氢或甲基；
R10选自氢或甲基；
R9为氰基；
环A选自
m选自0、1、2或3；
每个R11各自独立地选自氯、甲基或三氟甲基；
环B选自：
每个R12各自独立地选自氟、氯、溴、氰基、氨基、硝基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、环丙基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、-C(＝O)-OCH3、-C(＝O)-OCH2CH3、苯基、苄基、吡啶基、-C(＝O)-NH2、或-NH-C(＝O)-CH3；
所述药学上可接受的形式选自药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、氮氧化物、同位素标记物、代谢物和前药。
在一些实施方案中，上述式I化合物或其药学上可接受的形式为式Ia-1至式Ia-8化合物或其药学上可接受的形式：
其中环A、环B、R1、R2、R3、R4、R6、R9和R10如式I中所定义。
本领域技术人员应当理解，本发明涵盖针对各个实施方案进行任意组合所得的化合物。由一个实施方案中的技术特征或优选技术特征与另外的实施方案中的技术特征或优选技术特征组合得到的实施方案也包括在本发明的范围内。
第二方面，本发明还提供了如下化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、氮氧化物、同位素标记物、代谢物或前药：
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种上述式I、式Ia-1至式Ia-8化合物或其药学上可接受的形式，以及一种或多种药学上可接受的载体。
第四方面，本发明提供了上述式I、式Ia-1至式Ia-8化合物或其药学上可接受的形式、或者上述药物组合物，其用作DHX33抑制剂，用于预防和/或治疗至少部分由DHX33介导的疾病或病症(例如脑胶质母细胞瘤等癌症)。
第五方面，本发明提供了上述具有式I、式Ia-1至式Ia-8化合物或其药学上可接受的形式或者上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗至少部分由DHX33介导的疾病或病症(例如脑胶质母细胞瘤等癌症)的药物中的用途。
第六方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗至少部分由DHX33介导的疾病或病症(例如脑胶质母细胞瘤等癌症)的方法，其包括以下步骤：将预防和/或治疗有效量的上述式I、式Ia-1至式Ia-8化合物或其药学上可接受的形式或者上述药物组合物施用于对其有需求的个体。
本发明不限于文中所述的特定实施方案；还应该理解，文中所使用的术语仅用于描述而非限制特定实施方案。
术语定义
除非另有说明，下列术语在本发明中的含义如下。
术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变体旨在涵盖非排他性或开放式的包含内容。例如，包含一系列元素的组合物、方法或装置不一定仅限于已明确列出的元素，而是可能还包含其它未明确列出的元素或上述组合物、方法或装置所固有的元素。
当数值范围的下限和上限被公开时，落入该范围中的任何数值或任何亚范围都表示被具体公开。特别地，本文中所公开的参数的每一个数值范围(例如，以“约a至b”，或同等的“大约a至b”，或同等的“约a-b”的形式)均应理解为涵盖其中的每一个数值和亚范围。例如，“C1-4”应理解为涵盖其中的任意亚范围以及每一个点值，如C2-4、C3-4、C1-2、C1-3、C1-4等，以及C1、C2、C3、C4等。又例如，“5-10元”应理解为涵盖其中的任意亚范围以及每一个点值，例如5-6元、5-7元、5-8元、5-9元、6-7元、6-8元等，以及5、6、7、8、9、10元等。
术语“药物组合物”是指可以用作药物的组合物，其包含药物活性成分(或治疗剂)以及可选的一种或多种药学上可接受载体。术语“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的辅料，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。在本发明中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于：a)稀释剂；b)润滑剂；c)粘合剂；d)崩解剂；e)吸收剂、着色剂、调味剂和/或甜味剂；f)乳化剂或分散剂；和/或g)增强化合物的吸收的物质等。
上述药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以通过适合的途径给药，例如通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌内途径或作为吸入剂给药。
上述给药途径可以通过适合的剂型来实现。在本发明中可使用的剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂等。
当口服给药时，可将上述药物组合物制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊剂、水溶液剂、水混悬剂等。
上述药物组合物还可以无菌注射剂的形式给药，包括无菌注射水或油混悬剂，或者无菌注射水或油溶液剂。其中，可使用的载体包括但不限于：水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
上述药物组合物可以包含0.01mg至1000mg的至少一种上述式I、式Ia-1至式Ia-8化合物或其药学上可接受的形式。
术语“至少部分由DHX33介导的疾病或病症”是指发病机理中至少包含一部分与DHX33有关的因素的疾病，例如脑胶质母细胞瘤等癌症。
术语“有效量”是指能够诱发细胞、组织、器官或生物体(例如个体)产生生物或医学反应，并且足以实现所需预防和/或治疗效果的剂量。
可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可单次给药，可随时间分剂量给药，或可根据实际情况按比例减少或增加剂量后给药。可以理解的是，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据需要以及给药组合物或监督组合物的给药人员的专业判断而调整。
术语“对其有需求”是指医生或其它护理人员对个体需要或者将要从预防和/或治疗过程中获益的判断，该判断的得出基于医生或其它护理人员在其专长领域中的各种因素。
术语“个体”(或称受试者)是指人类或非人动物。本发明的个体包括患有疾病和/或病症的个体(患者)和正常的个体。本发明的非人动物包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物，例如鸟类、两栖类、爬行类等，和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
术语“治疗”是指减轻或消除所针对的疾病或病症。如果受试者接受了治疗量的本发明的化合物或其药学上可接受的形式或者本发明的药物组合物，该受试者的至少一种指标和症状表现出可观察到的和/或可检测出的缓解和/或改善，则表明该受试者已被成功地“治疗”。可以理解的是，治疗不仅包括完全地治疗，还包括未达到完全地治疗，但实现了一些生物学或医学相关的结果。具体而言，“治疗”表示本发明的化合物或其药学上可接受的形式或者本发明的药物组合物可以实现下列效果中的至少一种，例如：(1)在可能有疾病倾向，但尚未经历或显示疾病病理学或症状学的动物中防止疾病发生；(2)在正在经历或显示疾病病理学或症状学的动物中抑制疾病(即阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；(3)在正在经历或显示疾病病理学或症状学的动物中改善疾病(即逆转病理学和/或症状学)。
术语“药学上可接受的盐”是指对生物体基本上无毒性的，本发明的化合物的盐。药学上可接受的盐通常包括但不限于本发明的化合物与药学上可接受的无机/有机酸或无机/有机碱反应而形成的盐，此类盐又被称为酸加成盐或碱加成盐。适合的盐的综述参见，例如，Jusiak,Soczewinski,et al.,Remington’s Pharmaceutical Sciences[M],MackPublishing Company,2005和Stahl,Wermuth,Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[M],Wiley-VCH,2002。用于制备本发明的化合物的药学上可接受的盐的方法是本领域技术人员已知的。
术语“药学上可接受的酯”是指对生物体基本上无毒性的，在生物体体内水解成本发明的化合物或其盐的酯。药学上可接受的酯通常包括但不限于本发明的化合物与药学上可接受的羧酸或磺酸形成的酯，此类酯又被称为羧酸酯或磺酸酯。
术语“异构体”是指因具有相同的原子数和原子类型而具有相同的分子量，但原子的空间排列或构型不同的化合物。
术语“立体异构体”(或称“旋光异构体”)是指由于具有至少一个手性因素(包括手性中心、手性轴、手性面等)而导致具有垂直的不对称平面，从而能够使平面偏振光旋转的稳定异构体。由于本发明的化合物存在可能导致立体异构的不对称中心以及其它化学结构，因此本发明也包括这些立体异构体及其混合物。除非另外指出，本发明的化合物的所有立体异构体形式都在本发明的范围之内。
术语“互变异构体”(或称“互变异构形式”)是指具有不同能量的，可通过低能垒互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(或称质子转移互变异构体)包括但不限于通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化、亚胺-烯胺异构化、酰胺-亚胺醇异构化等。除非另外指出，本发明的化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。
术语“溶剂化物”是指由本发明的化合物(或其药学上可接受的盐)与至少一种溶剂分子通过非共价分子间作用力结合而形成的物质。例如，溶剂化物包括但不限于水合物(包括半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等)、乙醇合物、丙酮合物等。
术语“氮氧化物”是指叔胺类或含氮(芳)杂环类化合物结构中的氮原子经氧化而形成的化合物。例如，式I化合物母核中的氮原子可以形成相应的氮氧化物。
术语“同位素标记物”是指将本发明的化合物中的特定原子替换为其同位素原子而形成的衍生化合物。除非另外指出，本发明的化合物包括H、C、N、O、F、P、S、Cl的各种同位素，例如但不限于2H(D)、3H(T)、13C、14C、15N、17O、18O、18F、31P、32P、35S、36S和37Cl。
术语“代谢物”是指本发明的化合物经代谢后形成的衍生化合物。关于代谢的进一步信息可参见Goodman and Gilman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics(9thed.)[M],McGraw-Hill International Editions,1996。本发明涵盖本发明的化合物的所有可能的代谢物形式，即在施用本发明的化合物的个体体内形成的物质。化合物的代谢物可以通过所属领域的公知技术来鉴定，其活性可以通过试验来表征。
术语“前药”是指在施用于个体后能够直接或间接地提供本发明的化合物的衍生化合物。特别优选的衍生化合物或前药是在施用于个体时可以提高本发明的化合物的生物利用度的化合物(例如，更易吸收入血)，或者促进母体化合物向作用位点(例如，淋巴系统)递送的化合物。除非另外指出，本发明的化合物的所有前药形式都在本发明的范围之内，且各种前药形式是本领域已知的，例如参见T.Higuchi,V.Stella,Pro-drugs as Novel DrugDelivery Systems[J],American Chemical Society,Vol.14,1975。此外，本发明还涵盖含有保护基的本发明的化合物。在制备本发明的化合物的任何过程中，保护在任何有关分子上的敏感基团或反应基团可能是必需的和/或期望的，由此形成本发明的化合物的化学保护的形式。这可以通过常规的保护基实现，例如在T.W.Greene,P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis[M],John Wiley&Sons,2006中描述的保护基。使用本领域已知的方法，在适当的后续阶段可以移除这些保护基。
术语“各自独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y各自独立地为氢、卤素、羟基、氰基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“烷基”是指直链或支链的脂肪族烃基。例如，本发明中所使用的术语“C1-4烷基”是指具有1至4个碳原子的烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、或叔丁基等。烷基可以是任选取代的或未取代的。
在本文中单独或与其他基团组合使用时，术语“亚烷基”是指直链或支链的二价饱和脂肪族烃基，其所连接的两个基团(或片段)既可以连接同一个碳原子，又可以连接不同的碳原子。例如，本文中所使用的术语“C1-4亚烷基”是指具有1-4个碳原子的亚烷基(如亚甲基、1,1-亚乙基、1,2-亚乙基、1,2-亚丙基、1,3-亚丁基等)。亚烷基可以是任选取代的或未取代的。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“卤代烷基”是指被一或多个(诸如1至3个)相同或不同的卤素原子取代的烷基。例如，本发明中所使用的术语“C1-4卤代烷基”是指具有1至4个碳原子的卤代烷基。例如，卤代烷基包括但不限于-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CF2CF3、-CH2CH2CF3、-CH2Cl等。卤代烷基可以是任选取代的或未取代的。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“羟基烷基”是指被一或多个(诸如1至3个)羟基取代的烷基。例如，本发明中所使用的术语“C1-4羟基烷基”是指具有1至4个碳原子的羟基烷基。例如，羟基烷基包括但不限于
等。羟基烷基可以是任选取代的或未取代的。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“烷氧基”是指通过氧原子与分子的其余部分连接的烷基。例如，烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。烷氧基可以是任选取代的或未取代的。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“卤代烷氧基”是指一价的直链或支链的卤代烷基-O-基团，其被至少一个选自氟、氯、溴和碘的原子取代，可以含有不饱和度，并且通过一个与氧原子相连的单键连接至其它基团，例如C1-4卤代烷氧基。例如，卤代烷氧基包括但不限于氟甲氧基(-OCH2F)、二氟甲氧基(-OCHF2)、三氟甲氧基(-OCF3)、1-氟乙氧基(-OCHFCH3)、2-氟乙氧基(-OCH2CH2F)、1,2-二氟乙氧基(-OCHFCH2F)、2,2-二氟乙氧基(-OCH2CHF2)、1,2,2-三氟乙氧基(-OCHFCHF2)、2,2,2-三氟乙氧基(-OCH2CF3)等。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的、单环或多环(诸如双环)的非芳香族烃基。例如，本发明中所使用的术语“C3-6环烷基”是指具有3至6个碳原子的环烷基。例如，环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。环烷基可以是任选取代的或未取代的。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“羟基”是指-OH。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“氰基”是指-CN。
在本文中单独或与其它基团组合使用时，术语“氨基”是指-NH2。
附图说明
图1示出用本发明的方法制备的重组DHX33蛋白经SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝染色后的结果分析。
图2示出本发明的化合物AB24254对已知DHX33下游基因的调控。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中所使用的试剂或仪器均为可以通过市购获得的常规产品。未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。本发明中所使用的术语“室温”是指20℃±5℃。在用于修饰某一数值或数值范围时，本发明中所使用的术语“约”是指包括该数值或数值范围以及该数值或数值范围的本领域技术人员可接受的误差范围，例如该误差范围为±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％等。
以下实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定。
核磁共振(NMR)的测定仪器使用Bruker 400MHz核磁共振仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)、氘代氯仿(CDCl3)、六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，内标物质为四甲基硅烷(TMS)。
以下实施例中的核磁共振(NMR)数据中的缩写代表的含义如下：
s：单峰、d：二重峰、t：三重峰、q：四重峰、dd：双二重峰、qd：四二重峰、ddd：双双二重峰、ddt：双双三重峰、dddd：双双双二重峰、m：多重峰、br：宽峰、J：偶合常数、Hz：赫兹、δ：化学位移。
全部化学位移(δ)值以百万分之一(ppm)的单位给出。
质谱(MS)的测定仪器使用Agilent 6120B质谱仪，离子源为电喷雾离子源(ESI)。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfirc C18，150X4.6mm，5μm，色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18，150X4.6mm，5μm色谱柱)。
薄层层析硅胶板使用青岛海洋GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm硅胶板。
柱层析一般使用青岛海洋200-300目硅胶为载体。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂的体系有A：二氯甲烷和甲醇体系；B：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括A：二氯甲烷和甲醇体系；B：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。
化合物的合成
实施例1：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈(AB24249)的合成
