CN112638427A - 用于术后治疗的原位喷雾生物响应性免疫治疗凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与生物响应性水凝胶基质有关的组合物和方法，所述生物响应性水凝胶基质包括纤维蛋白原包封的纳米颗粒和凝血酶。本发明公开了与免疫治疗生物响应性凝胶基质有关的方法和组合物，以及使用其治疗、预防和/或抑制肿瘤增殖的方法。

Description

用于术后治疗的原位喷雾生物响应性免疫治疗凝胶

背景技术

尽管手术技术不断进步，但肿瘤切除后残留的微肿瘤和/或循环肿瘤细胞(CTC)仍具有挑战性。还已证实，由创伤引起的围手术期炎症对肿瘤复发的发展、促进局部剩余肿瘤复发的加速以及促进肿瘤的侵袭和转移具有高风险。但是，目前依靠既定治疗方法(包括全身化疗和放疗)的方法可能具有高毒性。需要减少肿瘤浸润和转移同时避免产生毒性的新方法。

发明内容

本发明公开了与免疫治疗生物响应性凝胶基质有关的方法和组合物，以及使用其治疗、预防和/或抑制肿瘤增殖的方法。

一方面，本文公开了免疫治疗生物响应性凝胶基质，其包括第一组分(例如，H+清除剂诸如，例如，纤维蛋白(fibrinin))和第二组分(诸如，例如，凝血酶)；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中组分中的至少一种(即所述第一组分和/或第二组分)包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

本文还公开了任何前述方面的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂是抗CD47抗体。

一方面，本文公开了任何前述方面的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括至少一种第二纳米颗粒和/或至少一种第二抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

本文还公开了治疗、减少、抑制和/或预防癌症肿瘤的手术切除部位的肿瘤增殖和/或转移的方法，其包括向受试者的切除部位施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种(即所述第一组分和/或第二组分)包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。因此，一方面，本文公开了治疗、抑制和/或预防癌症肿瘤的手术切除部位的肿瘤增殖和/或转移的方法，包括向受试者的切除部位施用任何前述方面的免疫治疗生物响应性凝胶基质。

一方面，本文公开了治疗、减少、抑制和/或预防任何前述方面的肿瘤增殖和/或转移的方法，其中第一和第二组分在递送至受试者之前混合(从而在递送之前形成基质)，在向受试者施用组分的同时施用和混合，或分开递送至受试者(诸如，例如，并行或顺序施用)。

本文还公开了在肿瘤切除后增加对所述肿瘤的先天性或适应性免疫应答的方法，其包括向患有肿瘤的受试者施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种(即所述第一组分和/或第二组分)包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

附图简要说明

并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施例，并且与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。

图1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I和1J显示了原位形成的免疫治疗性纤维蛋白凝胶的示意图和特征。图1A显示了含aCD47@CaCO3NP的免疫治疗生物响应性纤维蛋白凝胶的示意图，该免疫治疗生物响应性纤维蛋白凝胶在快速喷雾后原位形成，用于有效抑制手术后肿瘤复发和转移。包封在纤维蛋白中的aCD47@CaCO3 NP能够清除手术伤口部位的H+和残留的TME，随后释放aCD47，从而引发免疫支持的切除后环境，诸如TAM极化为M1型表型，并阻止癌细胞上表达的“别吃我(don't eat me)”信号，从而增加巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用，并引发T细胞介导的抗肿瘤响应。图1B显示了aCD47@CaCO₃ NP的TEM图像(标尺：100nm)。实验重复三次。图1C显示了aCD47@CaCO₃ NP的扫描TEM(STEM)图像，显示了钙(绿色)、氧(红色)和钆标记的aCD47(绿色)。实验重复三次。图1D显示了由DLS确定的aCD47@CaCO₃ NP的平均流体动力学尺寸。图1E和图1F显示了负载aCD47@CaCO3 NP的纤维蛋白凝胶的代表性Cryo-SEM图像。标尺，1μm。图1G显示了纤维蛋白冷冻切片的代表性荧光图像，其中纤维蛋白原用FITC标记，CaCO3 NP用Cy5.5标记，aCD47经偶联罗丹明的抗大鼠IgG抗体染色。标尺，10μm。图1H显示了在不同pH值的溶液中aCD47从纤维蛋白的累积释放曲线。图1I显示了荧光IVIS成像，描绘了抗体不同递送六天后aCD47 Cy5.5的体内释放曲线。实验重复三次。图1J显示了aCD47 Cy5.5的体内滞留曲线(也称为释放曲线)的定量。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差。P值：*P<0.05。

图2A、图2B和图2C显示了使用具有25mm铝交叉影线平行板的TA Instruments AR-2000受控应力流变仪，在25℃下测得的凝胶化之前和之后的纤维蛋白原的动态流变学行为。所有实验均采用线性粘弹性方案，板之间的间隙为500μm，并至少进行三次测量。图2A显示了含IgG@CaCO3 NP样品的纤维蛋白原弹性模量(G')和粘性模量(G")的频谱，具有溶液样特征。图2B显示了IgG@CaCO3@纤维蛋白样品的弹性模量(G')和粘性模量(G")的频谱，显示出凝胶样行为。图2C显示了含IgG@CaCO3纤维蛋白原和凝血酶的混合物的G'和G"随时间函数的变化表现出超快的溶胶-凝胶转变。IgG(免疫球蛋白G)表示本研究中使用的aCD47。

图3A和图3B显示了aCD47@CaCO3 NP的TEM图像和释放曲线。图3A显示了aCD47@CaCO3 NP浸入具有不同pH值(7.4和6.5)的磷酸盐缓冲液(PBS)和在不同时间段内后的代表性TEM图像(标尺：100nm)。实验重复三次。图3B显示了分散在具有不同pH值(6.5、6.8和7.4)的PBS中的aCD47@CaCO3 NP的时间依赖性DLS测量的尺寸变化。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)。

图4显示了分散在具有不同pH值(6.5、6.8和7.4)的PBS中的从CaCO3 NP的aCD47的时间依赖性DLS测量的尺寸变化。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝3)。

图5显示了含CaCO3 NP的磷酸盐缓冲液(PB)的时间依赖性pH值变化。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝3)。

图6显示了荧光IVIS成像，描绘了不同天数的aCD47 Cy5.5的体内释放曲线。

图7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H和7I显示CaCO3@纤维蛋白掺入以减轻免疫抑制性TME。在不同处理后五天从小鼠采集B16F10肿瘤以进行分析。图7A显示了在F4/80+CD11b+CD45+细胞中M2-巨噬细胞(CD206hi)和M1-巨噬细胞(CD80 hi)的代表性流式细胞术分析图像和(7b)相应定量。图7C显示了在不同肿瘤中IL 10和IL12p70的分泌水平。图7D显示了CD45+细胞的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)。图7E显示了CD45+细胞上MDSC(CD11b+Gr-1+)门控的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)。图7F显示了CD3+细胞上的CD4+Foxp3+ T细胞门控的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)。图7G显示了通过Western印迹分析的B16F10肿瘤中的HIF1-α蛋白表达水平。图7H显示了CaCO3@纤维蛋白治疗之前和之后的全身性IFN-γ和TNF-α水平。图7I显示了CD3+细胞上的CD4+和CD8+ T细胞门控的代表性流式细胞术分析(左)和相应定量(右)。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey事后检验(7b,7c,7d-77f,i)或Welch t检验(7h)进行计算。P值：*P<0.05；

**P<0.01；***P<0.001。

图8显示了图7G的未裁剪的western印迹。用红色矩形表示用于图7G的条带。

图9A和图9B显示了DC和肿瘤细胞的PD-L1表达和肿瘤浸润淋巴细胞在CaCO3@纤维蛋白处理后的PD-1表达(9A)，以及(9B)PD-L1和PD-1平均值的相应定量。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝4)。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005。

图10A、10B、10C、10D、10E和10F显示了在体外增加吞噬作用并在体内发挥抗肿瘤免疫应答的CD47阻断作用。图10A显示了吞噬作用分析的代表性共聚焦图像，其中B16F10癌细胞用CellTracker DeepRed(红色)标记，BMDM用CellTracker Green(绿色)标记(标尺，100μm)。图10B显示了通过BMDM吞噬癌细胞的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)(n＝3)。吞噬的癌细胞被定量为CellTracker Green阳性BMDM或CellTracker DeepRed癌细胞中双阳性BMDM的百分比。图10C显示了CD45+细胞上Ly6ChiLy6G-巨噬细胞和CD11c+CD11b-DC门控的代表性流式细胞术分析图像和(10D)相应定量。图10E显示了CD11c+细胞上CD80+CD86+DC和CD103+DC门控的代表性流式细胞术分析图像和10F)相应定量。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝4)。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图11A显示了吞噬作用分析的代表性共聚焦图像，其中包括B16F10和4T1的癌细胞用CellTracker DeepRed标记，BMDM用CellTracker Green标记(标尺，100μm)。

图11B显示了通过BMDM吞噬癌细胞(B16F10和4T1)的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)(n＝3)。吞噬的癌细胞被定量为CellTracker Green阳性BMDM或CellTracker DeepRed癌细胞中双阳性BMDM的百分比。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝3)。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005。

图12显示了在CD45+细胞上Ly6G+Ly6Cdim中性粒细胞门控的百分比。

图13A、图13B和图13C显示了用于减少术后B16F10肿瘤复发的aCD47@CaCO3@纤维蛋白。图13A显示了去除原发性肿瘤后B16F10肿瘤的体内生物发光成像。每个处理组显示四只代表性小鼠。图13B显示了不同组中的个体和(13C)平均肿瘤生长动力学。当相应组的第一只小鼠死亡时，生长曲线停止。统计学显著性通过双因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。图13D显示了如所示的不同处理后对应于小鼠肿瘤大小的存活率。统计学显著性通过Log-Rank(Mantel-Cox)检验计算。图13E显示了不同组中小鼠的体重变化。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝6-8)。统计学显著性通过双因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图14A、14B、14C、14D、14E和14F显示了引发强抗肿瘤免疫应答的aCD47@CaCO3@纤维蛋白。在不同处理后五天从小鼠收获B16F10肿瘤用于分析。图14A显示了在F4/80+CD11b+CD45+细胞中M2-巨噬细胞(CD206hi)和M1-巨噬细胞(CD80 hi)的代表性流式细胞术分析图像和(左)和相应定量(右)。图14B显示了不同组中肿瘤内T细胞浸润的代表性流式细胞术分析(左)和相应定量结果(右)。图14C显示了经过各种处理后肿瘤内CD8+和(14D)CD4+ T细胞的绝对百分比。图14E显示了显示CD8+ T细胞和F4/80+巨噬细胞浸润的肿瘤的代表性免疫荧光图像。标尺，50μm。图14F显示在不同处理后五天从小鼠分离的血清中的细胞因子水平。误差线代表s.e.m.(n＝4)。G1：未处理，G2：纤维蛋白，G3：IgG@CaCO3@纤维蛋白，G4：aCD47@纤维蛋白，G5：aCD47@CaCO3@纤维蛋白。统计学显著性通过双因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图15A和15B显示了CD45+细胞中F4/80+CD11b+巨噬细胞的代表性流式细胞术分析图像(15A)和相应定量(15B)。

