CN112646197B

CN112646197B - 一种氨基化木质素及其制备方法和应用

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Publication number: CN112646197B
Application number: CN202011537498.7A
Authority: CN
Inventors: 陈凯; 陈凤凤; 王丹; 袁胜荣
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112646197A

Abstract

本发明涉及生物质基多功能抗菌剂技术领域，提供了一种兼具抗菌、抗紫外氧化和乳化性能的氨基化木质素及其制备方法和应用。所述氨基化木质素由酶解木质素，赖氨酸和乙二醛反应得到，通过Manich反应，在木质素多酚聚合物中引入氨基，增加静电相互作用，提高抗菌活性，实现木质素在生物医药中的高值化利用，具有重要的社会、环境和经济意义。利用氨基化木质素协同小分子助剂，稳定高内相乳液，用于负载天然抗菌试剂，提高天然抗菌试剂的化学稳定性、抑菌活性和生物利用度，为构建新型抗菌材料提供新策略。

Description

一种氨基化木质素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物质基多功能抗菌剂技术领域，尤其涉及一种兼具抗菌、抗紫外氧化和乳化性能的氨基化木质素及其制备方法和应用。

EHL指酶解木质素，Lys指赖氨酸，HIPEs指高内相乳液。

背景技术

由于不同病原菌引起的严重感染性疾病，如化脓性伤口感染、呼吸道炎症、皮炎等，依旧是人们生命健康的最大威胁之一。更为严重的是，由于传统抗生素的滥用，病原菌的耐药性不断增加，这对现有的细菌感染治疗系统造成了极大的威胁。因此，迫切需要新的、有效的抗菌策略和药物来减少对抗生素治疗的依赖。

自古以来，草药和植物化学物质被广泛用作治疗各种感染性疾病。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种天然多酚化合物，已被证明对包括幽门螺杆菌、大肠杆菌对白色念珠菌以及多药耐药菌在内的众多病原菌具有高效的抑制活性。然而，姜黄素对温度、氧气和光敏感导致易降解失活，水溶性差导致生物利用度低，在临床应用中受到了严重限制。

木质素是植物中第二丰富的多酚聚合物。工业木质素年产量也超过5000万吨，但大部分仅用于低产出物的应用，如燃烧燃料供热和工业过程的能源发电。这一过程不仅浪费了大量的生物资源，而且严重危害人类生存环境。事实上，保护植物免受细菌和真菌的侵袭是木质素的关键功能之一。Yang等人研究发现工业木质素对植物病原菌具有广泛的抑制活性，可用于植物病原菌抗菌剂或食品包装。Wang等人研究表明工业木质素对常见的医院病原菌包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌也具有一定的抑制活性。然而，工业木质素差的水溶性和低抗菌活性，限制了其在临床中的应用。有文献报道称，通过乙酰化、环氧化、羟甲基化、氨化等化学改性，可提高工业木质素的抗菌活性。此外，木质素分子中含有众多芳香环结构，赋予其优异的紫外线阻隔性能，可广泛应用于包括姜黄素和β-胡萝卜素等光热不稳定药物的保护剂。综上所述，合成多功能木质素基抗菌剂，并协同天然多酚化合物，是构建新型抗菌材料的一种理想策略。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的缺点与不足，构建一种新型抗菌材料及其应用。