(1)化合物3(2-(3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物1(3,4-二氨基吡啶)(400mg，3.67mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(1.24g，11.01mmol，3.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(6mL)中，在180℃搅拌5小时。反应物冷却后，去除溶剂。残余物用快速柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝50:1至10:1)纯化后得到棕色固体粉末化合物3(2-(3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(180mg，产率：31.0％)。MS(ESI)m/z:159[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(10:1)；Rf(化合物1)＝0.1；Rf(化合物3)＝0.3。
(2)化合物AB24249((E)-2-(3-(2-氰基-2-(3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)的合成
将化合物3(2-(3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(60mg，0.38mmol，1.0eq)溶解在乙醇(1.0mL)中，加入化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)(92mg，0.38mmol，1.0eq)和哌啶(32mg，0.38mmol，1.0eq)。将混合物加热回流并且搅拌1小时。反应完成后，将混合物冷却到室温，并且过滤。将固体物收集并且干燥后获得黄色固体粉末化合物AB24249((E)-2-(3-(2-氰基-2-(3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)(60mg，产率：41.3％)。MS(ESI)m/z:383[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.87(s,1H),8.24(d,J＝6.1Hz,2H),7.57(d,J＝5.7Hz,1H),6.97(s,1H),2.34(s,3H),2.30(s,3H),2.14(s,3H),2.09(s,3H)。
实施例2：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈(AB24254)的合成
(1)化合物6(6-甲氧基吡啶-3,4-二胺)的合成
将化合物5(2-甲氧基-5-硝基吡啶-4-胺)(3.0g，17.74mmol，1.0eq)溶解于甲醇(30mL)中，加入碳负载钯催化剂(300mg，0.1wt％)。将混合物在氢气条件下室温搅拌16小时。将固体物过滤，然后将滤液浓缩得到棕色固体化合物6(6-甲氧基吡啶-3,4-二胺)(2.6g，产率：100％)。MS(ESI)m/z:140[M+H]+。TLC：DCM:MeOH(10:1)；Rf(化合物5)＝0.7；Rf(化合物6)＝0.5。
(2)化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物6(6-甲氧基吡啶-3,4-二胺)(1.5g，10.2mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(3.5g，30.6mmol，3.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(6mL)中，在180℃搅拌5小时。冷却后去除溶剂。残余物通过快速柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝200:1至50:1)纯化得到棕色固体粉末化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(500mg，产率：26.0％)。MS(ESI)m/z:188[M+H]+。TLC:石油醚/乙酸乙酯(1:1)；Rf(化合物6)＝0.5；Rf(化合物7)＝0.2。
(3)化合物AB24254(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈的合成
将化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(80mg，0.42mmol，1.0eq)溶解于1mL乙醇中，加入化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)(103mg，0.42mmol，1.0eq)和哌啶(36mg，0.42mmol，1.0eq)。将混合物加热回流并且搅拌1小时。反应完成后，将反应物冷却到室温，过滤。固体收集干燥后获得黄色粉末化合物AB24254((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)(95mg，产率：54.3％)。MS(ESI)m/z:382[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.48(s,1H),8.13(s,1H),6.95(s,1H),6.79(s,1H),3.85(s,3H),2.31(d,J＝15.1Hz,6H),2.10(d,J＝20.0Hz,6H).
实施例3：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈(AB24288)的合成
以与实施例2相同的方式合成AB24288(产率：13.6％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.53(s,1H),8.16(s,1H),7.31(s,1H),6.96(s,1H),6.89(s,1H),3.89(s,3H),2.51(s,3H),2.30(s,3H),2.08(s,3H)。
实施例4：化合物(E)-3-(1-(3-氯吡啶-4-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-基)-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)丙烯腈(AB24289)的合成
以与实施例2相同的方式合成AB24289(产率：40.3％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.96(s,1H),8.77(d,J＝4.2Hz,1H),8.45(s,1H),8.14(s,1H),7.71(d,J＝4.1Hz,1H),6.96(s,1H),6.77(s,1H),3.84(s,3H),2.16(s,3H),1.95(s,3H)。
实施例5：化合物(E)-3-(2,5-二甲基-1-(3-甲基吡啶-4-基)-1H-吡咯-3-基)-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)丙烯腈(AB24295)的合成
以与实施例2相同的方式合成AB24295(产率：52.3％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.72(s,1H),8.62(s,1H),8.45(s,1H),8.15(s,1H),7.39(s,1H),6.96(s,1H),6.78(s,1H),3.84(s,3H),2.12(s,3H),1.93(d,J＝19.2Hz,6H)。
实施例6：化合物(E)-3-(1-(3-氟吡啶-4-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-基)-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)丙烯腈(AB24300)的合成
以与实施例2相同的方式合成AB24300(产率：50％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.91(s,1H),8.91(s,1H),8.67(d,J＝4.5Hz,1H),8.47(s,1H),8.16(s,1H),7.72(s,1H),6.98(s,1H),6.79(s,1H),3.85(s,3H),2.24(s,3H),2.03(s,3H)。
实施例7：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈(AB24281)的合成
(1)化合物9(6-甲氧基-2,3-二氨基吡啶)的合成
将化合物8(2-氨基-3-硝基-6-甲氧基吡啶)(3.0g，17.76mmol，1.0eq)溶解于甲醇(30mL)中，加入碳负载钯催化剂(450mg，0.15wt％)。将混合物在氢气存在的条件下室温搅拌16小时。将固体过滤，并且将滤液浓缩得到棕色固体粉末化合物9(6-甲氧基-2,3-二氨基吡啶)(2.6g，产率：100％)。MS(ESI)m/z:140[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(10:1)；Rf(化合物8)＝0.7；Rf(化合物9)＝0.3。
(2)化合物10(2-(5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物9(6-甲氧基-2,3-二氨基吡啶)(300mg，2.16mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(732mg，6.47mmol，3.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(3mL)中，加热到180℃搅拌5小时。冷却后取出溶剂，残余物用快速柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝200:1至50:1)纯化以获得棕色固体粉末化合物10(2-(5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)(90mg，产率：22.2％)。MS(ESI)m/z:188[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(1:1)；Rf(化合物9)＝0.6；Rf(化合物10)＝0.5。
(3)化合物AB24281((E)-2-(3-(2-氰基-2-(5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)的合成
将化合物10(2-(5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)(90mg，0.48mmol，1.0eq)溶解于乙醇(1.5mL)中，加入化合物4(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-甲腈)(116mg，0.48mmol，1.0eq)和哌啶(40mg，0.48mmol，1.0eq)。将混合物加热回流一小时。反应完成后将混合物冷却到室温过滤。固体物收集干燥后获得黄色固体粉末化合物AB24281((E)-2-(3-(2-氰基-2-(5-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基呋喃-3-腈)(100mg，产率：54.3％)。MS(ESI)m/z:411.0[M-H]-。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.08(s,1H),7.90(d,J＝8.2Hz,1H),6.93(s,1H),6.66(d,J＝8.6Hz,1H),3.87(s,3H),2.31(d,J＝11.5Hz,6H),2.10(d,J＝18.4Hz,6H)。
实施例8：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶基-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈(AB24302)的合成
(1)化合物12(3-甲氧基-5-硝基吡啶-4-胺)的合成
将硫酸(15mL)和硝酸(1.1g，15.48mmol，1.2eq)冷却到0℃后，加入化合物11(4-氨基-3-甲氧基吡啶)(1.6g，12.90mmol，1.0eq)。将混合物于室温搅拌2小时。将反应混合物在0℃下用氢氧化钠水溶液淬灭。过滤物浓缩后得到棕色固体粉末化合物12(3-甲氧基-5-硝基吡啶-4-胺)(1.2g，产率：55％)。MS(ESI)m/z:170[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(50:1)；Rf(化合物11)＝0.2；Rf(化合物12)＝0.5。
(2)化合物13(5-甲氧基吡啶-3,4-二胺)的合成
将化合物12(3-甲氧基-5-硝基吡啶-4-胺)(700mg，4.14mmol，1.0eq)溶解于甲醇(10mL)中，加入碳负载钯催化剂(200mg，0.3wt％)。将混合物于室温在氢气条件下搅拌16小时。将固体物滤除，将滤液浓缩干燥得到棕色固体化合物13(5-甲氧基吡啶-3,4-二胺)(520mg，产率：90％)。MS(ESI)m/z:140[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(20:1)；Rf(化合物12)＝0.5；Rf(化合物13)＝0.1。
(3)化合物14(2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物13(5-甲氧基吡啶-3,4-二胺)(580mg，4.17mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(950mg，8.34mmol，2.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(6mL)中，加热到180℃搅拌5小时。冷却后去除溶剂。残余物通过快速柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝200:1至50:1)纯化后获得棕色固体粉末化合物14(2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(200mg，产率：26.0％)。MS(ESI)m/z:189[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(20:1)；Rf(化合物13)＝0.1；Rf(化合物14)＝0.3。
(4)化合物AB24302((E)-2-(3-(2-氰基-2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶基-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物14(2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(58mg，0.31mmol，1.0eq)溶解于乙醇(2.0mL)中，加入化合物15(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-甲腈)(79mg，0.31mmol，1.0eq)和哌啶(52mg，0.62mmol，2.0eq)。将混合物加热回流并且搅拌1小时。反应完成后冷却浓缩，固体物收集干燥获得黄色固体粉末化合物AB24302((E)-2-(3-(2-氰基-2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶基-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)(50mg，产率：37.8％)。MS(ESI)m/z:429[M+H]+。1H NMR(400MHz,dmso)δ8.55(s,1H),8.27(s,1H),8.02(s,1H),6.97(s,1H),4.03(s,3H),2.42(s,3H),2.31(s,3H),2.24(s,3H),2.09(s,3H)。
实施例9：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈(AB24301)的合成
(1)化合物17(5-甲氧基吡啶-2,3-二胺)的合成
将化合物16(5-甲氧基-2-硝基吡啶-3-胺)(1.0g，5.91mmol，1.0eq)溶解于甲醇(30mL)中，加入碳负载钯催化剂(300mg，0.3wt％)。将混合物在室温下在氢气存在的条件下搅拌16小时。将固体物过滤，将滤液浓缩得到棕色固体粉末化合物17(5-甲氧基吡啶-2,3-二胺)(700mg，产率：85％)。MS(ESI)m/z:140[M+H]+。TLC：EA；Rf(化合物16)＝0.4；Rf(化合物17)＝0.1。
(2)化合物18(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物17(5-甲氧基吡啶-2,3-二胺)(500mg，3.59mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(812mg，7.19mmol，2.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(2mL)中，于180℃搅拌5小时。冷却后除去溶剂。残余物通过快速柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝200:1至50:1)纯化以获得棕色固体粉末化合物18(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)(500mg，产率：73.9％)。MS(ESI)m/z:189[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(20:1)；Rf(化合物17)＝0.2；Rf(化合物18)＝0.5。
(3)化合物AB24301((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)的制备方法
将化合物18(50mg，0.265mmol，1.0eq)溶解于乙醇(1.0mL)中，加入化合物15(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-甲腈)(68.6mg，0.265mmol，1.0eq)和哌啶(45mg，0.530mmol，2.0eq)。将混合物加热回流并且搅拌1小时。反应完成后冷却到室温过滤。固体收集干燥后获得黄色固体粉末化合物AB24301((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)(10mg，产率：9.66％)。MS(ESI)m/z:429[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.16(s,1H),8.15(s,1H),8.06(s,1H),7.55(s,1H),6.97(s,1H),3.83(s,3H),2.42(s,3H),2.30(s,3H),2.24(s,3H),2.09(s,3H)。
实施例10：化合物(E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯(AB24314)的合成
(1)化合物21(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)的合成
