CN112618558A - 含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体及其制备和应用 - Google Patents

含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含毛兰素‑阿霉素双药共载脂质体及其制备和应用。所述含毛兰素‑阿霉素双药共载脂质体由负载毛兰素和盐酸阿霉素的脂质体和叶酸‑壳聚糖交联物修饰外层组成。本发明提供了所述含毛兰素‑阿霉素双药共载脂质体在制备抗癌药物中的应用。本发明将两种药物负载在同一载体上进行递送，能增强对癌细胞抑制能力，降低应用成本，且对正常细胞毒害作用弱。

Description

含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体及其制备和应用
(一)技术领域
本发明涉及药物领域，涉及一种含石斛提取物毛兰素-阿霉素双药共载脂质体及其制备方法和应用。
(二)技术背景
癌症是一种严重危害人类健康的疾病，随着现代社会的发展，其已成为人类死亡的主要原因之一。其中，乳腺癌是一种起源于乳腺导管内上皮或乳腺腺泡上皮的恶性肿瘤，全球每年新发乳腺癌病例达150万以上，发病率位居女性恶性肿瘤首位。在过去的几十年中，出现了多种癌症治疗方式，其中手术治疗、放射治疗、化学治疗已成为主要手段。化学治疗指利用化学药物来治疗癌症，是癌症治疗手段中最多变，发展最快的领域。其中，如何将化疗药物快速准确的递送到人体病灶以及如何提高药物疗效成为了主要的研究话题。
毛兰素是一种从中药石斛中提取的低分子量联苄类天然产物，已有研究证明其对肝癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌等多种癌细胞具有显著抑制效果。研究表明，毛兰素能够通过调控线粒体凋亡的方式抑制癌细胞的生长，具有成为抗癌药物的潜力。但是，毛兰素存在以下问题：水相中溶解度低，不利于在生物体内的吸收利用；相比人工合成化疗药物，提取成本更高，不利于大规模商业化生产。将毛兰素与已有的临床化疗药物联合使用能够提高抗癌效果，并且一定程度上降低毒副作用，因此，寻找具有协同效果的药物配方是提高毛兰素应用价值的一种有效方法。
脂质体作为药物载体已应用于多种疾病治疗，将抗癌药物包封于脂质体中，能够显著改善药物在体内的代谢动力学行为，提高药物在肿瘤部位的积聚量，从而达到降低毒副作用，提高疗效的效果。但是，由于脂质体结构的限制，其载药量远小于其他类型的药物载体，当药物抗癌效果较差时，往往需要增加给药量，降低了应用价值。此外，现有研究往往仅利用脂质体的囊泡腔进行载药，改善药物的水溶性以及体内稳定性，或负载两种不确定协同效果的药物。
专利CN 109602707 A公开了一种毛兰素脂质体组合物及其制备方法。该发明利用毛兰素、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺修饰的聚乙二醇、胆固醇和L-组氨酸，通过注入法制备得到了脂质体，该脂质体包封率高、稳定性好，但是仅装载一种药物毛兰素，如要达到较好的抗癌效果需要提高药物浓度，应用成本较高。专利CN 109846822 A公开了一种毛兰素纳米制剂及其制备方法和应用。该发明将毛兰素单体、W/O型乳化、卵磷脂、乙醇、和O/W型乳化剂通过注入法制备得到脂质体，该脂质体解决了毛兰素水溶性差的问题，但是仅能通过被动靶向效应集聚在肝脏部位，对于其他器官癌细胞缺乏靶向性。专利CN 109528655A公开了一种双载药脂质体及其制备和应用。该发明以磷脂、胆固醇、PEG化磷脂制备脂质体，通过主动载药方式，装载盐酸小檗碱和盐酸阿霉素，该脂质体解决了盐酸小檗碱静脉给药安全问题，并且使血液中两种药物浓度较长时间保持在协同作用比例范围内。但是这种脂质体仅能负载两种水溶性药物，不能同时负载溶解性不同的两种药物，并且制作工艺复杂，成本较高。专利CN 107753434 A公开了一种包载亲疏水性不同药物的载药脂质体及其制备方法与应用。该发明将亲疏水性不同的药物载入脂质体内使之具有包载疏水性组分的脂质体壳层和包载亲水性组分的脂质体核，以实现亲疏水性不同的两种及以上组分在不同时间的程序性释放的药物效果。但是该脂质体两种药物限定为临床上已应用的常规化疗药物，并且不确定是否具有协同效果。
