CN112626109B

CN112626109B - 一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法

Info

Publication number: CN112626109B
Application number: CN202110086584.9A
Authority: CN
Inventors: 闵玲; 张献龙; 吴元龙; 金双侠
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112626109A

Abstract

本发明提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，属于棉花育种技术领域。海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；将构建的载体在农杆菌介导下转入陆地棉，筛选获得转基因材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi‑Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T‑DNA片段的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。本发明提供的方法简单、高效创制出海岛棉杂交后代雄性不育材料，为海岛棉材料的遗传改良提供新思路，同时对海岛棉材料的基因功能验证具有重要意义。

Description

一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法

技术领域

本发明属于棉花育种技术领域，具体涉及一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法。

背景技术

棉花作为重要的经济作物和油料作物，具有重要的经济价值，在我国乃至世界的国民经济发展中占据重要地位。其在植物学分类上属于锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)。在长期的栽培与驯化过程中，棉花共形成了四个栽培种，包括两个二倍体栽培种：草棉(G.herbaceum)、亚洲棉(G.arboreum)，和两个四倍体栽培种：陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)。陆地棉产量约占世界棉花总产量的90％，海岛棉约占5～8％(Qin et al.,2011)。海岛棉纤维品质优良，对棉花黄萎病具有较高的耐病性，但产量相对较低，这很大程度上限制了海岛棉品种的生产实践过程。通过遗传突变的方法来改良海岛棉的生产特性，有利于提高海岛棉的种植价值。

CRISPR/Cas9技术的简单高效，目前已经广泛的应用于作物的遗传改良中。在棉花中，利用CRISPR/Cas9技术创制突变体材料需要经过组织培养过程。而棉花组织培养再生过程，受到基因型影响，只有个别品种能够进行组织培养再生获得植株，且目前还未有海岛棉再生成功的报道，因此无法直接通过转基因再生技术获得突变体材料，这就大大的限制了CRISPR/Cas9技术在棉花遗传改良上的应用，特别是在海岛棉中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，是利用陆地棉转基因雄性不育突变体材料与海岛棉材料进行杂交，以获得在海岛棉材料中相应的雄性不育的突变体材料，实现海岛棉的遗传改良目的。

本发明提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，包括以下步骤：

1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；

2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；

3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；

4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代。

优选的，步骤1)中所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，步骤2)中sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：

A.以pGTR载体为模板，分别扩增含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2；

B.将所述含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2利用重叠延伸PCR方法连接形成串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段；

C.将所述串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段插入pRGEB32-GhU6.7-NPT II载体中，得到含sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

优选的，步骤A中所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；

所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述GhNSP-CRISPR-1-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，步骤A中所述扩增含所述sgRNA2的目标片段2用引物对为GhNSP-CRISPR-2-S和GhNSP-CRISPR-2-AS；

所述GhNSP-CRISPR-2-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述GhNSP-CRISPR-2-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

优选的，所述重叠延伸PCR方法中所用的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的inf-pRGER32-7-S和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的inf GhNSP-CRISPR-AS。

优选的，所述陆地棉材料包括Jin668。

优选的，所述筛选含CRISPR/Cas9和sgRNA的T-DNA片段的方法是利用gRNA1-Hi-Tom-gb-S和gRNA1-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA1，用gRNA2-Hi-Tom-gb-S和gRNA2-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA2；

gRNA1-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

gRNA1-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

gRNA2-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

gRNA2-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

优选的，所述海岛棉包括新海35号。

本发明提供了一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，本发明通过在可以进行遗传转化的陆地棉材料中对棉花隐性核不育恢复基因GhNSP进行基因编辑敲除，创制陆地棉突变体材料，再通过杂交将含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段转移到海岛棉中，获得杂交后代中发生GhNSP基因的敲除，获得雄性不育性状。本发明提供的创制方法对海岛棉材料的遗传改良与基因功能验证具有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明中用于创造基因编辑棉花材料的pRGEB32-GhU6.7-NPT2-GhNSP质粒载体图谱，其中，左下角sgRNA功能元件已用圆角方框标出，LB T-DNArepeat和RB T-DNArepeat中间的片段为插入到基因组中的T-DNA片段；

图2为利用GhNSP-CRISPR/Cas9系统在陆地棉中获得不育系材料；其中A为转化受体材料Jin668植株形态图；B为转化pRGEB32-GhU6.7-NPT II-GhNSP的植株形态图；C为Jin668材料与转基因植株T0代花药的表型图，左边为Jin668花药图表现为正常开裂，右边为转基因材料花药图表现花丝变短，花药不能正常开裂的败育表型；D为Jin668材料花粉碘碘化钾染色结果，花粉被染成黑色，表示为花粉发育正常可育；E为转基因材料花粉碘碘化钾染色结果，花粉无法被染成黑色，表示为花粉发育异常不育；

图3为杂交后代检测T-DNA片段的电泳图；

图4为利用GhNSP-CRISPR/Cas9系统在海岛棉中突变GhNSP的同源基因Gbar_D02G025630与Gbar_D04G020900，创制海岛棉不育系材料，在后代群体材料中筛选获得不育系材料；A为杂交后代表型鉴定结果；B和C为Hi-TOM鉴定基因型结果，其中A的比例尺为2cm。

具体实施方式

1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；

2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；

4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。

本发明设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2。

本发明对GhNSP基因的sgRNA的设计方法没有特殊性限制，采用本领域所熟知的设计方法即可，例如采用网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/设计获得陆地棉GhNSP基因特异的sgRNA。所述sgRNA1是针对陆地棉GhNSP基因的三号外显子区域设计得到。所述sgRNA2是针对陆地棉GhNSP基因的二号外显子区域设计得到。所述sgRNA1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示(AGGCTCGTAGTGTCCCTCCGTGG，下划线部分为PAM序列)；所述sgRNA2的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示(ATTATGGAGCAGACCCAACGGGG，下划线部分为PAM序列)。

得到sgRNA1和sgRNA2后，本发明将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中。

在本发明中，sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，优选包括以下步骤：

本发明对pGTR载体的来源不做具体限制，采用本领域所熟知的pGTR载体即可。在本发明实施例中，所述pGTR载体来自华中农业大学谢卡斌教授馈赠。

在本发明中，所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对优选为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：3所示；所述GhNSP-CRISPR-1-AS的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：4所示。所述扩增的反应体系为20μL：ddH₂O 15.1μL、10×Buffer solution 2.0μL、10mM dNTP 0.3μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、cDNA2.0μL、Taq聚合酶0.2μL。所述扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min。

在本发明中，所述扩增含所述sgRNA2的目标片段2用引物对优选为GhNSP-CRISPR-2-S和GhNSP-CRISPR-2-AS。所述GhNSP-CRISPR-2-S的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：5所示；所述GhNSP-CRISPR-2-AS的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：6所示。所述扩增的反应体系为20μL：ddH₂O 15.1μL、10×Buffer solution 2.0μL、10mM dNTP 0.3μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、cDNA2.0μL、Taq聚合酶0.2μL。所述扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min。

在本发明中，所述sgRNA1的目标片段1和sgRNA2的目标片段2优选进行纯化，所述纯化的方法优选采用DNA片段纯化试剂盒进行，分别得到纯化片段1和纯化片段2。

在本发明中，所述重叠延伸PCR方法中所用的引物优选为核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示的inf-pRGER32-7-S和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的inf GhNSP-CRISPR-AS。所述重叠延伸PCR的扩增体系为100μL：ddH₂O 83.5μL、10×Buffer solution 10μL、10mMdNTP 1.5μL、上游引物inf-pRGER32-7-S 1μL、下游引物infGhNSP-CRISPR-AS 1μL、纯化片段11μL、纯化片段21μL、Taq聚合酶1μL。所述扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min。