图15C和15D显示了CD45+细胞中(15C)M2-巨噬细胞(CD206hi)和(15D)M1-巨噬细胞(CD80 hi)的百分比。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差(n＝4)。统计学显著性通过双因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005。

图16A显示了在不同处理后CD3+细胞上的CD4+Foxp3+ T细胞门控的代表性流式细胞术分析图像。

图16B显示了在不同处理后CD3+细胞上的CD4+Foxp3+ T细胞门控的相应定量。

图17A和17B显示了显示CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和F4/80+巨噬细胞浸润的肿瘤的代表性免疫荧光图像。标尺，50μm。

图18A、18B、18C、18D、18E、18F和18G显示了aCD47@CaCO3@纤维蛋白的局部处理，其诱导全身性抗肿瘤免疫应答。图18A显示了说明在不完全切除和转移的小鼠模型中aCD47@CaCO3@纤维蛋白疗法的示意图。对于aCD47@CaCO3@纤维蛋白处理，右侧的肿瘤被指定为“原发肿瘤”，而未经任何处理的左侧的肿瘤被指定为“远端肿瘤”。图18B显示了对局部aCD47@CaCO3@纤维蛋白处理响应的B16F10肿瘤的体内生物发光成像。图18C显示了在未处理的和处理的小鼠(n＝8)中左右肿瘤的生长曲线。图18D显示了在第22天的代表性小鼠照片。红色箭头表示肿瘤。图18E显示F4/80+CD11b+CD45+细胞中M1-巨噬细胞(CD80hi+)的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)(n＝4)。图18F显示了CD11c+细胞中CD103+DC的代表性流式细胞术分析图像(左)和相应定量(右)(n＝4)。图18G显示了不同组(n＝4)中肿瘤内的T细胞浸润的代表性流式细胞术分析(左)和CD8+ T细胞的百分比(右)。误差条代表平均值(s.e.m.)的标准误差。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图19显示了在未处理的和处理的小鼠的左右肿瘤中CD4+细胞的百分比。误差条指示平均值(s.e.m.)的标准误差。统计学显著性借由单因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*,P<0.05；**,P<0.01；***P<0.005。

图20A、20B、20C和20D显示了联合免疫疗法对肿瘤复发和远端肿瘤的抑制。图20A显示了不同处理后B16F10肿瘤的体内生物发光成像。实验重复三次。(图20B显示了不同组中的个体肿瘤生长动力学，图20C显示了不同组中的平均肿瘤生长动力学。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝6)。安乐死相应组的第一只小鼠时，生长曲线中断。图20C显示了不同组中小鼠的体重变化。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝6)。统计学显著性通过单因素ANOVA结合Tukey事后检验计算。P值：*P<0.05。

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因而，它们当然也可有所变化。另外应当了解，本文使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。

A.定义

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”“一种”“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。

范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每一个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每一个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于”值时，也公开了如本领域技术人员所恰当理解的介于值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每一个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

对受试者的“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行施用，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉、肌肉内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用(simultaneous administration或administered simultaneously)”意指化合物在同一时间点施用或基本上紧接着施用。在后一种情况下，该两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用化合物时获得的结果不可区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻施用点的一个或多个区域，并且不以治疗上显著的量系统地引入该药剂。例如，局部施用的药剂在局部施用点的附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。

“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受体造成显著的副作用。

“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所提到的元素，但不包括对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲液、防腐剂等。“由...组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于给予本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个所定义的实施例都在本发明的范围内。

“对照”是在实验中出于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。

“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。

药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。

“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并施用到如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人类的施用时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲液、水、乳液(诸如油/水或者水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。

“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。

“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不良生理病症，预防效应例如预防障碍或其他不良生理病症(例如，非免疫原性癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药学上可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。

组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(诸如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的所需治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年施用多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。

在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。

B.组合物

本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每一个在本文中均予以特别考虑和描述。例如，如果公开和讨论了包含化疗剂和阻断抑制剂的特定水凝胶基质，并且讨论了可以对包括化疗剂和阻断抑制剂的水凝胶基质在内的许多分子进行的许多修饰，则具体考虑的是水凝胶基质的每个和每一个组合和排列，其包含化疗剂和阻断抑制剂以及可能的修饰，除非有具体的相反指示。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子的实例，则公开了A-D，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。

癌症免疫疗法的最新成功表明，可以将其用于预防癌症复发。一方面，本文公开了免疫治疗生物响应性凝胶基质，其包括第一组分(例如，H⁺清除剂诸如，例如，纤维蛋白)和第二组分(诸如，例如，凝血酶)；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种(即所述第一组分和/或第二组分)包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种治疗剂运载体(诸如，例如，抗癌剂)、阻断抑制剂或免疫调节剂。一方面，至少一种第一纳米颗粒可以包括pH响应材料，诸如，例如，右旋糖酐、CaCO3、壳聚糖、透明质酸，及其聚合物，包括例如右旋糖酐单体的聚合物(例如间葡聚糖单体的聚合物)。

应当理解并且如本文设想，治疗剂运载体可以包括抗体、小分子、肽、多肽、肽模拟物、聚合物或核酸。例如，治疗剂运载体可以包括免疫检查点抑制剂，诸如，例如，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂(诸如，例如，纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗或阿维鲁单抗(Avelumab))；免疫调节剂，诸如，例如，任何抗体，细胞因子，趋化因子，核酸，或者抑制或促进免疫细胞活性、产生、增殖或成熟的小分子，该小分子包括但不限于NK细胞、NK T细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。一方面，免疫调节剂可以是IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-2IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CTLA-4抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体、抗CD25抗体、抗CD27抗体、抗LAG3抗体和/或抗CD47抗体；和/或一种或多种化疗剂。可用于公开的水凝胶基质中的化疗剂可以包括本领域已知的任何抗癌剂，包括但不限于阿贝西利(Abemaciclib)、醋酸阿比特龙、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、Adcetris(维布妥昔单抗)、ADE、曲妥珠单抗抗体-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、Adriamycin(盐酸多柔比星)、马来酸阿法替尼、Afinitor(依维莫司)、Akynzeo(奈妥匹坦帕洛诺司琼)、Aldara(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(阿来替尼)、阿来替尼、阿仑单抗、Alimta(培美曲塞二钠)、Aliqopa(盐酸库潘尼西)、注射用Alkeran(盐酸美法仑)、Alkeran片(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布加替尼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、Aredia(帕米膦酸二钠)、Arimidex(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、天门冬酰胺酶欧文菊(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿替利珠单抗、Avastin(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(奥英妥珠单抗)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、贝林妥欧单抗、Blincyto(贝林妥欧单抗)、硼替佐米、Bosulif(博苏替尼)、博苏替尼、维布妥昔单抗、布加替尼、BuMel、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、Cabometyx(苹果酸卡波替尼)、苹果酸卡波替尼(Cabozantinib-S-Malate)、CAF、Campath(阿伦单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶-外用)、卡铂、CARBOPLATIN-TAXOL、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、塞瑞替尼、Cerubidine(盐酸柔红霉素)、Cervarix(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡波替尼)、盐酸考潘利昔、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(放线菌素D)、Cotellic(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫卢单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉非尼、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷妥尤单抗、Darzalex(达雷妥尤单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤蛋白钠、Defitelio(去纤蛋白钠)、地加瑞克、地尼白介素、地舒单抗、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努图希单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗、Efudex(氟尿嘧啶-外用)、Elitek(拉布立海)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲泊帕乙醇胺、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(天门冬酰胺酶欧文菊)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(注射用氟尿嘧啶)、5-FU(氟尿嘧啶--外用)、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶--外用)、注射用氟尿嘧啶、氟尿嘧啶--外用、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、伊立替康、伊立替康-贝伐珠单抗、伊立替康-妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、Gardasil(重组HPV四价疫苗)、Gardasil 9(重组HPV非价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗(Gemtuzumab Ozogamicin)、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入物)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、Herceptin(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV非价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸托泊替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(哌柏西利)、替伊莫单抗(IbritumomabTiuxetan)、伊布替尼、ICE、Iclusig(盐酸普纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯(Idelalisib)、Idhifa(Enasidenib Mesylate)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(伊布替尼)、Imfinzi(度伐利尤单抗)、咪喹莫特、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab Ozogamicin)、重组干扰素Alfa-2b、白介素-2(Aldesleukin)、Intron A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗(Ipilimumab)、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、枸橼酸伊沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸芦可替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗抗体-美坦新偶联物(Ado-TrastuzumabEmtansine))、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(帕博利珠单抗)、Kisqali(瑞博西林)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼(LenvatinibMesylate)、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷替匹嘧啶)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、Methotrexate LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林(Midostaurin)、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥单抗)、纳米紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦帕洛诺司琼、Neulasta(培非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(枸橼酸伊沙佐米)、尼拉帕利甲苯磺酸一水合物(Niraparib Tosylate Monohydrate)、纳武利尤单抗、Nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗(Ofatumumab)、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗(Olaratumab)、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素)、Opdivo(纳武利尤单抗)、OPPA、奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒制剂、PAD、哌柏西利、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、奈妥匹坦帕洛诺司琼、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(Panitumumab)、帕比司他(Panobinostat)、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、盐酸培唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、培非格司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-Intron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲泊帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯嘌呤)、Purixan(巯嘌呤)、223氯化镭、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、拉布立海、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)非价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西林、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦(RolapitantHydrochloride)、罗米地辛、罗米司亭(Romiplostim)、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸芦可替尼、Rydapt(雷德帕斯)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石粉)、司妥昔单抗(Siltuximab)、Sipuleucel-T、Somatuline Depot(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石粉)、Steritalc(滑石粉)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉非尼)、Tagrisso(奥希替尼)、滑石粉、Talimogene Laherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、TarabinePFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿替利珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦罗莫司(Temsirolimus)、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、塞替派、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶--外用)、盐酸托泊替康、托瑞米芬、Torisel(坦罗莫司)、托西莫单抗和碘I131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷替匹嘧啶、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(地努图希单抗(Dinutuximab))、尿苷三乙酸酯、VAC、凡德他尼(Vandetanib)、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼、Venclexta(维奈克拉)、维奈克拉、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉(Vismodegib)、Vistogard(尿苷三乙酸酯)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸培唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(223氯化镭)、Xtandi(恩扎鲁胺)、Yervoy(伊匹单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(尼拉帕利甲苯磺酸一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、Zevalin(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(塞瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。