(三)发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体的制备方法。
本发明要解决的第三个问题是提供所述含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体在制备抗癌药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体，其由负载毛兰素和盐酸阿霉素的脂质体和叶酸-壳聚糖交联物修饰外层组成。
作为优选，毛兰素与盐酸阿霉素摩尔比为2:25-1:50，更优选为2:25-1:37.5。
作为优选，所述含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体通过如下方法制得：
(1)将卵磷脂、胆固醇、毛兰素溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂为氯仿和无水乙醇的混合溶剂，得到有机相，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；
(2)将盐酸阿霉素水溶液加入脂质体膜材中，水化、超声得到粗脂质体水溶液；
(3)将粗脂质体水溶液与叶酸-壳聚糖交联物的醋酸溶液混合避光搅拌2-4h，随后用0.22-0.45μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(4)所得均匀脂质体使用pH＝7.2～7.6的PBS水溶液以截留分子量1-10kDA透析袋透析除去杂质得到含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体。
作为进一步的优选，所述磷脂与胆固醇摩尔比为(1.5～4):1；所述磷脂与盐酸阿霉素摩尔比为(10～15):1；所述磷脂与叶酸壳聚糖交联物的质量比为4:1-3:1。
作为进一步的优选，所述有机溶剂为氯仿与无水乙醇的混合溶剂，其中氯仿与无水乙醇的体积比为(1～4)：1；所述磷脂与有机溶剂的质量体积比为(10～12)mg：1mL。
第二方面，本发明提供一种含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将卵磷脂、胆固醇、毛兰素溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂为氯仿和无水乙醇的混合溶剂，得到有机相，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；
(2)将盐酸阿霉素水溶液加入脂质体膜材中，水化、超声得到粗脂质体水溶液；
(3)将粗脂质体水溶液与叶酸-壳聚糖交联物的醋酸溶液混合避光搅拌2-4h，随后用0.22-0.45μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(4)所得均匀脂质体使用pH＝7.2～7.6的PBS水溶液以截留分子量1-10kDA透析袋透析除去杂质得到含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体。
作为优选，所述卵磷脂与胆固醇摩尔比为(1.5～4):1；所述卵磷脂与盐酸阿霉素摩尔比为(10～15):1；所述卵磷脂与叶酸壳聚糖交联物质量比为4:1-3:1。
作为优选，所述有机溶剂为氯仿与无水乙醇的混合溶剂，其中氯仿与乙醇体积比为(1～4)：1；所述卵磷脂与有机溶剂质量体积比为(10～12)mg：1mL。
作为优选，所述的水化的条件为：38-45℃，30-120min。
第三方面，本发明提供了所述含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体在制备抗癌药物中的应用。
