CN112656819B

CN112656819B - 植物乳杆菌在促进肝脏再生方面的应用

Info

Publication number: CN112656819B
Application number: CN202011510371.6A
Authority: CN
Inventors: 谢纯良; 彭源德; 艾连中; 朱作华; 龚文兵; 周映君; 夏永军; 严理; 胡镇修
Original assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS; University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: Institute of Bast Fiber Crops of CAAS; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112656819A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了植物乳杆菌AR113在促进肝脏再生方面的应用。本发明提供了植物乳杆菌AR113促进肝脏部分切除术后肝脏再生以及肝功能恢复的新应用，通过对切除术后肝脏再生能力进行评价、病理切片观察对比、肝细胞再生标志物ki67检测以及肝脏再生的重要调控因子检测等手段，验证了所述乳杆菌相较于对照组有明显的促进肝脏再生的活性；同时，通过对肝功能的评价验证了所述植物乳杆菌还能够促进损伤肝脏的肝功能恢复，以上实验结论说明植物乳杆菌AR113可为肝脏切除患者围手术期采用特殊性的营养支持，促进肝脏再生能力以及肝功能恢复提供合适的益生菌。

Description

植物乳杆菌在促进肝脏再生方面的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌在促进肝脏再生方面的应用。

背景技术

肝癌是全球癌症死亡率排名第二的恶性肿瘤。肝切除手术是治疗巨大肝脏肿瘤的有效方法，术后保护残肝功能，促进肝再生至关重要。但是病化切除后，残余肝脏能否再生发挥功能将直接影响患者的恢复和生存。已有临床实验发现，在围手术期采用特殊性的营养支持治疗可使患者肝脏损伤明显减轻，并发症显著降低。

益生菌是一类对人体及哺乳动物基本无毒副作用的微生物，给予足够剂量后，它们能对机体产生有益的作用。益生菌对肠道菌群的调节作用、对肠道屏障的保护作用、及对肠道免疫功能的影响已经被广泛报道。在LPS诱导的肝损伤模型及疾病中，经消化道给予益生菌后能对疾病的发生发展产生有益的干预作用。但是，益生菌对肝脏部分切除术后肝再生能力的影响尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供植物乳杆菌AR113在促进肝脏再生方面的新活性用途，并可应用于相关促进肝脏再生药物中的制备中。同时，还提供植物乳杆菌AR113在制备促进肝功能恢复的药物中的应用。

植物乳杆菌AR113已经公开于专利CN202010135379.2和 CN202010223696.X中，分别应用于脑卒中和糖尿病的药物制备领域，但是相关肝脏再生用途并无任何记载说明。

在促进肝脏再生的试验中，本发明设立肝脏部分切除对照组、植物乳杆菌AR113保护组和治疗组，分别于3d和7d两个时间段进行肝脏再生率的统计，结果显示在7d时间点，植物乳杆菌AR113保护组和治疗组的肝脏再生率相比肝脏切除对照组有明显的提高，其中以保护组的肝脏再生率最为显著。

在肝功能恢复的试验中，肝脏部分切除手术组、AR113乳杆菌保护组和 AR113乳杆菌治疗组3天大鼠血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及球蛋白(GLo)浓度较正常组(CK3和CK7)及假手组(JSH)均有下降。与手术组7天(SH7)相比，保护组7天(BH7)和治疗组7天(ZL7)总蛋白(TP) 和球蛋白(GLo)浓度升高，具有统计学意义(P<0.05)。保护组7天(BH7)和治疗组7天(ZL7)中的谷草转氨酶(AST)浓度低于手术组7天(SH7)。与手术组(SH3和SH7)和治疗组(ZL3和ZL7)相比，保护组3天和7天 (BH3和BH7)总胆红素(T-Bil-V)下降。表明AR113乳杆菌能够促进肝脏部分切除手术后肝功能的恢复。

