CN112626261A - 玉米雄穗分枝数性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

玉米雄穗分枝数性状相关的snp分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记，包括序列1和序列2，与玉米雄穗分枝数性状极显著相关的SNP分子标记的制备方法，包括如下步骤：提取玉米基因组DNA；简化基因组测序；使用软件GAPIT(3.1.0)中的CMLM模型对性状进行关联分析；检出显著位点不同基因型组间比较。本发明属于作物分子标记制备技术领域，具体是提供三个与玉米雄穗分枝数性状极显著相关的SNP分子标记，以此作为玉米育种过程中雄穗分枝数性状的辅助选择标记，提高选择的准确性，加快育种进程的玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记及应用。

Description

玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记及应用
技术领域
本发明属于作物遗传育种分子标记制备技术领域，具体是指玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
玉米是重要的粮食与饲料作物，对于保障国家粮食安全具有重要的意义。玉米的雄穗位于植株的顶端，在生长发育过程中与雌穗存在养分竞争和花期相遇确保授粉等互作关系，因此雄穗性状对玉米的产量具有重要的影响，它是品种培育过程中不可忽视的重要目标性状。玉米雄穗的分枝数、分枝长度、分枝夹角、雄穗重等若干个指标中，分枝数的多少是决定雄穗大小的主要因素，二者的关系非常密切。杂交种的雄穗分支数与产量的关联研究表明，雄穗分枝数的多少与产量基本不相关或呈显著的负相关。在保证一定量的花粉满足玉米完全授粉的前提条件下，雄穗过大，分支数过多则会加大植株养分的竞争和消耗，开花期过多的花粉堆积在叶片上霉变，影响叶片的光合作用。但是，对于玉米杂交种生产过程中的父本而言，父本自交系应产生较多的花粉满足母本的授粉需要，故分枝数多，花粉量大可以提高单位面积的制种产量。
玉米雄穗分枝数的分化发育受多个基因的调控，是一个比较典型的由多基因控制的数量性状，同时它的广义和狭义遗传力都比较高，说明其中有对性状贡献较大的主效基因在发挥作用。目前通过QTL定位和候选基因法已经确定了许多与雄穗分枝数相关的QTL区域及候选基因，但是QTL定位的区域一般跨度很大，通常会有几个厘摩(centimorgan，cM)，定位的区域中包括大量的候选基因，精细定位较困难。候选基因法是根据已有的生理、生化背景知识，直接从已知或潜在的基因库中挑选出可能对该性状有影响的基因，但它的缺点是不能识别新的基因。近年来，随着高通量测序技术的不断发展，测序速度的提高与测序成本的降低，使得全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)广泛应用于作物重要农艺性状遗传位点的检测。与传统的QTL相比，GWAS具有更高的分辩率，可以更准确的识别和定位新的基因。
ENTH/VHS蛋白是网格蛋白包被囊泡(clathrin-coated vesicle,CCV)形成的早期阶段中起关键作用的一组辅助蛋白，这些蛋白质共享一个相似的，在进化上保守的结构域，即在它们的N末端具有ENTH/VHS结构域和内膜相互作用，而相对非结构化的C末端部分则与囊泡生成装置的其它成分相互作用。哺乳动物中Epsin 1蛋白是第一个分离鉴定的具有ENTH结构域的蛋白质,ENTH结构域(the Epsin N-Terminal Homology domain，ENTHdomain)形成一个由八个a螺旋组成的紧凑型螺线管，由大约130到150个氨基酸组成。VHS结构域(Vps-27、Hrs and STAM，VHS domain)和ENTH结构域类似，也包括八个a螺旋，长度大约是150个氨基酸，具有VHS结构域的蛋白通常还具有一些其他的重要结构域，所以它们也可以被归入其他的蛋白质群组中。VHS结构域物理插入到膜中的机制尚未报道，因此，这些蛋白的功能更可能是胞内运输的货物招募并和随后的组成部分结合，以纳入CCVs或ESCRT(the Endosomal sorting complexes Required for Transport)依赖的降解途径。
