CN112626079A

CN112626079A - 一种ZmSAUR15基因及其在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用

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Publication number: CN112626079A
Application number: CN202011483687.0A
Authority: CN
Inventors: 马浪浪; 何世江; 沈亚欧; 王艳丽
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-12-16
Also published as: CN112626079B

Abstract

本发明提供一种ZmSAUR15基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种由ZmSAUR15基因编码的ZmSAUR15蛋白，其序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供ZmSAUR15基因在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用。本发明有效扩大了胚性愈伤组织诱导能力强的玉米种质资源的选择范围。

Description

一种ZmSAUR15基因及其在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用

技术领域

本发明属于转基因植物技术领域，一种ZmSAUR15基因及其在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用。

背景技术

转基因技术能够缩短育种年限，打破物种间界限，靶向精确改良基因等优势。在转基因转化系统中，优良的转化受体是转化成功的基础。玉米幼胚诱导的胚性愈伤组织因为其具有繁殖力强，不受季节影响，具有高效分化成完整植株的能力等优势而被广泛应用。然而胚性愈伤组织诱导能力强的种质资源稀少，限制了转基因技术的快速发展和应用。

SAUR基因是植物中早期生长素应答基因家族，活性生长素在2-5分钟内诱导其表达，说明生长素在SAUR基因的转录调控中发挥重要作用。水稻和拟南芥有关报道SAUR家族参与植物生长、生长素合成有关。玉米中报道的SAUR家族参与了生长素介导的细胞伸长。但还未见其参与玉米胚性愈伤组织的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种ZmSAUR15基因及其在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用，其有效扩大了胚性愈伤组织诱导能力强的玉米种质资源的选择范围。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

提供一种ZmSAUR15基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供ZmSAUR15基因在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用，通过敲除 ZmSAUR15基因提高玉米胚性愈伤组织诱导率。

根据上述技术方案，本发明具有如下优点：

本发明对309份玉米自交系胚性愈伤组织形成能力进行了调查，鉴定了胚性愈伤组织诱导率高、低的极端材料。对这16个基因CDS和启动子分别在极端材料中进行PCR序列扩增，只有基因SAUR15在极端材料中表现出有规律的遗传差异。因此，SAUR15被认为是潜在的控制胚性愈伤组织形成能力的关键基因。随后对SAUR15进行了候选基因关联分析，确定影响性状的基因内部原因。并通过拟南芥过表达、玉米突变体、玉米过表达、亚细胞定位、组织学观察等手段验证了SAUR15参与调控玉米胚性愈伤组织的形成。本发明首次明确了 ZmSAUR15基因与诱导胚性愈伤组织的关系，可以通过敲除ZmSAUR15基因提高玉米胚性愈伤组织诱导率，产生胚性愈伤组织诱导能力强的种质资源，扩大了植物转基因转化受体，特别是玉米转基因转化受体的选择范围。