将化合物19(5-氨基-2-甲基-1,3-噻唑-4-羧酸乙酯)(0.5g，2.7mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃(5mL)中，并加入2,5-己二酮(456mg，4mmol，1.5eq)、对甲苯磺酸一水合物(TsOH-H2O)(186mg，1.04mmol，0.4eq)以及3A分子筛(1g)。将混合物回流加热并搅拌过夜。将固体过滤出并将滤液浓缩。使用快速柱色谱(FCC)(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化残余物并得到黄色固体，即化合物21(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(462mg，产率：64.8％)。MS(ESI)m/z:265[M+H]+。TLC：PE/EA(5/1)；Rf(化合物19)＝0.2；Rf(化合物21)＝0.5。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.89(s,2H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),2.75(s,3H),2.01(s,6H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H)。
(2)化合物22(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)的合成
在0℃氮气条件下，将三氯氧磷(690mg，4.51mmol，1.0eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(5mL)中。将混合物在0℃搅拌30分钟后回温至室温，然后将溶解于二甲基甲酰胺(5mL)的化合物21(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(1.19g，4.51mmol，1.0eq)加入上述混合物中。将混合物加热至100℃并在氮气环境中搅拌5小时。待冷却后，将混合物倒入冰水中并使用Na2CO3溶液调节pH值为9。将混合物用乙酸乙酯萃取并且用盐水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥并且过滤和浓缩。使用快速柱色谱(FCC)(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)纯化残余物并得到黄色固体，即化合物22(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(285mg，产率78.5％)。MS(ESI)m/z:293[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(2/1)；Rf(化合物21)＝0.7；Rf(化合物22)＝0.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.87(s,1H),6.40(d,J＝0.9Hz,1H),4.23(q,J＝7.1Hz,2H),2.80(s,3H),2.32(s,3H),2.02(d,J＝0.5Hz,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,3H)。
(3)化合物AB24314((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)的合成
将化合物22(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(77.6mg，0.266mmol，1.0eq)溶于乙醇(1mL)中，并加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(50mg，0.266mmol，1.0eq)和2滴哌啶。将混合物回流加热并搅拌2小时。待混合物冷却至室温并过滤。使用制备型高效液相色谱仪纯化残余物并得到黄色固体，即AB24314(10mg，产率：8.15％)。MS(ESI)m/z:463.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.59(s,1H),8.21(s,1H),6.96(d,J＝7.0Hz,2H),4.11(q,J＝6.6Hz,2H),3.94(s,3H),2.75(s,3H),2.27(s,3H),2.03(s,3H),1.06(t,J＝6.8Hz,3H)。
实施例11：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈(AB24308)的合成
以与实施例10相同的方式合成AB24308(78mg，产率：69.2％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.99(s,1H),8.51(s,1H),8.17(s,1H),7.00(s,1H),6.83(s,1H),3.89(s,3H),2.45(s,3H),2.33(s,3H),2.27(s,3H),2.12(s,3H)。
实施例12：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-羧酸甲酯(AB24311)的合成
以与实施例10相同的方式合成AB24311(30mg，产率：37.2％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.57(s,1H),8.16(s,1H),7.24(s,1H),6.90(s,1H),6.86(s,1H),3.92(s,3H),3.66(s,3H),2.53(s,3H),2.25(s,3H),2.02(s,3H)。
实施例13：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-羧酸甲酯(AB24316)的合成
以与实施例10相同的方式合成AB24316(45mg，产率：40.3％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(s,1H),8.11(s,1H),6.88(s,1H),6.77(s,1H),3.85(s,3H),3.57(s,3H),2.38(s,3H),2.22(d,J＝12.1Hz,6H),1.98(s,3H)。
实施例14：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-乙基噻吩-3-腈(AB24317)的合成
以与实施例10相同的方式合成AB24317(40mg，产率：48.1％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.17(s,1H),7.41(s,1H),7.01(s,1H),6.83(s,1H),3.89(s,3H),2.51(s,3H),2.34(s,3H),2.13(s,3H)。
实施例15：化合物(E)-4-氰基-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-2-羧酸甲酯(AB24320)的合成
以与实施例10相同的方式合成AB24320(22mg，产率：18.0％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.53(s,1H),8.35(s,1H),8.17(s,1H),7.01(s,1H),6.85(s,1H),4.36(q,J＝6.6Hz,2H),3.88(s,3H),2.35(s,3H),2.14(s,3H),1.30(t,J＝6.2Hz,3H)。
实施例16：化合物(E)-5-氯-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯(AB24318)的合成
(1)化合物24(2-氨基-5-氯噻吩-3-羧酸甲酯)的合成
将化合物23(2-氨基噻吩-3-羧酸甲酯)(1g，6.369mmol，1.0eq)溶于四氢呋喃(10mL)中，并加入N-氯代丁二酰亚胺(0.847g，6.369mmol，1.0eq)，将混合物搅拌过夜。将固体过滤出并将滤液浓缩。使用快速柱色谱(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)纯化残余物并得到白色固体，即化合物24(2-氨基-5-氯噻吩-3-羧酸甲酯)(420mg，产率34.4％)。MS(ESI)m/z:192[M+H]+。TLC：PE/EA(5:1)；Rf(化合物23)＝0.5；Rf(化合物24)＝0.4；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.87-6.71(m,1H),5.83(s,2H),3.78(s,3H)。
(2)化合物25(5-氯-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)的合成
将化合物24(2-氨基-5-氯噻吩-3-羧酸甲酯)(420mg，2.356mmol，1.0eq)加入甲苯(10mL)中，并加入2,5-己二酮(403mg，3.534mmol，1.5eq)、对甲苯磺酸一水合物(81mg，0.2mmol，0.471eq)以及3A分子筛(500mg)。将混合物回流加热并搅拌过夜。将固体过滤出并将滤液浓缩。使用快速柱色谱(石油醚:乙酸乙酯＝50:1)纯化残余物并得到无色液体，即化合物25(5-氯-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)(480mg，产率81.2％)。MS(ESI)m/z:270[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(20:1)；Rf(化合物24)＝0.2；Rf(化合物25)＝0.7；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.29(s,1H),5.89(s,2H),3.69(s,3H),2.03(s,6H)。
(3)化合物26(5-氯-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)的合成
在0℃氮气条件下，将三氯氧磷(340mg，2.319mmol，1.2eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(30mL)中。将混合物在0℃搅拌30分钟后回温至室温。将化合物25(5-氯-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)(520mg，1.933mmol，1.0eq)加入二甲基甲酰胺(4mL)中，将混合物加热至100℃并在氮气环境中搅拌1小时。待冷却后，将混合物倒入冰水中并使用30％NaOH溶液调节PH值为10。将混合物用乙酸乙酯萃取并且用盐水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥并且过滤和浓缩。使用快速柱色谱(石油醚:乙酸乙酯＝100:1)纯化残余物并得到黄色固体，即化合物26(5-氯-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)(300mg，产率：52.8％)。MS(ESI)m/z:298[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(20:1)；Rf(化合物25)＝0.2；Rf(化合物26)＝0.7；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.85(s,1H),7.34(s,1H),6.37(s,1H),3.69(s,3H),2.02(d,J＝4.2Hz,6H)。
(4)化合物AB24318((E)-5-氯-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)的合成
将化合物26(5-氯-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)(84mg，0.38mmol，1.0eq)溶于乙醇(1mL)中，并加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(53mg，0.32mmol，1.0eq)和哌啶(47mg，0.32mmol，2.0eq)。将混合物回流加热并搅拌1小时。待混合物冷却至室温并过滤。收集固体并干燥得到黄色固体，即AB24318(E)-5-氯-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-羧酸甲酯)(40mg，产率：28.8％)。MS(ESI)m/z:468[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(s,1H),8.49(s,1H),8.12(s,1H),7.68–7.47(m,1H),6.92(s,1H),6.78(s,1H),3.86(s,3H),3.65(s,3H),2.27(s,3H),2.04(s,3H)。
实施例17：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(4-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈(AB24309)的合成
(1)化合物28(3,4-二氨基-2-甲氧基吡啶)的合成
将化合物27(2-甲氧基-3-硝基吡啶-4-胺)(1.0g，5.9mmol，1.0eq)溶解于甲醇(10mL)中，加入钯碳(200mg，0.2wt％)。将混合物在氮气条件下于室温搅拌16小时。将固体物过滤，将滤液浓缩获得棕色固体粉末化合物28(3,4-二氨基-2-甲氧基吡啶)(1.1g，产率：100％)。MS(ESI)m/z:140[M+H]+。TLC：PE/EA(1/1)；Rf(化合物27)＝0.4；Rf(化合物28)＝0.2。
(2)化合物29(2-(4-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物28(3,4-二氨基-2-甲氧基吡啶)(200mg，1.44mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(488mg，4.32mmol，3.0eq)溶解于乙酸乙酯(1mL)中，加热到180℃后搅拌8小时。冷却后，残余物用制备型高效液相纯化以获得棕色固体粉末化合物29(2-(4-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(130mg，产率：48.1％)。MS(ESI)m/z:189[M+H]+。
(3)化合物AB24309((E)-2-(3-(2-氰基-2-(4-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物29(2-(4-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(75mg，0.40mmol，1.0eq)溶解于乙醇(1.5mL)中，加入化合物15(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-甲腈)(104mg，0.40mmol，1.0eq)和哌啶(34mg，0.40mmol，1.0eq)。将混合物加热回流1小时。反应完成后冷却到室温，过滤。收集固体干燥后获得黄色固体粉末AB24309((E)-2-(3-(2-氰基-2-(4-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)(25mg，产率：14.6％)。MS(ESI)m/z:429[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.20(s,1H),7.88-7.82(m,2H),7.20(d,J＝5.2Hz,1H),7.00(s,1H),4.02(s,3H),2.45(s,3H),2.33(s,3H),2.27(s,3H),2.12(s,3H)。
实施例18：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈(AB24310)的合成
(1)化合物31(4-甲氧基-3-硝基吡啶-2-胺)的合成
将化合物30(2-氨基-3-硝基-4-氯吡啶)(1.5g，8.64mmol，1.0eq)溶解在甲醇中(30mL)，加入甲醇钠(933mg，17.3mmol，2.0eq)。将混合物在80℃氮气环境下搅拌16小时，冷却后真空浓缩。残余物通过乙酸乙酯和水萃取。将合并后的有机层通过饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩后得到粗产物，通过硅胶色谱纯化(二氯甲烷:甲醇＝100:1)得到黄色化合物31(4-甲氧基-3-硝基吡啶-2-胺)(1248mg，7.38mmol，85.4％)。MS(ESI)m/z:170[M+H]+。TLC：DCM:MeOH＝10:1。Rf(化合物30)＝0.7；Rf(化合物31)＝0.6。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(s,1H),6.84(s,2H),6.43(s,1H),3.80(s,3H)。
(2)化合物32(4-甲氧基吡啶-2,3-二胺)的合成
向化合物31(4-甲氧基-3-硝基吡啶-2-胺)(1.248g，7.38mmol，1.0eq)的甲醇溶液(20mL)加入钯碳(120mg，0.2wt％)。在氢气环境室温条件下搅拌16小时。将固体过滤。过滤后将滤液浓缩得到棕色固体化合物32(4-甲氧基吡啶-2,3-二胺)(940mg，产率：91.6％)。MS(ESI)m/z:140[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(10:1)；Rf(化合物31)＝0.7；Rf(化合物32)＝0.2。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.22(s,1H),6.24(s,1H),5.16(s,2H),3.99(s,2H),3.68(s,3H)。
(3)化合物33(2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物32(4-甲氧基吡啶-2,3-二胺)(300mg，2.16mmol，1.0eq)和化合物2(氰基乙酸乙酯)(488mg，4.32mmol，2.0eg)在二甲基甲酰胺(2mL)中于180℃条件下搅拌反应5小时。冷却后去除溶剂。残余物通过快速柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝100:1至30:1)纯化得到棕色固体化合物33(2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2基)乙腈)(193mg，产率：47.5％)。MS(ESI)m/z:189[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(10:1)；Rf(化合物32)＝0.2；Rf(化合物33)＝0.5。
(4)化合物AB24310((E)-2-(3-(2-氰基-2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)的合成