至今为至，在植物中我们对ENTH/VHS蛋白的作用与功能了解非常有限，通过GWAS研究群体中突变位点多态性与性状的关联，进而研究基因的功能是一个非常有用的技术手段。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供三个与玉米雄穗分枝数性状极显著相关的SNP分子标记，以此作为玉米育种过程中雄穗分枝数性状的辅助选择标记，提高选择的准确性，加快育种进程。
本发明采取的技术方案如下：本发明提供玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记，包括序列1：
Zea mays cultivar B73 chromosome 3:159306300-159306618,B73 RefGen_v4,
1 CACCTCACAC CGCGTCTTCG TCCAGCTCAC TCCCCCGCCG CGCCCCCGCT CCGCTCCCCT
61 CTCTTCCTCG CCGCGGGTCG CGCGCAGCCA GGCGCCGAGC CGCCGACCAG TAACYGACGT
121 ATATCTCATC CTTCCCCCTC CCCYCTGCAC AGCCCCCTCT ACAACTCCCC GATTAAACCC
181 TAGAATCTCC CAACTCCCAA ATGCGCGCCC CCACCTAGGC CCCCGAATTC GGCATCCGCT
241 CCGCGGAAGG TACGGGATCT ATCGCGCTCT GCTCCCTCTC CTCCTGCGCT GGTCTGGTTC
301 TGATCTAGCT CGAGCTCAC
上述序列中115位的碱基Y是C或T，144位碱基Y是C或T，导致供试玉米自交系群体基因多态性及雄穗分枝数极显著差异。
序列2：
Zea mays cultivar B73 chromosome 3:159307850-159308168,B73 RefGen_v4,
1 GTGCTTTATG CTAGTCATTC ACTGCACCCT GCTTAAGATT GCCACCTACT ATTGCTGACT
61 GTGATTATTT TCTCATGTGC TACATTATTT TATCCATTCA CGTAATGTCA TCCTTAACTA
121 AAGAAAAGCT TTATCACATT GGTGTGTCTT TCATCATCGT TACTSCCAAC AAGTTGTAGA
181 AACATGGGAT TGCGAGTTTC ATGCAGCTCC TGGAGAGAGG AGGGTATCTT TGCTGTACCT
241 TGCAAATGAT ATTATGCAGA ATAGCAGAAA AGAAGGCAAT GGATATATAA CTGAATTCAT
301 GAGGGTCATC CCTGCTGCC
上述序列中165位的碱基S是G或C,导致供试玉米自交系群体基因多态性及雄穗分枝数极显著差异。
本发明提供与玉米雄穗分枝数性状极显著相关的SNP分子标记的制备方法，包括如下步骤：
1)提取玉米基因组DNA；
2)简化基因组测序；
3)使用软件GAPIT(3.1.0)中的CMLM模型(compressed mixed linear model)对性状进行关联分析；
4)检出显著位点不同基因型组间比较。
采用上述技术方案，本发明取得的有益效果如下：本方案玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记及应用，运用全基因组关联分析的方法，根据ENTH/VHS蛋白家族基因Zm00001d042291的序列多态性与玉米雄穗分枝数性状存在极显著的关联，即该基因中存在与雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记，提供三个与玉米雄穗分枝数性状极显著相关的SNP分子标记，以此作为玉米育种过程中雄穗分枝数性状的辅助选择标记，提高选择的准确性，加快育种进程。
附图说明
图1、玉米供试群体雄穗分枝数性状次数分布的方柱形图；
图2、玉米基因组DNA检测电泳图(部分)；
图3、玉米雄穗分枝数性状的全基因组关联分析的曼哈顿图；
图4、玉米雄穗分枝数性状的全基因组关联分析的QQ图；
图5、Zm00001d042291基因chr3:159306414位点不同基因型样本的雄穗分枝数分布的箱形图；
图6、Zm00001d042291基因chr3:159306443位点不同基因型样本的雄穗分枝数分布的箱形图；
图7、Zm00001d042291基因chr3:159308014位点不同基因型样本的雄穗分枝数分布的箱形图。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1
