CN112656701A - 一种含pdrn的美白祛斑组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含PDRN的美白祛斑组合物，包括PDRN、九胜肽、五胜肽、透明质酸和烟酰胺。以重量份数计，包括PDRN 0.05～5份、九胜肽0.05～0.5份、五胜肽0.001～0.5份、烟酰胺0.1～7份。本发明还公开了上述美白祛斑组合物在化妆品中的应用。本发明的组合物及包含该组合物的化妆品协同作用，能从多角度抑制黑色素的形成，激活老化细胞活性，促进胶原、弹性蛋白合成，重建修复表皮防御功能，改善皮肤细胞微环境，增加皮肤的含水量，提高皮肤的弹性和光滑度，减少炎性因子生成，从而全角度解决皮肤的干燥、粗糙、松弛、细纹、暗沉等问题。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及一种含PDRN的美白祛斑组合物及其应用。
背景技术
衰老(Aging)又称老化，是生命的自然过程，皮肤位于体表，是最早显现机体衰老的组织。随着年龄的增加，在内源性、外部环境因素的影响下皮肤发生水分缺失、黑色素细胞反应增强、胶原及弹性蛋白合成减少，导致皮肤色素沉着、组织松弛、皱纹增加。现代社会竞争激烈、生活节奏快，给人们带来了更大的生理、心理压力，加上环境影响，导致皮肤出现各种问题，面部雀斑、黄褐斑、老年斑、皮肤松弛对女性容貌和自信造成严重影响，进而影响了她们的正常生活。
随着老龄化社会的日益发展，人们对皮肤的保养和护理越来越重视，美白祛斑养颜已经成为人们的一种时尚追求，特别是女性对白皙肤色的诉求日益加强。众所周知，黑色素细胞的主要生理功能是合成黑色素(Melanin)。大量研究发现，黑色素的含量及分布决定着皮肤的颜色，过量的黑色素沉着会导致雀斑、黄褐斑等皮肤疾病，严重的甚至会导致黑色素瘤。科学家对美白的原理进行了深入研究，美白机理即黑色素的抑制机理，主要包括抑制黑色素合成酶、抑制黑素细胞增殖、还原黑色素形成过程中各中间体或阻碍其结合、抑制黑色素转移和清除自由基来达到美白的效果。目前市场上的美白祛斑的主要成分分为三类：1、抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素产生的物质，主要包括维生素C及其衍生物、熊果苷及其衍生物、曲酸及其衍生物等；2、降低黑素小体向角质细胞的传递速度，减少各表皮细胞层的黑素含量的物质，主要有壬二酸，烟酰胺等；3、促进表皮新陈代谢，使黑素小体快速脱落的物质，主要有果酸、溶角蛋白酶等，以上物质在尽管安全，但透皮吸收效果差，导致美白祛斑效果不明显；间隔停用后其美白祛斑效果易反复；加大剂量尽管能在一定程度上提高美白祛斑效果，但剂量过高易引起肌肤不耐受等问题。
中国人每年在化妆品消费市场上的消费金额高达数千亿元，尤其在养颜护肤方面，美白祛斑产品层出不穷，除了含有上述成分外还含有多种防腐剂、乙醇、合成香精香料等成分，过多的非功效性成分的存在，给皮肤会带来额外的损害，可能引发癌症；加快色素沉淀，使皮肤越来越暗沉；引起皮肤的过敏、红肿。面对广阔的需求市场，如何获得透皮吸收性好，副作用低，疗效明确且安全可靠的美白祛斑护肤产品是一个急切需要解决的问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种含PDRN的美白祛斑组合物，并将其应用于美白祛斑化妆品，能够有效激活老化细胞活性、抑制黑色素生成、促进皮肤胶原蛋白合成，紧致皮肤，美白皮肤、祛除色斑。
具体技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种含PDRN的美白祛斑组合物。一种含PDRN 的美白祛斑组合物，其包括PDRN(多聚脱氧核糖核苷酸)、九胜肽、五胜肽和烟酰胺。
所述的PDRN(Polydeoxyribonucleotide)即多聚脱氧核糖核苷酸，其为提取自鲑鱼精巢、卵巢、内脏或肌肉组织的多聚脱氧核糖核苷酸。