向化合物33(2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)(45mg，0.24mmol，1.0eg)的乙醇溶液(1.0mL)加入化合物15(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-甲腈)(62mg，0.24mmol，1.0eq)和两滴哌啶。将混合物回流加热并且搅拌2小时。结束后冷却过滤。收集得到黄色固体AB24310((E)-2-(3-(2-氰基-2-(7-甲氧基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4,5-二甲基噻吩-3-腈)(10mg，产率：8.8％)。MS(ESI)m/z:429.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.19(s,1H),8.17(s,2H),6.97(s,1H),6.83(s,1H),4.02(s,3H),2.42(s,3H),2.30(s,3H),2.24(s,3H),2.09(s,3H)。
实施例19：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-羧酰胺(AB24313)的合成
(1)化合物35(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲酰胺)的合成
向溶于4mL乙醇的化合物34(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(200mg，0.82mmol，1.0eq)的溶液中加入4M的氢氧化钠(2mL)。将混合物在100℃下搅拌0.5小时。之后进行收集浓缩，将残余物用水稀释，用乙酸乙酯洗涤。将水溶液层用6NHCl调节至PH＝6，并且用乙酸乙酯萃取。有机层进行干燥，过滤和浓缩得到黄色固体化合物35(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲酰胺)(200mg，产率：93％)。MS(ESI)m/z:263[M+H]+。TLC：DCM:MeOH(10:1)；Rf(化合物34)＝0.7；Rf(化合物35)＝0.1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),7.40(s,1H),7.28(s,1H),7.15(s,1H),6.19(s,1H),3.30(s,3H),2.22(s,3H),1.93(s,3H)。
(2)化合物AB24313((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-羧酰胺)的合成
向溶于1mL乙醇的化合物35(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(50mg，0.19mmol，1.0eq)中加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(36mg，0.19mmol，1.0eq)和哌啶(20mg，0.24mmol，1.0eq)。将混合物加热回流并搅拌1h，完成之后将混合物冷却至室温，过滤。收集固体并干燥获得黄色固体化合物AB24313(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-羧酰胺)(30mg，产率：36.5％)MS(ESI)m/z:433[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO)δ12.92(s,1H),8.48(s,1H),8.14(s,1H),7.52(s,1H),7.35(s,1H),7.21(s,1H),6.88(s,1H),6.81(s,1H)3.88(s,3H),2.51(s,3H),2.29(s,3H),2.04(s,3H)。
实施例20：化合物(E)-3-(1-(2,4-二甲基噻唑-5-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-基)-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)丙烯腈(AB24319)的合成
(1)化合物37((2,4-二甲基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯)的合成
向溶于80mL叔丁醇的化合物36(2,4-二甲基-1,3-噻唑-5-羧酸)(4g，25.33mmol，1.0eq)的溶液中加入二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA，8.8g，34.19mmol，1.35eq)和三乙醇胺(6.4g，63.32mmol，2.5eq)。在氮气存在的条件下于85℃搅拌3h，之后进行收集，将残余物溶解在水(80mL)中，并且用乙酸乙酯(80mL×3)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤和浓缩。残余物通过快速柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝200/1至150/1)纯化得到黄色固体化合物37((2,4-二甲基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯)(5.6g，产率：96.5％)。MS(ESI)m/z:229.0[M+H]+。TLC：DCM/MeOH(20:1)；Rf(化合物36)＝0.2；Rf(化合物37)＝0.7。1H NMR(CDCl3,400Hz):δ6.40(s,1H),2.57(s,3H),2.25(s,3H),1.49(s,9H)。
(2)化合物38(2,4-二甲基噻唑-5-胺盐酸盐)的合成
将化合物37(2,4-二甲基噻唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯)(2g，8.76mmol，1.0eq)加入到20mL的盐水/乙酸乙酯溶液中于室温搅拌3h，过滤固体物质，并且用乙醚(5mL×2)进行洗涤，浓缩收集得到黄色固体化合物38(2,4-二甲基噻唑-5-胺盐酸盐)(1.7g，产率：98.2％)。MS(ESI)m/z:129.0[M+H]+。TLC：PE/EA(1:1)；Rf(化合物37)＝0.5；Rf(化合物38)＝0.2。
(3)化合物39(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2,4-二甲基噻唑)的合成
向溶于THF(20mL)的化合物38(2,4-二甲基噻唑-5-胺盐酸盐)(1.2g，5.96mmol，1.0eq)的溶液中加入2,5-已二酮(1.02g，8.94mmol，1.5eq)、4g的3A分子筛和水合对甲基苯磺酸(453mg，2.38mmol，0.4eq)。将混合物在85℃下搅拌4h，过滤固体物质，将滤液进行浓缩，残余物通过快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝30/1)纯化得到黄色固体化合物39(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2,4-二甲基噻唑)(1.1g，产率：89.4％)。MS(ESI)m/z:207.0[M+H]+。TLC：PE/EA(5:1)；Rf(化合物38)＝0.2；Rf(化合物39)＝0.7。
(4)化合物40(1-(2,4-二甲基噻唑-5-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲醛)的合成
在0℃和N2条件下，将三氯氧磷(1.1g，7.26mmol，3.0eq)缓慢加入到5mL的二甲基甲酰胺中，将混合物在0℃下搅拌30min，然后温热至室温，再加入溶于2mL二甲基甲酰胺的化合物39(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2,4-二甲基噻唑)(500mg，2.42mmol，1.0eq)。将混合物加热至100℃，在N2存在的条件下搅拌1h，之后将混合物放入冰水混合物中冷却，并且用30％的NaOH溶液调节PH＝10。将混合物用乙酸乙酯(40mL×3)萃取。有机层通过盐水洗涤，Na2SO4干燥，过滤和浓缩。残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝50/1-20/1-10/1)纯化以获得黄色固体化合物40(1-(2,4-二甲基噻唑-5-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲醛)(312mg，产率：55％)。MS(ESI)m/z:235[M+H]+。TLC：PE/EA(5:1)；Rf(化合物39)＝0.7；Rf(化合物40)＝0.5。1H NMR(CDCl3,400Hz):δ9.87(s,1H),6.39(s,1H),2.72(s,3H),2.31(s,3H),2.13(s,3H),2.02(s,3H)。
(5)化合物AB24319((E)-3-(1-(2,4-二甲基噻唑-5-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-基)-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)丙烯腈)的合成
向溶于2mL乙醇的化合物40(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(50mg，0.26mmol，1.0eq)的溶液中加入化合物7(1-(2,4-二甲基噻唑-5-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲醛)(62mg，0.26mmol，1.0eq)和哌啶(22mg，0.26mmol，1.0eq)。将混合物加热回流并且搅拌1h，完成之后将混合物进行浓缩并通过制备型高效液相色谱进行纯化，获得黄色固体化合物AB24319((E)-3-(1-(2,4-二甲基噻唑-5-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-基)-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)丙烯腈)(24mg，产率：22.8％)。MS(ESI)m/z:405.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(s,1H),8.17(s,1H),6.91(d,J＝20Hz,2H),3.90(s,3H),2.65(s,3H),2.24(s,3H),2.04(s,3H),2.02(s,3H)。
实施例21：化合物AB24333((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物34(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(105mg，0.425mmol，1eq)溶解于2ml乙醇中，加入化合物18(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙腈)(80mg，0.425mmol，1eq)和两滴哌啶。将混合物加热回流搅拌1小时，待反应完成后，将混合物冷却到室温，并过滤，收集固体物，干燥后获得棕色固体化合物AB24333((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(150mg，产率：68.6％)。MS(ESI)m/z:415[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.15(s,1H),8.16(s,1H),8.06(s,1H),7.55(s,1H),7.33(s,1H),6.98(s,1H),3.84(s,3H),2.53(s,3H),2.31(s,3H),2.10(s,3H)。
实施例22：化合物AB24334((E)-2-(4-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物42(2-甲基-4-氰基噻吩)的合成
将化合物41(4-溴-2-甲基噻吩)(10g，56.497mmol，1eq)悬浮于N-甲基吡咯烷酮NMP(100mL)中，加入氰化亚铜(10g，112.994mmol，2eq)。将混合物加热到160℃，在有氮气保护的条件下搅拌6个小时。待反应完成后，将反应物用水合碳酸钠淬灭，用二氯甲烷萃取两次。然后将有机层干燥，过滤并浓缩得到无色液体的粗提物化合物42(2-甲基-4-氰基噻吩)(5.6g，产率：80％)。TLC：PE/EA(20/1)；Rf(化合物41)＝0.6；Rf(化合物42)＝0.3；1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.68(s,1H),6.93(s,1H),2.50(d,J＝5.0Hz,3H)。
(2)化合物43(2-碘-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
将粗提化合物42(2-甲基-4-氰基噻吩)(5g，40.650mml，1.0eq)溶解于四氢呋喃(50mL)中，在-78℃的条件下，加入二异丙基胺基锂(24.4ml，48.780mmol，1.2eq)，搅拌30分钟。然后加入碘，将混合物搅拌1个小时。用薄层色谱(PE/EA＝20/1)分析显示化合物3完全消耗。用饱和氯化铵水溶液淬灭反应混合物，将水层用二氯甲烷萃取，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝50/1)纯化后获得白色固体化合物43(2-碘-5-甲基噻吩-3-腈)(6.9g，产率：68.2％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(20/1)；Rf(化合物42)＝0.6；Rf(化合物43)＝0.7；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ6.76(d,J＝6.1Hz,1H),2.48(d,J＝6.0Hz,3H)。
(3)化合物45(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯)的合成
将氧化亚铜(0.18g，1.299mmol，0.2eq)、碳酸铯(4.2g，12.987mmol，2eq)、化合物43(2-碘-5-甲基噻吩-3-腈)(1.9g，7.792mmol，1.2eq)和化合物44(3-甲基吡唑-4-甲酸乙酯)(1g，6.493mmol，1.0eq)混合于20mL二甲基甲酰胺中。将混合物用氮气置换三次，并于110℃搅拌8个小时。用薄层色谱监测反应进行情况。待反应完成后，过滤，滤液用无水硫酸钠干燥，在减压的条件下浓缩获得粗提物，然后用柱色谱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1至10:1)，获得黄色油状化合物45(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯)(160mg，产率：7.4％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(10/1)；Rf(化合物45)＝0.4；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝7.0Hz,1H),6.76(s,1H),4.32(t,J＝7.1Hz,2H),2.53(d,J＝6.9Hz,3H),2.46(d,J＝6.9Hz,3H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H)。
(4)化合物46(2-(4-(羟甲基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)的合成
将化合物45(1-(3-氰基-5-甲基噻吩-2-基)-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯)(125mg，0.454mmol，1eq)溶解于四氢呋喃(10mL)中，在-5℃的条件下，加入二异丁基氢化铝(1.2ml，1.816mmol，4eq)。在有氮气保护的条件下，回温到室温进行反应3个小时。反应物用液质联机色谱监测。将反应物过滤浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化，获得化合物46(2-(4-(羟甲基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(80mg，产率：75.5％)。MS(ESI)m/z:234[M+H+]。Rf(化合物45)＝0.8；Rf(化合物46)＝0.4。
(5)化合物47(2-(4-甲酰基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物46(2-(4-(羟甲基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(120mg，0.515mmol，1eq)溶解于二氯甲烷(10mL)中，于0℃加入氯铬酸吡啶(332mg，1.545mmol，3eq)。将混合物回温到室温反应2个小时，用液质联机色谱监测反应进行情况。将混合物过滤浓缩，经快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化获得黄色固体化合物47(2-(4-甲酰基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(60mg，产率＝50％)。MS(ESI)m/z:232[M+H+]。Rf(化合物46)＝0.6；Rf(化合物47)＝0.4；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.99(s,1H),8.72(s,1H),6.78(s,1H),2.55(d,J＝6.4Hz,3H),2.47(d,J＝6.9Hz,3H)。
(6)化合物AB24334((E)-2-(4-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物47(2-(4-甲酰基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(55mg，0.238mmol，1eq)溶解于2mL乙醇中，加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(45mg，0.238mmol，1eq)和两滴哌啶。混合物加热回流搅拌1个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温过滤。收集固体物干燥后获得黄色固体化合物AB24334((E)-2-(4-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(65mg，产率：68％)。MS(ESI)m/z:402[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.09(s,1H),9.14(s,1H),8.55(s,1H),8.10(s,1H),7.14(s,1H),6.83(s,1H),3.86(s,3H),2.44(s,6H)。