附图说明

图1为胚性愈伤组织(EC)和非胚性愈伤组织(NEC)的表型；

图2为ZmSAUR15基因在极端材料中的序列信息和比对结果，序列信息按材料诱导率高低从上到下排序；

图3为不同单倍型的平均胚性愈伤组织诱导率(ECIR)；

图4为含有ZmSAUR15_SCL155的转基因植株OE1与野生型拟南芥Col诱导的愈伤组织表型；

图5为含有ZmSAUR15_SCL155的转基因植株OE1与野生型拟南芥Col诱导的愈伤组织增殖状况；

图6为含有ZmSAUR15_SCL155的转基因植株OE1和OE5与野生型拟南芥Col诱导愈伤组织平均鲜重的柱状图；

图7为含有ZmSAUR15_SCL155的转基因植株OE1和OE5与野生型拟南芥Col诱导愈伤组织平均直径的柱状图；

图8为阳性转化植株OE1、OE2和OE3和野生型综31中ZmSAUR15的相对表达量结果。

图9为玉米T₃代阳性转化植株与野生型材料(wild type，WT)幼胚出芽率；

图10为玉米T₃代阳性转化植株与野生型材料幼胚出芽率的柱状图；

图11为玉米T₃代阳性转化植株与野生型材料幼胚诱导率；

图12为玉米T₃代阳性转化植株与野生型材料幼胚诱导率的柱状图；

图13为Mu突变体zmsaur15和野生型W22的愈伤组织形态；

图14为Mu突变体zmsaur15和野生型W22的诱导率的柱状图；

图15为Mu突变体zmsaur15和野生型W22的鲜重柱状图；

图16为Mu突变体zmsaur15和野生型W22愈伤组织分化绿点图；

图17为Mu突变体zmsaur15和野生型W22愈伤组织分化绿点柱状图；

图18为CRISPR/Cas9所得的抗性胚性愈伤组织和对照组愈伤组织的对照图；

图19为抗性胚性愈伤组织的U6启动子PCR扩增后产物的电泳图；

图20为CRISPR/Cas9的sgRNA和PAM序列；

图21为野生型玉米的胚性愈伤组织和抗性胚性愈伤组织的测序结果；

图22为拟南芥野生型Col和转基因材料愈伤组织电镜观察；

图23为玉米野生型W22与转基因材料愈伤组织电镜观察；

图24为拟南芥野生型Col和转基因材料愈伤组织石蜡切片观察；

图25为玉米野生型W22与转基因材料愈伤组织石蜡切片观察。

具体实施方式

在本发明中，首先，在三个环境下(四川温江、四川崇州、云南西双版纳)对309份玉米自交系胚性愈伤组织诱导率进行调查；对前期通过转录组数据分析鉴定到的16个影响胚性愈伤组织形成能力基因的CDS及启动子序列分别在胚性愈伤组织高诱导率和低诱导率自交系中扩增，初步确定控制胚性愈伤组织诱导率的基因为ZmSAUR15。

其次，对基因ZmSAUR15的CDS区和启动子区分别在以上309份自交系中进行PCR序列扩增，挖掘SNP和Indel变异；结合表型调查结果和SNP和Indel标记进行关联分析，确定了基因ZmSAUR15为控制胚性愈伤组织诱导率的目标基因，并发现CDS区和启动子区均存在SCL155为代表的优异单倍型和B73为代表的非优异单倍型。

再次，亚细胞定位表明ZmSAUR15定位在细胞核中。分别用CDS区两个单倍型构建拟南芥过表达载体，结果表明ZmSAUR15抑制愈伤组织的形成，而且野生型拟南芥愈伤组织IAA含量显著高于转基因材料愈伤组织，说明ZmSAUR15在生长素代谢通路中通过影响 IAA的合成，负向调控胚性愈伤组织的形成。两种CDS区单倍型过表达拟南芥后，愈伤组织表型受到抑制程度一致，表明CDS区变异并不是影响胚性愈伤组织诱导能力的原因。组织学观察表明ZmSAUR15可能通过调节细胞大小、细胞扩增来调节愈伤组织形成。

进而再利用GUS报告基因检测ZmSAUR15不同单倍型对下游基因驱动活性的影响。结果表明由ProZmSAUR15_B73启动子驱动的mRNA和GUS酶活性均显著高于由ProZmSAUR15_SCL155启动子驱动的mRNA和酶活性。并且以B73为代表的单倍型在愈伤组织诱导过程中ZmSAUR15的表达量要高于以SCL155为代表的单倍型，ProZmSAUR15_B73单倍型胚性愈伤组织诱导率显著低于ProZmSAUR15_SCL155单倍型胚性愈伤组织诱导率。表明启动子区变异是影响胚性愈伤组织诱导能力的根本原因。以SCL155、B73为代表的单倍型分别被鉴定为优异单倍型、非优异单倍型。

