CN112630322B - 一种检测鱼中酚类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测鱼中酚类化合物的方法，属于水产品污染检测技术领域。本发明通过采用了改良的QuEChERS方法提取、富集、净化鱼中多种酚类化合物，并结合气相色谱串联质谱法，定性定量测定鱼中酚类化合物，建立了一种高效且能同时检测18种酚类化合物的检测方法。开发一种不需要衍生，且能同时、准确的检测鱼中多种不同种类酚类化合物，尤其是烷基酚、溴酚类化合物的方法；采用本发明方法能同时检测18种酚类化合物，平均加标回收率为81.3％–115.7％，相对标准偏差为1.1％–11.3％，检出限为0.002–0.01mg/kg。

Description

一种检测鱼中酚类化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种检测鱼中酚类化合物的方法，属于水产品污染检测技术领域。
背景技术
酚类化合物由于具有表面活性剂的性质，在化工、医药、农业等领域有着广泛的应用。这类化合物包括从煤焦油和塑料、染料、药品、杀菌剂、防腐剂和防腐剂中提取的剧毒、腐蚀性物质。这些酚类化合物通过直接排放或工业排放到水环境中，由于其疏水性，它们可能与沉积在河流或湖泊底部的颗粒物结合。酚类化合物被认为对人类和环境都有很大的危害，它们被美国环境保护署将其列为优先控制污染物。酚类化合物不仅可通过污染的生活饮用水直接进入人体，也可经水体及水体微生物转移并富集在人体内，因其在体内代谢过程缓慢，因而具有慢性危害效应，对人体的健康产生潜在的威胁。在种类繁多的酚类化合物中，烷基酚、双酚A(BPA)、溴酚(BPs)和硝基酚(NPs)被认为是主要的有毒污染物。其中烷基酚中的辛基苯酚(OP)、壬基酚(NP)和双酚A这三种化学物质被称为内分泌干扰物，它会通过阻止内源激素的作用，改变激素的合成、转运、代谢和排泄，从而干扰内分泌系统。
当前水产品中酚类化合物污染较为严重，鱼中酚类化合物均有不同程度的检出，Liao等在美国和中国进行的两个调查报告显示，海产品中双酚A的平均水平分别为3.23ng/g和14.1ng/g。刘等结合微波辅助提取和气相色谱质谱法，检测野生鱼类肌肉组织(干重)中OP、NP和BPA的含量，鱼组织中酚类化合物最大浓度分别为4.6、18.9和83.5ng/g。Xu等人分析了水产品的BP含量(0.56–4.44μg/kg)。大量研究表明鱼类中含有多种酚类化合物，鱼类是一种脂肪复合基质，含有大量的脂类。传统的鱼肉组织提取方法有索氏提取法、加压液体提取法和微波辅助提取法。然而，这些技术是耗时、浪费溶剂和仪器设备投资高。当前研究对鱼中硝基酚、溴酚的检测报道较少，而且当前酚类化合物的检测方法大都要衍生，但衍生操作较复杂，反应条件苛刻，反应的副产物和过量的衍生化试剂可能会干扰目标化合物的分离与检测等。与此同时，衍生还限制了GC-MS/MS联用技术同时测定几种酚类化合物。因此，开发一种可靠、快速、简便的同时分析鱼肉中多种酚类化合物的方法是十分必要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在获得一种无需衍生化的高灵敏度分析方法，通过采用改良的QuEChERS方法提取、富集、净化鱼中多种酚类化合物，并结合气相色谱串联质谱法，定性定量测定鱼中酚类化合物，建立了一种高效且能同时检测18种酚类化合物的检测方法。开发一种不需要衍生，且能同时、准确的检测鱼中多种不同种类酚类化合物，尤其是烷基酚、溴酚类化合物的方法；与传统方法相比，该方法易操作耗时少，简化了样品预处理、灵敏度高、稳定性好；可满足4大类18种酚类化合物的同时检测，提高了酚类化合物的分析率。