实施例23：化合物AB24335((E)-甲基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸酯)的合成
(1)化合物50(4-甲基-5-硝基噻吩-2-羧酸)的合成
将硝酸(12mL)和化合物49(乙酸酐)(28mL)于0℃混合，加入化合物48(4-甲基-2-噻吩甲酸)(3g，21.1mmol，1eq)。反应于0℃条件下进行半个小时。待反应完成后，将混合物倒入冰水(200mL)，然后用乙醚萃取两次(每次100mL)。将有机层干燥过滤浓缩获得黄色固体化合物50(4-甲基-5-硝基噻吩-2-羧酸)(2.9g，产率：74.3％)。MS(ESI)m/z:186[M-H+]。TLC：二氯甲烷/甲醇(10/1)；Rf(化合物48)＝0.4；Rf(化合物50)＝0.2；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.68(s,1H),2.53(s,3H)。
(2)化合物51(4-甲基-5-硝基噻吩-2-甲酸甲酯)的合成
将化合物50(4-甲基-5-硝基噻吩-2-羧酸)(2.7g，14.4mmol，1.0eq)溶解于甲醇(30mL)中，于0℃条件下缓慢加入浓硫酸(2.8g，28.8mmol，2.0eq)。将混合物于80℃条件下搅拌16个小时。浓缩后，残余物用二氯甲烷(100mL)稀释，用水(50mL)洗后，将有机层干燥过滤浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/二氯甲烷＝200/1至100/1)纯化以获得黄色油状化合物51(4-甲基-5-硝基噻吩-2-甲酸甲酯)(2.3g，产率：79.6％)。MS(ESI)m/z:202[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5/1)；Rf(化合物50)＝0.1；Rf(化合物51)＝0.7。
(3)化合物52(5-氨基-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)的合成
将化合物51(4-甲基-5-硝基噻吩-2-甲酸甲酯)(1.7g，8.59mmol，1.0eq)溶解于甲醇/水(3/1，48mL)，加入金属锌(2.8g，42.93mmol，5.0eq)和氯化铵(910mg，17.18mmol，2.0eq)。将反应物加热到95℃，在氮气保护的条件下搅拌4个小时。待反应冷却后，将固体物过滤，用乙酸乙酯萃取三次(每次50mL)。浓缩后，将残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝100/1至50/1至30/1)纯化以获得黄色固体化合物52(5-氨基-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)(500mg，产率：34.7％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(3/1)；Rf(化合物51)＝0.7；Rf(化合物52)＝0.5。
(4)化合物53(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)的合成
将化合物52(5-氨基-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)(500mg，2.92mmol，1.0eq)溶解于四氢呋喃(10mL)中，加入化合物20(2,5-己二酮)(500mg，4.39mmol，1.5eq)、3A分子筛(500mg)和对甲苯磺酸(100mg，0.58mmol，0.2eq)。将反应在85℃下搅拌16个小时。过滤固体物并浓缩，残余物经快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝100/1)纯化后获得黄色固体化合物53(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)(570mg，产率：78.3％)。MS(ESI)m/z:250[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(10/1)；Rf(化合物52)＝0.3；Rf(化合物53)＝0.7。
(5)化合物54(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)的合成
在有氮气保护的条件下，于0℃将三氯氧磷(212mg，1.38mmol，1.5eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(5mL)，然后回温到室温，然后将溶解于二甲基甲酰胺(3mL)中的化合物53((5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯))(230mg，0.92mmol，1.0eq)加入其中。在有氮气保护的条件下，将混合物加热到100℃，搅拌3个小时。待反应冷却后，将混合物倒入冰水中，用30％的氢氧化钠调节pH＝10。混合物用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤后，将有机层收集，用无水硫酸钠干燥，然后过滤浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)纯化，获得黄色固体化合物54(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)(170mg，产率：66.6％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(10/1)；Rf(化合物53)＝0.7；Rf(化合物54)＝0.3。
(6)化合物AB24335((E)-甲基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸酯)的合成
将化合物54(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯)(70mg，0.25mmol，1eq)溶解于2mL乙醇中，加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(47mg，0.25mmol，1eq)和两滴哌啶。将混合物加热回流2个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温，过滤收集固体物，干燥后获得黄色固体化合物AB24335((E)-甲基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-4-甲基噻吩-2-羧酸酯)(31mg，产率：27.7％)。MS(ESI)m/z:448[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(s,1H),8.14(s,1H),7.81(s,1H),6.95(s,1H),6.77(s,1H),3.84(d,J＝4Hz,6H),2.23(s,3H),2.02(s,3H),1.94(s,3H)。
实施例24：化合物AB24341((E)-2-(3-(2-(6-氯-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-2-氰基乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物56(3,4-二氨基-6-氯吡啶)的合成
将化合物55(2-氯-4-氨基-5-硝基吡啶)(2g，11.52mmol，1eq)溶解于30mL甲醇中，加入钯碳Pd/C(400mg，0.2wt％)。将混合物在有氢气保护的条件下，于室温搅拌反应16个小时。过滤浓缩后得到棕色固体的粗提化合物56(3,4-二氨基-6-氯吡啶)(1.8g，产率：100％)，无需进一步纯化。MS(ESI)m/z:144[M+H+]。TLC：二氯甲烷/甲醇(10/1)；Rf(化合物55)＝0.5；Rf(化合物56)＝0.8。
(2)化合物58(N-(4-氨基-6-氯吡啶-3-基)-2-氰基乙酰胺)的合成
将化合物56(3,4-二氨基-6-氯吡啶)(1.3g，9.09mmol，1.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(20mL)中，加入化合物57(氰乙酸)(1.16g，13.64mmol，1.5eq)和二环己基碳二亚胺(2.1g，10.0mmol，1.1eq)。将混合物于室温搅拌16个小时。待浓缩后，将残余物经快速柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝100/1至50/1至30/1)纯化，获得黄色油状化合物58(N-(4-氨基-6-氯吡啶-3-基)-2-氰基乙酰胺)(1.1g，产率：21.1％)。MS(ESI)m/z:211[M+H+]。TLC：二氯甲烷/甲醇(10/1)；Rf(化合物56)＝0.6；Rf(化合物58)＝0.2。
(3)化合物59(2-(6-氯-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物58(N-(4-氨基-6-氯吡啶-3-基)-2-氰基乙酰胺)(1.1g，5.22mmol，1.0eq)溶解于乙酸(20mL)中，在100℃搅拌3个小时。浓缩后，残余物用快速柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝100/1至50/1至20/1至10/1)纯化，获得棕色固体化合物59(2-(6-氯-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(730mg，产率：72.6％)。MS(ESI)m/z:193[M+H+]。TLC：二氯甲烷/甲醇(10/1)；Rf(化合物58)＝0.5；Rf(化合物59)＝0.45。
(4)化合物AB24341((E)-2-(3-(2-(6-氯-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-2-氰基乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物59(2-(6-氯-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(60mg，0.314mmol，1eq)溶解于乙醇(1.5mL)中，加入化合物34(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(74mg，0.314mmol，1eq)和哌啶(27mg，0.314mmol，1eq)。将混合物加热回流搅拌2个小时。待反应完成后，将混合物浓缩，用制备型高压液相色谱纯化获得黄色固体化合物AB24341((E)-2-(3-(2-(6-氯-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-2-氰基乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(55mg，产率：41.8％)。MS(ESI)m/z:419[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.68(s,1H),8.25(s,1H),7.63(s,1H),7.34(s,1H),6.99(s,1H),2.53(s,3H),2.32(s,3H),2.10(s,3H)。
实施例25：化合物AB24336((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-2-基)噻吩-3-甲腈)的合成
(1)化合物62(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-2-基)噻吩-3-甲腈)的合成
将化合物60(5-溴-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(50mg，0.162mmol，1.0eq)溶解于1mL二甲基甲酰胺中，加入化合物61(2-吡啶硼酸频哪醇酯)(40mg，0.323mmol，2.0eq)、碳酸铯(105mg，0.323mmol，2.0eq)、氯化亚铜(16mg，0.162mmol，1.0eq)、乙酸钯(2mg，0.0081mmol，0.05eq)和1,1'-双(二苯基膦)二茂铁DPPF(9mg，0.0162mmol，0.1eq)。将混合物于100℃在封闭试管内反应16个小时。收集固体物，过滤浓缩，残余物用制备型薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化后，获得黄色油状化合物62(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-2-基)噻吩-3-甲腈)(23mg，产率：46％)。MS(ESI)m/z:308[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(3/1)；Rf(化合物60)＝0.6；Rf(化合物62)＝0.3。
(2)化合物AB24336((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-2-基)噻吩-3-甲腈)的合成
向溶解于1mL乙醇的化合物62(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-2-基)噻吩-3-甲腈)(21mg，0.068mmol，1.0eq)的溶液中，加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(13mg，0.068mmol，1.0eq)和哌啶(6mg，0.068mmol，1.0eq)。将混合物加热回流1个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温过滤，收集固体物干燥后获得黄色固体化合物AB24336((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-2-基)噻吩-3-甲腈)(19mg，产率：58％)。MS(ESI)m/z:478[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(s,1H),8.58(d,J＝4.8Hz,1H),8.49(s,1H),8.37(s,1H),8.17-8.09(m,2H),7.99-7.95(m,1H),7.45-7.42(m,1H),7.02(s,1H),6.80(s,1H),3.86(s,3H),2.38(s,3H),2.17(s,3H)。
实施例26：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-3-基)噻吩-3-甲腈(AB24337)的合成
以与实施例25相同的方式获得化合物AB24337(产率：70.2％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.58(s,1H),8.49(s,1H),8.21(s,1H),8.17(s,2H),7.54(s,1H),7.02(s,1H),6.80(s,1H),3.86(s,3H),2.38(s,3H),2.17(s,3H)。
实施例27：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-(吡啶-4-基)噻吩-3-腈(AB24338)的合成
以与实施例25相同的方式获得化合物AB24338(产率：72.8％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.68(s,2H),8.49(s,1H),8.39(s,1H),8.17(s,1H),7.75(s,2H),7.02(s,1H),6.80(s,1H),3.86(s,3H),2.38(s,3H),2.17(s,3H)。
实施例28：化合物AB24342((Z)-2-(3-(2-氰基-2-(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物64(2-甲氧基-4-甲基-5-硝基吡啶)的合成
将化合物63(2-氯-5-硝基-4-甲基吡啶)(7.8g，45.348mmol，1eq)溶解于甲醇(80mL)中，在0℃下加入甲醇钠(2.93g，54.418mmol，1.2eq)。将混合物于室温搅拌8个小时。待反应完成后，将混合物浓缩获得棕色固体的粗提化合物64(2-甲氧基-4-甲基-5-硝基吡啶)(7g，产率：92.1％)，无需进一步纯化。TLC：石油醚/乙酸乙酯(10/1)；MS(ESI)m/z:169[M+H+]。Rf(化合物63)＝0.3；Rf(化合物64)＝0.5；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.93(d,J＝3.3Hz,1H),6.63(d,J＝3.4Hz,1H),4.00(d,J＝3.1Hz,3H),2.61(d,J＝3.3Hz,3H)。
(2)化合物65(3-(2-甲氧基-5-硝基吡啶-4-基)-2-氧代丙酸乙酯)的合成
将叔丁醇钾(3.4g，29.761mmol，1.0eq)溶解于四氢呋喃(50mL)中，在有氮气保护的条件下加入草酸二乙酯(4.4g，29.761mmol，1.0eq)。将反应物于室温搅拌15分钟，然后将化合物64(2-甲氧基-4-甲基-5-硝基吡啶)(5g，29.761mmol，1.0eq)的溶液加入上述反应体系内，混合物加热回流4个小时。将反应物冷却到室温，用2N盐酸调节pH＝3-4。将水层用乙酸乙酯萃取三次，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化后获得化合物65(3-(2-甲氧基-5-硝基吡啶-4-基)-2-氧代丙酸乙酯)(2.8g，产率：25％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5/1)。MS(ESI)m/z:269[M+H+]。Rf(化合物64)＝0.8；Rf(化合物65)＝0.2；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.89(d,J＝4.0Hz,1H),7.54(d,J＝4.0Hz,1H),7.06(d,J＝12.7Hz,2H),4.61–4.34(m,2H),4.02(d,J＝4.1Hz,3H),1.39(t,J＝6.7Hz,3H)。
(3)化合物66(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-羧酸乙酯)的合成
将化合物65(3-(2-甲氧基-5-硝基吡啶-4-基)-2-氧代丙酸乙酯)(2.5g，8.741mmol，1eq)溶解于乙醇(30mL)中，加入钯碳Pd/C(0.5g，0.2wt％)。混合物在有氢气存在的条件下于室温搅拌8个小时。将固体物过滤浓缩，残余物经快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)纯化，获得化合物66(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-羧酸乙酯)(1g，产率：48.7％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(2:1)；MS(ESI)m/z:221[M+H+]。Rf(化合物65)＝0.4；Rf(化合物66)＝0.6；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.34(s,1H),8.53(s,1H),7.07(s,1H),6.94(s,1H),4.43(d,J＝7.3Hz,2H),3.96(d,J＝2.8Hz,3H),1.41(t,J＝7.1Hz,3H)。