巨噬细胞是先天免疫的重要组成部分，能够吞噬异物，而异物在其表面上没有特定的“自我信号”蛋白，并能将其呈现给T淋巴细胞(T细胞)。但是，棘手的癌细胞会上调整合素相关蛋白(IAP)，也称为CD47，这是一种抗吞噬的“别吃我”信号，以避免巨噬细胞吞噬细胞。巨噬细胞、树突状细胞(DC)和中性粒细胞上表达的信号调节蛋白-α(SIRPα)阻断CD47及其配体之间的相互作用，激活这些吞噬细胞并促进癌细胞的吞噬作用。尽管在I期临床试验中进行了大量投资并取得了显著进展，但当前的CD47阻断策略仍存在许多局限性。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)通常限制其应用。在CD47介导的免疫治疗领域中，高度需要避免这些重度副作用的努力。一方面，本文公开了免疫治疗生物响应性凝胶基质，其包括第一组分(例如，H+清除剂诸如，例如，纤维蛋白)和第二组分(诸如，例如，凝血酶)；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中至少一种组分(即所述第一组分和/或第二组分)包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂；其中所述至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂包括抗CD47抗体。

如上所述，公开的免疫治疗生物响应性凝胶基质包括设计用于至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂延释的纳米颗粒。应当理解并如本文设想，选择免疫治疗生物响应性凝胶基质的何种组分(即第一或第二组分)包括纳米颗粒可以是与生产和储存有关而不是与任何医学效果有关的决定。因此，应理解的是，第一组分、第二组分或两种组分均可以包括纳米颗粒。

一方面，本文公开的免疫治疗生物响应性凝胶基质可以包括多于一个的纳米颗粒。例如，免疫治疗生物响应性凝胶基质可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个纳米颗粒。因此，一方面，生物响应性凝胶基质可以包括至少一种第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和/或第十纳米颗粒。进一步理解并如本文设想，第一和任何随后的纳米颗粒可以包括在第一组分、第二组分或两种组分中。一方面，第一纳米颗粒和任何随后的纳米颗粒(例如，第二纳米颗粒)包括在相同组分中。另一方面，第一纳米颗粒和任何随后的纳米颗粒(例如，第二纳米颗粒)包括在不同的组分中。例如，本文公开的是生物响应性凝胶基质，其中第一组分包括第一纳米颗粒，第二组分包括至少一种第二纳米颗粒。本文还公开了生物响应性凝胶基质，其中第一组分包括至少一种第一纳米颗粒和至少一种第二纳米颗粒。一方面，本文公开了生物响应性凝胶基质，其中第二组分包括至少一种第一纳米颗粒和至少一种第二纳米颗粒。还公开了生物响应性凝胶基质，其中第二组分包括第一纳米颗粒，并且第一组分包括至少一个随后的纳米颗粒(例如第二纳米颗粒)。

进一步理解并如本文设想，生物响应性凝胶基质的组分可以包括多于一种类型的抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。一方面，纳米颗粒可以包括多于一种类型的抗癌剂、阻断剂或免疫调节剂，以及所述抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。例如，纳米颗粒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂的任何组合。应当理解并如本文设想，由于生物响应性凝胶基质可以包括一个或多个纳米颗粒，每个纳米颗粒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂的任何组合。另外，应当理解并如本文设想，除了包括在第一和/或第二组分的任何纳米颗粒中的一种或多种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂外，免疫治疗生物响应性凝胶基质还可以包括另外的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。应当理解并如本文设想，包括在纳米颗粒内的任何另外的抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂可以包括在与在第一纳米颗粒中或任何第一纳米颗粒外部提供的任何第一抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂相同或不同的组分中。

为了促进这些功能，可以将生物响应性水凝胶工程化为聚合物。“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”涵盖所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。一方面，凝胶基质可以包括共聚物、嵌段共聚物、二嵌段共聚物和/或三嵌段共聚物。

本文所公开的三嵌段共聚物包含核心聚合物，诸如，例如，聚乙二醇(PEG)、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯)、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚己内酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、纤维素衍生物(诸如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等)。在一个方面，该核心聚合物侧翼可为多肽嵌段。

本文公开的免疫治疗生物响应性凝胶基质不仅用作高效输送治疗剂的局部药物递送贮库，而且还调节肿瘤内微环境以促进治疗的有效性。例如，第一组分中的H+清除剂(诸如，例如，纤维蛋白)可以升高微环境的pH、改变活性氧种类或调节T细胞为TH1或TH2型或调节巨噬细胞为M1型。例如，肿瘤微环境(TME)中pH的调节可以影响纳米颗粒中包括的或免疫治疗生物响应性凝胶基质中包含的任何抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂的释放速率。如本文所示，在肿瘤微环境的pH为6.5的情况下，经24小时释放50％的抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂，并且经140小时释放约80％。但是，通过将TME的pH值升高到7.4，从而更接近地反映血液的pH值，抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂显示出显著延释，在140小时时释放约20％。一方面，本文公开的是本文公开的任何生物响应性凝胶基质，其中少于80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％或10％的抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂在140小时时释放。一方面，10-50％的抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂在140小时时释放，优选地20-40％的抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂在140小时时释放。应当理解并如本文设想，释放速率在本文也可以指其反面，即滞留速率(在某个时间点滞留的量)。因此，一方面，本文公开的是本文公开的任何生物响应性凝胶基质，其中至少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％的抗癌剂、阻断抑制剂和/或免疫治疗剂在140小时时滞留。

1.抗体

(1)一般抗体

本文在广义上使用术语“抗体”，并且该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，术语“抗体”中还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及人或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段。可使用本文所述的体外测定或类似方法测试抗体所需的活性，然后根据已知的临床试验方法来测试它们的体内治疗和/或预防活性。存在以下五大类人类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些还可以分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将识别小鼠的可比类。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均匀的抗体群中获得的抗体，即，除了可能存在于抗体分子的小亚群中自然发生的突变外，群中的单个抗体是相同的。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的拮抗活性。

可使用产生单克隆抗体的任何程序制备所公开的单克隆抗体。例如，所公开的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein，自然(Nature)，256:495(1975)所描述的方法。在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物通常用免疫剂免疫以诱导产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将特异性地结合到该免疫剂上。可替换地，淋巴细胞可以在体外免疫。

单克隆抗体也可通过重组DNA方法制备。可以使用常规程序来容易地对编码所公开的单克隆抗体的DNA进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。抗体库或活性抗体片段也可以使用噬菌体展示技术生成和筛选，例如，如Burton等人的美国专利号5,804,440以及Barbas等人的美国专利号6,096,441所述。

体外方法也适用于制备单价抗体。使用本领域已知的常规技术可以消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例见1994年12月22日出版的WO 94/29348和美国专利号4,342,566中所述的那些。木瓜蛋白酶消化抗体通常产生两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段)，每一个片段都有一个抗原结合位点和一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生的片段具有两个抗原结合位点并仍然能够-交联抗原。

如本文所用，术语“抗体或其片段”包括具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等片段，这些片段包括杂合片段。因此，提供保留结合其特异性抗原能力的抗体片段。这些抗体和片段可以通过本领域已知的技术制备，并且可以根据实例中所述的方法和用于产生抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法来筛选特异性和活性(参见Harlow和Lane，Antibodies,A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988))。

在“抗体或其片段”的含义中还包括抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物。

片段，无论是否附加到其他序列，也可以包括插入、删除、替换或对特定区域或特定氨基酸残基的其他选择修饰，前提是抗体或抗体片段的活性与未经修饰的抗体或抗体片段相比没有显著的改变或损害。这些修饰可以提供一些额外的特性，如去除/添加能够二硫键合的氨基酸、增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，该抗体或抗体片段必须具有生物活性特性，如与其同源抗原的特异性结合。该抗体或抗体片段的功能或活性区域可通过对蛋白质的特定区域进行诱变，然后对表达的多肽进行表达和检测来确定。这些方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以包括编码该抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变(Zoller,M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3:348-354,1992)。

如本文所用，术语“抗体(antibody或antibodies)”也可指人类抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，来自小鼠、大鼠或兔子的抗体)在人类中是天然的抗原，因此在施用到人类时会引起不良免疫应答。因此，在这些方法中使用人类或人源化抗体有助于减少给人类施用抗体引起不良免疫应答的可能性。

(2)人类抗体

所公开的人类抗体可以使用任何技术制备。所公开的人类抗体也可以从转基因动物中获得。例如，已经描述了能够在免疫反应中产生全套人类抗体的转基因突变小鼠(参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551-255(1993)；Jakobovits等人，《自然》，362:255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.，7:33(1993))。具体地说，在这些嵌合和生殖系突变小鼠中，抗体重链连接区(J(H))基因-的纯合缺失导致内源性抗体产生完全抑制，而将人类生殖系抗体基因-阵列成功地转移到这些生殖系突变小鼠中-则导致在抗原攻击时产生人类抗体。如本文所述，使用Env-CD4共受体复合物选择具有所需的活性的抗体。

(3)人源化抗体

抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。据此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段，诸如sFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合部分)，其包含来自整合到人类(受体)抗体框架中的非人类(供体)抗体的抗原结合位点的一部分。

为了产生人源化抗体，来自受体(人类)抗体分子的一个或多个互补决定区(CDR)的残基被来自已知具有所需的抗原结合特性(例如，对目标抗原有一定的特异性和亲和力)的供体(非-人类)抗体分子的一个或多个CDR的残基取代。在一些情况下，人类抗体的Fv框架(FR)残基被相应的非-人类残基取代。人源化抗体也可能含有既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体具有从非-人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。实际上，人源化抗体通常是人类抗体，其中一些CDR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代，且一些FR残基可能被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。人源化抗体通常含有抗体恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类抗体恒定区(Jones等人，《自然》，321:522-525(1986)，Reichmann等人，《自然》，332:323-327(1988)，以及Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2:593-596(1992))。