本发明选择花鲢为空白样品，采用改良的QuEChERS方法提取、富集、净化鱼中酚类化合物，同时对色谱条件、质谱条件、提取溶剂、净化剂种类、净化剂的用量等前处理条件进行优化，从而确定出最优的前处理方法，最后利用气相色谱串联质谱法对不同种类的酚类化合物同时进行定量检测。
本发明的第一个目的是提供一种从鱼样中提取酚类化合物的预处理方法，所述方法是：先将鱼样粉碎，加水浸润后，再采用改良的QuEChERS方法对酚类化合物进行提取、富集和净化；所述改良的QuEChERS方法条件为：提取剂选自丙酮、正己烷、乙腈和乙酸乙酯中的一种或多种，氯化钠为沉淀剂，无水硫酸镁为除水剂，净化剂选自C18、PSA或GCB；所述酚类化合物包括烷基酚类化合物、溴酚类化合物和硝基酚类化合物中的一种或多种。
在本发明一种实施方式中，所述预处理方法包括：先将鱼样粉碎，加水浸润后，再采用提取剂进行快速提取，氯化钠和无水硫酸镁盐析后，经C18净化，离心即可。
在本发明一种实施方式中，优选地，提取剂为乙腈，提取剂的添加量与样品体积质量比为(0.5-2):1，mL/g。
在本发明一种实施方式中，氯化钠与样品的质量比为(0.1-0.5)：1；无水硫酸镁与样品的质量比为(0.2-0.6)：1。
在本发明一种实施方式中，优选地，所述净化剂选择C18；所述净化剂与样品的质量比为(0.01-0.05)：1。
在本发明一种实施方式中，预处理的具体过程为：准确称取搅碎后的鱼样10g至50ml塑料离心管中。然后，加入2ml水和10ml乙腈，涡旋3min，超声5min，随后，向试管中添加2g NaCl和4g MgSO4。再将样品溶液涡流5min，然后超声处理10min。紧接着以4500r/min的速度离心5min，收集上清液并添加到含有C18(500mg)的15mL离心管中。在涡旋振荡约10分钟后，取5mL上清液转移到塑料离心管中。接下来，在40℃水浴中氮吹至约0.8mL，并用甲醇将体积固定至1mL。最后，用有机滤膜过滤上清液，用GC-MS/MS测定。
在本发明一种实施方式中，所述酚类化合物包括壬基酚、双酚A、2-溴苯酚、4-溴苯酚、2,4-二溴苯酚、2,6-二溴苯酚、2,4,6-三溴苯酚、2-硝基酚、3-硝基酚、4-甲基-2-硝基酚、6-硝基间甲酚、2-硝基-3-甲基苯酚、2,6-二甲基-4-硝基酚、辛基酚、4-硝基酚、2,4-二硝基苯酚、3-甲基-4-硝基酚和4,6-二硝基邻甲苯酚中的一种或多种。
本发明第二个目的是提供一种所述预处理方法在检测鱼中酚类化合物含量方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测鱼样中酚类化合物含量的方法，所述方法是应用上述预处理方法对鱼样中酚类化合物进行提取、富集、净化，再采用气相色谱串联质谱法GC-MS/MS对酚类化合物进行定量检测。
在本发明一种实施方式中，色谱柱选择30m×0.25mm×0.25μm TG-5MS毛细管色谱柱。
在本发明一种实施方式中，色谱条件为：初始柱温70℃，维持1min，然后以8℃/min升至160℃，再以3℃/min升至200℃，最后以40℃/min升至300℃，保持3min。
在本发明一种实施方式中，质谱条件：离子源温度240℃，传输线温度250℃，电子轰炸(EI)离子源，电子能量：70eV，溶剂延迟10min，选择离子(SIM)监测方式。
本发明的有益效果：
(1)本发明建立的方法不需要衍生，前处理方法简便，操作简单、且准确性高，重复性好，可同时检测复杂鱼体中多种酚类化合物，能显著提高酚类化合物的分析速率；
(2)采用本发明方法能同时检测18种酚类化合物，平均加标回收率为81.3％–115.7％，相对标准偏差为1.1％–11.3％，检出限为0.002–0.01mg/kg。
附图说明