本发明制备的含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体可作为一种纳米制剂应用于实体瘤等癌症疾病治疗，其负载的毛兰素与化疗药物阿霉素具有协同抗癌效果，在相同药物浓度下，药物共同作用的癌细胞抑制率较两者单独使用之和更高；脂质体除了改善药物溶解性不同以及体内药代动力表现不同产生的协同效果下降的情况外，能够帮助药物快速在癌细胞中集聚，相同浓度下，负载药物脂质体对癌细胞的抑制率较游离药物提高20％以上。本发明采用叶酸-壳聚糖取代了传统研究中常用的聚乙二醇对脂质体进行修饰，这两种完全生物亲和的材料在提高脂质体体内循环稳定性以及癌细胞靶向性的同时，有利于降低可能存在的生物安全隐患。本发明的另一优势在于，相比已有的生物活性提取物协同提高化疗药物抗癌效果研究，大大降低了天然提取物与化疗药物的浓度比例，从常见的1:2-2:1降低为2:25-1:50，极大的减少了天然提取物用量以及总药物用量，为减弱毒副作用、降低生产成本提供了可能。
作为优选，所述的癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7或MDA-MB-231。
本发明所述的叶酸-壳聚糖交联物可通过文献报道的方法制备得到，具体推荐按照如下方法制备：
(1)称取叶酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中避光活化(优选活化时间为4h)得到叶酸溶液；称取壳聚糖溶于醋酸溶液中；
(2)将上述叶酸溶液加入壳聚糖溶液混合，避光充分搅拌(优选避光搅拌时间为16h)后，调整pH至9；
(3)将上述溶液转移至透析袋中，分别使用pH7.4的PBS溶液及蒸馏水透析若干天；将溶液离心后冻干沉淀得到叶酸-壳聚糖交联物。
作为优选，所述叶酸壳聚糖交联物中叶酸、EDC、NHS摩尔比为1～2:4～10：4～10。
作为优选，所述壳聚糖与醋酸溶液质量体积比为(5～20)mg:1mL。
作为优选，所述叶酸壳聚糖交联物中叶酸与壳聚糖质量比为1:1-1:2。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过体外细胞实验，得到毛兰素与化疗药物具有协同抗癌效果的浓度比例并进行应用，显著提高了药物对癌细胞的抑制效果并降低了药物的用量。
具体而言，传统毛兰素的应用方式是直接以有机溶剂对毛兰素进行溶解或通过修饰改性等方式改变毛兰素的溶解性从而单独使用。但是这种应用方式往往需要极大浓度的毛兰素才能达到较好的抗癌效果，并且不能排除对于正常细胞的毒害作用。而在毛兰素的提取成本远高于化学合成化疗药物的情况下，大规模应用制造成本较高。本发明通过实施例1发现，在相同药物浓度下，一定浓度比例的药物共同作用的癌细胞抑制率较两者单独使用之和提高8％-34％；而在相同的癌细胞抑制率下，两药联合使用时，毛兰素浓度为单独使用时的4％-5％，化疗药物浓度为单独使用时的50％-75％，总药物浓度减少20％-45％，极大提高了应用价值。
(2)本发明根据脂质体疏水性壳层载药量相对较低、亲水性核层载药量相对较高的特点，将低比例的毛兰素装载在脂质体壳中，高比例的化疗药物装载在脂质体核中，将两种药物负载在同一载体上进行递送，达到增强对癌细胞抑制能力、进一步降低应用成本的效果。
具体而言，脂质体的磷脂双分子层结构能够提高药物的生物亲和性，但是有限的负载体积不利于递送高浓度药物。而限制药物协同作用的一个重要因素就是不同药物在体内的代谢动力学行为不同，能否将两种药物保持在协同作用浓度下传递到细胞是评价药剂的重要指标。已有研究中，利用天然提取物协同化疗药物往往需要较高的浓度比例，提取物与化疗药物浓度比例可达2:1-10:1，这种比例不但不利于对药物进行装载，更提高了生产应用成本。而本发明通过实验得到了一种低浓度毛兰素与高浓度化疗药物比例，将提取物与化疗药物协同比例降低至2:25-1:50，在该浓度比例下，两种药物表现出较好的协同抗癌效果，不仅有利于长时间保持协同浓度，而且降低了应用成本。并且本发明将毛兰素与化疗药物装载在脂质体的不同部位，不仅解决了脂质体对不同水溶性药物负载能力不同的问题，同时提高了药物的协同抗癌效果。通过实施例5发现，较相同浓度的游离药物，本发明的双载药脂质体对癌细胞抑制率提高20％以上。
(3)本发明制备的双载药脂质体通过体外细胞实验验证，在较低浓度下，对于癌细胞抑制效果强，对正常细胞毒害作用弱。
具体而言，对癌细胞以及正常细胞的不同抑制表现能够体现药物的应用价值。毛兰素在低浓度下对癌细胞具有较好的抑制效果而对正常细胞抑制能力较弱，是一种有潜力的抗癌成分。本发明通过毛兰素与化疗药物的联合使用以及修饰负载，与已有配方相比，在较低浓度便能达到对癌细胞较好的抑制效果。同时，由于叶酸-壳聚糖修饰的应用，有利于提高脂质体在体内正常环境中的稳定性，减少药物在非病患部位的释放，从而更好的靶向具有叶酸抗体过表达的癌细胞，并由此在提高对癌细胞抑制效果的同时，不对正常细胞产生更强的毒副作用，提高了药物的应用价值。