非-人类抗体的人源化方法在本领域中是众所周知的。例如，可根据Winter和同事-的方法(Jones等人，《自然》，321:522-525(1986)，Riechmann等人，《自然》，332:323-327(1988)，Verhoeyen等人，《科学》(Science)，239:1534-1536(1988))通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人类抗体的相应序列来生成人源化抗体。可用于产生人源化抗体的方法也描述于美国专利号4,816,567(Cabilly等人)、美国专利号5,565,332(Hoogenboom等人)、美国专利号5,721,367(Kay等人)、美国专利号5,837,243(Deo等人)、美国专利号5,939,598(Kucherlapati等人)、美国专利号6,130,364(Jakobovits等人)以及美国专利号6,180,377(Morgan等人)中。

(4)抗体的施用

这些抗体的施用可以如本文所公开的那样进行。还存在用于抗体递送的核酸方法。广泛中和的抗体和抗体片段也可作为编码抗体或抗体片段的核酸制剂(例如DNA或RNA)施用到患者或受试者，使患者或受试者自身的细胞吸收核酸并产生和分泌编码的抗体或抗体片段。例如，如本文所公开的，核酸的递送可以通过任何方式。

2.药物载体/药品的递送

如上所述，这些组合物也可以药学上可接受的载体施用到体内。“药学上可接受”意指非生物学上或其他方面不良的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用到受试者，不会造成任何不良生物效应或以有害方式与含其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知，该载体将自然地被选择，以最小化该活性成分的任何降解，并最小化该受试者中的任何不利副作用。

可经口服、肠外(例如静脉)、肌肉注射、腹腔注射、经皮、体外、局部等方式施用组合物，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过一个或两个鼻孔将该组合物递送至鼻腔和鼻腔通道，且可包括通过喷雾机制或液滴机制递送，或通过核酸或载体的雾化递送。通过吸入剂的组合物的施用是经鼻腔或口腔、通过喷雾或液滴机制递送。通过插管，递送也可以直接到达呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切数量因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄、体重和一般情况、所治疗过敏性障碍的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切数量。然而，适当的量可以由本领域的普通技术人员通过仅使用本文给出教导的常规实验来确定。

该组合物的肠外施用(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适合在注射前于液体中溶解悬浮液的固体形式，或者是乳剂。最近修订的肠外施用方法包括使用缓释或缓释系统，以保持恒定剂量。参见，例如，美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Senter等人，Bioconjugate Chem.，2:447-451，(1991)；Bagshawe、K.D.，Br.J.Cancer，60:275-281，(1989)；Bagshawe等人，Br.J.Cancer，58:700-703，(1988)；Senter等人，Bioconjugate Chem.，4:3-9，(1993)；Battelli等人，CancerImmunol.Immunother.,35:421-425,(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992)；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等载体。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Hughes等人，Cancer Research,49:6214-6220,(1989)；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta,1104:179-187,(1992))。一般来说，受体参与内吞作用的通路，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化通路具有多种功能，如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节等。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价态和配体浓度，许多受体遵循不止一个细胞内通路。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and CellBiology 10:6，399-409(1991))。

a)药学上可接受的载体

组合物包括抗体，可在治疗上与药学上可接受的载体结合使用。

合适的载体及其制剂在以下文献中有所描述：Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第19版)，A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA1995。通常，在该制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使该制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该溶液的pH值优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。载体还包括缓释制剂，诸如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透膜基质，其基质为成型制品的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，某些载体可能更可取，例如取决于施用途径和所施用的组合物的浓度。

本领域技术人员已知药物载体。这些通常是给人类施用药物的标准载体，包括无菌水、生理盐水和生理pH下的缓冲液等溶液。这些组合物可以肌肉注射或皮下注射。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

除了所选择的分子，药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。

根据是否需要局部或全身治疗以及治疗区域的不同，药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或肠外，例如静脉滴注、皮下、腹腔或肌肉注射。所公开的抗体可经静脉、腹腔、肌肉、皮下、腔内或经皮施用。

用于肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

局部施用制剂可包括软膏、乳液、面霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。传统的药物载体、水、粉末或油性碱、增稠剂等可能是必要的或可取的。

免疫治疗生物响应性凝胶基质的第一组分和第二组分可以在施用前混合以同时施用，或保持分开以分开施用，包括分开外部施用(例如两次单独喷雾)，或者并行施用时混合(例如，单一涂药器在进行涂药时将各个组分混合，或者允许同时或并行涂药)。

口服施用组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。

一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐给予，并通过无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应形成，或无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如一、二、三烷基和芳基胺及取代乙醇胺)反应形成。

b)治疗用途

可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。组合物的施用剂量范围应足够大，以产生所需的效果，从而影响障碍的症状。剂量不应太大以致引起不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以通过本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。例如，在抗体治疗用途的文献中可以找到选择适当剂量抗体的指南，例如，Handbookof Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编，NogesPublications,Park Ridge,N.J.,(1985)第22章和第303-357页；Smith等人，Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编，Raven Press,New York(1977)第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能在每天约1μg/kg至100mg/kg体重或以上的范围内。

C.治疗癌症的方法

在一个方面中，应当理解，本文所公开的治疗剂递送载体旨在施用给受试者以治疗、预防、抑制或减少癌症或转移，或治疗、预防、抑制或减少手术切除(即，切除)之后的复发或转移。因此，本文公开了治疗、抑制和/或预防癌症肿瘤的手术切除部位的肿瘤增殖和/或转移的方法，其包括向受试者的切除部位施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。因此，一方面，本文公开了治疗、抑制和/或预防癌症肿瘤的手术切除部位的肿瘤增殖和/或转移的方法，包括向受试者的切除部位向受试者施用本文公开的任何免疫治疗生物响应性凝胶基质。

如本文所述，所公开的免疫治疗生物响应性凝胶基质可以用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症。所公开的组合物可用于治疗的代表性但不限于以下的癌症列表：白血病(包括但不限于急性髓细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL))，淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；蕈样肉芽肿；霍奇金病；白血病，包括但不限于髓细胞白血病；浆细胞瘤；组织细胞瘤；膀胱癌；脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮癌、肾癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞癌、咽喉鳞癌、喉癌和肺鳞癌；结肠癌；宫颈癌；子宫颈癌；乳腺癌；上皮癌；肾癌、泌尿生殖道癌；肺癌；食管癌；头颈癌；大肠癌；造血癌；睾丸癌；结直肠癌；前列腺癌；艾滋病相关淋巴瘤或肉瘤、转移癌或者一般癌症；或者胰腺癌。

因此，一方面，本文公开了用于受试者的以下方法：治疗、减少、抑制或预防癌症(包括但不限于急性髓细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、黑色素瘤、肾细胞癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)；癌症增殖(包括但不限于急性粒细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、黑色素瘤、肾细胞癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)；癌症转移(包括但不限于急性粒细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(Mm)、黑色素瘤、肾细胞癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)；和/或在肿瘤手术修复后治疗、减少、抑制或预防癌症的复发、增殖或转移(包括但不限于急性髓细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、黑色素瘤、肾细胞癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)，包括向癌症患者施用本文公开的免疫治疗生物响应性凝胶基质。因此，在一个方面，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症；癌症的增殖；和/或治疗、减少、抑制或预防在手术切除肿瘤之后癌症的复发、增殖或转移的方法，其包含向受试者施用包含本文所公开的任何生物响应水凝胶基质(包括，例如，包含抗CD47抗体的生物响应性水凝胶基质)的组合物。

如上所述，在公开的治疗、抑制和/或预防癌症手术切除部位的肿瘤增殖和/或转移的方法中使用的免疫治疗生物响应性凝胶基质包括治疗剂运载体诸如，例如，抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。例如，治疗剂运载体可以包括免疫检查点抑制剂，诸如，例如，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂(诸如，例如，纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗或阿维鲁单抗(Avelumab))；免疫调节剂，诸如，例如，任何抗体，细胞因子，趋化因子，核酸，或者抑制或促进免疫细胞活性、产生、增殖或成熟的小分子，该小分子包括但不限于NK细胞、NK T细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。一方面，免疫调节剂可以是IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-2IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CTLA-4抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体、抗CD25抗体、抗CD27抗体、抗LAG3抗体和/或抗CD47抗体。