图1为18种酚类化合物标准溶液的总离子流色谱图；1为2-溴苯酚；2为2-硝基酚；3为2-硝基-3-甲基苯酚；4为4-甲基-2-硝基酚；5为6-硝基间甲酚；6为4-溴苯酚；7为2,4-二溴苯酚；8为2,6-二溴苯酚；9为3-硝基酚；10为2,4-二硝基苯酚；11为4-硝基酚；12为3-甲基-4-硝基酚；13为辛基酚；14为4,6-二硝基邻甲苯酚；15为2,6-二甲基-4-硝基酚；16为2,4,6-三溴苯酚；17为壬基酚；18为双酚A。
图2为不同提取溶剂对酚类化合物回收率的影响。
图3为不同净化剂对酚类化合物回收率的影响。
图4为不同量净化剂对酚类化合物回收率的影响。
图5为不同量净化剂所对应的基质效应。
图6为不同种类的鱼所对应的基质效应。(注：同一行中的不同字母表示P＜0.05时的统计显著差异)
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：
(1)标准溶液的制备
首先将每种酚类化合物溶解在甲醇中来制备标准储备溶液，其次使用甲醇将标准储备溶液稀释至最终浓度10/100mg/L来制备混合标准中间溶液。分别准确吸取18种混合标准液适量，用空白基质稀释得第一类酚类物质浓度为0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00mg/L，第二类酚类物质浓度为1.00、3.00、5.00、10.00、15.00、20.00mg/L的混合标准使用液。
其中，所述第一类酚类物质为：壬基酚(Nonylphenol，NP)、双酚A(Bisphenol A，BPA)、2-溴苯酚(2-Bromophenol，2-BP)、4-溴苯酚(4-Bromophenol，4-BP)、2,4-二溴苯酚(2,4-Dibromophenol，2,4-DBP)、2,6-二溴苯酚(2,6-Dibromophenol，2,6-DBP)、2,4,6-三溴苯酚(2,4,6-Tribromophenol，2,4,6-TBP)、2-硝基酚(2-Nitrophenol)、3-硝基酚(3-Nitrophenol)、4-甲基-2-硝基酚(4-Methyl-2-nitrophenol)、6-硝基间甲酚(5-Methyl-2-nitrophenol)、2-硝基-3-甲基苯酚(3-Methyl-2-nitrophenol)、2,6-二甲基-4-硝基酚(2,6-Dimethyl-4-nitrophenol)、辛基酚(Octylphenol，OP)；
所述第二类酚类物质为：4-硝基酚(4-Nitrophenol，AR)、2,4-二硝基苯酚(2,4-Dinitrophenol，DNP)、3-甲基-4-硝基酚(3-Methyl-4-nitrophenol)、4,6-二硝基邻甲苯酚(2-Methyl-4,6-dinitrophenol)。
(2)鱼样的制备
以甲醇为溶剂，将烷基酚、溴酚以及10种硝基酚的标准样品配制成1g/L的储备液10mL，然后用甲醇将1g/L的储备液稀释成10/100mg/L的中间液备用(上述储备液和中间液置于-10℃条件下保存)。将新鲜鱼样去皮、去内脏同时剔除鱼骨，准确称取粉碎后的鱼样10g，向其中加入酚类混合标准液，制成待测鱼样。
(3)气相色谱串联质谱条件
色谱条件：色谱柱选择TG—5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国赛默飞世尔公司)。初始柱温70℃，维持1min，然后以8℃/min升至160℃，再以3℃/min升至200℃，最后以40℃/min升至300℃，保持3min，载气为高纯氦(纯度≥99％)，流速1.2mL/min，不分流进样进样口温度：260℃，进样量1μL。
质谱条件：离子源温度240℃，传输线温度250℃，电子轰炸(EI)离子源，电子能量：70eV，溶剂延迟10min，选择离子(SIM)监测方式。