最后，在玉米自交系综31中过表达ZmSAUR15，与对照相比转基因材料胚性愈伤组织诱导率显著降低，在玉米自交系SCL155幼胚中敲除ZmSAUR15能够提高胚性愈伤组织诱导率；玉米ZmSAUR15的Mu突变体所诱导的愈伤组织结构致密，存在分生组织区，胚性状态优于W22的愈伤组织。进一步验证了ZmSAUR15负调控胚性愈伤组织形成。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规生物学实验方法操作。

实施例1玉米胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的表型观察

玉米胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的表型观察，包括以下步骤：

(1)消毒挑胚：以授粉后10-15天、胚大小直径在1.2-1.5mm的玉米穗为材料，取309份材料，用75％酒精进行一次消毒，然后剥离苞叶，再用75％酒精进行二次消毒，最后在超净工作台环境下进行挑胚，选择穗中部的胚；

(2)诱导培养：将步骤(1)所得的穗中部的胚放在MS培养基为基础的诱导培养基进行诱导；

诱导N6培养基配方(后续的玉米诱导培养基也如此)：N6大量(100ml/L),N6有机(1ml/L), N6微II(1ml/L),B5微I(1ml/L),铁盐(5ml/L),2，4-D 2mg/L+肌醇120mg/L+L-脯氨酸1.38g/L+ 水解酪蛋白500mg/L,蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L,pH6.0。

上述配方中，N6大量包括如下成分和浓度(mg/L)：

硝酸钾(KNO₃)：2830、硫酸铵(NH₄SO₄)：463、氯化钙(CaCl₂·2HzO)：166、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)：185、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：400。

N6微量Ⅱ(mg/L)：

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)：25、硫酸铜(Cu₂SO₃)：2.5、氯化钴(CoCl₂·6H₂O)：2.5。

N6有机(mg/L)：

甘氨酸：200、烟酸：50、盐酸硫胺素(维B1)：40、盐酸吡哆素(维B6)：50。

B5微量Ⅰ(mg/L)：

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)：200、硼酸(H₂BO₃)：300、碘化钾(KI)：75、硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)： 100。

铁盐(mg/L)：硫酸铁(FeSO₄·4H₂O)：5560、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)：7460。

(3)结果观察：对步骤(2)所得的诱导后5d、10d、15d、20d、25d的胚进行观察，统计不同材料的胚性愈伤组织诱导情况，如表1和图1。

表1 309份GWAS群体材料胚性愈伤组织诱导表型

图1中的左图为诱导20天SCL155材料的胚性愈伤组织代表，右图为诱导20天B73的非胚性愈伤组织。

实施例2 ZmSAUR15基因的关联分析

ZmSAUR15基因的关联分析，包括以下步骤：

(1)ZmSAUR15基因与胚性愈伤组织诱导率相关度分析

根据实施例1的统计结果，在309份材料中选择诱导率最高的5份材料和诱导率最低的五份材料，在高、低诱导率材料中扩增生长素代谢通路上的16个候选基因(表2)，进行ZmSAUR15基因的PCR扩增测序，并对测序结果进行比对，结果见图2。

上述PCR扩增过程如对ZmSAUR15基因的PCR扩增引物序列如下：

F:5’-ATGCAGCAGCAAGATCCGGT-3’(SEQ ID NO.3)；

R:5’-TTAAAAGAAGAAAAAAGAGACGAGA-3’(SEQ ID NO.4)；

PCR反应体系(表3)和反应程序如下：

94℃预变性4min，98℃变性40s，58℃退火40s，68℃延伸1min，35个循环，68℃再延伸10min。KOD高保真酶反应体系：20ul：

表2生长素代谢通路上的16个候选基因

表3 PCR反应体系

图2(图2中的下面的图承接上面的图)中，高诱导材料代表为：SCL027、SCL108、SCL155、SCL 250、SCL 318；低诱导材料代表为：SCL004、SCL 006、SCL 070、SCL 117、SCL 356，候选基因GRMZM2G135978(Tir1)等15个基因的序列在高低诱导率材料中不存在规律性，CDS区和启动子区多态性位点与胚性愈伤组织诱导率之间无明显相关性(图2)，而候选基因GRMZM2G365162(ZmSAUR15)在极端材料中的CDS区规律地存在3个SNP(singlenucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)和15bp的Indel(insertion-deletion，插入缺失标记)，并且等位基因变异与胚性愈伤组织诱导率高度相关，确认了基因ZmSAUR15和胚性愈伤组织诱导率高度相关。ZmSAUR15的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)ZmSAUR15基因与胚性愈伤组织诱导率相关性状的关联分析