(4)化合物67((5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)甲醇)的合成
将化合物66(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-羧酸乙酯)(935mg，3.488mmol，1eq)溶解于四氢呋喃(10mL)中，在-5℃的条件下，加入氢化铝锂(123mg，3.523mmol，1.1eq)。在有氮气保护的条件下，反应于室温进行1个小时。用液质联机色谱监测反应进行。反应完成后用碳酸氢钠淬灭，过滤收集固体物，用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化后获得化合物67((5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)甲醇)(700mg，产率：92.5％)。MS(ESI)m/z:179[M+H+]。Rf(化合物66)＝0.2；Rf(化合物67)＝0.6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.16(s,1H),8.22(s,1H),6.73(s,1H),6.17(s,1H),5.40(d,J＝5.8Hz,1H),4.59(d,J＝5.4Hz,2H),3.78(s,3H)。
(5)化合物68(2-(氯甲基)-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶)的合成
将化合物67((5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)甲醇)(300mg，1.685mmol，1eq)溶解于四氢呋喃(10mL)中，于0℃条件下，加入氯化亚砜(407mg，3.370mmol，2eq)和两滴二甲基甲酰胺。在有氮气保护的条件下，将反应回温到室温，反应8个小时。用液质联机色谱监测反应进行。待反应完成后，用碳酸氢钠溶液调节pH＝9-10，然后用二氯甲烷萃取三次。将有机层干燥过滤浓缩获得化合物68(2-(氯甲基)-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶)(300mg，产率：90.6％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(1:1)；MS(ESI)m/z:197[M+H+]。Rf(化合物67)＝0.2；Rf(化合物68)＝0.4。
(6)化合物69(2-(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)乙腈)的合成
将化合物68(2-(氯甲基)-5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶)(300mg，0.16mmol，1eq)溶解于乙腈/水混合液10:1(10mL)，加入氰化钾(132mg，2.215mmol，1.3eq)。反应于室温搅拌2个小时。用液质联机色谱监测反应进行。待反应完成后，用二氯甲烷萃取水相三次。将有机层干燥过滤浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化获得化合物69(2-(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)乙腈)(60mg，产率＝21％)。MS(ESI)m/z:188[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(1:1)；Rf(化合物68)＝0.4；Rf(化合物69)＝0.6。
(7)化合物AB24342((Z)-2-(3-(2-氰基-2-(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
将化合物69(2-(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)乙腈)(50mg，0.267mmol，1eq)溶解于乙醇(2mL)中，加入化合物34(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(65mg，0.267mmol，1eq)和两滴哌啶。混合物加热回流搅拌1个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温，过滤收集固体物，干燥后获得黄色固体化合物AB24342((Z)-2-(3-(2-氰基-2-(5-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(27mg，产率：22.2％)。MS(ESI)m/z:414[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.75(s,1H),8.32(d,J＝7.0Hz,1H),7.89(s,1H),7.32(s,1H),6.91(s,1H),6.82(s,1H),6.51(s,1H),3.81(d,J＝7.0Hz,3H),2.52(s,3H),2.29(s,3H),2.09(s,3H)。
实施例29：化合物AB24345((E)-甲基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)的合成
(1)化合物71(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)的合成
将化合物70(5-氨基-2-甲基-1,3-噻唑-4-羧酸乙酯)(4.5g，24.16mmol，1.0eq)溶解于四氢呋喃(100mL)中，加入化合物20(2,5-己二酮)(5.5g，48.32mmol，2eq)、3A分子筛(8g)和水合对甲苯磺酸(1.8g，9.66mmol，0.4eq)。混合物加热回流搅拌16个小时。固体物过滤浓缩，用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝100/1)纯化获得黄色固体化合物71(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(2.9g，产率：45.4％)。TLC：PE/EA(5/1)；Rf(化合物70)＝0.3；Rf(化合物71)＝0.5。
(2)化合物72(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸甲酯)的合成
将化合物71(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(1.2g，4.54mmol，1.0eq)溶解于甲醇(30mL)中，加入甲醇钠(368mg，6.81mmol，1.5eq)。混合物加热回流搅拌16个小时。浓缩后，用水(50mL)稀释固体物，用乙酸乙酯萃取三次(30mL*3)。将有机层干燥，过滤浓缩。残余物用快速柱色谱(PE/EA＝100/1)纯化，获得黄色油状化合物72(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸甲酯)(360mg，产率：31.7％)。TLC：PE/EA(5/1)；Rf(化合物71)＝0.5；Rf(化合物72)＝0.7。
(3)化合物73(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸甲酯)的合成
在有氮气保护的条件下，在0℃将三氯氧磷(221mg，1.44mmol，1.0eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(5mL)，然后回温到室温，然后将溶解于二甲基甲酰胺(2mL)中的化合物72(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸甲酯)(360mg，1,44mmol，1.0eq)加入上述反应体系中。将混合物加热到100℃，在有氮气保护的条件下搅拌3个小时。待反应冷却后，将混合物倒入冰水，用30％的NaOH调节pH＝10。混合物用乙酸乙酯萃取三次，用盐水洗涤后，将有机层收集，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)纯化，获得黄色固体化合物73(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸甲酯)(50mg，产率：12.5％)。TLC：PE/EA(5:1)；Rf(化合物72)＝0.7；Rf(化合物73)＝0.5。
(4)化合物AB24345((E)-甲基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)的合成
将化合物73(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸甲酯)(50mg，0.18mmol，1eq)溶解于甲醇(1mL)中，加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(34mg，0.18mmol，1eq)和哌啶(15mg，0.18mmol，1eq)。混合物加热回流2个小时，待反应完成后，将混合物冷却到室温并过滤，收集固体物，干燥后获得黄色固体化合物AB24345((E)-甲基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)(17mg，产率：21％)。MS(ESI)m/z:449[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.53(s,1H),8.15(s,1H),6.89(d,J＝12Hz,2H),3.89(s,3H),3.67(s,3H),2.73(s,3H),2.24(s,3H),2.01(s,3H)。
实施例30：化合物AB24324((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-环丙基噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物75(2-氨基-5-溴噻吩-3-腈)的合成
将化合物74(2-氨基噻吩-3-甲腈)(2g，16.1mmol，1eq)悬浮于二氯甲烷(40mL)中，再加入N-溴代丁二酰亚胺(2.87mg，16.1mmol，1eq)。将混合物在有氮气保护的条件下于室温搅拌两个小时。反应完成后，用碳酸钠淬灭，用二氯甲烷萃取2次，然后将有机层浓缩，获得棕色固体的粗提化合物75(2-氨基-5-溴噻吩-3-腈)(3.2g)，无需进行进一步纯化。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5/1)；Rf(化合物74)＝0.3；Rf(化合物75)＝0.32；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.93(s,1H),7.40(br s,2H)。
(2)化合物76(5-溴-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)的合成
将粗提化合物75(2-氨基-5-溴噻吩-3-腈)(3.2g，1.0eq)溶解于四氢呋喃(16mL)中，加入化合物20(2,5-己二酮)(3.63g，31.8mmol，2eq)、3A分子筛(3g)和水合对甲苯磺酸(1.2g，6.36mmol，0.4eq)。将混合物加热回流搅拌4个小时。将固体物过滤，将滤液浓缩。残余物经快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝100/1)纯化后获得黄色油状化合物76(5-溴-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)(945mg，二步反应总产率：21.1％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5/1)；Rf(化合物75)＝0.55；Rf(化合物76)＝0.7；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.22(s,1H),5.93(s,2H),2.12(s,6H)。
(3)化合物77(5-溴-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)的合成
在有氮气保护的条件下，于0℃将三氯氧磷(514mg，3.36mmol，1.0eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(5mL)中，然后回温到室温。将溶解于二甲基甲酰胺(3mL)的化合物76(5-溴-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)(944mg，3.36mmol，1.0eq)加入上述的混合物中。将反应物加热到100℃，然后在有氮气存在的条件下搅拌3个小时。等反应物冷却后，将混合物倒入冰水，用30％NaOH调节pH＝10。混合物用乙酸乙酯提取，用饱和氯化钠水溶液洗后，将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)纯化后获得黄色固体粉末化合物77(5-溴-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(667mg，产率：64.5％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5:1)；Rf(化合物76)＝0.8；Rf(化合物77)＝0.3；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.89(s,1H),7.30(s,1H),6.43(s,1H),2.41(s,3H),2.12(s,3H)。
(4)化合物79(5-环丙基-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)的合成
将化合物77(5-溴-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(50mg，0.16mmol，1eq)溶解于2mL甲苯中，加入环丙基硼酸(41mg，0.48mmol，3eq)、乙酸钯(16mg，0.012mmol，7.5％)、Sphos(10mg，0.024mmol，0.15eq)、磷酸钾(71mg，0.336mmol，2.1eq)。反应物在有氮气的条件下加热到100℃。混合物用液相质谱监测，过滤后浓缩。残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化以获得黄色固体化合物79(5-环丙基-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(35mg，产率：83％)。MS(ESI)m/z:271[M+H+]。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.86(s,1H),6.89(s,1H),6.39(s,1H),2.36(s,3H),2.07(s,4H),1.13(d,J＝7.3Hz,2H),0.81(d,J＝4.6Hz,2H)。
(5)化合物AB24324((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-环丙基噻吩-3-腈)的合成
将化合物79(5-环丙基-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(35mg，0.133mmol，1eq)溶解于2mL乙醇中，加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(25mg，0.133mmol，1eq)和2滴哌啶。将混合物加热回流搅拌2个小时。反应完成后，混合物冷却到室温过滤，收集固体物干燥后获得黄色固体粉末化合物AB24324((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-环丙基噻吩-3-腈)(33mg，产率：57.7％)。MS(ESI)m/z:441[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(s,1H),8.09(s,1H),7.27(s,1H),6.92(s,1H),6.75(s,1H),3.81(s,3H),2.26(s,3H),2.24-2.15(m,1H),2.05(s,3H),1.04(d,J＝6.1Hz,2H),0.79(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例31：化合物(E)-5-溴-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈(AB24323)的合成
以与实施例30相同的方式获得化合物(产率：21.2％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.15(s,1H),7.93(s,1H),6.99(s,1H),6.81(s,1H),3.88(s,3H),2.35(s,3H),2.14(s,3H)。
实施例32：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-腈(AB24325)的合成
(1)化合物81(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-腈)的合成
将化合物80(2-氨基-5-异丙基噻吩-3-腈)(250mg，1.506mmol，1.0eq)溶解于四氢呋喃(10mL)中，加入化合物20(2,5-己二酮)(257mg，2.259mmol，1.5eq)、3A分子筛(500mg)和水合对甲苯磺酸(52mg，0.211mmol，0.2eq)。反应物加热回流4个小时。将固体物过滤，将滤液浓缩，然后用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝50/1)纯化，获得无色液体化合物81(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-腈)(270mg，产率：73.4％)。MS(ESI)m/z:245[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(50/1)；Rf(化合物80)＝0.2；Rf(化合物81)＝0.6。
(2)化合物82(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-甲腈)的合成