在本发明中，将所述串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段插入pRGEB32-GhU6.7-NPTII载体中的方法，优选采用利用infusion反应进行。得到的连接载体转入大肠杆菌中，培养，菌落PCR鉴定，提取重组质粒见图1，可用于后续方案。所述菌落PCR鉴定用引物优选为pRGER32-7-S/inf GhNSP-CRISPR-AS。所述pRGER32-7-S的核苷酸序列如的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：12所示。所述inf GhNSP-CRISPR-AS的核苷酸序列如的核苷酸序列优选如SEQID NO：7所示。所述反应程序为a.95℃5min；b.95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；c.72℃7min。

得到重组CRISPR/Cas9基因编辑载体，本发明将所述重组CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料。

在本发明中，本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。所述陆地棉材料优选包括Jin668。所述筛选优选用pRGER32-7-S和inf GhNSP-CRISPR-AS进行转基因阳性检测。

得到陆地棉突变体材料和海岛棉后，本发明将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段的杂交后代。

在本发明中，所述海岛棉优选包括新海35号。本发明对所述杂交的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杂交方法即可。

在本发明中，所述筛选含CRISPR/Cas9和sgRNA的T-DNA片段的杂交后代的方法优选是利用gRNA1-Hi-Tom-gb-S和gRNA1-Hi-Tom-AS引物对杂交材料DNA序列进行第一轮PCR扩增，再进行第二轮PCR扩增加测序接头，得到的PCR扩增产物进行二代测序检测gRNA1，用gRNA2-Hi-Tom-gb-S和gRNA2-Hi-Tom-AS引物对杂交材料DNA序列进行第一轮PCR扩增，再进行第二轮PCR扩增加测序接头，得到的PCR扩增产物进行二代测序检测gRNA2；通过测序结果分析，表明杂交后代转基因材料中GhNSP-CRISPR/Cas9也可以对海岛棉杂交后代的GhNSP的同源基因进行编辑，产生雄性不育系材料。所述gRNA1-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：8所示；gRNA1-Hi-Tom-AS的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：9所示；gRNA2-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：10所示；gRNA2-Hi-Tom-AS的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：11所示。所述第一轮PCR扩增的反应体系为10×Buffer solution，2μl；Taq聚合酶，0.3μl；10mM dNTP，0.3μl；上游引物(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10)，0.2μl；下游引物(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11)，0.2μl；模板DNA，1μl；ddH₂O，16μl；所述第一轮PCR扩增的反应程序为a.95℃5min；b.95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；c.72℃7min；d.15℃保温。所述第二轮PCR扩增可参考文献进行(Hi-TOM:aplatform forhigh-throughputtracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems,Qing,et al.,ScienceChina.Life science,2019Jan；62(1):1-7)。

得到含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段的杂交后代，为了得到纯合海岛棉雄性不育材料，本发明将所述含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段的杂交后代与海岛棉杂交，筛选，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料。

在本发明中，所述海岛棉优选包括新海35号。由于海岛棉与陆地棉杂交后，得到的杂交后代中含部分陆地棉基因片段，因此，通过与海岛棉杂交得到纯化海岛棉突变体材料。所述筛选优选是筛选含T-DNA片段、敲除GhNSP基因的海岛棉突变材料。所述筛选含T-DNA片段的海岛棉突变材料用引物为正向引物：TTGTCACTGAAGCGGGAAGG，SEQ ID NO:12和反向引物：CGATACCGTAAAGCACGAGG，SEQ ID NO:13。所述敲除GhNSP基因的海岛棉突变材料用引物为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。

本发明采用上述方法创制得到新的海岛棉杂交后代雄性不育材料对海岛棉材料的遗传改良与基因功能验证具有非常重要的意义。

下面结合实施例对本发明提供的一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

转基因陆地棉阳性植株的获得

1转基因载体构建

1.1靶点sgRNA的获得

嵌合引导RNA(chimeric guide RNA)由网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/设计获得陆地棉GhNSP基因特异的sgRNA(序列见表1)。

表1 GhNSP基因的sgRNA序列

根据两条sgRNA序列设计用于扩增的引物对，其中inf-pRGER32-7-S/GhNSP-CRISPR-1-AS用于扩增GhNSP-sgRNA1+tRNAGly形成的含sgRNA1的目标片段1；GhNSP-CRISPR-2-S/GhNSP-CRISPR-2-AS用于扩增GhNSP-sgRNA2+tRNAGly形成的含sgRNA2的目标片段2，具体引物序列如下：

inf-pRGER32-7-S：5'aagcatcagatgggcaaacaaa 3'(SEQ ID NO:3)；

GhNSP-CRISPR-1-AS：5'cggagggacactacgagccttgcaccagccgggaat 3'(SEQ IDNO:4)；

GhNSP-CRISPR-2-S：5'aggctcgtagtgtccctccggttttagagctagaaata 3'(SEQ IDNO:5)

GhNSP-CRISPR-2-AS：5'cgttgggtctgctccataattgcaccagccgggaat 3'(SEQ IDNO:6)。

以pGTR载体为模板，利用上述引物进行目的基因片段1(GhNSP-sgRNA1+tRNAGly)和目的基因片段2(GhNSP-sgRNA2+tRNAGly)的扩增；目的片段的扩增体系(20μL)：ddH₂O15.1μL、10×Buffer solution 2.0μL、10mM dNTP 0.3μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、pGTR 2.0μL、Taq聚合酶0.2μL。PCR条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃50sec，32个循环；72℃7min，15℃保温。

1.2载体构建

扩增完成后，利用DNA纯化回收试剂盒，分别回收目的片段，再利用重叠延伸PCR将两个目标片段连接成为一个片段。

重叠延伸PCR的扩增体系(100μL)：ddH₂O 83.5μL、10×Buffer solution 10μL、10mM dNTP 1.5μL、上游引物inf-pRGER32-7-S 1μL、下游引物inf GhNSP-CRISPR-AS 1μL、纯化片段11μL、纯化片段21μL、Taq聚合酶1μL。其中上游引物inf-pRGER32-7-S：5'aagcatcagatgggcaaacaaa 3'(SEQ ID NO:3)；inf GhNSP-CRISPR-AS 5'ttctagctctaaaaccgttgggtctgctccataat 3'(SEQ ID NO:7)。

扩增完成后，利用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，再利用infusion反应，将目标片段构建到pRGEB32-GhU6.7-NPT II载体上(Xie,K.,Minkenberg,B.andYang,Y.(2015)Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,112,3570–3575.Wang,P.et al.Highefficient multisites genome editing in allotetraploid cotton(Gossypiumhirsutum)using CRISPR/Cas9 system.PlantBiotechnol.J.16,137-150,(2018).)。连接反应体系(5μL)如下：目的片段1.0μL、酶切好pRGEB32-GhU6.7-NPT II 1.0μL、CE buffer1.0μL、Exnase 0.5μL、ddH₂O 1.5μL。

连接两条sgRNA后载体总长度为16,495bp，载体环形图谱如图1所示。

1.3重组载体的验证及转化农杆菌的方法

通过热激转化的方法转入大肠杆菌Top10中，然后涂到含有kan+抗性的固体LB培养皿中，37℃过夜培养。挑取单菌落，PCR阳性鉴定(pRGER32-7-S/inf GhNSP-CRISPR-AS引物对进行验证阳性重组载体)，将重组载体命名为pRGEB32-GhU6.7-NPT II-GhNSP(表达GhNSP-CRISPR/Cas9)。将构建好的载体利用电激转化方法转到农杆菌GV3101中。

2.陆地棉转化

(1)无菌苗的种植。挑选饱满的棉花种子，剥去种壳，用0.1％的HgCl₂消毒8min左右，再用无菌水清洗3～5次，清除升汞，每次约5min，种于无菌苗培养基中，28℃黑暗培养于培养箱中。

(2)菌液的活化。取保存的含有目的基因的农杆菌菌液，划平板，2d后挑取单克隆，摇菌过夜；经高速离心使菌液沉淀，弃上清，加入10mL的MGL和25μL的AS，充分震荡，使菌液悬浮，28℃摇床，200rpm/min活化至少30min。