利用PCR扩增、测序并比对309份材料基因ZmSAUR15的CDS区间，在CDS区检测到 25个SNP和14个Indel；其中，12个SNP产生非同义突变，13个SNP产生同义突变。

对ZmSAUR15和玉米胚性愈伤组织诱导率相关性状采用GLM(generalize linearmodel，广义线性模型)和MLM(Mixed linear model，混合线性模型)研究，探讨胚性愈伤组织诱导率、愈伤组织膨大直径、芽长、出芽率与SNP和Indel的相关性，并以此确认单倍型。

结果如下所示，GLM模型下在三个环境(崇州、西双版纳、温江)下检测的18个SNP和5个Indel与胚性愈伤组织诱导率显著相关，两个环境(云南、崇州)下检测到两个SNP 与1个Indel与胚性愈伤组织诱导率显著相关；MLM模型下在三个环境下(崇州、西双版纳、温江)检测到1个SNP和1个Indel与胚性愈伤组织诱导率显著相关，两个环境(云南、崇州)下检测到5个Indel和22个SNP与胚性愈伤组织诱导率显著相关；

GLM模型下三个环境下(崇州、西双版纳、温江)检测到4个Indel与愈伤组织膨大直径显著相关，MLM模型下4个Indel与愈伤组织膨大直径显著相关；

GLM模型下三个环境下(崇州、西双版纳、温江)检测到3个Indel和2个SNP与芽长显著相关，MLM模型下三个环境下(崇州、西双版纳、温江)检测到1个SNP，两个环境下(云南、崇州)检测到3个Indel和1个SNP与芽长显著相关；

GLM模型下两个环境下(云南、崇州)检测到3个Indel与出芽率显著相关，MLM模型下两个环境下(云南、崇州)检测到3个Indel和1个SNP与出芽率显著相关。

如图3所示，使用GLM和MLM两个模型多环境下检测到的5个Indel和19个SNP用于评价单倍型，利用DNASP6软件将309份自交系确定了5个单倍型，Hap1和Hap2是最主要的单倍型；其中，单倍型Hap1的胚性愈伤组织诱导率较低，单倍型Hap2的胚性愈伤组织诱导率较高，低诱导率材料B73是单倍型Hap1的代表自交系，高诱导率材料SCL155是单倍型Hap2的代表自交系。

实施例3拟南芥中过表达基因ZmSAUR15抑制愈伤组织形成

拟南芥中过表达基因ZmSAUR15抑制愈伤组织形成，包括以下步骤：

(1)构建转基因载体：使用低诱导率材料B73和高诱导率材料SCL155的ZmSAUR15基因构建过表达载体AN101-35S：ZmSAUR15_SCL155和AN101-35S：ZmSAUR15_B73；

(2)侵染拟南芥：使用步骤(1)所得的过表达载体侵染野生型拟南芥Col，得到侵染后的T₀代种子；

其中，侵染过程为：将含有目的重组质粒的农杆菌菌液扩繁后，待菌液的OD₆₀₀达到1.0-1.2 时，于4500r/min下，离心10min后，收集菌体，然后用等体积的渗透培养基将其迅速悬浮备用。悬浮液中加入万分之一的silwetL-77，然后将侵染液倒入大口培养皿中，将拟南芥开过的花和果荚减掉，将健状未开花的花苞置于悬浮液中2min，之后用黑色塑料袋遮盖，平放黑暗培养12小时，揭开塑料袋后16h光照，8h黑暗培养，28℃条件下正常培养至收种。