(4)本发明的双载药脂质体的制备方法省略了脂质体水合后利用pH浓度差再装载亲水性药物的过程，同时减少了制备过程中的pH变化，避免药物可能受到的影响，此外在制备过程中加入了叶酸壳聚糖对脂质体进行包覆修饰，有助于提高脂质体的稳定性以及靶向性，在最后进行挤压过膜，有助于尽可能得到小尺寸的脂质体。
(四)附图说明
附图是用来对本发明的进一步理解，与下面的具体实施方式共同用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。附图中：
图1为传统毛兰素制剂的技术路线；
图2为传统双载药脂质体的技术路线；
图3为本发明的技术路线；
图4为双载药脂质体的微观形貌图；
图5为双载药脂质体处理MCF-7，MDA-MB-231，MCF-10A细胞后的结果；
图6为双载药脂质体处理MCF-7，MDA-MB-231细胞后的荧光显微镜荧光图。
(五)具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的内容特点易于被本领域中的研究人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为详实的界定。然而本发明不由以下实施例限定。
实施例中使用的各原料来源：
人乳腺正常细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231:中科院上海细胞库；
DMEM培养基：Hyclone；
胎牛血清：Gibco；
胰蛋白酶：Hyclone；
青霉素-链霉素：Hyclone；
CCK-8：MedChemExpress；
二甲基亚砜：>99.8％，上海麦克林生化科技有限公司；
毛兰素：≥98％，MW＝318.36，上海源叶生物科技有限公司；
盐酸阿霉素：98％，MW＝579.98，上海麦克林生化科技有限公司；
叶酸：≥97％，MW＝441.4，上海麦克林生化科技有限公司；
壳聚糖：脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa.s，上海麦克林生化科技有限公司；
卵磷脂：≥98％，MW＝758.06，上海麦克林生化科技有限公司；
胆固醇：99％，MW＝386.65，上海麦克林生化科技有限公司；
N-羟基琥珀酰亚胺：98％，MW＝115.09，上海麦克林生化科技有限公司；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：98.5％，MW＝191.7，上海麦克林生化科技有限公司；
本发明所述的叶酸-壳聚糖交联物通过文献报道的方法制备得到，具体推荐按照如下方法制备：
(1)称取叶酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中避光活化4h得到叶酸溶液；称取壳聚糖溶于1％醋酸溶液中；
(2)将上述叶酸溶液加入壳聚糖溶液混合，避光搅拌16h后，用0.1mol/L NaOH溶液调整pH至9；
(3)将上述溶液转移至透析袋中，分别使用pH7.4的PBS溶液及蒸馏水透析2天；将溶液离心后冻干沉淀得到叶酸-壳聚糖交联物。
作为优选，所述叶酸壳聚糖交联物中叶酸、EDC、NHS摩尔比为1～2:4～10：4～10。
作为优选，所述壳聚糖与醋酸溶液质量体积比为(5～20)mg:1mL。
作为优选，所述叶酸壳聚糖交联物中叶酸与壳聚糖质量比为1:1-1:2。
实施例1：
体外细胞毒性实验筛选毛兰素(ER)与盐酸阿霉素(DOX)协同作用的最佳比例；
(1)使用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，用DMEM培养基将细胞稀释至5*103cells/ml，吹打均匀后向96孔板每孔接种100μl的细胞悬液，培养过夜；
(2)细胞贴壁后，弃去步骤1中旧培养基，分别向各孔加入100μl含不同浓度两种药物的DMEM培养基，每个浓度设置3个平行孔，对照孔加入空白培养基，培养48h；