所述的烟酰胺(CAS:98-92-0)，烟酰胺又称尼克酰胺、维生素B3或维生素PP，是一种水溶性维生素，属于B族维生素，为辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)和辅酶Ⅱ(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADP)的组成成分，在生物氧化中起着递氢作用对维持皮肤的完整性具有重要意义。
九胜肽CAS号为158563-45-2。
五胜肽CAS号为214047-00-4。
上述组合物各组分具备显著的协同作用，能够有效激活老化细胞活性、抑制黑色素生成、促进皮肤胶原蛋白合成，紧致皮肤，美白皮肤、祛除色斑。该组分能够从抑制酪氨酸酶活性，到表层沉积黑色素的抗氧化，实现淡去现有色素斑，并且能对肌肤肌底进行调整强化，组分毒副作用小，疗效也相对稳定。
进一步，所述的美白祛斑组合物以重量份数计，包括PDRN 0.05～5份、九胜肽0.05～0.5份、五胜肽0.001～0.5份、烟酰胺0.1～7份。
再进一步，所述的美白祛斑组合物以重量份数计，包括PDRN 0.1～3份、九胜肽0.1～0.5份、五胜肽0.05～0.5份、烟酰胺0.5～3份。
进一步，所述的PDRN的分子量为50bp～2000bp。
进一步，所述的PDRN获得自雄性鲑鱼的精巢。
进一步，上述的PDRN的制备方法包括如下步骤：
(1)将雄性鲑鱼精巢与浓度为0.8wt％～1.5wt％的三氯醋酸溶液混合并匀浆，离心，弃去上清；鲑鱼精巢与三氯醋酸溶液的质量比为1：(3～10)；
(2)向步骤(1)获得的沉淀中加入裂解液，充分混匀，70～95℃热处理10～20min，冷却至30℃以下后离心，取上清液；所述的裂解液中含有75～ 150mM Tris-HCl，100～250mM NaCl，2～6mM EDTA和0.15wt％～0.25wt％ SDS，其pH为7.0～8.5；
(3)向步骤(2)获得的上清液加入等体积的异丙醇或无水乙醇混匀，使其在-18～-25℃放置25～40min，7000～10000rpm离心8～15min，弃上清，收集沉淀，并将沉淀干燥，得PDRN。
再进一步，步骤(2)的离心条件为4000～8000rpm离心5～10min。
再进一步，步骤(1)中，裂解的热处理温度优选为80～95℃。
进一步，所述的美白祛斑组合物还包括维生素C及其衍生物、洋甘菊提取物、熊果苷及其衍生物、积雪草提取物、虎杖根提取物、高良姜提取物、红景天提取物、马齿苋提取物中的一种或数种。
再进一步，所述的美白祛斑组合物以重量份数计还包括洋甘菊提取物0.1～5份、熊果苷及其衍生物0.1～5份、积雪草提取物0.05～5份，虎杖根提取物0.05～5份、高良姜提取物0.1～6份、红景天提取物0.1～6份、马齿苋提取物0.01～2份。
本发明的目的之二是提供上述美白祛斑组合物化妆品中的应用。
进一步，所述的化妆品中还包括抗氧化剂、保湿剂、乳化剂、植物油脂、防腐剂和增稠剂中的一种或多种。
上述嫩肤抗皱组合物可应用于各种具备美白祛斑的化妆品，且没有常规的副作用，安全无刺激，适合各种肤质的人群，适合应用于医疗化妆品。化妆品的剂型优选为膏霜状、乳液状、凝胶状或水剂状等多种能被人接受的制剂形式。
再进一步，所述的抗氧化剂可以是抗坏血酸及盐、维生素E、辅酶Q10、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、牛磺酸、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、维生素e醋酸酯等中的至少一种。其中，优选抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E和牛磺酸中的至少一种。抗氧化剂的添加比例没有特别限定，但相对于皮肤外用组合物(例如抗皱营养液)的总量，通常为0.001wt％～6wt％，优选为0.01wt％～3wt％，进一步优选为0.1～1.5wt％。