在有氮气保护的条件下，于0℃将三氯氧磷(242mg，1.598mmol，1.5eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(30mL)中。反应物于0℃搅拌30分钟，然后回温到室温，将溶解于4mL的二甲基甲酰胺的化合物81(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-腈)(260mg，1.065mmol，1.0eq)加入上述混合物中。反应物加热到100℃，在有氮气存在的条件下搅拌1个小时。待反应冷却后，倒入冰水，用30％NaOH溶液调节pH＝10。混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和氯化钠洗涤后，分离有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)纯化后获得化合物82(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-甲腈)(200mg，产率：69％)。MS(ESI)m/z:273[M+H]+。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5:1)；Rf(化合物81)＝0.8；Rf(化合物82)＝0.2；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.88(s,1H),6.96(s,1H),6.41(s,1H),3.18(s,1H),2.38(s,3H),2.09(s,3H),1.38(d,J＝4.3Hz,6H)。
(3)化合物AB24325((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-腈)的合成
将化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(54mg，0.287mmol，1.0eq)溶解于1.5mL乙醇中，加入化合物82(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-甲腈)(78mg，0.287mmol，1.0eq)和哌啶(48mg，0.574mmol，2.0eq)。混合物加热回流搅拌1个小时。反应完成后，混合物冷却到到室温过滤。收集固体物，干燥后获得黄色固体化合物AB24325((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基噻吩-3-腈)(80mg，产率：63％)。MS(ESI)m/z:443[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.95(s,1H),8.48(s,1H),8.13(s,1H),7.41(s,1H),6.97(s,1H),6.79(s,1H),3.85(s,3H),3.22(m,1H),2.30(s,3H),2.09(s,3H),1.31(d,J＝6.8Hz,6H)。
实施例33：化合物(E)-5-(叔丁基)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈(AB24326)的合成
以与实施例32相同的方式获得化合物AB24326(产率：86.2％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.46(s,1H),8.17(s,1H),7.45(s,1H),6.97(s,1H),6.79(s,1H),3.85(s,3H),2.30(s,3H),2.09(s,3H),1.31(s,9H)。
实施例34：化合物(E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-苯基噻吩-3-腈(AB24327)的合成
以与实施例32相同的方式获得化合物AB24327(产率：64.3％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.49(s,1H),8.13(s,1H),8.01(s,1H),7.75(s,2H),7.50-7.44(m,3H),7.01(s,1H),6.80(s,1H),3.86(s,3H),2.37(s,3H),2.16(s,3H)。
实施例35：化合物(E)-5-苄基-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈(AB24328)的合成
以与实施例32相同的方式获得化合物AB24328(产率：53.8％)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.95(s,1H),8.48(s,1H),8.12(s,1H),7.41(s,1H),7.34(d,J＝7.2Hz,4H),7.28-7.24(m,1H),6.96(s,1H),6.78(s,1H),4.24(s,2H),3.85(s,3H),2.28(s,3H),2.07(s,3H)。
实施例36：化合物AB24349((E)-5-氯-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物84(2-氨基-5-氯噻吩-3-腈)的合成
在60℃条件下，将化合物83(2-氨基噻吩-3-甲腈)(2.00g，16.1mmol，1eq)悬浮于哌啶(100mL)中，加入N-氯代丁二酰亚胺(2.57mg，19.3mmol，1.2eq)。将混合物于60℃在有氮气保护的条件下搅拌4个小时。待反应完成后，将混合物浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化，获得白色固体化合物84(2-氨基-5-氯噻吩-3-腈)(1.2g，产率：47.0％)。MS(ESI)m/z:159[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5:1)；Rf(化合物83)＝0.4；Rf(化合物84)＝0.42。
(2)化合物85(5-氯-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)的合成
将粗提化合物84(2-氨基-5-氯噻吩-3-腈)(200mg，1.26mmol，1.0eq)溶解于四氢呋喃(10mL)中，加入化合物20(2,5-己二酮)(217g，1.90mmol，1.5eq)、3A分子筛(500mg)和水合对甲苯磺酸(48mg，0.26mmol，0.2eq)。将混合物加热回流搅拌24小时。过滤固体物并浓缩。残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化后获得白色固体化合物85(5-氯-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)(90mg，产率：30.2％)。MS(ESI)m/z:237[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(5:1)；Rf(化合物84)＝0.55；Rf(化合物85)＝0.7。
(3)化合物86(5-氯-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)的合成
在有氮气保护的条件下，于0℃将三氯氧磷(58mg，0.38mmol，1.0eq)逐滴加入二甲基甲酰胺(3mL)，然后回温到室温。将溶解于2mL二甲基甲酰胺中的化合物85(5-氯-2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)(90mg，0.38mmol，1.0eq)加入上述体系中。将混合物加热到100℃，在有氮气存在的条件下搅拌3个小时。待反应冷却后，将混合物倒入冰水，用30％的氢氧化钠溶液调节pH＝9。将混合物用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，过滤浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)纯化后，获得白色固体化合物86(5-氯-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(60mg，产率：59.7％)。MS(ESI)m/z:265[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(3:1)；Rf(化合物85)＝0.8；Rf(化合物86)＝0.3。
(4)化合物AB24349((E)-5-氯-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)的合成
在溶解于4mL乙醇的化合物86(5-氯-2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-甲腈)(40mg，0.15mmol，1eq)中加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(28mg，0.15mmol，1eq)的两滴哌啶。将混合物加热回流搅拌2个小时，待反应完成后，将混合物冷却到室温并过滤。收集固体物干燥后获得黄色固体化合物AB24349((E)-5-氯-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)噻吩-3-腈)(30mg，产率：45.5％)。MS(ESI)m/z:435[M+H+].1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.98(s,1H),8.49(s,1H),8.14(s,1H),7.83(s,1H),6.98(s,1H),6.80(s,1H),3.86(s,3H),2.34(s,3H),2.13(s,3H)。
实施例37：化合物AB24351((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酰胺)的合成
(1)化合物88((E)乙基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)的合成方法
向溶解于2mL乙醇的化合物87(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(160mg，0.548mmol，1eq)中加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(103mg，0.548mmol，1eq)和哌啶(46mg，0.548mmol，1eq)。将混合物加热回流搅拌2个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温并过滤。收集固体物，然后干燥获得黄色固体化合物88((E)乙基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)(130mg，产率：51.3％)。MS(ESI)m/z:463[M+H+]。
(2)化合物AB24351((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酰胺)的制备方法
将化合物88((E)乙基5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸酯)(50mg，0.108mmol，1.0eq)溶解于NH3-MeOH(2mL)中，在80℃搅拌16小时。将反应物冷却到室温并浓缩，残余物用制备型高压液相纯化以获得黄色固体化合物AB24351((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酰胺)(61mg，产率：85.9％)。MS(ESI)m/z:434[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.46(s,1H),8.12(s,1H),7.82(s,1H),7.64(s,1H),6.88(s,1H),6.78(s,1H),3.85(s,3H),2.72(s,3H),2.23(s,3H),2.01(s,3H)。
实施例38：化合物AB24347((E)-2-(3-(1-氰基-1-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物90(2-(3-乙酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成方法
在0℃条件下，将乙酰氯(412mg，5.278mmol，1.2eq)溶解于无水二氯乙烯DCE(20mL)中，小心加入四氯化锡(1.14g，4.398mmol，1eq)，将混合物在0℃条件下搅拌10分钟。然后将溶解于20mL二氯乙烯的化合物89(2-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(950mg，4.398mmol，1eq)加入上述混合物中。将混合物于0℃搅拌30分钟，然后升到室温3个小时。将反应用50mL水冷却后，用二氯甲烷萃取三次(每次50mL，然后将有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5:1至2:1)纯化后获得黄色固体化合物90(2-(3-乙酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(888mg，产率：78.3％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(1/1)；Rf(化合物89)＝0.6；Rf(化合物90)＝0.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.93(s,1H),6.33(s,1H),2.53(s,3H),2.40(s,3H),2.39(s,3H),2.08(s,3H)。
(2)化合物AB24347((E)-2-(3-(1-氰基-1-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的制备方法
将化合物90(2-(3-乙酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(50mg，0.265mmol，1eq)溶解于四氢呋喃(1mL)中，加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(68mg，0.265mmol，1eq)、钛酸四异丙酯(225mg，0.795mmol，3eq)和两滴哌啶。将混合物于室温搅拌12个小时，将固体物过滤，用乙酸乙酯洗后，将滤出物浓缩，用制备型高压液相纯化后获得黄色固体化合物AB24347((E)-2-(3-(1-氰基-1-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)丙-1-烯-2-基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(30mg，产率：36.1％)。MS(ESI)m/z:429.14[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(s,1H),7.19(s,1H),6.66(s,1H),6.27(s,1H),3.81(s,3H),3.14(s,3H),2.44(s,3H),2.04(s,3H),1.33(s,3H)。
实施例39：化合物AB24348((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)的合成
(1)化合物92(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-甲酰胺)的制备方法
将化合物91(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-羧酸乙酯)(1.5g，5.68mmol，1.0eq)溶解于氨水NH3-H2O(100mL)中，将反应物加热到70℃，搅拌3个小时。待反应完成后，将反应物冷却到室温并过滤。收集固体物并干燥后获得白色固体化合物92(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-甲酰胺)(1.0g，产率：74.9％)。MS(ESI)m/z:236[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(3/1)；Rf(化合物91)＝0.6；Rf(化合物92)＝0.3。
(2)化合物93(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)的制备方法
将化合物92(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-甲酰胺)(500mg，2.10mmol，1.0eq)和哌啶(198mg，2.50mmol，1.2eq)溶解于乙腈(40mL)中，于0℃条件下，逐滴加入草酰氯(406mg，3.20mmol，1.5eq)。将混合物在0℃条件下反应半个小时。待反应完成后，将残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化后，获得无色的油状化合物93(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)(180mg，产率：38.9％)。MS(ESI)m/z:218[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(2/1)；Rf(化合物92)＝0.5；Rf(化合物93)＝0.6。
(3)化合物94(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)的制备方法
在有氮气保护的0℃条件下，在三氯氧磷(105mg，0.69mmol，1.0eq)中逐滴加入二甲基甲酰胺(10mL)，然后升到室温。将溶解于5mL二甲基甲酰胺中的化合物93(5-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)(150mg，0.69mmol，1.0eq)加入上述体系中。在有氮气保护的条件下，将混合物加热到100℃搅拌3个小时。待反应冷却后，将混合物倒入冰水，用30％的氢氧化钠溶液调节pH＝9。用乙酸乙酯萃取后，用盐水洗涤，将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。残余物用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化以获得白色固体化合物94(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)(60mg，产率：35.6％)。MS(ESI)m/z:246[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(3:1)；Rf(化合物93)＝0.4；Rf(化合物94)＝0.2。
(4)化合物AB24348((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)的合成