(3)切苗及侵染。在无菌条件下，将暗培养了7d左右的无菌苗下胚轴切割成0.5～0.8cm的小段；用已活化的农杆菌菌液侵染下胚轴8min，弃菌液，将下胚轴转移到有滤纸的培养皿中，吹干约10min；然后将下胚轴转至共培养皿中，21℃暗培养2～3d。

(4)下胚轴的筛选培养。将共培养皿中的下胚轴转移到筛选培养皿中(含有卡那霉素和头孢霉素)，摆放整齐，通过筛选可以去除未被农杆菌侵染的下胚轴，然后放到光照培养室培养。每隔30d左右继代一次，约3～5次，在这个过程中会长出大量愈伤组织和胚性愈伤。

(5)分化培养。将胚性愈伤转入到分化培养基中，经30d左右继代一次，出现体胚；把体细胞胚再继代一次，直到长出真叶。

(6)生根培养。将长出真叶后的小苗转移到生根培养基中，7d左右会长出新根，进而长成苗子；若苗子较小，可以再继代一次，提高苗子的成活率。

(7)练苗。揭开再生植株封口膜，练苗3d，再在水中练苗3d，即可移栽。

表2 组织培养以及转化中用到的培养基(参见金双侠博士论文2006)

3.转基因棉花植株DNA的提取与检测

采用CTAB法提取T₀代转基因棉花叶片DNA。具体包括以下步骤：取转基因叶片置于2ml离心管中，冰上摆好后逐个加入钢珠和200μL抽提缓冲液(0.35M葡萄糖，0.1M Tris-HCl，0.005M Na₂EDTA，2％PVP K-30和0.1％DIECA，pH值7.5)，磨样机打60s，频率为60Hz；加700μL裂解液(0.1M Tris-HCl，1.4M NaCl，0.02M Na₂EDTA，2％CTAB，2％PVP K-30和0.1％DIECA，pH值8.0)在65℃水浴30min裂解，取上清加800μL氯仿轻柔摇匀抽提20min，后取上清加等体积异丙醇后混匀沉淀DNA，最后倒掉上清，絮状沉淀用75％酒精洗两次后吹干，用适ddH₂O溶解。

获得DNA后，用pRGER32-7-S和infGhNSP-CRISPR-AS进行转基因阳性检测。挑选阳性植株进行表型鉴定，发现在陆地棉材料Jin668背景中，转化pRGEB32-GhU6.7-NPT II-GhNSP的植株表现正常(图2中A和B)，但花丝变短，花药不能正常开裂(图2中C)，且花粉不能被碘碘化钾染成黑色，表现为败育(图2中D和E)。

实施例2

利用CRISPR/Cas9系统在海岛棉中创制不育系材料

在海岛棉中分析GhNSP的同源基因，发现在海岛棉中具有两个同源基因，分别为Gbar_D02G025630(SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:15)与Gbar_D04G020900(SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:17)。同时，发现在这两条序列中，均含有GhNSP-CRISPR/Cas9的靶向的位点。因此，GhNSP-CRISPR/Cas9在海岛棉中也是具有靶向突变的功能。因此，利用实施例1制备的陆地棉突变体T₀代plant1植株与海岛棉材料(新海35号)进行杂交，获得杂交种子，对杂交后代(命名规则为H+植株编号，如H1代表杂交后代编号为1的植株)进行PCR检测，所用引物序列为正向引物：TTGTCACTGAAGCGGGAAGG，SEQ ID NO:12；反向引物：CGATACCGTAAAGCACGAGG，SEQ ID NO:13；反应体系为10×Buffer solution，2μl；Taq聚合酶，0.3μl；10mM dNTP，0.3μl；正向引物，0.2μl；反向引物，0.2μl；模板DNA，1μl；ddH₂O，16μl。反应程序为：a.95℃5min；b.95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；c.72℃7min；d.15℃保温。

检测结果表明，杂交后代H1和H2为转基因阳性植株，即杂交后代含有T-DNA片段，杂交后代H6为转基因阴性植株，即杂交后代不含有T-DNA片段(序列见SEQ ID NO:18)(图3)。

同时，为了对杂交后代进行表型鉴定，在杂交后代材料开花时，对花药的外在形态进行观察拍照。

结果表明，杂交后代H1和H2表现出花药不能正常开裂的不育表型特征，而杂交后代H6表现出花药能正常开裂的正常可育表型(图4中A)。同时，该结果也表明转基因阳性的杂交后代表现为不育表型，转基因阴性的杂交后代表现为正常可育表型。

为了证明不育表型的出现是由于海岛棉中GhNSP的同源基因突变导致了不育表型的出现，对杂交后代进行Hi-Tom检测，利用Hi-TOM平台对获得的杂交后代材料进行CRISPR/Cas9系统诱导的突变类型鉴定，具体实施过程如下，首先提取获得转基因材料的DNA样品；其次利用设计好的Hi-TOM检测引物，引物序列如下：

gRNA1-Hi-Tom-gb-S：ggagtgagtacggtgtgcatttgctgagttgggtattt(SEQ ID NO:8)；

gRNA1-Hi-Tom-AS：gagttggatgctggatggtaagatacccatcaaccggaaa(SEQ ID NO:9)；

gRNA2-Hi-Tom-gb-S：ggagtgagtacggtgtgctgtaattgagaatggatttg(SEQ ID NO:10)；

gRNA2-Hi-Tom-AS：gagttggatgctggatgggcgattgccttgtttagtgctt(SEQ ID NO:11)。

序列中有下划线的小写字母为特异的接头引物，接头引物信息详见参考文献(Hi-TOM:a platform for high-throughput tracking ofmutations induced by CRISPR/Cassystems,Qing,et al.,Science China.Life science,2019Jan；62(1):1-7DOI：10.1101/235903)。利用上述引物进行第一轮PCR扩增，得到的PCR产物后再根据参考文献(Hi-TOM:aplatform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cassystems,Qing,et al.,Science China.Life science,2019Jan；62(1):1-7)给出的第二轮引物进行第二轮PCR扩增(该轮PCR主要目的是加上测序接头以便于高通量测序)，最后对PCR产物进行纯化回收；纯化后的PCR产物送公司进行二代测序；最后在网站上(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)对测序的结果进行分析。

结果分析表明，杂交后代H1和H2在GhNSP同源基因Gbar_D02G025630与Gbar_D04G020900的靶标序列上均发生了纯合隐性突变。而在杂交后代H6中没有检测到纯合隐性突变(图4中B和C)。结合上述表型数据结果。最终，确认GhNSP-CRISPR/Cas9在海岛棉杂交后代材料中也可以对GhNSP的同源基因进行编辑，产生不育系材料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggctcgtag tgtccctccg tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attatggagc agacccaacg ggg 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcatcaga tgggcaaaca a 21

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggagggaca ctacgagcct tgcaccagcc gggaat 36

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggctcgtag tgtccctccg gttttagagc tagaaata 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgttgggtct gctccataat tgcaccagcc gggaat 36

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctagctct aaaaccgttg ggtctgctcc ataat 35

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggagtgagta cggtgtgcat ttgctgagtt gggtattt 38

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagttggatg ctggatggta agatacccat caaccggaaa 40

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggagtgagta cggtgtgctg taattgagaa tggatttg 38

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagttggatg ctggatgggc gattgccttg tttagtgctt 40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgtcactga agcgggaagg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgataccgta aagcacgagg 20