1.1、GWAS群体的构建
玉米研究群体包括431份不同亲缘关系的自交系。所有的自交系都是由吉林大学植物科学学院提供，种植于吉林大学植物科学学院教学与科研实验基地(吉林省长春市绿园区)。小区排列按随机区组设计，区组3次重复，单行小区，行长3m，行距65厘米，株距20厘米，田间管理措施与大田相同。
1.2、样品的采集和表型数据的调查
小区玉米幼苗出苗后的5-6叶期，采集3株幼苗，清洗干净后置于-20℃冰箱冻存。玉米授粉后15天，每个小区调查有代表性的5个植株的雄穗一级分枝数(tassel branchnumber,TBN)，以区组三次重复的平均值作为GWAS分析的表型数据，调查数据采用Excel2013软件进行整理。
1.3、玉米基因组DNA的提取与检测
(1)、取50-100mg玉米幼苗用液氮研磨成粉末，转移至1.5ml离心管中，加入400ulBuffer PCL，8ulβ-巯基乙醇，震荡混匀，65℃水浴45min至样品完全裂解。
(2)、加入200ul Buffer PP，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min，室温10000rpm离心5min，将上清液(500-550ul)转移到新的1.5ml离心管中。若上清液混浊，可再加入等体积氯仿混匀，12000rpm离心取上清。
(3)、加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min。
室温10000
rpm离心5min，弃上清。
(4)、加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rpm离心2min，弃上清。重复上述操作一次，开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。
(5)、得到的DNA用50-100ul TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
(6)、1％琼脂糖凝胶(200V电泳30min)检测DNA完整性，Qubit2.0定量检测DNA样本浓度。
1.4、研究结果
自交系群体玉米雄穗分枝数性状样本均值8.184个，中位数为7.741个，平均偏差2.109个，极差16.259个，标准差2.798个，变异系数0.342，95％置信区间为7.919-8.449个，性状次数分布见图1。
玉米幼苗基因组DNA采用Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit提取后，在裂解液作用下裂解消化RNA，有机相洗脱蛋白等杂质，得到纯净DNA，DNA样本经电泳检测合格后(>10ng/ul)，可用于基因组文库构建，电泳检测结果见图2。
实施例2
2.1、测序文库的构建
(1)、200ng基因组DNA用限制性内切酶EcoRI酶切，酶切消化完全后磁珠纯化回收。
(2)、酶切后纯化的DNA用T4 DNA Ligase连接Barcode adapters PI，连接产物磁珠纯化回收，记录合格的P1引物标签。
(3)、所有样本按要求等比例混合为一个总DNA mix，使用covaris220将DNA片段化，打断后的DNA的碎片长度约为200-500bp。
(4)、End Repair&dA-tailing后，连接Adaptor P2，连接产物磁珠纯化回收。
(5)、利用KAPA 2G Robust PCR Kit扩增并富集接头连接产物，利用磁珠对PCR反应产物进行纯化分选，通过2％琼脂糖凝胶电泳检测构建完成的文库PCR纯化产物质量，合格的PCR产物进行二代测序。
2.2、简化基因组测序(restriction site-associated DNA sequencing，RAD)
(1)、采用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行双末端测序(PE150)，读长(Reads)为2×150bp。
(2)、产出数据的质控与过虑：对碱基检出的错误发生几率进行预测，如果质量分值(Q-score)为低质量(Q≤5(E))的碱基数占整条read的一半以上，则去掉该read，同时还去除用于样品识别的标签序列。
(3)、利用STACKS-1.08(http://creskolab.uoregon.edu/stacks/)分别对所有样品进行stack聚类分析，检测获得各样本Tag序列，以及SNP信息。