本发明目的第一方面在于提供一种氨基化木质素，具有很高的抗菌活性和水溶性，由以下组分反应得到：酶解木质素，赖氨酸和乙二醛。

本发明目的第二方面在于一种氨基化木质素的制备方法，提高木质素抗菌活性和水溶性。通过下述方案实现：

本发明提供了一种氨基化木质素的制备方法，包括以下步骤：

S1、将酶解木质素溶解于碱溶液中得到酶解木质素溶液，加入赖氨酸和乙二醛，搅拌加热反应一定时间；

S2、反应结束后，加入酸溶液调节反应液的pH至中性，用透析袋透析2～6天；

S3、对得到的透析液进行干燥得到氨基化木质素。

优选地，本发明的一种氨基化木质素的制备方法，还包括以下附加技术特征至少其中之一：

所述酶解木质素溶液的浓度为5～20wt％；

所述酶解木质素、赖氨酸和乙二醛的质量比为1：0.5～3：0.5～3；

所述透析袋分子量为Mw＝2500～4000Da；

所述干燥为冷冻干燥。

优选地，所述搅拌加热反应的条件为：反应温度30～60℃，反应时间2～10h。

本发明目的第三方面在于提供一种氨基化木质素在抑制大肠杆菌和金葡萄球菌中的应用。

本发明目的第四方面在于提供一种氨基化木质素在制备稳定高内相乳液中的应用。通过下述方案实现：

本发明提供了一种稳定高内相乳液的制备方法，包括以下步骤：

1)将一定量的天然抗菌剂溶解在油相中，并装入棕色瓶，置于冰箱中备用；

2)将一定量的氨基化木质素、小分子助剂、超纯水与一定体积的所述油相混合，高速剪切乳化。

优选地，步骤1)中所述油相为棕榈油，大豆油，液体石蜡，松节油，甲苯，正己烷中的一种；和/或

步骤2)中所述小分子助剂为十二烷基硫酸钠，烷基糖苷中的一种或多种。

优选地，本发明的一种稳定高内相乳液的制备方法，步骤2)中还包括以下附加技术特征至少其中之一：

所述超纯水与油相的体积比为1：8～3：7；

以超纯水的质量计，所述氨基化木质素的浓度为0.5～10.0wt％；

所述氨基化木质素的接枝率为0.1～1.0mmol/g；其中，产物接枝率＝氨基化木质素中的羧酸含量—木质素中的羧酸含量；

以超纯水的质量计，所述小分子助剂的浓度为0.5～5.0wt％；

所述高速剪切乳化的速度为10000～13000rpm。

本发明目的第四方面在于提供一种基于氨基化木质素稳定高内相乳液在制备天然抗菌试剂传递系统中的应用。

本发明的机理为：

通过Manich反应，在酚羟基邻位引入氨基，赋予了木质素正电性，增加与细菌间的静电作用，提高了抗菌活性。其次，木质素原有酚羟基和苯环结构没有被破坏，使其依旧具有优异的紫外吸收、抗氧化和抗菌作用。因此，能赋予天然抗菌试剂良好的紫外、热和氧防护性能，提高其抑菌活性和生物利用度。

相对于现有技术，本发明可取得如下有益效果：

1、通过Manich反应，在木质素多酚聚合物中引入氨基，增加静电相互作用，提高抗菌活性，实现木质素在生物医药中的高值化利用，具有重要的社会、环境和经济意义。

2、在木质素酚羟基邻位引入氨基基团，未破坏木质素原有酚羟基和苯环结构，很好的保留了它的本征特性如抗菌、防紫外和抗氧化等，且具有更加优异的抗菌、防紫外和抗氧化性能。

3、利用氨基化木质素协同小分子助剂，稳定高内相乳液，用于负载天然抗菌试剂，提高天然抗菌试剂的化学稳定性、抑菌活性和生物利用度，为构建新型抗菌材料提供新策略。

4、氨基化木质素生物相容，安全无毒，绿色环保，可以在生物医药中广泛推广。

附图说明

图1为本发明优选实施例的氨基化木质素合成路线图；

图2为本发明优选实施例的氨基化木质素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性图；

图3为本发明优选实施例的氨基化木质素对大肠杆菌的抑菌活性图；

图4为本发明优选实施例的氨基化木质素溶血率图；

图5为本发明优选实施例的稳定高内相乳液的宏观和微观形貌图；

图6为本发明优选实施例的载药乳液中姜黄素的保留率图；

图7为本发明优选实施例的载药乳液处理后的细菌形貌图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例中的附图，对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

系列氨基化木质素的合成。

首先，将4.0g酶解木质素溶解于40mL 0.5mol/L氢氧化钠水溶液中，加入不同质量比例的赖氨酸和乙二醛(酶解木质素：赖氨酸：乙二醛为1：0.5：0.5，1：1.0：1.0，1：1.5：1.5和1：2.0：2.0)，在40℃搅拌反应6h后，用盐酸调节反应液pH至中性，用透析袋(Mw＝3000Da)透析3天，冷冻干燥得最终样品。氨基化木质素合成路线如图1所示。

其中，氨基化木质素的接枝率计算方法为：产物接枝率＝氨基化木质素中的羧酸(羧酸根)含量—木质素中的羧酸含量。接枝率分别为：0.15mmol/g，0.27mmol/g，0.38mmol/g，0.64mmol/g，0.50mmol/g。

实施例2

以实施例1制备得到的氨基化木质素进行抗菌活性测试。

根据国家临床实验室标准化委员会(CLSI)标准，评估氨基化木质素衍生物对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌的抗菌活性。测试过程如下：

首先，将样品溶解在无菌水中，用Muller-Hinton肉汤在96孔板中连续稀释，最终浓度分别为1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL，12mg/mL，14mg/mL，16mg/mL，18mg/mL，20mg/mL。