一方面，在公开的治疗受试者癌症的方法中使用的生物响应性凝胶基质包括抗癌剂。在公开的方法中使用的抗癌剂可以包括本领域已知的任何化疗剂，包括但不限于阿贝西利(Abemaciclib)、醋酸阿比特龙、Abitrexate(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、Adcetris(维布妥昔单抗)、ADE、曲妥珠单抗抗体-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、Adriamycin(盐酸多柔比星)、马来酸阿法替尼、Afinitor(依维莫司)、Akynzeo(奈妥匹坦帕洛诺司琼)、Aldara(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(阿来替尼)、阿来替尼、阿仑单抗、Alimta(培美曲塞二钠)、Aliqopa(盐酸库潘尼西)、注射用Alkeran(盐酸美法仑)、Alkeran片(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布加替尼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、Aredia(帕米膦酸二钠)、Arimidex(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、天门冬酰胺酶欧文菊(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿替利珠单抗、Avastin(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(奥英妥珠单抗)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、贝林妥欧单抗、Blincyto(贝林妥欧单抗)、硼替佐米、Bosulif(博苏替尼)、博苏替尼、维布妥昔单抗、布加替尼、BuMel、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、Cabometyx(苹果酸卡波替尼)、苹果酸卡波替尼(Cabozantinib-S-Malate)、CAF、Campath(阿伦单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Carac(氟尿嘧啶-外用)、卡铂、CARBOPLATIN-TAXOL、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、Casodex(比卡鲁胺)、CEM、塞瑞替尼、Cerubidine(盐酸柔红霉素)、Cervarix(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(Clofarabine)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡波替尼)、盐酸考潘利昔、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(放线菌素D)、Cotellic(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫卢单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉非尼、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷妥尤单抗、Darzalex(达雷妥尤单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤蛋白钠、Defitelio(去纤蛋白钠)、地加瑞克、地尼白介素、地舒单抗、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地努图希单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗、Efudex(氟尿嘧啶-外用)、Elitek(拉布立海)、Ellence(盐酸表柔比星)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、Eloxatin(奥沙利铂)、艾曲泊帕乙醇胺、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(埃罗妥珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(天门冬酰胺酶欧文菊)、Ethyol(氨磷汀)、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(注射用氟尿嘧啶)、5-FU(氟尿嘧啶--外用)、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶--外用)、注射用氟尿嘧啶、氟尿嘧啶--外用、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、伊立替康、伊立替康-贝伐珠单抗、伊立替康-妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、Gardasil(重组HPV四价疫苗)、Gardasil 9(重组HPV非价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗(Gemtuzumab Ozogamicin)、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入物)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、Herceptin(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV非价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸托泊替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、Ibrance(哌柏西利)、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、伊布替尼、ICE、Iclusig(盐酸普纳替尼)、Idamycin(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯(Idelalisib)、Idhifa(Enasidenib Mesylate)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(伊布替尼)、Imfinzi(度伐利尤单抗)、咪喹莫特、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、奥英妥珠单抗(InotuzumabOzogamicin)、重组干扰素Alfa-2b、白介素-2(Aldesleukin)、Intron A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗(Ipilimumab)、Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、枸橼酸伊沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸芦可替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗抗体-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine))、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(帕博利珠单抗)、Kisqali(瑞博西林)、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷替匹嘧啶)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot-Ped(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、Methotrexate LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林(Midostaurin)、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素C)、Myleran(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥单抗)、纳米紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、Navelbine(酒石酸长春瑞滨)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦帕洛诺司琼、Neulasta(培非格司亭)、Neupogen(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(枸橼酸伊沙佐米)、尼拉帕利甲苯磺酸一水合物(Niraparib Tosylate Monohydrate)、纳武利尤单抗、Nolvadex(枸橼酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗(Ofatumumab)、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗(Olaratumab)、高三尖杉酯碱、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素)、Opdivo(纳武利尤单抗)、OPPA、奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定型纳米颗粒制剂、PAD、哌柏西利、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、奈妥匹坦帕洛诺司琼、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(Panitumumab)、帕比司他(Panobinostat)、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、盐酸培唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、培非格司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-Intron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(耐昔妥珠单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲泊帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯嘌呤)、Purixan(巯嘌呤)、223氯化镭、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、拉布立海、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)非价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、瑞博西林、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、,盐酸罗拉匹坦(RolapitantHydrochloride)、罗米地辛、罗米司亭(Romiplostim)、Rubidomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、磷酸芦可替尼、Rydapt(雷德帕斯)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石粉)、司妥昔单抗(Siltuximab)、Sipuleucel-T、Somatuline Depot(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石粉)、Steritalc(滑石粉)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、Sutent(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉非尼)、Tagrisso(奥希替尼)、滑石粉、Talimogene Laherparepvec、枸橼酸他莫昔芬、TarabinePFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Tecentriq(阿替利珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦罗莫司(Temsirolimus)、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、塞替派、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶--外用)、盐酸托泊替康、托瑞米芬、Torisel(坦罗莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷替匹嘧啶、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(地努图希单抗(Dinutuximab))、尿苷三乙酸酯、VAC、凡德他尼(Vandetanib)、VAMP、Varubi(盐酸罗拉吡坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼、Venclexta(维奈克拉)、维奈克拉、Verzenio(阿贝西利)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉(Vismodegib)、Vistogard(尿苷三乙酸酯)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸培唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(223氯化镭)、Xtandi(恩扎鲁胺)、Yervoy(伊匹单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(尼拉帕利甲苯磺酸一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、Zevalin(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(塞瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。

应当理解并如本文设想，水凝胶基质可被设计成对肿瘤的微环境具有生物响应性，并在暴露于微环境内的因素(例如活性氧或pH)时释放抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。可以将基质设计用于改变TIME的pH，以调节抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂的释放速率。例如，生物响应性基质可以包括H+清除剂诸如，例如，纤维蛋白，其将升高微环境的pH并导致延释。一方面，本文设想了可将生物响应性凝胶基质设计成释放抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂进入肿瘤微环境至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85或90天。

“治疗(Treat、treating或treatment)”及其在本文中使用的语法变体包括组合物的施用，其目的在于部分或完全预防、延迟、治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善、稳定、减缓和/或降低强度或一种或多种疾病或病症的频率，一种疾病或病症的症状，或一种疾病或病症的根本原因。根据本发明所述的治疗可防范性、预防性、姑息性或补救性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后施用到受试者。预防性施用可在感染症状出现之前一天或数天至数年发生。

一方面，公开的包括向受试者施用本文公开的任何治疗剂递送溶媒或药物组合物的治疗、预防、抑制或减少癌症或转移或者用于在手术消除(即切除)后治疗、预防、抑制或减少复发或转移的方法，可以包括以适合于治疗受试者中特定癌症的任何频率施用治疗剂递送溶媒或药物组合物。例如，治疗剂递送载体或药物组合物至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给患者。在一个方面中，治疗剂递送载体或药物组合物每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。

应当理解并如本文设想，当与免疫治疗生物响应性凝胶基质接触放置时，第一组分和第二组分可以在施用前混合以形成凝胶基质并同时施用或分开施用并允许在该施用部位形成凝胶基质。因此，本文设想了免疫治疗生物响应性凝胶基质的第一和第二组分可以分开保持且并行或顺序施用。例如，第一组分可以在第二组分之前至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时施用至受试者的肿瘤部位。类似地，第一组分可以在第二组分之后至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟，1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时施用至受试者的肿瘤部位。

应当理解并如本文设想，通过在切除之前施用免疫治疗生物响应性凝胶基质可以实现预防肿瘤的转移或切除后增殖的益处。因此，一方面，本文公开了治疗、预防、抑制或减少癌症或转移的方法，或用于治疗、预防、抑制或减少手术消除(即切除)后的复发或转移的方法，其中在去除肿瘤之前将第一和第二组分中的至少一种施用于切除部位。

肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)通常占肿瘤浸润免疫细胞的很大一部分。TAM分化为多种功能性表型，分别表示为经典激活(也称为M1型表型)巨噬细胞和替代性激活(也称为M2型表型)巨噬细胞。M1型TAM过量表达抗原呈递所必需的主要组织相容性复合物I类和II类分子，这在抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用。相反，M2型TAM发挥促癌作用。进行性肿瘤通常响应于不同的肿瘤决定因素，尤其是低pH值而执行M2型TAM激活。M2极化的TAM在肿瘤中的浸润通常与临床结局差有关，因为它通常促进肿瘤的侵袭和迁移以及血管生成，并抑制T细胞应答。因此，特定TME中TAM的M2极化似乎是癌症治疗的关键不良预后因素。

本文中，将喷雾式生物响应性免疫治疗纤维蛋白凝胶工程化为抑制手术后的肿瘤复发和转移。纤维蛋白凝胶是获FDA批准的材料，通过纤维蛋白原和凝血酶相互作用形成。用抗CD47抗体(aCD47@CaCO₃)预包封的包含CaCO₃纳米颗粒(NP)的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液在手术后迅速喷涂在肿瘤切除部位，并立即形成原位免疫治疗纤维蛋白凝胶(图1a)。预期CaCO₃ NP在酸性炎症和肿瘤微环境(TME)中逐渐溶解并随后释放被包封的aCD47，其通常通过影响免疫细胞功能(包括TAM极化、T细胞增殖和细胞因子产生)发挥免疫抑制作用。假设CaCO₃ NP可以减轻酸性环境的不良影响，诸如促进M1型TAM的激活。

同时，释放的抗CD47抗体可以阻断CD47和SIRPα之间的相互作用，增加癌细胞的巨噬细胞吞噬作用和肿瘤抗原呈递至T细胞，从而激活适应性免疫应答。结果表明，临床批准的含有aCD47@CaCO₃ NP的纤维蛋白凝胶可有效预防肿瘤复发并抑制术后转移。

本文还公开了在肿瘤切除后增加或调节对肿瘤的先天性或适应性免疫应答的方法，其包括向患有肿瘤的受试者施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。例如，本文公开了调节先天免疫应答以使巨噬细胞符合M1型的方法，包括施用公开的免疫治疗生物响应剂。

应当理解并如本文设想，尽管局部施用，但是公开的生物响应性凝胶仍可以具有全身作用。因此，一方面，本文公开了治疗、减少、抑制和/或预防受试者的癌症的方法，其中免疫治疗生物响应性凝胶基质的施用全身性地增加受试者的抗肿瘤应答并减缓肿瘤增殖。

一方面，本文公开的向受试者施用以供公开的方法中使用的治疗剂或药物组合物的量可包括医师所确定的适于治疗受试者的特定癌症的任何量。例如，治疗剂递送载体或药物组合物的量可为约10mg/kg至约100mg/kg。例如，施用的治疗剂递送载体或药物组合物的量可为至少10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg。因此，在一个方面中，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，其中施用的治疗剂递送载体或药物组合物的剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。

D.实例

提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范而非旨在限制公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

1.实例1

a)结果

(1)通过快速喷雾形成含有aCD47@CaCO₃ NP的纤维蛋白凝胶

通过添加Ca²⁺和CO₃ ^2-，在含聚(乙二醇)-b-聚(谷氨酸)(PEG-b-P(Glu))嵌段共聚物的溶液中沉淀出载量为5％，包封率为50％的aCD47@CaCO₃NP。获得了直径约100nm的单分散aCD47@CaCO₃ NP，其大小由PEG-b-P(Glu)通过羧基和Ca2+之间的相互作用控制，并带有PEG壳以消除进一步的聚集和团聚(图1b、1c和1d)。元素映射图像(图1c)表明aCD47(钆螯合)在这些CaCO₃ NP中的均匀分布。

通过同时喷雾和混合等体积的含有纤维蛋白原与aCD47@CaCO₃ NP或凝血酶的溶液，可以快速形成纤维蛋白凝胶，这已通过流变学检测得到验证(图2A、图2B和图2C)。与CaCO₃ NP相关的溶液中的Ca²⁺可以促进纤维蛋白凝胶的形成。两种溶液的混合物导致弹性模量(G')快速增加。通过冷冻扫描电子显微镜(Cryo-SEM)成像观察到含有aCD47@CaCO₃ NP的纤维蛋白凝胶的形态(图1e和图1f)。为了进一步证实aCD47@CaCO₃NP在水凝胶中的分布，使用荧光素(FITC)标记的纤维蛋白原和Cy5.5标记的CaCO₃ NP形成水凝胶。然后，冷冻切片经偶联罗丹明的驴抗大鼠IgG抗体染色以示踪aCD47。如共聚焦成像所示，来自CaCO₃的Cy5.5信号显示出均匀的分布模式，与aCD47共定位，进一步表明aCD47包封在CaCO₃NP中(图1g)。Cy5.5标记的纤维蛋白凝胶的生物降解行为通过体内荧光成像系统监测。喷雾后三周，无法检出来自凝胶的荧光信号，表明凝胶已完全降解。