(4)、数据比对以及SNP-Callling：采用BWA软件(版本0.7.17-r1188)进行基因组比对，将质控合格的数据比对B73参考基因组序列。
2.3、基因型检测与GWAS
(1)、变异检测和筛选：使用PiCard软件标记重复，SamTools(1.9)对bam进行排序，BcfTools(1.9)进行call SNP。
(2)、SNP质控：质控软件为Vcf Tools(0.1.16)对SNP，质控标准为MAF<0.05,缺失率>0.8，HW(哈迪-温伯格指数)>0.0001。
(3)、SNP注释:软件Snp Eff(版本4.3t)利用基因组结构注释数据(GTF文件)对VCF文件中的SNP/InDel信息进行注释，即是否能够对基因编码蛋白造成影响，包括SNP的突变类型和突变位置，氨基酸的变异类型和效应等。
(4)、GWAS：使用软件GAPIT(3.1.0)中的CMLM模型(compressed mixed linearmodel)对性状进行关联分析。
2.4、研究结果
SNP质控后，获得549211个合格的SNP用于全基因组关联分析，关联分析时基于贝叶斯信息准则(Bayesian information criterion,BIC)的模型选择，找到GWAS模型中最优的PCs数量，用以拟合最优的性状因子。玉米雄穗分枝数性状的GWAS分析结果的见图3和图4，图3是关联分析结果的曼哈顿图，X轴是每个SNP所在的基因组上的位置，Y轴为CMLM模型下每个SNP位点P值的以10为底的负对数。图4是关联分析的QQ图，Y轴是观察到P值以10为底的负对数，X轴是假设P值服从均匀[0,1]分布，所预期观察的P值以10为底的负对数；
当检出的SNP的P值小于10-4时，我们认为这个SNP达到了基因组水平的显著，Zm00001d042291基因的5’端非翻译区(5’Untranslated Region,5’UTR)检出3个SNP位点符合上述条件，这三个位点分别位于玉米的第3号染色体的159306414、159306443、159308014位，生物信息学功能注释表明它们属于ENTH/VHS蛋白家族基因，已有的研究结果表明该蛋白家族是一组在网格蛋白包被囊泡形成的早期阶段中起关键作用的辅助蛋白，而网格蛋白则参与了质膜的内吞作用，分泌及空泡转运(vacuolar transport)等后高尔基体物质运输(post-Golgi traffic)，结果详见表1。
表1 Zm00001d042291基因3个位点的关联分析
Figure BDA0002903232740000091
Figure BDA0002903232740000101
实施例3检出显著位点不同基因型组间比较
3.1、Zm00001d042291基因chr3:159306414位点组间比较
Zm00001d042291基因chr3:159306414位点包括了三种基因型即C/C、T/T、C/T，不同基因型样本的雄穗分枝数分布的箱形图见图5；C/C组中位数为7.44个、下四分位数Q1：6.27个、上四分位数Q3为8.85个；T/T组中位数为10.22个、下四分位数Q1为7.44个、上四分位数Q3为13.14个；C/T中位数为8.75个、下四分位数Q1为7.25个、上四分位数Q3为10.14个。
不同基因型组间表型均值差异的t测验结果见表2，由表2可知C/C与T/T间差异极显著(P<0.0001)，组间均值差为2.548个；C/C与(C/T+T/T)之间差异极显著(P<0.0001)，组间均值差为2.251个。因此，基因型C/C是较少雄穗分枝数的极显著分子标记，基因型T/T及C/T是较多雄穗分枝数的极显著分子标记。
表2 Zm00001d042291基因chr3:159306414位点雄穗分枝数的组间均值比较
Figure BDA0002903232740000111
3.2、Zm00001d042291基因chr3:159306443位点组间比较
Zm00001d042291基因chr3:159306443位点包括了三种基因型即C/C、T/T、C/T，不同基因型样本的雄穗分枝数分布的箱形图见图6，C/C组中位数为7.44个、下四分位数Q1：6.29个、上四分位数Q3为8.85个；T/T组中位数为10.22个、下四分位数Q1为7.44个、上四分位数Q3为13.15个；C/T中位数为8.67个、下四分位数Q1为7.26个、上四分位数Q3为9.63个。
不同基因型组间表型均值差异的t测验结果见表3，由表3可知C/C与T/T间差异极显著(P<0.0001)，组间均值差为2.536个；C/C与(C/T+T/T)之间差异极显著(P<0.0001)，组间均值差为2.226个。因此，基因型C/C是较少雄穗分枝数的极显著分子标记，基因型T/T及C/T是较多雄穗分枝数的极显著分子标记。