然后，加入一定量的细菌悬浮液，细菌悬浮液测试浓度为5×10⁵CFU/mL，并以仅有样品和仅有细菌悬浮液的两个微量滴定板作为生长(无共聚物)和无菌(无细菌)对照。所有微量滴定板在37℃下培养18h。

在600nm下用酶标仪测量悬浮液光密度。所有实验重复三次。氨基化木质素抑菌活性如图2所示。由图2和图3可知，在20mg/mL时，氨基化木质素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率分别为93％和50％。

实施例3

以实施例1制备得到的氨基化木质素进行生物相容性测试，测试过程如下：

首先，将样品溶解在缓冲液中，用缓冲液连续稀释至测试浓度(1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL，12mg/mL，14mg/mL，16mg/mL，18mg/mL，20mg/mL)。然后，加入红细胞悬浮液(6.45×10¹²RBCs/L)，在37℃下轻轻摇动30分钟，离心去除细胞，在540nm处测试上清液的光密度。此外，用纯缓冲液和2％TRITON-X分别作为阴性和阳性对照。另外，纯样品溶液作为空白样品。所有实验重复三次。氨基化木质素溶血率如图4所示。由图4可知，在20mg/mL时，氨基化木质素溶血率仍低于50％，说明本发明的氨基化木质素具有良好的生物相容性。

实施例4

以实施例1制备得到的氨基化木质素进行抗菌机制研究，包括以下步骤：

用石英晶体微天平(QCM-D)测量样品在细菌上的吸附量。首先，在QCM-D流动模块中注入纯水。待基线稳定后，注入细菌悬液，再次等待基线新的平衡。然后，将样品水溶液注入QCM-D流动模块，记录第三泛音频移(△F₃)。其中，纯水流速为0.15mL/min，细菌悬浮液浓度为2.6×10⁷CFU/mL，样品溶液浓度为1.0mg/mL。

用原子力显微镜(AFM)测定细菌与样品间的粘附力。首先，采用热熔胶法，将样品修饰在二氧化硅标准粒子，并固定在氮化硅探针上。其次，采用静电自组装技术将细菌涂在玻璃上，用磷酸钾缓冲液冲洗游离的浮游菌，做成细胞切片备用。其中，二氧化硅标准粒子直径为23.33μm，氮化硅探针标称悬臂弹簧常数为0.12n/m，AFM力测量参数为20.0nN的限制力、5.0nN的设定值和1.0μm的力距。每次测量重复150次以确保数据的可靠性。

实验结果表明，氨化木质素表现为一种膜损伤机制，随着氨基化木质素的正电荷增加，抗菌活性增加。

实施例5

以实施例1制备得到的氨基化木质素进行稳定高内相乳液的制备，制备方法如下：

将3.0g姜黄素溶解在100mL棕榈油中，并装入棕色瓶，置于冰箱中备用。将接枝率为0.15mmol/g的氨基化木质素(0.1g)、烷基糖苷(0.06g)、2mL的超纯水混合均匀。然后，加入8mL上述备用的油相，在11000rpm下高速剪切1分钟，制备得到高内相乳液。按照同样的方法，制备得到5组高内相乳液，如表1所示。

表1

其中，编号3的实验组得到的氨基化木质素高内相乳液的宏观和微观形貌如图5所示，其余编号得到的宏观和微观形貌与图5类似。结果表明，本发明提供的氨基化木质素具有优良的乳化性能。

实施例6

以实施例5制备得到的氨基化木质素稳定高内相乳液进行防护性能测试，包括光稳定性试验、热稳定性试验和储存稳定性试验。

1、光稳定性试验：将10g载药乳液倒入玻璃培养皿(直径6cm，高4cm)中，在紫外光下(25瓦)照射72h，用紫外可见分光光度计在254nm处测量原药保留水平。编号1～5制备得到的载药乳液中姜黄素的保留率分别为71％，65％，67％，68％，71％；其中，编号3的载药乳液中姜黄素的保留率如图6所示。

2、热稳定性试验：将10g载药乳液倒入玻璃瓶(20mL)，置于烘箱中7天，烘箱温度为60℃，测试乳液中原药的保留率。编号1～5制备得到的载药乳液中姜黄素的保留率分别为70％，75％，73％，73％，71％；其中，编号3的载药乳液中姜黄素的保留率如图6所示。