<210> 14

<211> 5802

<212> DNA

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 14

gtgactttta agtcaaattt tgacaaaaat aaacatggtg tagttcaggt ggttgagaaa 60

gggcagagtt tcaaggatca aaggggaatg aaaatcacgt gtttcacttt ggagaatcga 120

gtatgggttt cccaaattcg gatgtgcaag cagtgtagac ggttttatcc aacagaagaa 180

accaccagat tgcgaattgg aaggtgatga atccccaatg gtggagctaa cgacgacaat 240

ggagggcatt gaacaaggaa ccccgaatag ttccccagca gaagaattaa tttctgtggt 300

ggaaggtatg gatgataatg ctatcagaaa tgtcgaggta gttgctgaat ttggtgttga 360

aacttggatt ggctgtttgt tgttgtttta tggattcaaa actattcttc tggaactgtc 420

aaggaacgag tcatctccgt ttccataaat ttgtggctga gtatggaaga gaattttgtc 480

caggtgttat atgtttgttt gagactcagt tcggtggtgt tagggtgaat ggcatcattt 540

ccaagcttgg gttcccaaat tctttcaatt tggatgtagt aactttcaat tttttctgtt 600

tgataatggt atccgtgact tggggttcag tgggccctgg gcttagtgga ccagcccacc 660

cttggtccaa tcgaaggatg ctggccatgt tccctttcaa acggcctact ttcgaactca 720

aggagaacgt ccattaacct gcgtagtgga agcggctcag aggagaaaga cgcaagagtg 780

acaaccgcgt catactcgga cgacaacccc gcaagaacaa tctccaccct ttcggaatcc 840

gaaatctgat gatctgaggc ctcaagcaga gcacatgtat tttgaatttt agcaatgtat 900

tctttaatcc tttgggtact tttcttgatg gaatgtaaat cgtgtttgat acgagacaac 960

ttggcagcag tcacggcggc aaacagacga ttggcggtgg tccatacatc attagaggtt 1020

cgcacatcag tgaaacacga gagtaaggag ccactgatcg tggatagcaa ccatgacgca 1080

aggagcttat cctgttgatg aaacaccgaa gctttaggat tcaacaccat ctggccctct 1140

tgagtcgaca caaaacgagg tggagacgaa agagatccat caacaaaacc ggtgagatca 1200

taaccttata gaatgagttt aatgtgttgc tgccactgta taaaattgcc ttcatcgagc 1260

ttaactgtat cctgtttagg aaaacactgc agtcttacca gattcagagt gaaccgaagg 1320

tgccggatca cgcacaggtg gagaatggtc attagtggca gagacaaaat tcgtggattg 1380

agccatgaga acgcagcagg aaacgcaacc aggatcttag gcgaatgaac catgaaagta 1440

aatggaacaa tatgaaaatc aaatttgaga ctaacactgg taaatgaatc ttttcactga 1500

atactaacaa cctactaaca atttgaacaa actgaactga ctaattgact tgcagctcct 1560

tttatatatt ctaacagaag caaagaaagg tttctttgtt tggttgagtt ttgggttact 1620

tcaagatgaa gaagaacatc caattccatg tagtagcaat tggaagctac cttacccatt 1680

actcaaccca ctgcatattc cttcaatcct tcagttttct ttctttcttt ctaccataga 1740

ttattactta aataaaaaca taaaaacaat catccatgtt tttctcttct tccctttttt 1800

ttttcttaga aaataaattt attgaattaa aatgtagaaa ctagtcttac aaaagttcat 1860

tacagttttg aaatattaga tgaaacaata agaaacacgc ttcaaacatg gatactctct 1920

caatgccatt ttcgcccaag aatctgcaaa gaagttagct tccctgaagg cacgaggtga 1980

aaaatctttt taacggtaca atttgatata taaatgataa actatatgtt tgtgatgtta 2040

gtgtgcatat aaattaaaat ggagtcgtgt taaatggatg tttgacaaaa aatttaaaaa 2100

attaaattat aattataatt gcaattgtaa tttaagacta taattataat tgcaattgta 2160

atttaagtaa taaatggtat aagaaatcac aaagttttca tcaaaatgac ttcaattata 2220

gttcctaacc ctttgtctga cttatgacga ttgcttttgc tttgtaatag taagtaaaag 2280

ataagatcca agatgaaaaa gaatattgga cctagctatc tttgatgcat tggcaatcta 2340

gctagtaggg gaactggatc catccttcta cttggcaggg caggcgtaaa aatagacaaa 2400

cacattgaat tcatatacca cttatctctt tctttttcag ccctctagct agtcttctac 2460

cattacattt gttcctccca tttaattcat ctcttaatta aatttatcat gatctgtatg 2520

ttacttacat cgcatgccta gtaatatttc aatttattga ttccttattg taacatatac 2580

atattcactc ttaattgcat ttttaatttt ctttaatttc actccacaat taatttatac 2640

gcgtttaata atcaattatt aatttgtgtg tatataaata ttctactcat ttgatatgtg 2700

aatcagcaga aaattcaaga acaaaaaaat atctcctcct ccttctcatg cgaaggtctg 2760

ggtccatcaa cgcaagatat caattcatga atataagaag ttggtaaaaa gttgataaga 2820

agctgataag tgattagtgt tttgtcaaac aagaagtttt tttttatcca ttgtcagaca 2880

agaaattaaa tttcaaacag gctttttacc taagcaagct ctcctcgcaa gtcatgtcga 2940

aaaatccccc acacatttaa acagaaacta taggtgtcat gtgtgtgatc taatattata 3000

aaacattcta tagatttcct agcaaatctt agttagcccc ttctctttcc atgttcctcc 3060

tcttgctcct tcccttcgtc atttaaaccg tatgtctctc tctcaaaacg gagagaaaac 3120

agatcgaaag atgatggaga gaagaaacat gggaggaagg aatattgctg tagcaacact 3180

ctccatgata ttgggtttgt tcctaatcca tgtttctggc gataattcac gagtgggaaa 3240

gttttctgct gctcctgacc acgaccaaat gcgccaattg caagcgttta aggcctctct 3300

tattggtcga caatccgttt caggttcacc tatctcgccc tcttcttcgc cactgcaggt 3360

aaataatttc ttgtgcatct agtttctaac atttcctcaa tggcggaatg atgttaatta 3420

attaaattaa tgcaatgtaa ttgagaatgg atttggatat ataggaagcc ataggtccac 3480

gtgtgtatca tgtaacaaat tatggagcag acccaacggg gaaatcagac agcacagaag 3540

cactaaacaa ggcaatcgcg gatgcatttc aggttcctag tgaagggttc ttgatggagg 3600

ggatcactaa tcttggaggg ccacaaatta atcttgaagg tgggaactac cttatcagta 3660

aaccactgca gttagttgct gccggtgcag gaaatcttat ggtatgcgca accaaacatt 3720

tttaatcaat tgaaattatc ttttatacta gctaattgct gtcatgtcat aatctttctt 3780

tataaagtag aacaatatat atatacttgt atttatattg gctcatcatc tacgtactta 3840

attaccgttt ctatgctagc agtaccacac atacacacat ataagcagtt ggtgtttttg 3900

gtgaatgaaa cacacctggt tggatgactt atatcgtccc cgagaaaatt gcagatagat 3960