表3 Zm00001d042291基因chr3:159306443位点雄穗分枝数的组间均值比较
Figure BDA0002903232740000121
3.3、Zm00001d042291基因chr3:159308014位点组间比较
Zm00001d042291基因chr3:159308014位点包括了三种基因型即C/C、G/G、C/G，不同基因型样本的雄穗分枝数分布的箱形图见图7；C/C组中位数为9.04个、下四分位数Q1为7.39个、上四分位数Q3为12.87个；G/G组中位数为7.48个、下四分位数Q1：6.29个、上四分位数Q3为8.92个；C/G中位数为13.19个、下四分位数Q1为9.98个、上四分位数Q3为13.67个。
不同基因型个体组间表型均值差异的t测验结果见表4，由表4可知C/C与G/G间差异极显著(P<0.0001)，组间均值差为2.143个；G/G与(C/C+C/G)之间差异极显著(P<0.0001)，组间均值差为2.405个。因此，基因型G/G是较少雄穗分枝数的极显著分子标记，基因型C/C和C/G是较多雄穗分枝数的极显著分子标记。
表4 Zm00001d042291基因chr3:159308014位点雄穗分枝数的组间均值比较
Figure BDA0002903232740000131
序列1：
Zea mays cultivar B73 chromosome 3:159306300-159306618,B73 RefGen_v4,
1 CACCTCACAC CGCGTCTTCG TCCAGCTCAC TCCCCCGCCG CGCCCCCGCT CCGCTCCCCT
61 CTCTTCCTCG CCGCGGGTCG CGCGCAGCCA GGCGCCGAGC CGCCGACCAG TAACYGACGT
121 ATATCTCATC CTTCCCCCTC CCCYCTGCAC AGCCCCCTCT ACAACTCCCC GATTAAACCC
181 TAGAATCTCC CAACTCCCAA ATGCGCGCCC CCACCTAGGC CCCCGAATTC GGCATCCGCT
241 CCGCGGAAGG TACGGGATCT ATCGCGCTCT GCTCCCTCTC CTCCTGCGCT GGTCTGGTTC
301 TGATCTAGCT CGAGCTCAC
上述序列中115位的碱基Y是C或T，144位碱基Y是C或T，导致供试玉米自交系群体基因多态性及雄穗分枝数极显著差异。
序列2：
Zea mays cultivar B73 chromosome 3:159307850-159308168,B73 RefGen_v4,
1 GTGCTTTATG CTAGTCATTC ACTGCACCCT GCTTAAGATT GCCACCTACT ATTGCTGACT
61 GTGATTATTT TCTCATGTGC TACATTATTT TATCCATTCA CGTAATGTCA TCCTTAACTA
121 AAGAAAAGCT TTATCACATT GGTGTGTCTT TCATCATCGT TACTSCCAAC AAGTTGTAGA
181 AACATGGGAT TGCGAGTTTC ATGCAGCTCC TGGAGAGAGG AGGGTATCTT TGCTGTACCT
241 TGCAAATGAT ATTATGCAGA ATAGCAGAAA AGAAGGCAAT GGATATATAA CTGAATTCAT
301 GAGGGTCATC CCTGCTGCC
上述序列中165位的碱基S是G或C,导致供试玉米自交系群体基因多态性及雄穗分枝数极显著差异。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 319
<212> DNA
<213> 玉米自交系(Zea mays)
<400> 1
cacctcacac cgcgtcttcg tccagctcac tcccccgccg cgcccccgct ccgctcccct 60
ctcttcctcg ccgcgggtcg cgcgcagcca ggcgccgagc cgccgaccag taacygacgt 120
atatctcatc cttccccctc cccyctgcac agccccctct acaactcccc gattaaaccc 180