再进一步，所述的保湿剂为透明质酸钠(可选大分子透明质酸(分子量为1800000～2200000道尔顿)、中分子透明质酸(分子量为1000000～1800000道尔顿)，小分子透明质酸(分子量为400000～1000000道尔顿))、乙酰基透明质酸钠、软骨素硫酸钠、氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、茶氨酸等氨基酸及其衍生物)及其衍生物、乙二醇、1,3-丙二醇、1，3-丁二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、二丙二醇、二1,3-丙二醇、聚乙二醇、甘油、乳酸钠中的至少一种。其中，优选透明质酸钠、丙二醇、甘油和甘氨酸中的至少一种。保湿剂的添加比例没有特别限定，但相对于皮肤外用组合物(例如抗皱营养液)的总量，通常为0.001wt％～40wt％，优选为0.1wt％～30wt％，进一步优选为5wt％～20wt％。
再进一步，所述的乳化剂选自鲸蜡醇、C20-22醇磷酸酯、单硬脂酸甘油酯、吐温、司盘、泊洛沙姆188、PEG-20氢化蓖麻油、硬脂酸甘油酯/PEG- 100、聚乙烯醇和聚乳酸-羟基乙酸中的至少一种。乳化剂的添加比例没有特别限定，但相对于皮肤外用组合物(例如抗皱营养液)的总量，通常为 0.001wt％～10wt％，优选为0.01wt％～5wt％，进一步优选为0.1wt％～3wt％。
再进一步，所述的植物油脂选自玫瑰果油、甜杏仁油、玫瑰花油、霍霍巴油、酪梨油、蓖麻油、鳄梨油、椰子油、棕榈油、可可油、可可脂、棕榈仁油、芦荟油、婆罗脂、牛油树脂、澳洲坚果油、石栗子油、沙刺油、西番莲花油、金盏花、芒果核油、蔷薇果油中的至少一种。其中优选为玫瑰果油、霍霍巴油、甜杏仁油中的至少一种。植物油脂的添加比例没有特别限定，但相对于皮肤外用组合物(例如抗皱营养液)的总量，通常为0.001wt％～10wt％，优选为0.01wt％～8wt％，进一步优选为0.1wt％～5.0wt％。
再进一步，所述的防腐剂选自苯甲醇、苯乙醇、苯氧乙醇和月桂酰精氨酸乙酯中的至少一种，优选为月桂酰精氨酸乙酯。防腐剂添加比例没有特别限定，但相对于皮肤外用组合物(例如抗皱营养液)的总量，通常为 0.001wt％～10wt％，优选为0.01wt％～5wt％，进一步优选为0.1wt％～2wt％。
再进一步，所述增稠剂为卡波姆、阿拉伯胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素、醋酸纤维素酞酸酯中的至少一种。增稠剂的添加比例没有特别限定，但相对于皮肤外用组合物(例如抗皱营养液)的总量，通常为0.001wt％～5wt％，优选为0.01wt％～3wt％，进一步优选为0.05wt％～1wt％。
本发明的有益效果如下：
本发明的组合物及包含该组合物的化妆品协同作用，能从多角度抑制黑色素的形成，激活老化细胞活性，促进胶原、弹性蛋白合成，重建修复表皮防御功能，改善皮肤细胞微环境，增加皮肤的含水量，提高皮肤的弹性和光滑度，减少炎性因子生成，从而全角度解决皮肤的干燥、粗糙、松弛、细纹、暗沉等问题。
附图说明
图1为实施例1、2、3中获得的PDRN的凝胶电泳图；
图2为实验1中对比例1～6与实施例1、4、5、6中的组合物对细胞活性的影响；
图3为实验1中对比例1～6与实施例1、4、5、6中的组合物对黑色素形成率的影响；
图4为实验1中对比例1～6与实施例1、4、5、6中的组合物对酪氨酸酶活性的影响；
图1中：图1中，从左至右，泳道1为实施例1制备获得的PDRN，泳道 2为实施例2制备获得的PDRN，泳道3为实施例3制备获得的PDRN，泳道4 为空白样，泳道5为marker。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
1、制备PDRN(多聚脱氧核糖核苷酸)，包括如下步骤：
(1)将雄性鲑鱼精巢与浓度为1wt％的三氯醋酸溶液按照质量比1：4混合，并匀浆，4000rpm离心5min，弃去上清；
(2)向步骤(1)获得的沉淀中加入裂解液，充分混匀，90℃水浴加热 15min，冷却至室温后6000rpm离心10min，取上清液；所述的裂解液中含有100mM Tris-HCl，200mM NaCl，5mM EDTA和0.2wt％SDS，其pH为8.0；