3、储存稳定性试验：将10g载药乳液倒入玻璃瓶(20mL)，置于室温环境中，储藏时间为30天，测试乳液中原药的保留率。编号1～5制备得到的载药乳液中姜黄素的保留率分别为92％，95％，92％，93％，94％；其中，编号3的载药乳液中姜黄素的保留率如图6所示。

经紫外线、热辐射和贮藏处理后，HIPEs中姜黄素的最高残留量分别是纯油相的60倍、3倍和5倍。

实施例7

以实施例5制备得到的氨基化木质素稳定高内相乳液进行氨基化木质素与姜黄素协同抗菌性能测试。测试过程如下：

首先，将载药乳液分散在无菌水中，用Muller-Hinton肉汤在96孔板中连续稀释至测试浓度(0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.8mg/mL，1.6mg/mL，3.2mg/mL，6.25mg/mL，12.5mg/mL，25mg/mL，50mg/mL)。

然后，加入一定量的细菌悬浮液(5×10⁵CFU/mL)，并以仅有样品和仅有细菌悬浮液的两个微量滴定板作为生长(无共聚物)和无菌(无细菌)对照。所有微量滴定板在37℃下培养18h。

在600nm下用酶标仪测量悬浮液光密度。当细菌可见生长受到抑制时，以最低抑菌浓度作为最小抑菌浓度(MIC)值。所有实验重复三次。其中，编号3的载药乳液处理后的细菌形貌如图7所示。图中显示细菌细胞膜由光滑变褶皱，表明细胞被灭杀。

对比例1：

中未引入氨基，测试酶解木质素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，测试方法与实施例2相同，结果分别如图2和图3所示。结果表明，在20mg/mL时，木质素对金黄色葡萄球菌的杀菌率在67％左右，对大肠杆菌的杀菌率在10％左右，远低于本发明的杀菌率，说明在木质素中引入氨基能提高其抗菌活性。

对比例2：

酶解木质素的原药防护性能测试：不引入氨基基团，直接以酶解木质素不能在中性条件下制备稳定高内相乳液，原因在于酶解木质素需要在pH值12及以上时才能溶解。因此对原药防护性能为0。

对比例3：

未加入小分子助剂，以实施例1制备得到的氨基化木质素进行稳定高内相乳液的制备，结果无法制备得到稳定高内相乳液，说明氨基化木质素协同小分子助剂，才可制备得到稳定高内相乳液。

本发明采用Manich反应合成了一系列具有生物相容性的氨基化木质素衍生物，既增加了木质素的水溶性，又增加了其抑菌活性。随后，将其与小分子助剂联用，稳定高内相乳液，用于负载天然抗菌剂—姜黄素，赋予姜黄素良好的紫外、热和氧防护性能，提高其抑菌活性和生物利用度。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种稳定高内相乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将一定量的姜黄素溶解在油相中，并装入棕色瓶，置于冰箱中备用；

2）将一定量的氨基化木质素、小分子助剂、超纯水与一定体积的所述油相混合，高速剪切乳化；

所述氨基化木质素的制备方法包括以下步骤：将酶解木质素溶解于碱溶液中得到酶解木质素溶液，加入赖氨酸和乙二醛，搅拌加热反应一定时间；反应结束后，加入酸溶液调节反应液的pH至中性，用透析袋透析2~6天，所述透析袋分子量为Mw=2500~4000 Da；对得到的透析液进行干燥得到氨基化木质素；

所述小分子助剂为十二烷基硫酸钠，烷基糖苷中的一种或多种；所述超纯水与油相的体积比为1：8~3：7；所述氨基化木质素的接枝率为0.1~1.0 mmol/g；以超纯水的质量计，所述氨基化木质素的浓度为0.5~10.0 wt%；以超纯水的质量计，所述小分子助剂的浓度为0.5~5.0 wt%；所述高速剪切乳化的速度为10000~13000 rpm。

2.根据权利要求1所述的一种稳定高内相乳液的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述油相为棕榈油，大豆油，液体石蜡，松节油，甲苯，正己烷中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种稳定高内相乳液的制备方法，其特征在于，还包括以下附加技术特征至少其中之一：

所述酶解木质素溶液的浓度为5~20wt%；

所述酶解木质素、赖氨酸和乙二醛的质量比为1：0.5~3：0.5~3；

所述干燥为冷冻干燥。

4.根据权利要求1所述的一种稳定高内相乳液的制备方法，其特征在于，所述搅拌加热反应的条件为：反应温度30~60 ℃，反应时间2~10 h。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的制备方法制备得到的稳定高内相乳液在制备抗菌药物传递系统中的应用。