ttctatatgt taatgtttcg gcacttaact ctcaaagcaa agcaattggt cttttctagg 4020

atagaaaaaa tggtaataat aatatctagt aggatatgtt catgtttgga attgatgata 4080

acatttgttg aagactgaaa tgacaaccat ttttatcata tgaaaatgag gtgatgtgca 4140

cctaattcca attggttaaa ctgacacaga ctgtatataa tataatatag tatgtacatt 4200

ttgcaacatg gtagacctgc tcaccatatt gaattccagt gagcaatcgt tggagaagag 4260

agggtctggg tctagattct gtaattgatg taatataaca tatataaatt tacatatgtt 4320

gaggttgcat taattaacaa cgtcgagtta tatttttttt cttttttggt atctaacaac 4380

gtcaggttaa ttaataaagc atataaatta tatcaccaaa taaaacttcg ttttaatttg 4440

ctgagttggg tatttctttg tttaaattat atatggagca gatccacgga gggacactac 4500

gagcctcaga tgattttccg gttgatgggt atcttattga tttgtctcca aattcatggg 4560

ctagcagtac tgaagaagaa ataagagaag ggagctcctt gaaattgaat ttacagctta 4620

cctcatcatc atcatcctat aactacgagt acataaccct cagagacctg atgttggatt 4680

ctaattacag gggtggtggc atttcagtta taaactcact aaggactagc attgacaatt 4740

gctacattgc ccatttctcc actaatggaa ttttagtcca aggcgggcac gagacctata 4800

tcaggaattc tttccttggg caacatatca cggccggtgg tgatgcaggc gaaaggaact 4860

ataccggcac tgccattaac ctaatgggaa acgataatgc agtgacggat gtggtgattt 4920

tttcagctgc cataggaata atggcctcag gtcaagccaa caccttttct ggggtgcatt 4980

gttacaacaa ggcaacaggt tttggtggca cggggattta cttgaagctg cctggtctta 5040

cacaaacccg gatagtaaat tcatacctag attacactgg gattgtggct gaagacccag 5100

tgcaacttca tatctctagc agttttttcc tcggtgatgc atttatcctc ttgaaatcaa 5160

taaatggggt agcaaatgga gtgactatag tggataacat gttcagtgga tctaataagg 5220

gggttgatat agttcagtta gagggtcctt tcacacaaat tgatcaggtt gtagttgata 5280

ggaatagtgc caaggggatg aacattaaag caacagttgc gagagggtct gttgaaggga 5340

atagcagctc ctggacggtt gattttaatc ctgttctttt atttcctaac ctgattaagc 5400

atgttcagta ttcactaagc tcaagcaggg gcagctcatt tcctagccat gccctgagaa 5460

atgtgtctga aaatcaagtt gtgattgagt ctgatctcgc tgtgctggct aatgttttcg 5520

tcacggtgga tcaagcttaa gcaccatgac ctgacttatt attattatta ttattattat 5580

tatcatcatc agcagcagca gcatcattat cagcatcatc atctgatgga gagttaagat 5640

cctttgacaa ttgtgaatat ggggtgaaag actagtattg tctttttctc tgaaagttca 5700

actcaaatca aacatatatc ggctaaaagg atagatttcc agaagataca aaattgacaa 5760

gaaggaattg aataaataaa agctttccct cacccattta ct 5802

<210> 15

<211> 507

<212> PRT

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 15

Met Met Glu Arg Arg Asn Met Gly Gly Arg Asn Ile Ala Val Ala Thr

1 5 10 15

Leu Ser Met Ile Leu Gly Leu Phe Leu Ile His Val Ser Gly Asp Asn

20 25 30

Ser Arg Val Gly Lys Phe Ser Ala Ala Pro Asp His Asp Gln Met Arg

35 40 45

Gln Leu Gln Ala Phe Lys Ala Ser Leu Ile Gly Arg Gln Ser Val Ser

50 55 60

Gly Ser Pro Ile Ser Pro Ser Ser Ser Pro Leu Gln Glu Ala Ile Gly

65 70 75 80

Pro Arg Val Tyr His Val Thr Asn Tyr Gly Ala Asp Pro Thr Gly Lys

85 90 95

Ser Asp Ser Thr Glu Ala Leu Asn Lys Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gln

100 105 110

Val Pro Ser Glu Gly Phe Leu Met Glu Gly Ile Thr Asn Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Gln Ile Asn Leu Glu Gly Gly Asn Tyr Leu Ile Ser Lys Pro Leu

130 135 140

Gln Leu Val Ala Ala Gly Ala Gly Asn Leu Met Ile His Gly Gly Thr

145 150 155 160

Leu Arg Ala Ser Asp Asp Phe Pro Val Asp Gly Tyr Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Ser Pro Asn Ser Trp Ala Ser Ser Thr Glu Glu Glu Ile Arg Glu Gly

180 185 190

Ser Ser Leu Lys Leu Asn Leu Gln Leu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr

195 200 205

Asn Tyr Glu Tyr Ile Thr Leu Arg Asp Leu Met Leu Asp Ser Asn Tyr

210 215 220

Arg Gly Gly Gly Ile Ser Val Ile Asn Ser Leu Arg Thr Ser Ile Asp

225 230 235 240

Asn Cys Tyr Ile Ala His Phe Ser Thr Asn Gly Ile Leu Val Gln Gly

245 250 255

Gly His Glu Thr Tyr Ile Arg Asn Ser Phe Leu Gly Gln His Ile Thr

260 265 270

Ala Gly Gly Asp Ala Gly Glu Arg Asn Tyr Thr Gly Thr Ala Ile Asn

275 280 285

Leu Met Gly Asn Asp Asn Ala Val Thr Asp Val Val Ile Phe Ser Ala

290 295 300

Ala Ile Gly Ile Met Ala Ser Gly Gln Ala Asn Thr Phe Ser Gly Val

305 310 315 320

His Cys Tyr Asn Lys Ala Thr Gly Phe Gly Gly Thr Gly Ile Tyr Leu

325 330 335

Lys Leu Pro Gly Leu Thr Gln Thr Arg Ile Val Asn Ser Tyr Leu Asp

340 345 350

Tyr Thr Gly Ile Val Ala Glu Asp Pro Val Gln Leu His Ile Ser Ser

355 360 365

Ser Phe Phe Leu Gly Asp Ala Phe Ile Leu Leu Lys Ser Ile Asn Gly

370 375 380

Val Ala Asn Gly Val Thr Ile Val Asp Asn Met Phe Ser Gly Ser Asn

385 390 395 400

Lys Gly Val Asp Ile Val Gln Leu Glu Gly Pro Phe Thr Gln Ile Asp

405 410 415

Gln Val Val Val Asp Arg Asn Ser Ala Lys Gly Met Asn Ile Lys Ala

420 425 430

Thr Val Ala Arg Gly Ser Val Glu Gly Asn Ser Ser Ser Trp Thr Val

435 440 445

Asp Phe Asn Pro Val Leu Leu Phe Pro Asn Leu Ile Lys His Val Gln

450 455 460

Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Arg Gly Ser Ser Phe Pro Ser His Ala Leu