为减少酚类化合物与柱子上活性点位的接触，提高仪器灵敏度，从而使用超高惰性衬管。结果显示，各种酚类化合物分离效果明显，峰形较好，具体详见图1。
(4)线性关系、检出限的确定
以空白鱼基质溶液作溶剂，配制18种酚类化合物系列浓度标准溶液，直接进样分析。以酚类化合物的浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制校准曲线，计算回归方程，经计算得到第一类酚类物质线性范围为0.1–2mg/L；第二类酚类物质线性范围为1–20mg/L。在最低添加水平下，以3倍信噪比结合浓度外推法确定方法检出限(LOD)，具体结果见表1。
表1酚类化合物的校准曲线及相关系数
Figure BDA0002803192390000051
Figure BDA0002803192390000061
实施例2：一种检测鱼中酚类化合物的方法
(1)样品预处理：酚类化合物的富集
准确称取搅碎后的鱼样10g至50ml塑料离心管中。然后，加入2ml水和10ml乙腈，涡旋3min，超声5min，随后，向试管中添加2g NaCl和4g MgSO4。再将样品溶液涡流5min，然后超声处理10min。紧接着以4500r/min的速度离心5min，收集上清液并添加到含有C18(500mg)的15mL离心管中。在涡旋振荡约10分钟后，取5mL上清液转移到塑料离心管中。接下来，在40℃水浴中氮吹至约0.8mL，并用甲醇将体积固定至1mL。最后，用有机滤膜过滤上清液，用GC-MS/MS测定。
(2)气相色谱串联质谱条件：
色谱条件：色谱柱选择TG—5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，美国赛默飞世尔公司)。初始柱温70℃，维持1min，然后以8℃/min升至160℃，再以3℃/min升至200℃，最后以40℃/min升至300℃，保持3min，载气为高纯氦(纯度≥99％)，流速1.2mL/min，不分流进样进样口温度：260℃，进样量1μL。
质谱条件：离子源温度240℃，传输线温度250℃，电子轰炸(EI)离子源，电子能量：70eV，溶剂延迟10min，选择离子(SIM)监测方式。
实施例3：前处理条件的优化
(1)提取溶剂的选择
分别选择丙酮、正己烷、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂，按照相应实验步骤进行前处理，经测定后所得结果详见表2、图2。结果显示丙酮的萃取效果最差，回收率仅为31.3％，当使用乙酸乙酯作为萃取溶剂时，在目标峰附近会发现较大的杂质峰干扰。我们推断，由于乙酸乙酯和水的不溶混性，样品基质不容易分散。此外，乙酸乙酯中18种酚类化合物的回收率低于乙腈。而以乙腈为萃取溶剂可获得18种酚类化合物的最高回收率，平均回收率为92.43％，这可能是因为乙腈可通过沉淀蛋白质和萃取较少的非极性物质(例如色素和脂肪)来减少基质干扰。同时，与乙酸乙酯相比，乙腈还可以通过盐析轻松地从样品中除去水。因此选择乙腈为提取溶剂。
表2不同提取溶剂对酚类化合物回收率的影响(n＝3)
Figure BDA0002803192390000062
Figure BDA0002803192390000071
(2)不同净化剂的选择
分别选取500mg(C18、PSA、GCB)作为净化剂，按照相应实验步骤进行前处理，经测定后所得结果详见表3、图3。由图3看出，用C18作吸附剂时18种酚类化合物的纯化效率明显好于用GCB和PSA。GCB可以吸附部分酚类化合物，特别是2-BP，3-甲基-2-硝基苯酚和2-甲基-4,6-二硝基苯酚，所以其回收率分别仅为57.09％，56.99％和55.87％。PSA可强烈吸附2,6-DBP，2-甲基-4,6-二硝基苯酚和2,4,6-TBP，其回收率均低于50％。C18作为净化剂其平均回收率在85.64％至106.47％之间。因此选择C18为净化剂。