(3)向步骤(2)获得的上清液加入等体积的4℃预冷的异丙醇，混匀，使其在-20℃放置30min，8000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，并将沉淀风干至无乙醇味，得PDRN。
2、对上述制备获得的PDRN进行凝胶电泳：
精确称取PDRN，加入TE溶液，用枪头吹打后，50℃恒温水浴锅内放置 2小时溶解，获得浓度>600ng/ul样品，按照1:6的体积比加入上样液loading buffer，利用凝胶电泳对样品中DNA的分子量进行测定，结果如图1所示 (图1中，从左至右，泳道1为实施例1制备获得的PDRN，泳道4为空白样，泳道5为marker)。如图1可见上述获得的PDRN的分子量为50bp～2000bp。
3、使用上述制备的PDRN获得一种含PDRN的美白祛斑组合物，由以下成分组成：PDRN 0.5份、九胜肽0.5份、五胜肽0.5份、烟酰胺1份。
实施例2
1、制备PDRN(多聚脱氧核糖核苷酸)
(1)将雄性鲑鱼精巢与浓度为1wt％的三氯醋酸溶液按照质量比1：10 混合，并匀浆，4000rpm离心5min，弃去上清；
(2)向步骤(1)获得的沉淀中加入裂解液，充分混匀，95℃水浴加热10min，冷却至室温后7000rpm离心10min，取上清液；所述的裂解液中含有150mM Tris-HCl，200mM NaCl，4mM EDTA和0.25wt％SDS，其pH为8.2；
(3)向步骤(2)获得的上清液加入等体积的4℃预冷的无水乙醇，混匀，使其在-20℃放置30min，8000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，并将沉淀风干至无乙醇味，得PDRN。
2、对上述制备获得的PDRN进行凝胶电泳：利用凝胶电泳对样品中DNA 的分子量进行测定，结果如图1所示，从左至右，泳道2为实施例2制备获得的PDRN。如图1可见上述获得的PDRN的分子量为50bp～2000bp。
实施例3
1、制备PDRN(多聚脱氧核糖核苷酸)
(1)将雄性鲑鱼卵巢与浓度为1wt％的三氯醋酸溶液按照质量比1：4混合，并匀浆，4000rpm离心5min，弃去上清；
(2)向步骤(1)获得的沉淀中加入裂解液，充分混匀，70℃水浴加热 20min，冷却至室温后7000rpm离心10min，取上清液；所述的裂解液中含有100mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM EDTA和0.15wt％SDS，其pH为8.0；
(3)向步骤(2)获得的上清液加入等体积的4℃预冷的无水乙醇，混匀，使其在-20℃放置30min，8000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，并将沉淀风干至无乙醇味，得PDRN。
2、对上述制备获得的PDRN进行凝胶电泳：
利用凝胶电泳对样品中DNA的分子量进行测定，结果如图1所示，从左至右，泳道3为实施例3制备获得的PDRN。由电泳图谱可见，实施例3获得的PDRN的分子量大于100bp，且存在一定量分子量大于2000bp的成分，这与其裂解温度较低有关。
实施例4
使用与实施例1相同的PDRN获得一种含PDRN的美白祛斑组合物，由以下成分组成：PDRN 1份、九胜肽0.5份、五胜肽0.5份、烟酰胺1份。
与实施例1的区别仅在于PDRN的用量。
实施例5
使用与实施例1相同的PDRN获得一种含PDRN的美白祛斑组合物，由以下成分组成：PDRN 0.2份、九胜肽0.3份、五胜肽0.3份、烟酰胺3份。
实施例6
使用与实施例1相同的PDRN获得一种含PDRN的美白祛斑组合物，由以下成分组成：PDRN 2.5份、九胜肽0.1份、五胜肽0.05份、烟酰胺0.5份。
对比例1
使用与实施例1相同的PDRN获得组合物，由以下成分组成：PDRN 0.5 份、九胜肽0.5份、烟酰胺1份。