465 470 475 480

Arg Asn Val Ser Glu Asn Gln Val Val Ile Glu Ser Asp Leu Ala Val

485 490 495

Leu Ala Asn Val Phe Val Thr Val Asp Gln Ala

500 505

<210> 16

<211> 3461

<212> DNA

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 16

atggtgttaa atggatgttt aacaaaaatt ttaaaaagtt aaactataat tataattata 60

attgcaattg taatttaagt aataaatggt ataagaaatc accaagtttt catcaaaatg 120

actttaatta tagttcctaa ccctttgtct gacttacgac gattgcttat gctttgtaat 180

agtaagtaaa agacaagatc caagatgaaa aagaatactg gacctagcta tctttgatgc 240

attggcaatc tagctagtag gggaactgga tccatccttc tacttggcag ggcaggcgta 300

aaaatagaca aacatattga attcatatac cacttatctc tttctttttc agtcctctag 360

ctagtcttct accattatat ttgttccttc ccatttaatt catctctcaa ttaaatttat 420

catgctctgt atgttactta catcacatgc ctagtaatat ttcaatttat tggttcctta 480

ttgtaacata tacatattca ctcttaattg catttttaat attctttaat ttcactccac 540

aattaattta tatgcgttta ataatcaatt atttaatttg tgtgtatata aatattctac 600

tcatttgata tgtgaatcag cagaaaattg aagaaatttt tttttctcct tctcgttctc 660

atgcgaaggt ctgggtccat caacgcaaga tatcaattca tgaatataag aagttggtaa 720

aaagttgata agaagctgat aagtgattag tgttttgtca aacaagaata ttttttttat 780

ccattgtcag acaagaaatt aaatttcaaa caggctttac ctaagcaagc tatcctcgca 840

agtcatgtct aaaaatcccc cacacattta aacagaaact ataggtgtca tgtgtgtgat 900

ctaatattat aaaacattct atagatttcc tagcaaatct tagttagccc cttctctttc 960

catgttcctc ctcttgctcc ttcccttcgt catttaaacc gtatgtctct ctctcaaaac 1020

ggagagaaaa cagatcgaaa gatgatggag agaagaaaca tgggaggaag gaatattgct 1080

gtagcaacac tctccatgat attgggtttg ttcctaatcc atgtttctgg cgataattca 1140

cgagtgggaa agttttctgc ttctccttac cacgaccaaa tgcgccaatt gcaagcgttt 1200

aaggcttctc ttattggtcg acaatccgtt tcagtttcac ctatctcgcc ctcttcttca 1260

tcatcctctt cttcgccact gcaggtaaat aatttcttgt gcatctaatt tctaacattt 1320

cctcaatggc ggaacgatgt taattaatta aattaatgca atgtaattga gaatggattt 1380

ggatatatag gaagccatag gtccacgtgt gtatcatgta acaaattatg gagcagaccc 1440

aacggggaaa tcagacagca cagaagcact aaacaaggca atcgcggatg catttcaggt 1500

tcctagtgaa gggttcttga tggaggggat cactaatctt ggagggccac aaattaatct 1560

tgaaggtggg aactacctta tcagtaaacc attgcagtta gttgctgccg gtgcaggaaa 1620

tcttatggta tgcgcaacca aacattttta atcaattgaa attatctttt atactagcta 1680

attgatgtca tgtcataatc tttctttata aagtagaaca atatatatac ttgtatttat 1740

attggctcat catctaccta cttaattacc gtttctatgc tagcagtacc acacatacac 1800

acatataagc atctggtgtt tttggtgaat gaaacccacc tggttggatg acttatgtcg 1860

tccctgagaa aattgcagat ttctatatgt taatgtttcg gcacttaact ctcaaagcaa 1920

agcaatcggt cttttctagg atagaaaaaa tggtaataat aatagctagt aggatatgtg 1980

catgtttgga attgatgata acatatttgt tgaagactga aatgacgacc ttttttatca 2040

tatgaaaatg agatgatgtg cacctaattc caattggtta aactggcaca gactgtatat 2100

aatataatat agtatgtaca ttttgcaaca ttgtagacct gctcaccata ctgaattcca 2160

atgagcaatc gttggagaag agagagtctg ggtctagatt ctgtaattga cgtaatataa 2220

catatataaa atttacgtat gttgaggttt cattaattaa caacgtcgag ttattttttt 2280

tcttttttgg tatctaacaa cgtcagatta attaatgaag catataaact atatcaccaa 2340

ataaaacttt gtttgaattt gctgagttgg gtatttcttt atttaaatta tatatggagc 2400

agatccacgg agggacacta cgagcctcag atgattttcc ggttgatggg tatcttattg 2460

atttgtctcc aaattcatgg gctagcagaa ctgaacaaga aataagaaaa gggagctcct 2520

tgaaattgaa ttcacagctt acctcatcat cgtcatccta taactacgag tacataaccc 2580

tcagagacct gatgttggat tctaattaca gaggtggtgg catttcagtt ataaactcac 2640

taaggactag cattgacaat tgctagattg cccatttctc cactaatgga attttagtcc 2700

aaggcgggca cgagacctat atcaggaatt ctttccttgg gcaacatatc acggccggtg 2760

gtgatgcagg cgaaaggaac tataccggca ctgcaattaa cctaatggga aacgataatg 2820

cagtgacgga tgtggtgatt ttttcagctg ccataggaat aatggcctca ggtcaagcca 2880

acactttttc tggggtgcat tgttacaaca aggcaacagg ttttggtggc acggggattt 2940

acttgaagct gcctggtctt acacaaaccc ggatagtgaa ttcataccta gattacactg 3000

ggattgtggc tgaagaccca gtgcaacttc atatctctag cagttttttc ctcggtgatg 3060

catttatcct cttgaaatca ataaatgggg tagcaaatgg agtgactgta gtggataaca 3120

tgttcagtgg atctaataag ggggttgata taatccagtt agagggtcct ttcacagaaa 3180

ttgatcaggt tgtagttgat aggaatagtg ccaaggggat gaacattaaa gcaacagttg 3240

cgagagggtc tgttgaaggg aatagcagct ccaggacggt tgattttaat cctgttcttt 3300

tatttcctaa cctgattaag catgttcagt attcactaag atcaagcagg ggcagctcat 3360

ttcctagcca tgccctgaga aatgtgtctg aaaatcaagt tgtgattgag tctgatctcg 3420

ctatgcccgc aaatgttttc gtcacggtgg atcaagctta a 3461

<210> 17

<211> 514

<212> PRT

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 17

Met Val Leu Asn Gly Cys Leu Thr Lys Ile Leu Lys Asn Arg Lys Met

1 5 10 15

Met Glu Arg Arg Asn Met Gly Gly Arg Asn Ile Ala Val Ala Thr Leu

20 25 30

Ser Met Ile Leu Gly Leu Phe Leu Ile His Val Ser Gly Asp Asn Ser

35 40 45

Arg Val Gly Lys Phe Ser Ala Ser Pro Tyr His Asp Gln Met Arg Gln

50 55 60

Leu Gln Ala Phe Lys Ala Ser Leu Ile Gly Arg Gln Ser Val Ser Val

65 70 75 80

Ser Pro Ile Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu Gln

85 90 95

Glu Ala Ile Gly Pro Arg Val Tyr His Val Thr Asn Tyr Gly Ala Asp

100 105 110

Pro Thr Gly Lys Ser Asp Ser Thr Glu Ala Leu Asn Lys Ala Ile Ala

115 120 125

Asp Ala Phe Gln Val Pro Ser Glu Gly Phe Leu Met Glu Gly Ile Thr

130 135 140

Asn Leu Gly Gly Pro Gln Ile Asn Leu Glu Gly Gly Asn Tyr Leu Ile

145 150 155 160

Ser Lys Pro Leu Gln Leu Val Ala Ala Gly Ala Gly Asn Leu Met Ile

165 170 175

His Gly Gly Thr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Phe Pro Val Asp Gly Tyr

180 185 190

Leu Ile Asp Leu Ser Pro Asn Ser Trp Ala Ser Arg Thr Glu Gln Glu

195 200 205

Ile Arg Lys Gly Ser Ser Leu Lys Leu Asn Ser Gln Leu Thr Ser Ser

210 215 220

Ser Ser Ser Tyr Asn Tyr Glu Tyr Ile Thr Leu Arg Asp Leu Met Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asn Tyr Arg Gly Gly Gly Ile Ser Ile Ala His Phe Ser Thr

245 250 255

Asn Gly Ile Leu Val Gln Gly Gly His Glu Thr Tyr Ile Arg Asn Ser

260 265 270

Phe Leu Gly Gln His Ile Thr Ala Gly Gly Asp Ala Gly Glu Arg Asn

275 280 285

Tyr Thr Gly Thr Ala Ile Asn Leu Met Gly Asn Asp Asn Ala Val Thr

290 295 300

Asp Val Val Ile Phe Ser Ala Ala Ile Gly Ile Met Ala Ser Gly Gln

305 310 315 320

Ala Asn Thr Phe Ser Gly Val His Cys Tyr Asn Lys Ala Thr Gly Phe

325 330 335

Gly Gly Thr Gly Ile Tyr Leu Lys Leu Pro Gly Leu Thr Gln Thr Arg

340 345 350

Ile Val Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Thr Gly Ile Val Ala Glu Asp Pro