表3不同净化剂对酚类化合物回收率的影响(n＝3)
Figure BDA0002803192390000072
Figure BDA0002803192390000081
(3)不同量净化剂的选择
分别选择100、300、500、700mg C18作为净化剂，对样本溶液进行净化，以考察不同量净化剂对回收率的影响，结果详见表4、图4。鱼的样品中18种酚类化合物的回收率因净化剂量的不同而不同。结果表明，当净化剂用量达到500mg时，纯化效率最高，18种酚类化合物的回收率均高于80％。同时，随着吸收剂用量的增加，回收率下降(个别情况除外)，特别是3-甲基-2-硝基苯酚，4-甲基-2-硝基苯酚，OP，3-甲基-4-硝基苯酚和BPA的回收率。因此，选择了500mg C18进行纯化。
表4不同量净化剂对酚类化合物回收率的影响(n＝3)
Figure BDA0002803192390000082
Figure BDA0002803192390000091
(4)不同量净化剂所对应的基质效应
分别考察了100、300、500、700mg C18作为净化剂时所对应的基质效应，按照相应实验步骤进行前处理，经测定后所得结果见表5、图5。由图5看出，不同量的净化剂对应于不同的基质效应。500mg和700mg C18的基质效应明显低于100mg和300mg C18的基质效应。样品中的杂质在500mg和700mg的C18时可被更好地吸附，它们具有最佳的净化效果。但500和700mg C18基质效应无显著差异，因此选择500mg C18。
表5不同量净化剂所对应的基质效应(n＝3)
Figure BDA0002803192390000092
Figure BDA0002803192390000101
(5)不同种类的鱼所对应的基质效应
分别考察了鲳鱼、花鲢、鲈鱼、鲫鱼、草鱼5种鱼所对应的基质效应，按照相应实验步骤进行前处理，经测定后所得结果见表6、图6。酚类化合物的ME值在1.22至4.49的范围内(ME>1.2)，这表明18种酚类化合物在鱼基质中均具有基质增强作用。对于不同类型的鱼，观察到了相似的MEs，不同鱼类之间的基质效应无显著性差异(P＞0.05)。所有酚类化合物均具有基质增强作用。一些酚类化合物如4-BP，2,4-DBP，4-硝基苯酚，OP，2,4,6-TBP，NP和BPA具有很强的ME。在这些酚类化合物中，OP的基质增强作用最为明显。因此，基质匹配的标准曲线对于准确定量鱼类中的酚类化合物是必不可少的。
表6不同种类鱼所对应的基质效应(n＝3)
Figure BDA0002803192390000102
Figure BDA0002803192390000111
实施例4：方法的准确性和重复性
方法的加标回收率和精密度
通过回收率实验，既在空白样品中添加三个加标浓度(0.02/0.2、0.08/0.8和0.4/4mg/kg)下评估了该方法的准确性和精密度。对于每个加标水平，均进行了六次重复的实验。在1天内对每个加标水平进行了6次重复测试以检查内部重复性(RSDr)，同时在3天内(每天重复6次)进行了测试，以检验实验室重复性(RSDwR)，如表7所示，这18种酚类化合物的回收率在81.3％至115.7％之间(在70％至120％的可接受范围内)。RSDr和RSDWr值分别在1.1％至11.3％和1.0％至1.2％的范围内，均在可接受的范围内(≤20％)。
表7酚类化合物的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)
Figure BDA0002803192390000112
Figure BDA0002803192390000121
*回收率＝(实际检出量－本底值)/加标量×100％.