与实施例1的区别仅在于不包括五胜肽。
对比例2
使用与实施例1相同的PDRN获得组合物，由以下成分组成：PDRN 1份、九胜肽0.5份、烟酰胺1份。
与实施例4的区别仅在于不包括五胜肽。
对比例3
使用与实施例1相同的PDRN获得组合物，由以下成分组成：PDRN 0.5 份、五胜肽0.5份、烟酰胺1份。
与实施例1的区别仅在于不包括九胜肽。
对比例4
使用与实施例1相同的PDRN获得组合物，由以下成分组成：PDRN 1份、五胜肽0.5份、烟酰胺1份。
与实施例4的区别仅在于不包括九胜肽。
对比例5
获得组合物，由以下成分组成：九胜肽0.5份、五胜肽0.5份、烟酰胺 1份。
与实施例1、4区别仅在于不包括PDRN。
对比例6
获得组合物，由以下成分组成：九胜肽0.5份、五胜肽0.25份、烟酰胺1份。
与对比例5的区别仅在于五胜肽的用量。
实施例7
基于对组合物的组方研究，使用实施例4获得的美白祛斑组合物制备美白祛斑面膜。
该面膜包括以下重量份数的原料：美白祛斑组合物20份、熊果苷及其衍生物0.5份、玫瑰果油0.25份、积雪草提取物1份、司盘83 0.2份、硬脂酸甘油酯0.4份、1,3-丁二醇0.6份、尿囊素0.05份、卡波姆0.5份、甘油5份、去离子水71.5份。
上述面膜的制备方法如下：
(1)按照配方准备物质：甘油、熊果苷提取物、玫瑰果油、积雪草提取物、司盘83、硬脂酸甘油酯、1,3-丁二醇、尿囊素、卡波姆、尿囊素，称重备用；
(2)将去离子水、甘油混合，加热至60℃，保持温度60min，以2000r/min 搅拌，使其完全溶解，得混合物A；
(3)将熊果苷提取物、玫瑰果油、积雪草提取物、司盘83、硬脂酸甘油酯、1,3-丁二醇、尿囊素、卡波姆、尿囊素混合，搅拌均匀，得混合物B；
(4)将混合物A降温至40℃，加入美白祛斑组合物，并与混合物B混合均匀，2000r/min搅拌1h，分散至无明显颗粒，得到混合面膜液；
(5)将该混合面膜液送检，合格后储存在已消毒的容器中；
(6)将载体膜/面膜布浸入混合面膜液进行充分吸收，无菌、封装。
实施例8
基于对组合物的组方研究，使用实施例4获得的美白祛斑组合物制备美白祛斑面霜，组成美白祛斑面霜的组分及其质量百分含量如表1所示。
表1.实施例8中美白祛斑面霜成分表
将油相组分加热至78℃，搅拌熔成液体，保温，备用；水相组分中的粉体原料慢慢撒入水中，边搅拌边加热分散均匀后，加热至82℃完全溶解均匀；，将水相组分缓慢加入油相组分中，3000r/min均质5分钟至完全乳化均匀，消泡后降温；搅拌降温，降温到45℃加入低温添加相，搅拌均匀，35℃放置后成白色细腻均匀的膏体。
实施例9
基于对组合物的组方研究，使用实施例4获得的美白祛斑组合物制备美白祛斑精华，组成美白祛斑精华的组分及其质量百分含量如表2所示。
表2.实施例9中美白祛斑精华成分表
| 组分 | 在总体系中的含量(wt％) |
| 去离子水 | 余量 |
| 美白祛斑组合物 | 3.00 |
| 透明质酸 | 15.00 |
| 丁二醇 | 1.00 |
| 维生素C及其衍生物 | 1.00 |
| 熊果苷及其衍生物 | 0.50 |
| 积雪草提取物 | 1.00 |
将上列成分依次混合，搅拌使其充分溶解，检验合格后，再进行灌装即得抗皱精华护肤品。
实施例10
基于对组合物的组方研究，使用实施例4获得的美白祛斑组合物制备美白祛斑乳液，组成美白祛斑乳液的组分及其质量百分含量如表3所示。
表3.实施例10中美白祛斑乳液成分表
先将A组的成分加热至75℃，熔化并搅拌均匀，将B组成分按配方比例依次溶于无菌水中，搅拌溶解，C组苯氧乙醇与丙二醇混溶后加入B组中，降温至45℃再将A组和B组搅拌混合均匀，放置后形成美白祛斑乳液。
实验1
研究实施例1、4、5、6与对比例1～6获得的组合物对人表皮黑色素细胞的影响。
将上述组合物分别配制成10mg/mL的溶液，备用。将对比例1～6以及实施例1、4、5、6依次序标记为a、b、c、d、e、f、g、h、i、j组。