355 360 365

Val Gln Leu His Ile Ser Ser Ser Phe Phe Leu Gly Asp Ala Phe Ile

370 375 380

Leu Leu Lys Ser Ile Asn Gly Val Ala Asn Gly Val Thr Val Val Asp

385 390 395 400

Asn Met Phe Ser Gly Ser Asn Lys Gly Val Asp Ile Ile Gln Leu Glu

405 410 415

Gly Pro Phe Thr Glu Ile Asp Gln Val Val Val Asp Arg Asn Ser Ala

420 425 430

Lys Gly Met Asn Ile Lys Ala Thr Val Ala Arg Gly Ser Val Glu Gly

435 440 445

Asn Ser Ser Ser Arg Thr Val Asp Phe Asn Pro Val Leu Leu Phe Pro

450 455 460

Asn Leu Ile Lys His Val Gln Tyr Ser Leu Arg Ser Ser Arg Gly Ser

465 470 475 480

Ser Phe Pro Ser His Ala Leu Arg Asn Val Ser Glu Asn Gln Val Val

485 490 495

Ile Glu Ser Asp Leu Ala Met Pro Ala Asn Val Phe Val Thr Val Asp

500 505 510

Gln Ala

<210> 18

<211> 10242

<212> DNA

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 18

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagctcagaa gaactcgtca 300

agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 360

aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 420

tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 480

ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcatcgccg 540

tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 600

tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 660

cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 720

attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 780

tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 840

acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc 900

agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 960

gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 1020

aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatc 1080

ccgggatctg cgaaagctcg agagagatag atttgtagag agagactggt gatttcagcg 1140

tgtcctctcc aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga aggatagtgg 1200

gattgtgcgt catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg ctttgaagac 1260

gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga 1320

ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg 1380

taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg 1440

aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct 1500

tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgtta 1560

tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc 1620

ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc 1680

tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg 1740

atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt 1800

tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag 1860

acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc 1920

tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag 1980

cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt 2040

tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 2100

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttttaat ctgatgctcc acctgctttt 2160

gattttcttt attggaagag tctttaagag atatgttaag tagcataaca gtttcatcaa 2220

aaacaacatt tctgttaatc acaacttttc tattttcagg ataccataac ttatacactt 2280

ttacactagc tttataacca agaaaaacac atttaatggt acacaatttt aattttccat 2340

tatcagcatg agtatacgca aaacacccaa aaatctttaa atcagaatcg tcagcaggat 2400

tactaaacca tacttcttat ggagtctttt tctcaatagc aacgaataga gacggattga 2460

tcaaaaacat atagttgaca ttgctttggc ccaaaataac tttgataagt tgccatttga 2520

caacatacat cgaacattct ccatgatcgt tctattcatt cgttctacaa tacctttttt 2580

aaaatgttca ggttctaaaa tgaaaaacaa tatgaattgc atgaattgct tatatgtcct 2640

atgaattata aaggaatgcg gttgaaatat tcccatcgat acatacatac atattcgtga 2700

agtatgttcc aatataatat caatattggg atttacgttt tataaagcaa cattattgat 2760

tggtaatata cattaattcc aaggcaaacc caaatatttt aaaatttaac ctacaactgt 2820

ggtaaatcaa acttaatagt aacccgattg taatgtgaag tcaaatatga aagtaacatt 2880

ggtttatata tatatttttc tctaaattct aataatcaag ttgggataag tgataaacac 2940

tgagcttgcc acgtgtgtta acctcgtttt catcatgtgc cactccaaag acatcaggcc 3000

tctattcaag ctggcatggt caggacgtgg tagcatactt cagggatctg gttagaaaat 3060

atcccatatc gctaaagaac tataacacag gagcgtttat ataagcgaaa gaagcatcag 3120

atgggcaaac aaagcaccag tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc 3180

cgggttcgat tcccggctgg tgcaaggctc gtagtgtccc tccggtttta gagctagaaa 3240

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 3300

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 3360

gattcccggc tggtgcaatt atggagcaga cccaacggtt ttagagctag aaatagcaag 3420

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg 3480

ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcatgcc 3540

tgcaggtcca caaattcggg tcaaggcgga agccagcgcg ccaccccacg tcagcaaata 3600

cggaggcgcg gggttgacgg cgtcacccgg tcctaacggc gaccaacaaa ccagccagaa 3660

gaaattacag taaaaaaaaa gtaaattgca ctttgatcca ccttttatta cctaagtctc 3720

aatttggatc acccttaaac ctatcttttc aatttgggcc gggttgtggt ttggactacc 3780

atgaacaact tttcgtcatg tctaacttcc ctttcagcaa acatatgaac catatataga 3840

ggagatcggc cgtatactag agctgatgtg tttaaggtcg ttgattgcac gagaaaaaaa 3900

aatccaaatc gcaacaatag caaatttatc tggttcaaag tgaaaagata tgtttaaagg 3960

tagtccaaag taaaacttat agataataaa atgtggtcca aagcgtaatt cactcaaaaa 4020

aaatcaacga gacgtgtacc aaacggagac aaacggcatc ttctcgaaat ttcccaaccg 4080

ctcgctcgcc cgcctcgtct tcccggaaac cgcggtggtt tcagcgtggc ggattctcca 4140

agcagacgga gacgtcacgg cacgggactc ctcccaccac ccaaccgcca taaataccag 4200

ccccctcatc tcctctcctc gcatcagctc cacccccgaa aaatttctcc ccaatctcgc 4260

gaggctctcg tcgtcgaatc gaatcctctc gcgtcctcaa ggtacgctgc ttctcctctc 4320

ctcgcttcgt ttcgattcga tttcggacgg gtgaggttgt tttgttgcta gatccgattg 4380

gtggttaggg ttgtcgatgt gattatcgtg agatgtttag gggttgtaga tctgatggtt 4440

gtgatttggg cacggttggt tcgataggtg gaatcgtggt taggttttgg gattggatgt 4500

tggttctgat gattgggggg aatttttacg gttagatgaa ttgttggatg attcgattgg 4560

ggaaatcggt gtagatctgt tggggaattg tggaactagt catgcctgag tgattggtgc 4620

gatttgtagc gtgttccatc ttgtaggcct tgttgcgagc atgttcagat ctactgttcc 4680

gctcttgatt gagttattgg tgccatgggt tggtgcaaac acaggcttta atatgttata 4740

tctgttttgt gtttgatgta gatctgtagg gtagttcttc ttagacatgg ttcaattatg 4800

tagcttgtgc gtttcgattt gatttcatat gttcacagat tagataatga tgaactcttt 4860

taattaattg tcaatggtaa ataggaagtc ttgtcgctat atctgtcata atgatctcat 4920

gttactatct gccagtaatt tatgctaaga actatattag aatatcatgt tacaatctgt 4980

agtaatatca tgttacaatc tgtagttcat ctatataatc tattgtggta atttcttttt 5040

actatctgtg tgaagattat tgccactagt tcattctact tatttctgaa gttcaggata 5100

cgtgtgctgt tactacctat ctgaatacat gtgtgatgtg cctgttacta tctttttgaa 5160

tacatgtatg ttctgttgga atatgtttgc tgtttgatcc gttgttgtgt ccttaatctt 5220

gtgctagttc ttaccctatc tgtttggtga ttatttcttg cagatagtta tcaacaagtt 5280

tgtacaaaaa agcaggcttc gaaggagata gaaccaattc tctaaggaaa tacttaacca 5340

tggactataa ggaccacgac ggagactaca aggatcatga tattgattac aaagacgatg 5400

acgataagat ggccccaaag aagaagcgga aggtcggtat ccacggagtc ccagcagccg 5460

acaagaagta cagcatcggc ctggacatcg gcaccaactc tgtgggctgg gccgtgatca 5520

ccgacgagta caaggtgccc agcaagaaat tcaaggtgct gggcaacacc gaccggcaca 5580

gcatcaagaa gaacctgatc ggagccctgc tgttcgacag cggcgaaaca gccgaggcca 5640

cccggctgaa gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg atctgctatc 5700