实施例5：一种检测实际鱼样酚类化合物含量的应用
对六个真实样品进行了分析，以验证该方法的可行性，并研究了鱼类中酚类化合物的残留水平。真实样品是从当地超市购买的，包括鲳鱼，花鲢，鲈鱼，鲤鱼，草鱼和黑鱼。确定了六种鱼，理论上应准备六种相应的基质匹配标准品进行定量。但是，为每种鱼类准备一套与基质匹配的标准品是不切实际的，特别是对于大规模筛选或常规残留监测而言。由于不同鱼类的基质效应相似，因此使用空白样品制备基质匹配的标准品进行定量。
如表8所示，在六个鱼类样品中检测到18种酚类化合物中的15种。结果表明，除了2-硝基苯酚，3-甲基-2-硝基苯酚，5-甲基-2-硝基苯酚和2,6-二甲基-4-硝基苯酚外，在所有鱼类中均检测到酚类化合物。鲳鱼的检出率最高，浓度范围为0.007mg/kg至0.074mg/kg，其中鲤鱼和草鱼的酚类化合物检出量最少，分别为0.008和0.014mg/kg和0.024和0.021mg/kg。在所有鱼类样品中都检测到了BPA，其中鲳鱼中最高(达0.074mg/kg)。
表8实际鱼样中酚类化合物的含量(n＝3)
Figure BDA0002803192390000131
注：ND表示未检出
对比例1：
准确称取搅碎后的鱼样10g至50ml塑料离心管中，加入混合标准液，使得加标浓度为0.08/0.8mg/kg、然后加入2mL饱和氯化钠和4mL乙腈，涡旋振荡10min，7500r/min离心5min，转移上清液至15mL离心管中，重复萃取2次，合并上清液氮吹浓缩，获得粗提物，对于所述萃取液氮吹浓缩至1ml，将所述粗提物转移至有装有50mg无水硫酸镁以及50mg C18的2mL塑料离心管中，最后提取上清液过滤，待测。
采用对比例1的方法，酚类化合物回收率整体偏低，其中5种酚类化合物回收了低于60％，不满足实际检测要求，具体详见表9。
表9采用对比实例的实验步骤后酚类化合物的回收率(n＝3)
Figure BDA0002803192390000141
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种无需衍生化的同时快速检测鱼样中18种酚类化合物含量的方法，其特征在于，所述酚类化合物为壬基酚、双酚A、2-溴苯酚、4-溴苯酚、2,4-二溴苯酚、2,6-二溴苯酚、2,4,6-三溴苯酚、2-硝基酚、3-硝基酚、4-甲基-2-硝基酚、6-硝基间甲酚、2-硝基-3-甲基苯酚、2,6-二甲基-4-硝基酚、辛基酚、4-硝基酚、2,4-二硝基苯酚、3-甲基-4-硝基酚和4,6-二硝基邻甲苯酚；所述方法是：先将鱼样粉碎，加水浸润后，再采用QuEChERS方法对酚类化合物进行提取、富集和净化，最后采用气相色谱串联质谱法对酚类化合物进行定量检测；
所述QuEChERS方法为：取搅碎的鱼样10g，加入2ml水和10ml乙腈涡旋3min，超声5min；随后，再添加2g NaCl和4g MgSO4涡流5min，超声10min，离心收集上清液；向上清液中添加500mg C18，涡旋振荡10分钟后，取5mL上清液在40℃水浴中氮吹至约0.8mL，用甲醇将体积固定至1mL；最后用有机滤膜过滤上清液；
气相色谱串联质谱条件：
色谱条件：色谱柱选择30m×0.25mm×0.25μm TG—5MS毛细管色谱柱；初始柱温70℃，维持1min，然后以8℃/min升至160℃，再以3℃/min升至200℃，最后以40℃/min升至300℃，保持3min，载气为高纯氦，流速1.2mL/min，不分流进样；进样口温度：260℃，进样量1μL；
质谱条件：离子源温度240℃，传输线温度250℃，电子轰炸离子源，电子能量：70eV，溶剂延迟10min，选择离子监测方式。
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