基于此技术效果，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.13909的植物乳杆菌在制备促进肝脏再生的药物中的应用，以及在制备促进肝功能恢复的药物中的应用。

根据上述应用，本发明还提供了一种促进肝脏再生或肝脏功能恢复的药物，包括保藏编号为CGMCC No.13909的植物乳杆菌和药学上可接受的载体。在本发明具体实施方式中，所述药学上可接受的载体为生理盐水，所述药物为灌胃的植物乳杆菌菌液。作为优选，所述植物乳杆菌的浓度至少为10⁹ CFU/mL；在具体实施方式中，所述植物乳杆菌的浓度为10¹⁰CFU/mL。

由以上技术方案可知，本发明提供了植物乳杆菌AR113促进肝脏再生以及促进肝功能恢复的新应用，通过对切除术后肝脏再生能力进行评价、病理切片观察对比、肝细胞再生标志物ki67检测以及肝脏再生的重要调控因子检测等手段，验证了所述乳杆菌相较于对照组有明显的促进肝脏再生的活性；同时，通过对肝功能的评价验证了所述植物乳杆菌还能够促进损伤肝脏的肝功能恢复，以上实验结论说明植物乳杆菌AR113可为肝脏切除患者围手术期采用特殊性的营养支持，促进肝脏再生能力以及肝功能恢复提供合适的益生菌。

生物材料保藏信息说明

AR113，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，已于2017 年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.13909；

附图说明

图1所示为肝叶切除顺序示意图；其中，切除肝叶顺序按照1-5的顺序进行；

图2-图3所示为不同处理组的肝脏部分切除术后3天和7天的病理切片结果；

图4所示为肝脏细胞因子检测结果；

图5所示为肝功能检测结果。

具体实施方式

本发明公开了植物乳杆菌在促进肝脏再生方面的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述植物乳杆菌的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的植物乳杆菌的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施例中，对比试验中除应有的技术区别外，其余所用原料、试剂、方法等试验条件保持一致；

以下就本发明所提供的植物乳杆菌在促进肝脏再生方面的应用做进一步说明。

实施例1：植物乳杆菌的培养

(1)MRS培养基：葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，无水乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.5g，吐温-80 1ML，(固体培养基加入琼脂20g)蒸馏水10 00mL，pH调整到6.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)乳酸菌的活化

挑取适量筛选的乳酸菌接种到10mL MRS进行一级培养，37℃恒温培养箱中静置培养20h，再将其加入到90mL MRS液体培养基进行二级培养，37℃ 恒温培养箱静置培养24h。离心后，去掉上清培养基，沉淀用1毫升生理盐水复溶，然后涂平板。结果显示菌种数量为10⁹-10¹⁰CFU/mL。

实施例2：肝脏再生实验

1、肝脏部分切除动物模型的构建及分组

参照Higgns-Anderson法进行70％肝脏切除，具体过程如下:4％水合氯醛腹腔内麻醉(0.6-0.8ml/100g)；将大鼠固定于手术台上，腹部碘伏消毒后，正中切口开腹，游离肝周韧带；将腹腔内脏器轻柔拨至左侧，湿纱布包裹(生理盐水浸湿)，充分暴露肝脏；用6.0丝线外科打结法结扎相应肝脏部分，确认无出血后，用微型手术剪切除肝脏各叶；最后3.0丝线连续缝合腹膜及皮肤切口, 予以保暖。按照上述方法可以进行70％或更小比例的肝脏部分切除。

具体分组如下:

(1)、正常对照组(CK组)；不作任何处理(n＝12)；

(2)、假手术对照组(JSH组)：开腹后仅切断肝周及肝叶间韧带，游离肝脏各叶。并根据处死采样时间设置以下2个亚组(各组n＝6):JSH-1组(3天)、JSH-2 组(7天)；

(3)、肝脏部分切除手术组(SH组):开腹后切断肝周及肝叶间韧带，游离肝脏各叶，6号线结扎并切除肝叶，详细切除肝叶的顺序按照图1内标序数字。在SH组相对应时间点设置相同2个亚组(各组n＝6)；