(3)培养拟南芥：将步骤(2)所得的T₀代种子置于含有KANR(50mg)1/2MS培养基上培养生长，得到拟南芥幼苗；

(4)筛选拟南芥幼苗：在步骤(3)所得的拟南芥幼苗中选择颜色较绿的植株，得到抗 KANA植株；

(5)PCR验证：用PCR检测步骤(4)所得的抗KANA植株，获得含有ZmSAUR15_SCL155的转基因植株OE1和OE5、含有ZmSAUR15_B73的转基因植株OE4和OE6；

引物序列：

F:5’-ATGCAGCAGCAAGATCCGGT-3’(SEQ ID NO.3)；

R:5’-TTAAAAGAAGAAAAAAGAGACGAGA-3’(SEQ ID NO.4)；

PCR反应程序及反应体系如下：

表4 PCR反应体系

(6)诱导愈伤组织：在B5诱导培养基上诱导培养步骤(5)所得的转基因植株和野生型拟南芥Col，促使步骤(5)所得的转基因植株和野生型拟南芥Col生成愈伤组织。

实验结果如图4所示(图4中从左到右分别代表培养10天、20天、30天、40天和50 天后形成的愈伤组织)，培养10天后转基因植株OE1和野生型拟南芥Col形成愈伤组织；培养20天后野生型拟南芥Col的愈伤组织增殖速度快于转基因植株OE1诱导的愈伤组织，利用微型显微镜观察单个愈伤组织的时候，可以发现转基因材料OE1只在叶片表面的叶脉形成愈伤组织，而且不出现增殖现象，而野生型拟南芥叶片诱导的愈伤组织呈现不断增殖的状态，叶片和叶脉都会分化成愈伤组织，愈伤组织逐渐增殖成球形；培养30天后转基因材料OE1的愈伤组织表现出停止生长的状态，只有叶片表面的叶脉形成愈伤组织，叶片几乎枯死；

如图5所示，30天到60天愈伤组织没有出现增殖的表型，而野生型叶片诱导的愈伤组织增殖明显加快，叶脉和叶片都形成愈伤组织，而且愈伤组织团几乎成圆形，愈伤组织体积增大，差异显著；

如图6和图7示，野生型和转基因材料的叶片诱导愈伤组织平均鲜重和愈伤组织平均直径表现出明显不同。

由实验结果可知，拟南芥中过表达基因ZmSAUR15能抑制愈伤组织的形成。

实施例4玉米中过表达基因ZmSAUR15抑制愈伤组织形成

玉米中过表达基因ZmSAUR15抑制愈伤组织形成，包括以下步骤：

(2)构建基因ZmSAUR15的表达载体Globulin-I：ZmSAUR1在高诱导率自交系综31中过量表达基因ZmSAUR15，利用除草剂结合PCR，确定阳性转化植株，分析阳性转化植株和野生型玉米综31基因ZmSAUR15的表达量，并将阳性转化植株正常培养3代，得到T3代阳性转化植株；

(2)诱导愈伤组织转化：将步骤(1)所得的T3代阳性转化植株以及野生型综31幼胚在B5培养基上28℃黑暗条件下进行愈伤组织诱导。

(3)诱导愈伤组织发芽率：将步骤(2)所得的T3代阳性转化植株以及野生型综31的愈伤组织进行发芽诱导。

确定的3个阳性转化植株为OE1、OE2和OE3，OE1、OE2和OE3中ZmSAUR15表达量均显著高于野生型综31，并且T₃代阳性转化植株的结实率较对照差，籽粒败育，愈伤组织状态差于对照综31(图8)。

如图9、图10、图11和图12所示，对转基因材料与对照综31进行愈伤组织诱导，发现转化事件OE1-3的胚性愈伤组织诱导率显著低于对照，而且OE1-3的出芽率也显著小于野生型综31。