(3)将步骤2中细胞培养基弃去，每孔加入100μl含10％CCK-8试剂的DMEM培养基，培养箱中孵育2h；
(4)使用酶标仪检测步骤3中96孔板吸光度，测试波长450nm；
(5)使用Chou-Talalay法(又称中位药效法，Median-drug effect analysis；联合指数法)计算毛兰素与阿霉素的联合指数(Combination Index,CI),考察其联合作用的特征。两药的联合指数公式为：
CIx＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2
其中，(Dx)1和(Dx)2分别为两药单独作用于细胞产生x％的抑制率时的浓度，(D)1和(D)2分别为两药联合作用于细胞产生x％的抑制率时的浓度。CI＝1为相加作用，CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用。
实验结果如下表所示：
表1不同浓度毛兰素与阿霉素协同效应
Figure BDA0002695855250000101
Figure BDA0002695855250000111
CI指数小于1说明两种药物在该浓度下存在协同效应。结果显示，在MDA-MB-231细胞中，当阿霉素浓度小于等于0.5μM时，两种药物呈拮抗效果，而随着阿霉素药物浓度提高至0.75μM及以上，药物呈协同效果；在MCF-7细胞中，在所有实验浓度下，两种药物均具有较好的协同效果；在MCF-10A细胞中，除了两种药物浓度为0.25μM和50nM时，其余浓度下两药均呈拮抗作用。两种癌细胞中不同的药物表现可能是由细胞本身的特性产生的，MDA-MB-231细胞属于三阴性乳腺癌细胞，分裂增殖能力强，细胞代谢旺盛，因此更容易受到抑制DNA增殖的阿霉素药物影响，当阿霉素浓度较低时，由于两种药物在通过被动扩散进入细胞时可能存在的竞争作用，反而产生了拮抗效果。而MCF-7细胞相对增殖速度较慢，细胞分裂周期长，有更充足的时间对药物进行摄取，充分发挥了药物的协同效果。
实施例2：
双载药脂质体的制备；
(1)称取叶酸132mg、NHS 184.16mg、EDC·HCl 268.38mg,溶解于30ml DMSO中避光活化4h；称取150mg壳聚糖加入30ml的1％醋酸溶液中搅拌直至溶解；
(2)将步骤1中叶酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，避光搅拌16h后，用0.1mol/LNaOH溶液调整pH至9；
(3)将步骤2中溶液转移至截留分子量为1kDA的透析袋中，分别使用pH 7.2的PBS溶液及蒸馏水透析2天；将溶液离心后冻干沉淀得到叶酸-壳聚糖交联物；
(4)称取189.5mg卵磷脂、28.95mg胆固醇、1.04mg毛兰素溶解于4ml氯仿、4ml无水乙醇的混合溶剂得到有机相；
(5)将步骤4中溶液真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；称取23.2mg盐酸阿霉素提前溶解于10ml蒸馏水，加入膜材中，38℃水化45min、超声45min得到粗脂质体；
(6)称取20mg叶酸-壳聚糖交联物，溶于10ml的1％醋酸溶液中，与步骤5中脂质体混合避光搅拌2h，随后用0.22μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(7)将步骤6中脂质体用pH＝7.4的PBS水溶液以截留分子量为2kDa的透析袋透析4h除去杂质得到双载药脂质体。
实施例3：
(1)称取叶酸176mg、NHS 230.2mg、EDC·HCl 383.4mg,溶解于30ml DMSO中避光活化4h；称取300mg壳聚糖加入30ml的1％醋酸溶液中搅拌直至溶解；
(2)将步骤1中叶酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，避光搅拌16h后，用0.1mol/LNaOH溶液调整pH至9；
(3)将步骤2中溶液转移至截留分子量为2kDA的透析袋中，分别使用pH 7.4的PBS溶液及蒸馏水透析2天；将溶液离心后冻干沉淀得到叶酸-壳聚糖交联物；
(4)称取94.75mg卵磷脂、19.3mg胆固醇、0.26mg毛兰素溶解于6ml氯仿、2ml无水乙醇的混合溶剂得到有机相；