通过将CaCO₃ NP与酸性缓冲液中的H⁺反应，可以溶解并释放包封的aCD47。同时，作为质子清除剂，CaCO₃ NP还可以升高酸性溶液的pH值(图3和图4)。Cy5.5标记的纤维蛋白凝胶的生物降解行为通过体内荧光成像系统监测。喷雾后三周，无法检出来自凝胶的荧光信号，表明凝胶已完全降解。

CaCO₃ NP通过与酸性缓冲液中的H⁺反应溶解并释放包封的aCD47(图3A、图3B和图4)。同时，作为质子清除剂，CaCO₃ Np升高酸性溶液的pH值(图5)。aCD47@CaCO₃ NP包封在水凝胶中允许aCD47逐渐释放(图1h)。为了评价体内释放行为，将aCD47分散在磷酸盐缓冲液(PBS)中，包封在CaCO₃ NP或CaCO₃@纤维蛋白凝胶中，然后注射或喷雾在肿瘤切除腔内。Cy5.5标记的aCD47信号通过体内成像系统(IVIS)进行监测和定量(图1i、图1j和图6)。尽管在切除部位无法检出溶液中注射的抗体的80％信号，但仍可检出79％的从CaCO₃@纤维蛋白凝胶释放的aCD47。残留肿瘤切片的共聚焦成像进一步证实了aCD47缓释，其中观察到与抗体相关的明显荧光信号远离NP信号，表明CaCO₃ NP降解并从NP缓释抗体。尽管与游离运载体相比，从凝胶纳米颗粒储库中缓释治疗剂是有利的，但是该应用所需的释放动力学需要进一步优化以最大化治疗效果并最小化毒性。

(2)CaCO₃ NP和aCD47诱导的免疫应答

缺氧TME中癌细胞的糖酵解代谢导致乳酸和H+(pH＝6.5-6.8)的产生，调节肿瘤内免疫细胞的作用和功能。此外，在炎症和组织损伤部位也发现局部酸化(pH＝6.0-7.0)。考虑到CaCO₃消除残留TME和炎症环境中H⁺的能力，在CaCO₃@纤维蛋白凝胶处理后检查总体免疫效应。CaCO₃@纤维蛋白处理后，发现M2-TAM(CD206^hiCD11b⁺F4/80⁺)显著减少，而M1-TAM(CD80^hiCD11b⁺F4/80⁺)增加，这表明TAM极化促进抑制M1表型的肿瘤(图7a和图7b)。通过TME中细胞因子的水平变化进一步证实TAM的这种极化(图7c)。观察到的巨噬细胞向M1表型的极化可归因于TME的酸度的调节，其通常有利于M2样巨噬细胞极化。与促进M1样巨噬细胞极化的小分子相比，炎症性肿瘤切除内CaCO₃对H⁺的清除提供了更简单的方法。通过流式细胞术评估，CaCO₃ NP浓度与巨噬细胞极化之间存在相关性。在CaCO₃@纤维蛋白治疗后，还观察到TME中髓样抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)减少以及HIF1-a表达减少(图7d、图7e、图7f和图7g；图8)。明显地，CaCO₃@纤维蛋白治疗导致肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，CD3⁺)增加，特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL，CD3⁺CD8⁺)增加(图7i)，以及血浆中干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)增加(图7h)。同时，在免疫细胞和癌细胞上的程序性死亡1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)的表达分别保持几乎不变或略有下降(图9A和图9B)。

共聚焦成像和流式细胞术分析结果表明，CD47阻断可增加巨噬细胞在体外对癌细胞的吞噬作用(图3a、图3b、图11a和图11b)。当将aCD47负载到纤维蛋白凝胶(aCD47:50μg，每只小鼠)并在肿瘤切除部位喷涂时，观察到切除肿瘤腔内Ly6C^hiLy6G^-巨噬细胞的频率增加，但未观察到Ly6G⁺Ly6C^dim中性粒细胞(图3c、图3d和图12)。还记录了CD11c⁺Dc的增加，这些细胞显示表达CD80、CD86和CD103，表明它们为成熟状态(图3e和图3f)。因此，CD47阻断增强巨噬细胞和DC吞噬癌细胞，激活先天免疫系统。

(3)aCD47@CaCO₃@纤维蛋白疗法抑制肿瘤复发

为了验证aCD47@CaCO₃@纤维蛋白对手术后残余微瘤的治疗效果，在B16F10小鼠模型中建立了不完全切除的肿瘤，以模拟手术后的肿瘤复发。在切除部位喷涂含有IgG@CaCO₃或aCD47或aCD47@CaCO₃(aCD47:50μg，每只小鼠)的原位形成的纤维蛋白。通过来自B16F10细胞的生物发光信号监测肿瘤复发(图13a)。经aCD47@CaCO₃@纤维蛋白处理的组中的小鼠显示出最小复发肿瘤大小，该组中八分之四的小鼠未显示出可检出的肿瘤(图13b和图13c)。相反，用IgG@CaCO₃@纤维蛋白或aCD47@纤维蛋白处理的小鼠显示出适度延迟的肿瘤生长，并且仅六分之一的小鼠没有肿瘤复发。与未治处理的对照组相比，温和的纤维蛋白凝胶的治疗效果可忽略(图13b和图13c)。监测与肿瘤大小相关的小鼠存活。百分之五十经aCD47@CaCO₃@纤维蛋白处理的小鼠在60天的观察期内存活。相比之下，两个月后，所有对照组中仅有两只小鼠存活(图13d)。经不同处理后，小鼠的体重未受到明显的影响(图13e)。此外，对aCD47@CaCO₃@纤维蛋白处理后30天从小鼠采集的主要器官的组织学分析，以及在处理后1、7和14天进行的全血板检测和血清生化测定表明，aCD47局部递送未对小鼠产生明显的副作用。

为了剖析免疫细胞之间的变化，在手术后五天采集复发肿瘤并通过流式细胞术和免疫荧光染色进行分析。先天性和适应性免疫系统均集中在巨噬细胞和TIL上。残留肿瘤中巨噬细胞的比例在aCD47阻断后增加，并且在CaCO₃处理后M1表型TAM的极化增加(图14a；图15a、图15b、图15c和图15d)。类似地，aCD47@CaCO₃@纤维蛋白处理后，残留肿瘤中TIL(CD3+细胞)的绝对数量也增加(图14b)。此外，与所有其他对照相比，aCD47@CaCO₃@纤维蛋白处理后肿瘤中的CD8+ T细胞百分比显著增加(图14b-c)。与未处理或空白纤维蛋白处理的对照相比，CD4+ T细胞的增殖也增加，而调节性T细胞(CD4+Foxp3+ T细胞)的百分比降低(图14d、图16a和图16b)。免疫荧光染色目视显示在aCD47@CaCO₃@纤维蛋白疗法后残留肿瘤中巨噬细胞和CD8+ T细胞显著增加(图14e、图17a和图17b)。细胞因子的分泌是免疫应答过程中的重要指标，进一步证实aCD47@CaCO₃@纤维蛋白诱导的有效先天性和适应性免疫应答(图14f)。

(4)aCD47@CaCO₃@纤维蛋白疗法治疗远端肿瘤

在确认aCD47@CaCO₃@纤维蛋白可以激活残留肿瘤中的先天性和适应性免疫细胞后，寻求研究aCD47@CaCO₃@纤维蛋白的局部处理是否可以引发全身性免疫应答。将B16F10癌细胞接种在每只小鼠的原发肿瘤的相对侧上，以模拟转移性肿瘤。然后部分切除原发肿瘤，并在肿瘤切除部位喷涂含有aCD47@CaCO₃ NP的纤维蛋白凝胶(图18a)。通过IVIS成像系统根据来自B16F10细胞的生物发光信号监测肿瘤负荷。发现通过aCD47@CaCO₃@纤维蛋白处理有效抑制局部肿瘤复发，并且在没有任何额外处理的情况下，相对侧的远端肿瘤也显示出缓慢生长速率(图18b、图18c和图18d)。与这些结果一致，在经aCD47@CaCO₃@纤维蛋白喷涂的肿瘤中，M1样TAM和CD103⁺DC的数量显著增加(图18e和图18f)，而在经处理的肿瘤和远端肿瘤中，CD8⁺ T细胞均增加(图18g和图19)。远端肿瘤中CD8⁺ T细胞的增加可归因于引发全身性抗肿瘤免疫力的巨噬细胞和DC局部交叉呈递肿瘤抗原。通过双注射器施用方法通过肿瘤周围注射aCD47@CaCO₃@纤维蛋白进一步证实免疫系统的激活。aCD47@CaCO₃@纤维蛋白介导的处理有效地抑制了局部和远端肿瘤的生长。

还评估了通过喷雾凝胶共递送的抗PD-1(aPD1)和aCD47的联合疗效。类似地，部分切除原发肿瘤，并用含有aCD47@CaCO₃ NP(aCD47：50μg，每只小鼠)、aPD1@CaCO₃ NP(aPD1：50μg，每只小鼠)或aCD47&aPD1@CaCO₃ NP(aCD47：25μg，每只小鼠，aPD1：25μg，每只小鼠)的纤维蛋白凝胶喷涂手术部位。令人鼓舞的是，aCD47&aPD1@CaCO₃@纤维蛋白处理在抑制肿瘤复发和转移方面具有协同作用，如生物发光成像以及生长和分布图所示(图20A、图20B和图20C)。

b)结论

总之，在肿瘤切除部位喷涂免疫治疗纤维蛋白可以逆转免疫抑制性TME并诱导全身性抗肿瘤免疫应答，以防止局部癌症复发并抑制已有转移。CaCO₃ NP可以通过生物响应方式消除H+来调节与残留TME和炎症环境相关的酸性肿瘤切除环境，从而有效地促进抗肿瘤免疫应答。连同此反应，从CaCO₃ NP释放的aCD47可以阻断癌细胞上调的“别吃我”信号，从而允许巨噬细胞去除程序性癌细胞。由于巨噬细胞和DC增强了肿瘤特异性抗原的表达，CD47的阻断也可能导致T细胞介导的癌细胞破坏。

c)材料和方法

(1)材料、细胞系和动物。

所有化学品均未经纯化直接购自Sigma-Aldrich。小鼠凝血酶和纤维蛋白原购自Molecular Innovations。抗CD47抗体(aCD47)购自Biolegend Inc(货号127518，克隆：miap301)。小鼠黑色素瘤(B16F10)细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。B16F10-luc细胞获自UNC的Leaf Huang博士。在37℃下，在5％CO₂气氛恒温箱(Thermo Scientific)中将细胞保存在含有10％胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)和100U/mL青霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco,Invitrogen)中。雌性C57BL/6小鼠(6-10周)购自Jackson Lab。所有小鼠研究均按照北卡罗来纳大学教堂山分校和北卡罗来纳州立大学的机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