实施例5验证ZmSAUR15在玉米愈伤组织形成过程中的作用

验证ZmSAUR15在玉米愈伤组织形成过程中的作用，包括以下步骤：

(1)筛选纯合Mu突变体：利用特异性引物和TIR6鉴定Mu突变体，得到纯合Mu突变体zmsaur15；

表5特异性引物序列

(2)诱导愈伤组织：诱导(培养基成分与上述实列1中诱导培养基一致)野生型玉米W22和纯合Mu突变体培养生成愈伤组织；

(3)分化愈伤组织：将培养25天的愈伤组织置于N6分化培养基上配养10天。

N6分化培养基：N6大量(100ml/L)，N6有机(1ml/L)，N6微II(1ml/L)，MS微I(1ml/L)，铁盐(5ml/L)，KT 1mg/L+肌醇120mg/L+L-脯氨酸1.38g/L+水解酪蛋白500mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L，pH6.0。

此处的N6大量、N6有机、N6微II、MS微I跟诱导N6培养基提到的这些成分一致。

结果如图13所示，Mu纯和突变体形成的愈伤组织表面有明显的黄色颗粒状突起，类似于胚状体，W22诱导的愈伤组织水渍化、玻璃化程度严重；如图14所示，培养25天时突变体zmsaur15的诱导率达到27.78％，显著高于W22；如图15所示，培养25天后玉米突变体zmsaur15平均愈伤组织重量显著高于野生型W22。

结果如图16和图17所示，Mu突变体愈伤组织能够形成绿点，而W22没有出现绿点，愈伤组织出现褐化状态。

实施例6验证ZmSAUR15增强胚性愈伤组织诱导率

验证ZmSAUR15增强胚性愈伤组织诱导率，包括以下步骤：

(1)敲除目的基因：构建CRISPR/Cas9载体转化农杆菌侵染高诱导率玉米SCL155的幼胚，敲除ZmSAUR15基因；

(2)筛选胚性愈伤组织：在诱导培养基(N6诱导培养基组分与上述一致，培养条件为 28℃黑暗培养)内加入除草剂筛选步骤(1)所得的敲除目的基因后的幼胚，得到抗性胚性愈伤组织；

(3)扩增与测序：PCR扩增步骤(2)所得的抗性胚性愈伤组织的U6启动子，对PCR 结果进行SDS凝胶电泳检测，并对步骤(2)所得的抗性胚性愈伤组织和随机随机挑选12个非抗性愈伤组织进行测序。扩增方法与上述PCR扩增方法一致。

表6引物序列

结果如图18所示，步骤(2)得到两个抗性胚性愈伤组织，这两个抗性胚性愈伤组织明显大于对照(对照为未敲除的SCL155培养的愈伤组织)，如图19所示对这两个愈伤组织分别进行DNA测序，发现存在碱基缺失和突变，表明是两个独立的阳性突变事件，如图20图21所示。

这些发现证实了ZmSAUR15负向调控玉米的胚性愈伤组织形成，而敲除该基因有利于玉米幼胚形成胚性愈伤组织。

实施例7电镜和石蜡切片观察

电镜和石蜡切片观察，包括以下步骤：

(1)电镜观察：对实施例3所得的、经30天诱导培养(诱导培养方法与上述实施例3一致)拟南芥野生型Col和转基因拟南芥OE1的愈伤组织进行电镜观察，对实施例5所得的、经30天培养的玉米野生型W22和Mu纯和突变体zmsaur15的愈伤组织进行电镜观察。

结果如图22所示，愈伤组织培养30天后，野生型拟南芥Col的愈伤组织细胞充盈饱满，可清楚观察到成组的胚性细胞；而转基因拟南芥OE1的愈伤组织表面细胞形状不规则、细胞皱褶状态，细胞干瘪；

结果如图23所示，愈伤组织培养30天后，突变体愈伤组织的细胞长于野生型愈伤组织， W22愈伤组织细胞短小，而Mu突变体zmsaur15愈伤组织细长，说明突变体愈伤组织细胞生长速度快于野生型自交系W22。

(2)石蜡切片观察：对实施例3所得的、经30天培养的拟南芥野生型Col和转基因拟南芥OE1的愈伤组织进行石蜡切片观察，对实施例5所得的、经30天培养的玉米野生型W22和Mu纯和突变体zmsaur15诱导的愈伤组织进行石蜡切片观察。