(4)、乳杆菌保护组(BH组)：手术之前一个星期通过灌胃饲喂益生菌制剂植物乳杆菌，剂量为10¹⁰CFU/mL(生理盐水配制)，一直饲喂到取样相应时间点，采样时间和其余同(3)；

(5)、乳杆菌治疗组(ZL组)：手术开始后饲喂益生菌制剂植物乳杆菌，剂量为10¹⁰CFU/mL(生理盐水配制)，一直饲喂到取样相应时间点，采样时间和其余同(3)；

2、标本采集

手术前测量并记录每只SD大鼠体重。术中记录切除的肝脏重量。在手术后不同时刻，用4％水合氯醛6-8ml/kg腹腔注射进行麻醉。在严格无菌操作下，取上腹正切口解剖，完整取下残余肝脏并称量记录重量，计算肝脏再生率。

肝脏再生率的计算:

采用如下公式计算:[C-(A-B)]/A/100。

A:肝脏切除术前大鼠肝脏总重量，总肝重量(A)是大鼠体重的3.4％；B：术中切除肝脏重量；C:处死大鼠时再生肝脏重量；

3、植物乳杆菌对肝脏再生能力影响分析

见表1；

表1植物乳杆菌对肝脏部分切除后肝脏再生率的影响

	术后3d肝脏再生率(平均)	术后7d肝脏再生率(平均)
			AR113乳杆菌保护组	46.49％±1.09<sup>a</sup>	67.72％±1.37<sup>a</sup>
AR113乳杆菌治疗组	40.32％±0.65<sup>a</sup>	62.51％±0.98<sup>a</sup>
			BNCC134417乳杆菌保护组	44.31％±1.59<sup>a</sup>	57.68％±1.06<sup>b</sup>
BNCC134417乳杆菌治疗组	38.42％±0.98<sup>b</sup>	55.32％±0.45<sup>b</sup>
			肝脏部分切除手术组	45.5％±0.57<sup>a</sup>	58.2％±0.83<sup>b</sup>

注：不同肩标表示具有显著性差异(P＜0.05)；BNCC134417乳杆菌(购自北纳生物http://www.bnbio.com/pro/p0/0/p_208174.html)

由表1可以看出，肝脏部分切除手术后第7天，保护组和治疗组的肝脏再生率均明显高于对照组，其中以保护组的效果最为明显；而同为乳杆菌的 BNCC134417乳杆菌却并未表现出此种活性。

4、肝脏病理学检测

取残端肝脏组织1x1x1(cm)固定于10％中性福尔马林，然后依次经石蜡包埋、Spm的切片、苏木素-伊红染色，最后光镜下观察组织结构并拍照用于组织学评价。采用Scheuer半定量积分系统对肝脏的损伤程度进行分级:0分(无炎症)、1分(汇管区炎症)、2分(鞋度碎屑样或灶性炎症)、3分(中度碎屑样坏死)、4分(重度碎屑样坏死戎桥接坏死)，在200倍光镜下计数20个视野。结果见图2-3。

图2所示，正常肝组织细胞，核圆、大且居中，少见核分裂，细胞体积正常，排列较整齐，未见炎性细胞；肝脏部分切除手术组，可见肝细胞水肿变性，胞质疏松，有点状坏死，细胞结构稍显紊乱，可见中性粒细胞等炎性细胞浸润；AR113乳杆菌治疗或保护组，炎性细胞浸润减少，细胞水肿较手术组略减轻，细胞体积较肝脏部分切除手术组有增大。

5、肝细胞增生免疫组化指标的检测

采用Ki67免疫组化染色来判定肝细胞增殖能为。将肝脏组织制成石蜡切片后即可进行免疫组化染色。细胞核呈边界清楚的棕黄色视为阳性细胞，在 400X的高倍视野下随机计数2000个肝细胞，记录阳性细胞数，最终以百分数表示增殖肝细胞比例。结果见表2。