(2)aCD47@CaCO₃的制备和表征。

通过化学沉淀制备aCD47@CaCO₃ NP。通常，首先将1ml包含100mM CaCl₂的Tris-HCl缓冲液(1mM，pH 7.6)与1ml HEPES盐缓冲液(50mM，pH 7.1，NaCl 140mM)混合，该缓冲液包含100μg aCD47、合成的10mg PEG-b-P(Glu)嵌段共聚物和10mM NaCO₃。然后，将混合物在4℃下搅拌过夜。通过以14 800rpm离心10分钟除去多余的离子、共聚物和抗体。通过DLS评估尺寸分布，并通过TEM(JEOL 2000FX)测量形态。使用分析型TEM(Titan)对aCD47@CaCO₃(aCD47经钆螯合)进行元素分析。通过ELISA(大鼠IgG总ELISA试剂盒，eBioscience，货号88-50490-22)测量包封在CaCO₃中的aCD47的量。CaCO₃ NP的负载量(LC)和包封效率(EE)通过下式计算：LC＝(A-B)/C和EE＝(A-B)/A，式中A是预期的抗体包封量，B是游离的未包封抗体，C是颗粒的总重量。

(3)aCD47@CaCO₃@纤维蛋白的形成和表征。

通过喷雾等体积的含有aCD47@CaCO₃和凝血酶(5NIH U/mL)的纤维蛋白原(10mg/ml)，获得纤维蛋白凝胶。用Cryo-SEM(带有Gatan Alto的JEOL 7600F)表征aCD47@CaCO₃@纤维蛋白的形态。用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)进一步表征aCD47@CaCO₃在纤维蛋白中的包封。

(4)aCD47的体外释放。

在37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在不同pH值(pH 6.5和7.4)下研究了aCD47的释放行为。通过大鼠IgG总ELISA试剂盒测量释放的aCD47。

(5)aCD47的体内释放。

为了研究aCD47的体内释放行为，在肿瘤切除部位注射Cy5.5标记的游离aCD47或分散在PBS中的aCD47@CaCO₃。此外，在手术后在肿瘤部位喷涂等体积的含有aCD47@CaCO₃和凝血酶(5NIH U/mL)的纤维蛋白原溶液(10mg/ml)。通过IVIS Spectrum系统(PerkinElmer)监测荧光成像。

(6)体外吞噬作用测定。

用CellTracker Green(C7025,Thermo-Fisher Scientific)标记骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)，并用CellTracker DeepRed(C34565,Thermo-Fisher Scientific,USA)标记癌细胞。将巨噬细胞(1×105)与用IgG或aCD47预封闭的癌细胞(4×105)在无血清培养基中共培养。在37℃下孵育2小时后，通过共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)和CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)研究吞噬作用。

(7)体内肿瘤模型和处理。

为了研究对肿瘤复发的疗效，将1×106fLuc-B16F10移植到小鼠右腋下10天后，将小鼠随机分为五组(n＝6-8)，并切除肿瘤，在模拟术后残留的微肿瘤后留下

的残留肿瘤组织。简单地说，将动物在诱导室中用异氟烷麻醉(高达5％用于诱导；1-3％用于维持)，并通过鼻锥维持麻醉。切除肿瘤区域并进行无菌准备。使用无菌器械去除约99％的肿瘤。手术后立即在手术床上喷洒不同剂量的纤维蛋白凝胶，包括纤维蛋白、IgG@CaCO₃@纤维蛋白、aCD47@纤维蛋白和aCD47@CaCO₃@纤维蛋白。然后，将伤口用自动伤口夹闭系统闭合。

对于转移性肿瘤模型，在1×106fLuc-B16F10移植到小鼠的右腋下7天后，将第二个肿瘤作为转移性肿瘤(1×106fLuc-B16F10)接种到每只小鼠的左腋下。三天后，将其原发肿瘤切除，留下～1％的残留肿瘤组织，以模拟上述手术后的残留微肿瘤。类似地，在手术后将相同剂量的aCD47@CaCO₃@纤维蛋白喷在手术床上。

用卡尺测量肿瘤大小，并根据下式计算：宽度2×长度×0.5。还通过生物发光成像监测肿瘤。将DPBS(15mg/mL)中的d-荧光素(Thermo Scientific^TM Pierce^TM)腹腔注射至小鼠(10μL/g体重)后10min，通过IVIS Spectrum成像系统(Perkin Elmer Ltd)对小鼠成像5min。使用Living Image软件将目标区域定量为平均辐射度(光子s-1cm-2sr-1)。当出现健康受损的体征或肿瘤体积超过1.5cm3时，用二氧化碳对动物实施安乐死。

(8)细胞因子检测。

根据供应商的方案(eBioscience)，使用ELISA试剂盒测量IL10、IL12p70、IL 6、IFN-γ或TNF-α的局部和血浆水平。为了检测细胞因子的局部(肿瘤)浓度，在喷涂纤维蛋白凝胶后5天，采集肿瘤组织并在冷PBS中匀浆以形成单细胞悬液。对于血浆水平，在不同处理后从小鼠分离血清样品并稀释以进行分析。

(9)流式细胞术。

为了研究肿瘤内的免疫细胞，将从不同组的小鼠采集的肿瘤切成小块，并在冷染色缓冲液中匀浆以形成单细胞悬液。然后，在不添加消化酶的情况下，用匀浆器通过适度的压力制备单细胞悬液。按照生产商的说明书，细胞用荧光标记的抗体CD45(Biolegend，货号103108)、CD11b(Biolegend，货号101208)、CD206(Biolegend，货号141716)、F4/80(Biolegend，货号123116)、CD80(Biolegend，货号104722)、Gr-1(Biolegend，货号108412)、CD3(Biolegend，货号100204)、CD4(Biolegend，货号100412)、CD8(Biolegend，货号140408)、Foxp3(Biolegend，货号126404)、CD11c(Biolegend，货号117310)、CD86(Biolegend，货号105008)、CD103(Biolegend，货号121406)、Ly6C(Biolegend，货号128016)和Ly6G(Biolegend，货号127608)染色。将实验中使用的所有这些抗体稀释200倍。在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)上测量染色的细胞，并通过FlowJo软件包(版本10.0.7；TreeStar，USA，2014)进行分析。

(10)免疫荧光染色。

从小鼠剥离肿瘤，并在最佳切割温度(OCT)培养基中速冻。使用冰冻切片机进行肿瘤切片，然后将其固定在载玻片上。然后，按照生产商的说明书，将切片用一抗染色：CD4(Abcam，货号ab183685)、CD8(Abcam，货号ab22378)和F4/80(Abcam，货号ab100790)，在4℃下过夜。加入荧光标记的二抗后：山羊抗大鼠IgG(H+L；Thermo Fisher Scientific，货号A18866)和山羊抗兔IgG(H+L；Thermo Fisher Scientific，货号A32733)，使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710)分析载玻片。将实验中使用的所有这些抗体稀释200倍。

(11)Western印迹。

对于Western印迹，将通过Bicinchoninic Acid蛋白测定试剂盒(BCA)测定的蛋白含量相同的每个样品与等体积的2×Laemmli缓冲液混合，并在95℃下煮沸5min。凝胶电泳完成后，将蛋白转移到Hybond硝酸纤维素膜上。然后，将1:1000稀释度的抗HIF1-α抗体(Santa Cruz，sc-13515)和1:5000稀释度的抗β-肌动蛋白抗体(Abcam，ab8226)用作一抗。用于这些印迹的二抗体是山羊抗小鼠抗体(Novus Biologicals，NBP175151)。

(12)统计分析。

所有结果均以平均值±s.e.m.表示。使用Tukey事后检验和单因素/双因素方差分析(ANOVA)进行多重比较(比较两组以上时)。通过对数秩检验确定生存益处。所有统计分析均使用Prism软件包(PRISM 5.0；GraphPad Software，USA，2007)进行。统计学显著性的阈值为P<0.05。

E.参考文献

Albain，K.S.等人，Radiotherapy plus chemotherapy with or withoutsurgical resection for stage III non-small-cell lung cancer:a phase IIIrandomised controlled trial.The Lancet 374，第379-386页(2009)。

Andersen,M.H.The Balance Players of the Adaptive Immune System.CancerRes.78，第1379-1382页(2018)。

Baer,C.等人，Suppression of microRNA activity amplifies IFN-γ-inducedmacrophage activation and promotes anti-tumor immunity.Nat.Cell Biol.18，第790–802页(2016)。

Baker,D.、Masterson,T.、Pace,R.、Constable,W.和Wanebo,H.，The influenceof the surgical wound on local tumor recurrence.Surgery 106，第525-532页(1989)。

Calandra,T.和Roger,T.，Macrophage migration inhibitory factor:aregulator of innate immunity.Nat.Rev.Immunol.3，第791–800等人(2003)。

Calcinotto,A.等人，Modulation of microenvironment acidity reversesanergy in human and murine tumor-infiltrating T lymphocytes.Cancer Res.72，第2746-2756页(2012)。

Carter,P.J.&Lazar,G.A.Next generation antibody drugs:pursuit of the'high-hanging fruit'.Nat.Rev.Drug Discov.17，第197-223页(2018)。

Chanmee,T.,Ontong,P.,Konno,K.&Itano,N.Tumor-associated macrophages asmajor players in the tumor microenvironment.Cancers 6，第1670-1690页(2014)。

Chao,M.P.等人，Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promotephagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma.Cell 142，第699-713页(2010)。

Chen,Q.等人，A Self-Assembled Albumin-Based Nanoprobe for In VivoRatiometric Photoacoustic pH Imaging.Adv.Mater.27，第6820-6827页(2015)。Chen,Q.等人，An albumin-based theranostic nano-agent for dual-modal imaging guidedphotothermal therapy to inhibit lymphatic metastasis of cancer postsurgery.Biomaterials 35，第9355-9362页(2014)。

Chen,Q.等人，Photothermal therapy with immune-adjuvant nanoparticlestogether with checkpoint blockade for effective cancerimmunotherapy.Nat.Commun.7，第13193页(2016)。

Chen,Q.等人，Tumor vasculature normalization by orally fed erlotinibto modulate the tumor microenvironment for enhanced cancer nanomedicine andimmunotherapy.Biomaterials 148，第69-80页(2017)。