tagaatctcc caactcccaa atgcgcgccc ccacctaggc ccccgaattc ggcatccgct 240
ccgcggaagg tacgggatct atcgcgctct gctccctctc ctcctgcgct ggtctggttc 300
tgatctagct cgagctcac 319
<210> 2
<211> 319
<212> DNA
<213> 玉米自交系(Zea mays)
<400> 2
gtgctttatg ctagtcattc actgcaccct gcttaagatt gccacctact attgctgact 60
gtgattattt tctcatgtgc tacattattt tatccattca cgtaatgtca tccttaacta 120
aagaaaagct ttatcacatt ggtgtgtctt tcatcatcgt tactsccaac aagttgtaga 180
aacatgggat tgcgagtttc atgcagctcc tggagagagg agggtatctt tgctgtacct 240
tgcaaatgat attatgcaga atagcagaaa agaaggcaat ggatatataa ctgaattcat 300
gagggtcatc cctgctgcc 319

Claims (3)

1.玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记，其特征在于：包括序列1：
1 CACCTCACAC CGCGTCTTCG TCCAGCTCAC TCCCCCGCCG CGCCCCCGCT CCGCTCCCCT
61 CTCTTCCTCG CCGCGGGTCG CGCGCAGCCA GGCGCCGAGC CGCCGACCAG TAACYGACGT
121 ATATCTCATC CTTCCCCCTC CCCYCTGCAC AGCCCCCTCT ACAACTCCCC GATTAAACCC
181 TAGAATCTCC CAACTCCCAA ATGCGCGCCC CCACCTAGGC CCCCGAATTC GGCATCCGCT
241 CCGCGGAAGG TACGGGATCT ATCGCGCTCT GCTCCCTCTC CTCCTGCGCT GGTCTGGTTC
301 TGATCTAGCT CGAGCTCAC
上述序列中115位的碱基Y是C或T，144位碱基Y是C或T，导致供试玉米自交系群体基因多态性及雄穗分枝数极显著差异。
序列2：
1 GTGCTTTATG CTAGTCATTC ACTGCACCCT GCTTAAGATT GCCACCTACT ATTGCTGACT
61 GTGATTATTT TCTCATGTGC TACATTATTT TATCCATTCA CGTAATGTCA TCCTTAACTA
121 AAGAAAAGCT TTATCACATT GGTGTGTCTT TCATCATCGT TACTSCCAAC AAGTTGTAGA
181 AACATGGGAT TGCGAGTTTC ATGCAGCTCC TGGAGAGAGG AGGGTATCTT TGCTGTACCT
241 TGCAAATGAT ATTATGCAGA ATAGCAGAAA AGAAGGCAAT GGATATATAA CTGAATTCAT
301 GAGGGTCATC CCTGCTGCC
上述序列中165位的碱基S是G或C,导致供试玉米自交系群体基因多态性及雄穗分枝数极显著差异。
2.根据权利要求1所述的玉米雄穗分枝数性状相关的SNP分子标记，其特征在于：分子标记玉米雄穗分枝数性状在遗传育种中的应用。
3.与玉米雄穗分枝数性状极显著相关的SNP分子标记的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)提取玉米基因组DNA；
2)简化基因组测序；
3)使用软件GAPIT(3.1.0)中的CMLM模型(compressed mixed linear model)对性状进行关联分析；
4)检出显著位点不同基因型组间比较。
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CN106676180A (zh) * 2017-01-22 2017-05-17 甘肃农业大学 调控玉米雄穗分枝数主效qtl的分子标记及其应用

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