表2术后3d和7d肝细胞增殖结果

	术后3d细胞增殖率(平均)	术后7d细胞增殖率(平均)
			正常对照组	0	0
假手术对照组	0	0
			肝脏部分切除手术组	0.18±0.06<sup>b</sup>	0.19±0.03<sup>a</sup>
AR113乳杆菌保护组	0.44±0.13<sup>a</sup>	0.21±0.06<sup>a</sup>
			AR113乳杆菌治疗组	0.21±0.07<sup>b</sup>	0.25±0.06<sup>a</sup>

注：不同肩标表示具有显著性差异(P＜0.05)；

ki67是一种与核糖体RNA转录相关的核蛋白，通常在细胞周期的活跃期可检测到，而在静止期检测不到。通过ki67染色，能迅速地反映细胞增殖的水平。表2结果显示，正常对照组和假手术组细胞增殖率为0，保护组3天细胞增殖率为0.44，显著高于肝脏部分切除手术组和治疗组。肝脏部分切除手术组，保护组和治疗组7天细胞增殖率之间没有明显差异。

6、细胞因子检测

为了评估肝脏总的TNF-α、IL-6、HGF和TGF-β的表达水平，取肝脏组织，置于1ml的PBS(含有蛋白酶抑制刻)，并捣成匀浆。匀浆液在3000g、4℃ 离心12分钟，上清液存于-20℃冰箱中。上清液中的总蛋白用BCA蛋白检测试剂盒检测得到。上清中各蛋白浓度表示为每毫克总蛋白中的各蛋白含量。采用ELISA检测试剂盒来测定肝脏组织TNF-α、IL-6、HGF和TGF-β的表达水平。结果见图4。

图4结果显示，肝脏再生的重要调控因子HGF在AR113乳杆菌保护组3 天(BH3)表达水平最高；TGF-beta在AR113乳杆菌保护组7天(BH7)和 AR113乳杆菌治疗组3天(ZL3)中表达上调；TNF-alpha在AR113乳杆菌保护组3天(BH3)和保护组7天(BH7)中上调；IL-6在肝脏部分切除手术组3天(SH3)和AR113乳杆菌治疗组3天(ZL3)中下调，与其他实验组相比，具有显著差异(P<0.05)。

实施例3：肝脏部分切除术后肝功能恢复实验

1、肝脏部分切除动物模型的构建及分组

同实施例2

2、方法

自下腔静脉取血5ml，室温3000rpm离记15分钟后，取血清，用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶(anine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶 (aspartateaminotransferase，AST)、总胆红素(totalbilirubin，TTB)等指标，反映肝功能的损伤情况。结果见图5。

图5显示，在蛋白合成方面，肝脏部分切除手术组、AR113乳杆菌保护组和AR113乳杆菌治疗组3天大鼠血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及球蛋白(GLo)浓度较正常组(CK3和CK7)及假手组(JSH)均有下降。与手术组7天(SH7)相比，保护组7天(BH7)和治疗组7天(ZL7)总蛋白 (TP)和球蛋白(GLo)浓度升高，具有统计学意义(P<0.05)。保护组7 天(BH7)和治疗组7天(ZL7)中的谷草转氨酶(AST)浓度低于手术组7 天(SH7)。与手术组(SH3和SH7)和治疗组(ZL3和ZL7)相比，保护组 3天和7天(BH3和BH7)总胆红素(T-Bil-V)下降。表明AR113乳杆菌能够促进肝脏部分切除手术后肝功能的恢复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.保藏编号为CGMCC No.13909的植物乳杆菌在制备促进肝脏再生的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述促进肝脏再生的药物包括保藏编号为CGMCC No.13909的植物乳杆菌和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体为生理盐水。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述植物乳杆菌的浓度至少为10⁹CFU/mL。