Coffey,J.C.等人，Excisional surgery for cancer cure:therapy at acost.Lancet Oncol.4，第760-768页(2003)。

Colegio,O.R.等人，Functional polarization of tumor-associatedmacrophages by tumor-derived lactic acid.Nature 513，第559–563页(2014)。

Credo,R.、Curtis,C.和Lorand,L.，Ca2+-related regulatory function offibrinogen.Proc.Nat.Acad.Sci.75，第4234-4237页(1978)。

Edris,B.等人，Antibody therapy targeting the CD47 protein is effectivein a model of aggressive metastatic leiomyosarcoma.Proc.Nat.Acad.Sci.109，第6656-6661页(2012)。

Gordon,S.，Alternative activation of macrophages.Nat.Rev.Immunol.3，第23-35页(2003)。

Grivennikov,S.I.、Greten,F.R.和Karin,M.，Immunity,inflammation,andcancer.Cell 140，第883-899页(2010)。

Herberman,R.R.、Ortaldo,J.R.和Bonnard,G.D.，Augmentation by interferonof human natural and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.Nature277，第221–223页(1979)。

Huang,Y.、Ma,Y.、Gao,P.和Yao,Z.，Targeting CD47:the achievements andconcerns of current studies on cancer immunotherapy.J.Thorac.Dis.9，第E168-E174页(2017)。

Jaiswal,S.等人，CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stemcells and leukemia cells to avoid phagocytosis.Cell 138，第271-285页(2009)。Kershaw,M.H.和Smyth,M.J.，Making Macrophages Eat Cancer.Science 341，第41-42页(2013)。

Kwon,E.D.等人，Elimination of residual metastatic prostate cancerafter surgery and adjunctive cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4(CTLA-4)blockade immunotherapy.Proc.Nat.Acad.Sci.96，第15074-15079页(1999)。Lawrence,T.和Natoli,G.，Transcriptional regulation of macrophage polarization:enabling diversity with identity.Nat.Rev.Immunol.11，第750-761页(2011)。

Lee,E.J.等人，Nanocage-Therapeutics Prevailing Phagocytosis andImmunogenic Cell Death Awakens Immunity against Cancer.Adv.Mater.30，第1705581页(2018)。

Lewis,C.E.、Harney,A.S.和Pollard,J.W.，The multifaceted role ofperivascular macrophages in tumors.Cancer Cell 30，第18-25页(2016)。

Lin,E.Y.和Pollard,J.W.，Tumor-associated macrophages press theangiogenic switch in breast cancer.Cancer Res.67，第5064-5066页(2007)。

Liu,Q.等人，Abrogation of local cancer recurrence after radiofrequencyablation by dendritic cell-based hyperthermic tumor vaccine.Mol.Ther.17，第2049-2057页(2009)。

Liu,Q.等人，Nanoparticle-Mediated Trapping of Wnt Family Member 5A inTumor Microenvironments Enhances Immunotherapy for B-Raf Proto-OncogeneMutant Melanoma.ACS Nano 12，第1250-1261页(2018)。

Lu,Y.、Aimetti,A.A.、Langer,R.和Gu,Z.，Bioresponsivematerials.Nat.Rev.Mater.2，第16075页(2017)。

Mantovani,A.、Sozzani,S.、Locati,M.、Allavena,P.和Sica,A.，Macrophagepolarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2mononuclear phagocytes.Trends Immunol.23，第549-555页(2002)。

Martin,P.，Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.Science276，第75-81页(1997)。

Meyer,M.A.等人，Breast and pancreatic cancer interrupt IRF8-dependentdendritic cell development to overcome immune surveillance.Nat.Commun.9，第1250页(2018)。

Mi,P.等人，A pH-activatable nanoparticle with signal-amplificationcapabilities for non-invasive imaging of tumor malignancy.Nat.Nanotechnol.11，第724-730页(2016)。

Michaels,A.D.等人，CD47 Blockade as an Adjuvant Immunotherapy forResectable Pancreatic Cancer.Clin.Cancer Res.24，第1415-1425页(2018)。Neubert,N.J.等人，T cell–induced CSF1 promotes melanoma resistance toPD1blockade.Sci.Transl.Med.10，第eaan3311页(2018)。

Nishiyama,N.等人，Novel cisplatin-incorporated polymeric micelles caneradicate solid tumors in mice.Cancer Res.63，第8977-8983页(2003)。

Pardoll,D.M.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat.Rev.Cancer 12，第252–264页(2012)。

Pyonteck,S.M.等人，CSF-1R inhibition alters macrophage polarizationand blocks glioma progression.Nat.Med.19，第1264-1272页(2013)。

Ribas,A.和Wolchok,J.D.Cancer immunotherapy using checkpointblockade.Science 359，第1350-1355页(2018)。

Ring,N.G.等人，Anti-SIRPαantibody immunotherapy enhances neutrophiland macrophage antitumor activity.Proc.Nat.Acad.Sci.114，第10578-10585页(2017)。

Rodell,C.B.等人，TLR7/8-agonist-loaded nanoparticles promote thepolarization of tumour-associated macrophages to enhance cancerimmunotherapy.Nat.Biomed.Eng.2，第578页(2018)。

Rosenberg,S.A.、Yang,J.C.和Restifo,N.P.，Cancer immunotherapy:movingbeyond current vaccines.Nat.Med.10，第909-915页(2004)。

Sockolosky,J.T.等人，Durable antitumor responses to CD47 blockaderequire adaptive immune stimulation.Proc.Nat.Acad.Sci.113,2646-2654(2016).Stephan,S.B.等人，Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-celltherapy.Nat.Biotechnol.33,97-101(2015).

Tohme,S.等人，Neutrophil extracellular traps promote the developmentand progression of liver metastases after surgical stress.Cancer Res.76，第1367-1380页(2016)。

Tumeh,P.C.等人，PD-1blockade induces responses by inhibiting adaptiveimmune resistance.Nature 515，第568-571页(2014)。

Turajlic,S.和Swanton,C.，Metastasis as an evolutionary process.Science352，第169-175页(2016)。

Vakkila,J.和Lotze,M.T.，Inflammation and necrosis promote tumorgrowth.Nat.Rev.Immunol.4，第641-648页(2004)。

Wang,C.等人，In situ activation of platelets with checkpointinhibitors for post-surgical cancer immunotherapy.Nat.Biomed.Eng.1，第0011页(2017)。Wang,C.等人，In situ formed reactive oxygen species–responsive scaffoldwith gemcitabine and checkpoint inhibitor for combinationtherapy.Sci.Transl.Med.10，第eaan3682页(2018)。

Wang,C.、Wen,D.和Gu,Z.，Cellular Bioparticulates with Therapeutics forCancer Immunotherapy.Bioconjugate Chem.29，第702-708页(2017)。

Wang,C.、Ye,Y.、Hu,Q.、Bellotti,A.和Gu,Z.，Tailoring biomaterials forcancer immunotherapy:Emerging trends and future outlook.Adv.Mater.29，第1606036页(2017)。

Wang,Y.-C.等人，Notch signaling determines the M1 versus M2polarization of macrophages in antitumor immune responses.Cancer Res.70，第4840-4849页(2010)。

Zhao,Y.等人，A Preloaded Amorphous Calcium Carbonate/Doxorubicin@Silica Nanoreactor for pH-Responsive Delivery of an AnticancerDrug.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.54，第919-922页(2015)。

Zou,W.、Wolchok,J.D.和Chen,L.，PD-L1(B7-H1)and PD-1pathway blockade forcancer therapy:Mechanisms,response biomarkers,andcombinations.Sci.Transl.Med.8，第328rv324页(2016)。

Claims (33)

1.一种免疫治疗生物响应性凝胶基质，其包括第一组分和第二组分；

其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中至少一种所述组分包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

2.根据权利要求1所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第一组分包括H+清除剂。

3.根据权利要求2所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述H+清除剂是纤维蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第二组分包括凝血酶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述阻断抑制剂或免疫调节剂是抗CD47抗体。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述免疫治疗生物响应性凝胶基质进一步包括至少一种第二纳米颗粒。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第一组分包括至少一种第一纳米颗粒。

8.根据权利要求7所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第一组分进一步包括第二抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

9.根据权利要求7所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第二组分包括第二抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质

11.其中所述第二组分包括至少一种第一纳米颗粒。

12.根据权利要求10所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第二组分进一步包括第二抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

13.根据权利要求10所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第一组分包括第二抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

14.根据权利要求1所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第二组分包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

15.根据权利要求1所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中所述第一组分包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质，其中在施用所述基质后140小时释放少于30％的抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

17.一种抑制癌症肿瘤在手术切除部位处转移的方法，其包括向所述切除部位施用权利要求1-15中任一项所述的免疫治疗生物响应性凝胶基质。

18.一种抑制癌症肿瘤在手术切除部位处转移的方法，其包括向所述切除部位施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组分和所述第二组分分开递送至所述受试者。

20.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一组分在所述第二组分之前递送至所述受试者的肿瘤部位。

21.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述第一组分在所述第二组分之前至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时施用。

22.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一组分在所述第二组分之后递送至所述受试者的肿瘤部位。

23.根据权利要求17、18或21中任一项所述的方法，其中所述第一组分在所述第二组分之后至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时施用。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组分和所述第二组分并行施用。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组分和所述第二组分同时施用。

26.根据权利要求24所述的方法，其中在向所述受试者施用之前将所述第一组分和所述第二组分混合在一起。

27.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中在去除所述肿瘤之前，将所述第一组分和所述第二组分中的至少一种施用于所述切除部位。

28.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其进一步包括随后施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分。

29.根据权利要求17-27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用另外的抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

30.根据权利要求17-28中任一项所述的方法，其中所述另外的抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂在所述免疫治疗生物响应性凝胶基质中施用。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述另外的抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂与所述免疫治疗生物响应性凝胶基质分开施用。

32.一种在肿瘤切除后增加对所述肿瘤的先天性或适应性免疫应答的方法，其包括向患有肿瘤的受试者施用免疫治疗生物响应性凝胶基质，所述免疫治疗生物响应性凝胶基质包括第一组分和第二组分；其中当所述第一组分与所述第二组分接触时，所述基质发生凝胶化；并且其中所述组分中的至少一种包括至少一种第一纳米颗粒；其中所述至少一种第一纳米颗粒包括至少一种抗癌剂、阻断抑制剂或免疫调节剂。

33.根据权利要求17-31中任一项所述的方法，其中所述免疫治疗生物响应性凝胶基质的施用全身性地增加所述受试者的抗肿瘤应答并减缓肿瘤增殖。

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