用含5％胎牛血清的DMEM培养基培养人表皮黑色素细胞(购于武汉普诺赛生命科技有限公司)，待细胞密度达到2×106后，将其接种于6孔板中并分为正常组、模型组、a(对比例1)、b(对比例2)、c(对比例3)、d(对比例4)、e(对比例5)、f(对比例6)、g(实施例1)、h(实施例4)、 i(实施例5)、j(实施例6)共12组，待细胞长满80％，除正常组外，其余各组细胞均置于紫外线下照射0.2J/cm2UVA(365nm)，每24小时照射30min，，每次照射完后分别加入上述组合物(各组合物的终浓度均为50μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。48小时后采用MTT法测定各组合物对细胞活性的影响；细胞经上述处理三天后，收集细胞加入500μLNaOH(1M含10％二甲基亚砜)溶液，65℃水浴完全溶解黑色素颗粒，利用酶标仪470nm测量黑素形成率；收集处理的细胞，用PBS洗2次，1000rpm离心5min，细胞沉淀备用，向沉淀中加入1mL 0.5％脱氧胆酸钠，置于0℃15min，然后加入3mL 0.1％L-dopa(pH6.8)磷酸缓冲液置于37℃水浴中，于475nm分别检测初始 0min和10min的吸光度值，算出各处理组酪氨酸酶相对活性。
不同组方对细胞活性的影响见图2。(注：*表示与正常组比较，**p<0.01 与正常组比较有极显著的差异；#表示与模型组比较，#p<0.05与模型组比较有显著的差异，##p<0.01与模型组比较有非常显著的差异，###p<0.001与模型组比较有极显著的差异；Δ表示与对比例1组比较，Δp<0.05两组比较有显著的差异；$表示与对比例3组比较，$p<0.05两组比较有显著的差异；+表示与实施例1组比较，+p<0.05与实施例1组比较有显著的差异， ++p<0.01与实施例1组比较有极显著的差异；&表示与实施例4组比较， &&&p<0.001与实施例4组比较有极显著的差异)
不同组方对黑色素形成率的影响见图3。(注：*表示与正常组比较， **p<0.01与正常组比较有极显著的差异；#表示与模型组比较，#p<0.05与模型组比较有显著的差异，##p<0.01与模型组比较有非常显著的差异，###p<0.001与模型组比较有极显著的差异；Δ表示与对比例1组比较，Δp<0.05两组比较有显著的差异；$表示与对比例3组比较，$p<0.05两组比较有显著的差异；+表示与实施例1组比较，++p<0.01与实施例1组比较有极显著的差异；&表示与实施例4组比较，&&p<0.01与实施例1组比较有非常显著的差异，&&&p<0.001与实施例4组比较有极显著的差异；φ表示与对比例5组比较，φφp<0.01与对比例5组比较有非常显著的差异。)
不同组方对酪氨酸酶活性的影响见图4。(注：*表示与正常组比较， **p<0.01与正常组比较有极显著的差异；#表示与模型组比较，#p<0.05与模型组比较有显著的差异，##p<0.01与模型组比较有非常显著的差异， ###p<0.001与模型组比较有极显著的差异；Δ表示与对比例1组比较，Δp<0.05两组比较有显著的差异；$表示与对比例3组比较，$p<0.05两组比较有显著的差异；+表示与实施例1组比较，++p<0.01与实施例1组比较有极显著的差异；&表示与实施例4组比较，&&p<0.01与实施例1组比较有非常显著的差异，&&&p<0.001与实施例4组比较有极显著的差异；φ表示与对比例5组比较，φp<0.05与对比例5组比较有显著的差异。)
由图2、3、4所示，长波紫外线照射能明显增加人表皮黑色素细胞的活性，提高酪氨酸酶活性，促进黑色素的形成。我们的组方能有效的抑制紫外线对黑色素细胞的促进作用，给予不同组方后细胞活性显著降低，由图谱可见增加组方中PDRN加入的量、提高组方中九胜肽、五胜肽的加入比例均能显著地降低酪氨酸酶活性、抑制黑色素的形成。另外h、i、j组比较我们发现提高组方中烟酰胺的比例能非常显著地降低长波紫外线对黑色素细胞的增活作用，有效地降低酪氨酸酶活性、抑制黑色素的形成。本研究显示实施例4的组方在提高细胞活性、抑制黑色素形成、降低酪氨酸酶活性方面具有最佳的效果。实验结果表明，四种组分在提高细胞活性、抑制黑色素形成、降低酪氨酸酶活性方面产生了显著的协同效应。