tgcaagagat cttcagcaac gagatggcca aggtggacga cagcttcttc cacagactgg 5760

aagagtcctt cctggtggaa gaggataaga agcacgagcg gcaccccatc ttcggcaaca 5820

tcgtggacga ggtggcctac cacgagaagt accccaccat ctaccacctg agaaagaaac 5880

tggtggacag caccgacaag gccgacctgc ggctgatcta tctggccctg gcccacatga 5940

tcaagttccg gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa ccccgacaac agcgacgtgg 6000

acaagctgtt catccagctg gtgcagacct acaaccagct gttcgaggaa aaccccatca 6060

acgccagcgg cgtggacgcc aaggccatcc tgtctgccag actgagcaag agcagacggc 6120

tggaaaatct gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa tggcctgttc ggaaacctga 6180

ttgccctgag cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa cttcgacctg gccgaggatg 6240

ccaaactgca gctgagcaag gacacctacg acgacgacct ggacaacctg ctggcccaga 6300

tcggcgacca gtacgccgac ctgtttctgg ccgccaagaa cctgtccgac gccatcctgc 6360

tgagcgacat cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc ccccctgagc gcctctatga 6420

tcaagagata cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct gaaagctctc gtgcggcagc 6480

agctgcctga gaagtacaaa gagattttct tcgaccagag caagaacggc tacgccggct 6540

acattgacgg cggagccagc caggaagagt tctacaagtt catcaagccc atcctggaaa 6600

agatggacgg caccgaggaa ctgctcgtga agctgaacag agaggacctg ctgcggaagc 6660

agcggacctt cgacaacggc agcatccccc accagatcca cctgggagag ctgcacgcca 6720

ttctgcggcg gcaggaagat ttttacccat tcctgaagga caaccgggaa aagatcgaga 6780

agatcctgac cttccgcatc ccctactacg tgggccctct ggccagggga aacagcagat 6840

tcgcctggat gaccagaaag agcgaggaaa ccatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg 6900

tggacaaggg cgcttccgcc cagagcttca tcgagcggat gaccaacttc gataagaacc 6960

tgcccaacga gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta cgagtacttc accgtgtata 7020

acgagctgac caaagtgaaa tacgtgaccg agggaatgag aaagcccgcc ttcctgagcg 7080

gcgagcagaa aaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac caaccggaaa gtgaccgtga 7140

agcagctgaa agaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtg gaaatctccg 7200

gcgtggaaga tcggttcaac gcctccctgg gcacatacca cgatctgctg aaaattatca 7260

aggacaagga cttcctggac aatgaggaaa acgaggacat tctggaagat atcgtgctga 7320

ccctgacact gtttgaggac agagagatga tcgaggaacg gctgaaaacc tatgcccacc 7380

tgttcgacga caaagtgatg aagcagctga agcggcggag atacaccggc tggggcaggc 7440

tgagccggaa gctgatcaac ggcatccggg acaagcagtc cggcaagaca atcctggatt 7500

tcctgaagtc cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca gctgatccac gacgacagcc 7560

tgacctttaa agaggacatc cagaaagccc aggtgtccgg ccagggcgat agcctgcacg 7620

agcacattgc caatctggcc ggcagccccg ccattaagaa gggcatcctg cagacagtga 7680

aggtggtgga cgagctcgtg aaagtgatgg gccggcacaa gcccgagaac atcgtgatcg 7740

aaatggccag agagaaccag accacccaga agggacagaa gaacagccgc gagagaatga 7800

agcggatcga agagggcatc aaagagctgg gcagccagat cctgaaagaa caccccgtgg 7860

aaaacaccca gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta cctgcagaat gggcgggata 7920

tgtacgtgga ccaggaactg gacatcaacc ggctgtccga ctacgatgtg gaccatatcg 7980

tgcctcagag ctttctgaag gacgactcca tcgacaacaa ggtgctgacc agaagcgaca 8040

agaaccgggg caagagcgac aacgtgccct ccgaagaggt cgtgaagaag atgaagaact 8100

actggcggca gctgctgaac gccaagctga ttacccagag aaagttcgac aatctgacca 8160

aggccgagag aggcggcctg agcgaactgg ataaggccgg cttcatcaag agacagctgg 8220

tggaaacccg gcagatcaca aagcacgtgg cacagatcct ggactcccgg atgaacacta 8280

agtacgacga gaatgacaag ctgatccggg aagtgaaagt gatcaccctg aagtccaagc 8340

tggtgtccga tttccggaag gatttccagt tttacaaagt gcgcgagatc aacaactacc 8400

accacgccca cgacgcctac ctgaacgccg tcgtgggaac cgccctgatc aaaaagtacc 8460

ctaagctgga aagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg cggaagatga 8520

tcgccaagag cgagcaggaa atcggcaagg ctaccgccaa gtacttcttc tacagcaaca 8580

tcatgaactt tttcaagacc gagattaccc tggccaacgg cgagatccgg aagcggcctc 8640

tgatcgagac aaacggcgaa accggggaga tcgtgtggga taagggccgg gattttgcca 8700

ccgtgcggaa agtgctgagc atgccccaag tgaatatcgt gaaaaagacc gaggtgcaga 8760

caggcggctt cagcaaagag tctatcctgc ccaagaggaa cagcgataag ctgatcgcca 8820

gaaagaagga ctgggaccct aagaagtacg gcggcttcga cagccccacc gtggcctatt 8880

ctgtgctggt ggtggccaaa gtggaaaagg gcaagtccaa gaaactgaag agtgtgaaag 8940

agctgctggg gatcaccatc atggaaagaa gcagcttcga gaagaatccc atcgactttc 9000

tggaagccaa gggctacaaa gaagtgaaaa aggacctgat catcaagctg cctaagtact 9060

ccctgttcga gctggaaaac ggccggaaga gaatgctggc ctctgccggc gaactgcaga 9120

agggaaacga actggccctg ccctccaaat atgtgaactt cctgtacctg gccagccact 9180

atgagaagct gaagggctcc cccgaggata atgagcagaa acagctgttt gtggaacagc 9240

acaagcacta cctggacgag atcatcgagc agatcagcga gttctccaag agagtgatcc 9300

tggccgacgc taatctggac aaagtgctgt ccgcctacaa caagcaccgg gataagccca 9360

tcagagagca ggccgagaat atcatccacc tgtttaccct gaccaatctg ggagcccctg 9420

ccgccttcaa gtactttgac accaccatcg accggaagag gtacaccagc accaaagagg 9480

tgctggacgc caccctgatc caccagagca tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc 9540

tgtctcagct gggaggcgac aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa 9600

agaaaaagta agaattcgcg gccgcactcg agatatctag acccagcttt cttgtacaaa 9660

gtggttgata acagcgacta caaggatgac gatgacaagg cttagagctc gaatttcccc 9720

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 9780

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 9840

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 9900

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 9960

atgttactag atcgggaatt cactggccgt cgttttacac tggccgtcgt tttacaacgt 10020

cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc 10080

gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 10140

ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga ttgtcgtttc ccgccttcag 10200

tttaaactat cagtgtttga caggatatat tggcgggtaa ac 10242

Claims

1.一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；

2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；

4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料；

所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述筛选含CRISPR/Cas9和sgRNA的T-DNA片段的方法是利用gRNA1-Hi-Tom-gb-S和gRNA1-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA1，用gRNA2-Hi-Tom-gb-S和gRNA2-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA2；

gRNA1-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

gRNA1-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

gRNA2-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

gRNA2-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

2.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤2)中sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤A中所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；

所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述GhNSP-CRISPR-1-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求2所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤A中所述扩增含所述sgRNA2的目标片段2用引物对为GhNSP-CRISPR-2-S和GhNSP-CRISPR-2-AS；

所述GhNSP-CRISPR-2-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述GhNSP-CRISPR-2-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

5.根据权利要求2～4任意一项所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR方法中所用的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的inf-pRGER32-7-S和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的infGhNSP-CRISPR-AS。

6.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，所述陆地棉材料包括Jin668。

7.根据权利要求1～4和6任意一项所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，所述海岛棉包括新海35号。