向溶解于4mL乙醇的化合物94(5-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)(20mg，0.08mmol，1eq)的体系中加入化合物7(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(15mg，0.08mmol，1eq)和哌啶(3mg，0.08mmol，1eq)。将混合物加热回流搅拌2个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温，并过滤。收集固体物干燥过滤获得黄色固体化合物AB24348((E)-5-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-2-甲基噻唑-4-碳腈)(13mg，产率：38.4％)。MS(ESI)m/z:416.3[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.99(s,1H),8.49(s,1H),8.15(s,1H),7.00(s,1H),6.80(s,1H),3.86(s,3H),2.77(s,3H),2.33(s,3H),2.13(s,3H)。
实施例40：化合物AB24355((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-(二甲基氨基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的的合成
(1)化合物97(N,N-二甲基-5-硝基吡啶-2,4-二胺)的合成方法
将化合物95(2-氯-4-氨基-5-硝基吡啶)(300mg，1.57mmol，1eq)溶解于异丙醇(5mL)中，加入化合物96(636mg，7.85mmol，5.0eq)、三乙胺(1.1g，11.0mmol，7.0eq)。混合物于100℃搅拌12h。待反应完成后，浓缩，将残留物用快速柱色谱(先用石油醚/乙酸乙酯＝10:1体系，而后用二氯甲烷:乙酸乙酯＝10:1体系)纯化，获得棕色固体粗提化合物97(N,N-二甲基-5-硝基吡啶-2,4-二胺)(270mg，产率：94.5％)。MS(ESI)m/z:183.20[M+H+]。TLC：石油醚/乙酸乙酯(1/1)；Rf(化合物95)＝0.6；Rf(化合物97)＝0.5。
(2)化合物98(N,N-二甲基吡啶-2,4,5-三胺)的制备方法
将化合物97(N,N-二甲基-5-硝基吡啶-2,4-二胺)(270mg，1.48mmol，1eq)溶解于甲醇中(10mL)，加入钯碳(50mg，0.2wt％)。在有氮气的条件下，将混合物于室温搅拌16h。过滤固体物并浓缩获得粗提棕色固体化合物98(N,N-二甲基吡啶-2,4,5-三胺)(270mg，产率：100％)。MS(ESI)m/z:153.25[M+H+]。TLC：二氯甲烷/甲醇(10/1)；Rf(化合物97)＝0.6；Rf(化合物98)＝0.1。
(3)化合物99(2-(6-(二甲基氨基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的制备方法
将化合物98(N,N-二甲基吡啶-2,4,5-三胺)(130mg，0.855mmol，1.0eq)溶解于二甲基甲酰胺(2mL)中，加入化合物2(氰基乙酸乙酯)(290mg，2.56mmol，3.0eq)。将混合物于150℃下搅拌5h。待反应完成后，浓缩获得残留物，经制备型高压液相纯化获得棕色固体化合物99(2-(6-(二甲基氨基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(78mg，产率：45.4％)。MS(ESI)m/z:202.25[M+H+]。TLC：二氯甲烷/甲醇(10/1)；Rf(化合物98)＝0.1；Rf(化合物99)＝0.5。
(4)化合物AB24355((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-(二甲基氨基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的制备方法
将化合物99(2-(6-(二甲基氨基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(78mg，0.388mmol，1.0eq)溶解于乙醇(1.5mL)中，加入化合物34(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(94.7mg，0.388mmol，1eq)和哌啶(33mg，0.388mmol，1eq)。将混合物加热回流搅拌1h，待反应完成后，将反应物浓缩，用制备型高压液相纯化获得黄色固体化合物AB24355((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-(二甲基氨基)-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(60mg，产率：36.2％)。MS(ESI)m/z:428.35[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.51(s,1H),8.46(s,1H),8.04(s,1H),7.33(s,1H),6.96(s,1H),6.45(s,1H),3.02(s,6H),2.52(s,3H),2.30(s,3H),2.09(s,3H)。
实施例41：化合物AB24352((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的合成
(1)化合物101(2-(6-甲氧基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)的制备方法
将化合物100(2-(6-甲氧基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(100mg，0.532mmol，1eq)溶解于二甲基甲酰胺和乙腈(3:1)的混合溶液中(4mL)，加入三乙基苄基氯化铵TEBAC(9.7mg，0.04mmol，0.075eq)、碳酸钾(73mg，0.532mmol，1.0eq)、和硫酸二甲酯(74mg，0.585mmol，1.1eq)。反应物在室温搅拌16个小时。待反应完成后，将反应物用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，浓缩后获得残余物，用快速柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝5:1至1:2)纯化，获得黑色固体化合物101(2-(6-甲氧基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(80mg，产率：75％)。TLC：石油醚/乙酸乙酯(0/1)；Rf(化合物100)＝0.3；Rf(化合物101)＝0.5。MS(ESI)m/z:203[M+H+]。
(2)化合物AB24352((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)的制备方法
将化合物101(2-(6-甲氧基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙腈)(80mg，0.396mmol，1eq)溶解于乙醇中(1mL)，加入化合物34(2-(3-甲酰基-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-甲腈)(93mg，0.396mmol，1eq)和两滴哌啶。将混合物加热回流搅拌1个小时。待反应完成后，将混合物冷却到室温并过滤，收集固体物干燥后获得黄色固体化合物AB24352((E)-2-(3-(2-氰基-2-(6-甲氧基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)乙烯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-5-甲基噻吩-3-腈)(61mg，产率：35.9％)。MS(ESI)m/z:429.10[M+H+]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.53(s,1H),7.98(s,1H),7.34(s,1H),6.99(s,2H),3.87(s,6H),2.52(s,3H),2.25(s,3H),2.10(s,3H)。
药理活性测试
重组RNA解旋酶DHX33的制备
蛋白质的分离纯化参见Wang X,Ge W,and Zhang Y.Recombinant DHX33 ProteinPossesses Dual DNA/RNA Helicase Activity.Biochemistry.2019；58(4):250-8。将RNA解旋酶基因(小鼠DHX33基因)克隆到pET32M-3C载体的BamH I/Not I酶切位点之间。然后将质粒转化到大肠杆菌菌株BL-21pLysS(DE3)中，加入0.5mM异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，在16℃诱导重组蛋白表达16小时。将细胞沉淀并重悬于细胞裂解缓冲液[50mMTris-HCl(pH7.2)，150mM NaCl，1％Triton X-100和添加有蛋白酶抑制剂的50mM咪唑]中。然后将细胞超声处理并以13000rpm的转速离心25分钟。将上清液与Tris缓冲液平衡的镍-次氮基三乙酸珠温育，然后充分洗涤。然后用Tris缓冲液中的300mM咪唑洗脱提纯的蛋白质，然后在4℃下对不含咪唑的Tris缓冲液透析过夜。
DHX33解旋酶活力分析
将解旋酶活性反应成分添加到96孔不透明白色板中。方法概述如下：将中性抗生物素蛋白(neutravidin)以10μg/mL(100μL/孔)的终浓度在4℃下包被在96孔板上过夜。随后将中性抗生物素蛋白包被的板用100μL的0.1％(w/v)BSA(溶于常规PBS中)在22℃封闭2小时。洗涤后，加入由两条寡DNA单链(一条单链的序列为生物素标记的5'-GCTGACCCTGCTCCCAATCGTAATCTATAG-3'；另一条单链的序列为DIG标记的5'-CGATTGGGAGCAGGGTCAGC-3')所退火产生的DNA双链体[2.5ng，退火反应在含1M NaCl的浓度为1M的PBS(pH7.0)中进行]，并在22℃温育4小时。加入90μL反应混合物后开始解旋酶反应[纯化的全长DHX33蛋白0.25μg，溶解于25mM 4-MOPS(pH 7.0)，5mM ATP，2mM DTT，3mMMnCl2和100μg/mL BSA]。在37℃下反应60分钟。洗涤后，每个孔用封闭溶液[10％(w/v)BSA在0.1M马来酸和0.15M NaCl(pH7.5)中]培育30分钟，然后与20μL抗体溶液一起温育(抗-DIG-AP，Roche，在封闭缓冲液中)30分钟。用100μL检测缓冲液[0.1M Tris-HCl和0.1M NaCl(pH9.5)]洗涤后，然后将1μL化学发光底物(CSPD-0.25mM)加入各孔，并将板在17℃温育5分钟。然后将板拍干并在37℃下温育30分钟。通过发光多孔板读数器(Enspire，PerkinElmer)对每个孔中剩余的DIG-AP标记物对照计数10分钟。
细胞半抑制浓度(IC50)测定
将DHX33过表达的癌症细胞株U251-MG细胞以1×104/100ul/孔铺到96孔板上。等待细胞贴壁完全，将化合物以5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM、2000nM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。等待化合物和细胞温育时间达到48小时后，用CCK-8试剂(上海丽生生物公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，温育2个小时后，用酶标仪读板(OD＝450nm)，将实验重复三次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线，计算化合物的半抑制浓度(IC50)。
细胞培养及来源
U251-MG细胞购自中科院细胞库。用含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺以及链霉素和青霉素的MEM培养基培养，生长条件设定为37℃、5％CO2带有湿度的细胞培养箱中。细胞每隔3天传代一次，传代10次之后丢弃不用。
定量实时PCR
引物均由IDT(http://sg.idtdna.com/site)在线“Realtime PCR Tool”设计，购自BGI(深圳)公司。通过High Pure RNA分离试剂盒(Roche)提取总RNA，然后使用PrimeScript混合试剂盒(Takara)转录成cDNA。使用ABI One step plus cycler进行实时PCR，使用相应的软件进行管理。为了分析mRNA水平，使用SYBR green Supermix(Bio-Rad)，并且在归一化为GAPDH值之后通过△△CT值计算转录物定量。熔解曲线用于确认单一产物的扩增。引物序列参见Yuan B,Wang X,Fan C,You J,Liu Y,Weber JD,Zhong H,and ZhangY.DHX33Transcriptionally Controls Genes Involved in the Cell Cycle.Molecularand cellular biology.2016；36(23):2903-17。
化合物对已知DHX33下游基因的调控
U251细胞用AB24254(浓度分别是30nM、40nM和50nM)或者等体积的二甲亚砜处理16小时。提取总RNA后，反转录为cDNA。而后进行实时定量PCR分析各个样品中的目的基因(包括CCNE2、E2F1和MCM3)转录本水平，内参使用GAPDH。
试验结果及分析
图1示出用上述方法制备的重组DHX33蛋白经SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝染色后的结果分析。图中箭头指示的是目的重组DHX33蛋白(含有硫氧还原蛋白标签)，目的条带的分子量在90kDa。
图2示出本发明的化合物AB24254对已知DHX33下游基因的调控，其中所选择的CCNE2、MCM3、E2F1基因都是在已发表文章中被鉴定为受DHX33调控的下游基因(Yuan B,Wang X,Fan C,You J,Liu Y,Weber JD,Zhong H,and Zhang Y.DHX33 TranscriptionallyControls Genes Involved in the Cell Cycle.Molecular and cellularbiology.2016；36(23):2903-17)，在DHX33遗传敲除或者抑制的情况下，这些下游基因有显著下调。从图2可以看出，本发明的化合物对这些下游基因的转录有显著的抑制效果(*，P小于0.05，n＝3，数据取自三次独立实验)，具有剂量依赖效应。
使用一系列浓度的化合物(浓度范围设定为1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、250nM、500nM)进行体外的重组DHX33蛋白解旋酶活力测定。对照化合物的结构式如表2中所示。本发明的化合物对DHX33蛋白的解旋酶活力的半抑制浓度如表1所示。从表1可以看出，本发明的化合物对DHX33蛋白的解旋酶活力具有显著的抑制作用。
表1：化合物对DHX33蛋白的解旋酶活力抑制性分析
| 化合物 | IC50(nM) |
| 对照化合物 | 450 |
| AB24249 | 352 |
| AB24254 | 7.5 |
| AB24335 | 95 |
| AB24336 | 127 |
表2：化合物对U251-MG的半抑制浓度分析
由表2可以看出，本发明的化合物对DHX33过表达的癌症细胞株U251-MG细胞具有明显的抑制作用。
Claims (13)
1.一种具有式I结构的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
X1选自N或CR1，X2选自N或CR2，X3选自N或CR3，X4选自N或CR4，条件是X1、X2、X3和X4中有一个为N；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、卤素、氨基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-NH(C1-4烷基)或-N(C1-4烷基)2；
X5选自N或CR5，X6为NR6；
R5为氢；
R6选自氢或C1-4烷基；
R9为氰基；
R10选自氢或C1-4烷基；
环A选自吡咯环、吡唑环、咪唑环、噻唑环或噁唑环；
环A任选地被一个或多个R11取代；
每个R11各自独立地选自卤素、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；
环B选自吡咯环、咪唑环、呋喃环、噁唑环、噻吩环、噻唑环或吡啶环；
环B任选地被一个或多个R12取代；
每个R12各自独立地选自卤素、氰基、氨基、硝基、羟基、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、C3-6环烷基、-C(＝O)-O-(C1-4烷基)、苄基、吡啶基或-C(＝O)-NH2，所述苄基、吡啶基任选地被一个或多个选自氢、卤素或C1-4烷基的取代基取代。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、氯、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、-NH(CH3)或-N(CH3)2。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R6选自氢或甲基。
4.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R10选自氢、甲基、乙基或异丙基。
5.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
环A选自
m选自0、1或2，R11如权利要求1中所定义。
6.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
每个R11各自独立地选自氟、氯、溴、甲基、乙基、异丙基或三氟甲基。
7.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环B选自：
n选自0、1、2或3，R12如权利要求1中所定义。
8.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
每个R12各自独立地选自氟、氯、溴、氰基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、环丙基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、-C(＝O)-OCH3、-C(＝O)-OCH2CH3、苄基、吡啶基或-C(＝O)-NH2。
9.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其为具有如下结构的化合物或其药学上可接受的盐：
其中环A、环B、R1、R2、R3、R4、R6、R9和R10如权利要求1中所定义。
10.化合物或其药学上可接受的盐，其选自如下化合物或其药学上可接受的盐：
11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求11所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗至少部分由DHX33介导的疾病或病症的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，所述疾病为癌症。
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