实验2
对实施例7～10获得的美白祛斑面膜、面霜、乳液、精华进行功能评估，并与市面上销售的相应的美白祛斑面膜(对比例7)、面霜(对比例8)、乳液(对比例9)、精华(对比例10)进行对比。
选取平均年龄为20～40岁皮肤健康的女性志愿者64名，受试者排除条件符合GB17149.2-1997《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》，无严重系统性疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病，无活动性过敏性疾病，对护肤类化妆品无过敏史，1个月内未曾全身使用激素类药物及免疫抑制剂，非妊娠或哺乳期，无伦理学禁忌。另外受试者因日晒、工作压力、年龄等原因面部均有斑点。将受试者随机分成8组，每组8名，分别使用本发明实施例 7～10和对比例7～10市面销售的相关美白产品。受试者在早晚清洁面部后，脸部涂抹美白实验产品，每天早晚涂抹两次，连续使用4周。实验期间，受试者在实验部位不能涂抹任何其它化妆品。对使用前、使用2周、使用4周后通过用皮肤色差测试探头(Colorimeter CL400，德国Courage Khazaka(CK) 公司)测试受试者使用样品前面部的L*值，皮肤白度(亮度)(L*值)：L*值为白平衡，值越大颜色越偏向白色，反之偏向黑色，其结果如表1。另外我们用皮肤水分测试仪对使用美白、祛斑、抗衰老护肤产品前后的皮肤含水量进行检测，结果如表2所示分别检测了在第0天和第28天记录检测皮肤含水量，评估产品的保湿效果。同时我们利用皮肤水分测试仪对使用护肤品前和4周后的皮肤弹性/肤质进行了检测，肤质共分为5个等级，分别为粗糙、偏粗糙、一般性、偏柔细、柔细，其结果如表4-6所示。
表4.对皮肤亮度的影响
注：*表示实施例9与对比例9比较，*P<0.05有显著性差异；+表示实施例10与对比例10比较，+P<0.05有显著性差异。
由表4可见，使用本发明护肤产品4周后，同组比较，使用后与使用前比较皮肤色度L*值有显著增大趋势。各实施例与其对比实施例比较，使用实施例2周后皮肤色度L*值均高于对比实施例，但无显著性差异；使用4周后，实施例7、8的皮肤色度L*值仍高于对比例7、8的L*值，但无显著差异，而实施例9、10的皮肤色度L*值显著高于对比例7、8的L*值，具有统计学意义。结果说明面部使用本发明护肤品之后，皮肤亮度增加，肤色逐渐变白，皮肤上的色斑颜色逐渐变淡。
表5.对皮肤含水量的影响
注：
表示实施例7与对比实施例7比较，
P<0.05有极显著性差异； #表示实施例8与对比实施例8比较，##P<0.01有极显著性差异；*表示实施例9与对比实施例9比较，**P<0.01有极显著性差异；+表示实施例10与对比实施例10比较，++P<0.01有极显著性差异。
由表5可见，给予本发明护肤产品后，每组受试者使用4周后与使用前比较，皮肤含水量均显著升高。各实施例与对比实施例比较，本发明美白、祛斑、抗衰老护肤品对皮肤保湿能力显著高于对比实施例所使用的其他对照护肤品，说明本发明具有很好的保湿功能。表2数据显示，当连续使用本发明护肤品4周后，皮肤含水量均增加了47％以上，进一步说明本发明具有较强的锁水能力。
表6.对皮肤弹性/肤质的影响
由表6可见，8位受试者给予本发明实施例7～10后有肤质均有效地得到了提高，肤质柔细的比例分别为4/8、7/8、5/8、5/8，而给予对比例7～10 后肤质柔细的比例为2/8、2/8、1/8和0，我们由此可以推断：本发明在提高皮肤弹性、改善肤质方面具有显著的效果。
实验3
测试实施例7～10获得的美白祛斑面膜、面霜、乳液、精华对豚鼠紫外照射模型肤色的影响，并与市面上销售的相应的美白祛斑面膜(对比例7)、面霜(对比例8)、乳液(对比例9)、精华(对比例10)进行对比。