结果如图24所示，转基因拟南芥OE1愈伤组织细胞较大，细胞间存在间隙，细胞以松散、不规则形状的细胞为主，而野生型Col愈伤组织体积小，胞质致密。

结果如图25所示，玉米自交系W22具有较大的无质体空泡，细胞排列松散，无规则，而Mu突变体zmsaur15的愈伤组织具有有序的细胞层、分生组织区和体细胞结构。

如结果所示，电镜观察和石蜡切片观察到的这些细胞表面特征都表明基因ZmSAUR15对细胞伸长和扩张有抑制作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种ZmSAUR15基因及其在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcagcagc aagatccggt acatcgtgtg gctgcggcag acgctgcggc ggtggcggtc 60

ccgcgcggcg gctcgcgcgg cggtcccggc ggggcacgtg gcggtgtgcg tgggcggcgc 120

ggcgcggcgg ttcgtggtgc gggcggcgca cctgaaccac cccgtgttcc gggagctgct 180

ccggcaggcg gaggaggagt acgggttccc gtcgggggcc tgcgcgggcc ccatcgcgct 240

cccctgcgac gagggcctct tcgagcacgt cctccgccac ctctcctccc cgtccaagtc 300

cgcccgcttc gtcaccctcg aggacctcga gagcggcgca ctgtcctgct gctgcgtcgc 360

cgccgccgga gactcgctcc cgctcctccg cggcatctcc gccgacaagg ccgtctggtg 420

agcgcgccgc cctgcccatt gcgggcgcgg gcgcgacggc cgtttcgccg gagactcgct 480

cccgctcctg tacggcgacg gccatttcgt cgtctcgtct cttttttctt cttttaa 537

<210> 2

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Gln Gln Asp Pro Val His Arg Val Ala Ala Ala Asp Ala Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala Val Pro Arg Gly Gly Ser Arg Gly Gly Pro Gly Gly Ala

20 25 30

Arg Gly Gly Val Arg Gly Arg Arg Gly Ala Ala Val Arg Gly Ala Gly

35 40 45

Gly Ala Pro Glu Pro Pro Arg Val Pro Gly Ala Ala Pro Ala Gly Gly

50 55 60

Gly Gly Val Arg Val Pro Val Gly Gly Leu Arg Gly Pro His Arg Ala

65 70 75 80

Pro Leu Arg Arg Gly Pro Leu Arg Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Leu

85 90 95

Pro Val Gln Val Arg Pro Leu Arg His Pro Arg Gly Pro Arg Glu Arg

100 105 110

Arg Thr Val Leu Leu Leu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Ala Pro Ala

115 120 125

Pro Pro Arg His Leu Arg Arg Gln Gly Arg Leu Val Ser Ala Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Leu Arg Ala Arg Ala Arg Arg Pro Phe Arg Arg Arg Leu Ala

145 150 155 160

Pro Ala Pro Val Arg Arg Arg Pro Phe Arg Arg Leu Val Ser Phe Phe

165 170 175

Phe Phe

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcagcagc aagatccggt 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaaaagaag aaaaaagaga cgaga 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggacgatccg aaaggcaaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtccacacg atcacggttt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctcactggg ccgtaaatct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agctttcaca gcctgctcat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cactgatatg gcatcgcgga 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggccacttc ctttgttact c 21

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agagaagcca acgccawcgc ctcyatttcg tc 32

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggcgaaat gcagcagcaa ga 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcaccagacg gccttgtcgg 20

Claims

1.一种ZmSAUR15基因，其特征在于，所述ZmSAUR15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种ZmSAUR15蛋白，其特征在于，所述ZmSAUR15蛋白由权利要求1所述的ZmSAUR15基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的ZmSAUR15基因在提高玉米胚性愈伤组织诱导率方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过敲除ZmSAUR15基因提高玉米胚性愈伤组织诱导率。