选取清洁级健康6～8周龄雌性棕黄色豚鼠20只，将豚鼠分两组：A组和B组，每组10只，每只豚鼠背部皮肤分成5个2×2cm区域，给豚鼠背部去毛，A组每只豚鼠背部5块区域编号为1、2、3、4、5，B组每只豚鼠背部 5块区域编号为6、7、8、9、10，对每个区域进行紫外照射，照射强度为 2mW/cm2，每日照射时间10min，共照射7天，7天后使用色差仪测量每个区域的皮肤白度值(记为L1)，数值比未照射前数值(L0)降低20表明造模成功。其中1号不涂抹任何物质为空白组，2、4号分别涂抹实施例7和8， 3、5号分别涂抹对比例7和8，6号涂抹阳性对照(左旋维生素C取原液 1-3滴轻匀涂于脸部)，7、9号涂抹实施例9和10,8、10号涂抹对比例9和 10。20只豚鼠连续涂抹6周，每天一次，6周后测定白度值(记为L2)，按公式：(L2-L1)/L1*100％计算白度增长率，判断各种配方的美白效果，测试结果如表7所示。
表7.对豚鼠紫外照射模型肤色的影响
注：
表示实施例7与对比例7比较，
P<0.01有极显著性差异；#表示实施例8与对比例8比较，##P<0.01有极显著性差异；*表示实施例9与对比例9比较，**P<0.01有极显著性差异；+表示实施例10与对比例10比较，++P<0.01有极显著性差异
如表7所示，经过6周的美白、祛斑、抗衰老护肤品(实施例7、8、9、 10)涂抹后，豚鼠皮肤的白度值已经接近恢复至紫外照射前的数值。结果显示实施例7、8、9、10的白度增长率分别为75.9％、77.7％、75.3％和73.8％，而与之相对应的对比例7、8、9、10的白度增长率则分别为52.8％、47％、 42.9％和43％，二者间存在着显著性差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含PDRN的美白祛斑组合物，其特征在于，包括PDRN、九胜肽、五胜肽和烟酰胺。
2.根据权利要求1所述的美白祛斑组合物，其特征在于，以重量份数计，包括PDRN 0.05～5份、九胜肽0.05～0.5份、五胜肽0.001～0.5份、烟酰胺0.1～7份。
3.根据权利要求2所述的美白祛斑组合物，其特征在于，以重量份数计，包括PDRN 0.1～3份、九胜肽0.1～0.5份、五胜肽0.05～0.5份、烟酰胺0.5～3份。
4.根据权利要求1～3任一项所述的，其特征在于，所述的PDRN的分子量为50bp～2000bp。
5.根据权利要求1～3任一项所述的美白祛斑组合物，其特征在于，所述的PDRN获得自雄性鲑鱼的精巢。
6.根据权利要求1～3任一项所述的美白祛斑组合物，其特征在于，还包括维生素C及其衍生物、洋甘菊提取物、熊果苷及其衍生物、积雪草提取物、虎杖根提取物、高良姜提取物、红景天提取物、马齿苋提取物中的一种或数种。
7.根据权利要求1～3任一项所述的美白祛斑组合物，其特征在于，所述的PDRN的制备方法包括如下步骤：
(1)将雄性鲑鱼精巢与浓度为0.8wt％～1.5wt％的三氯醋酸溶液混合并匀浆，离心，弃去上清；鲑鱼精巢与三氯醋酸溶液的质量比为1：(3～10)；
(2)向步骤(1)获得的沉淀中加入裂解液，充分混匀，70～95℃热处理10～20min，冷却至30℃以下后离心，取上清液；所述的裂解液中含有75～150mM Tris-HCl，100～250mMNaCl，2～6mM EDTA和0.15wt％～0.25wt％SDS，其pH为7.0～8.5；
(3)向步骤(2)获得的上清液加入等体积的异丙醇或无水乙醇混匀，使其在-18～-25℃放置25～40min，7000～10000rpm离心8～15min，弃上清，收集沉淀，并将沉淀干燥，得PDRN。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的美白祛斑组合物在化妆品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的化妆品中还包括抗氧化剂、保湿剂、乳化剂、植物油脂、防腐剂和增稠剂中的一种或数种。
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