(5)将步骤4中溶液真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；称取5.8mg盐酸阿霉素提前溶解于10ml蒸馏水，加入膜材中，40℃水化2h、超声45min得到粗脂质体；
(6)称取25mg叶酸-壳聚糖交联物，溶于10ml的1％醋酸溶液中，与步骤5中脂质体混合避光搅拌2h，随后用0.22μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(7)将步骤6中脂质体用pH＝7.4的PBS水溶液以截留分子量为1kDA的透析袋透析4h除去杂质得到双载药脂质体。
实施例4：
(1)称取叶酸264mg、NHS 299.26mg、EDC·HCl 536.76mg,溶解于30ml DMSO中避光活化4h；称取600mg壳聚糖加入30ml的1％醋酸溶液中搅拌直至溶解；
(2)将步骤1中叶酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，避光搅拌16h后，用0.1mol/LNaOH溶液调整pH至9；
(3)将步骤2中溶液转移至截留分子量为5kDA的透析袋中，分别使用pH 7.6的PBS溶液及蒸馏水透析2天；将溶液离心后冻干沉淀得到叶酸-壳聚糖交联物；
(4)称取113.7mg卵磷脂、17.37mg胆固醇、0.39mg毛兰素溶解于8ml氯仿、2ml无水乙醇的混合溶剂得到有机相；
(5)将步骤4中溶液真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；称取9.75mg盐酸阿霉素提前溶解于10ml蒸馏水，加入膜材中，45℃水化1.5h、超声45min得到粗脂质体；
(6)称取40mg叶酸-壳聚糖交联物，溶于10ml的1％醋酸溶液中，与步骤5中脂质体混合避光搅拌2h，随后用0.45μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(7)将步骤6中脂质体用pH＝7.4的PBS水溶液以截留分子量为8kDA的透析袋透析4h除去杂质得到双载药脂质体。
对比例1:无药有包覆脂质体
(1)称取叶酸176mg、NHS 230.2mg、EDC·HCl 383.4mg,溶解于30ml DMSO中避光活化4h；称取300mg壳聚糖加入30ml的1％醋酸溶液中搅拌直至溶解；
(2)将步骤1中叶酸溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，避光搅拌16h后，用0.1mol/LNaOH溶液调整pH至9；
(3)将步骤2中溶液转移至截留分子量为2kDA的透析袋中，分别使用pH 7.4的PBS溶液及蒸馏水透析2天；将溶液离心后冻干沉淀得到叶酸-壳聚糖交联物；
(4)称取94.75mg卵磷脂、19.3mg胆固醇溶解于6ml氯仿、2ml无水乙醇的混合溶剂得到有机相；
(5)将步骤4中溶液真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；取10ml蒸馏水，加入膜材中，40℃水化2h、超声45min得到粗脂质体；
(6)称取25mg叶酸-壳聚糖交联物，溶于10ml的1％醋酸溶液中，与步骤5中脂质体混合避光搅拌2h，随后用0.22μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(7)将步骤6中脂质体用pH＝7.4的PBS水溶液以截留分子量为1kDA的透析袋透析4h除去杂质得到双载药脂质体。
对比例2:无药无包覆脂质体
(1)称取94.75mg卵磷脂、19.3mg胆固醇溶解于6ml氯仿、2ml无水乙醇的混合溶剂得到有机相；
(2)将步骤1中溶液真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；取10ml蒸馏水，加入膜材中，40℃水化2h、超声45min得到粗脂质体；
(3)将步骤2中脂质体用0.22μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(4)将步骤3中脂质体用pH＝7.4的PBS水溶液以截留分子量为1kDA的透析袋透析4h除去杂质得到脂质体。
表2不同脂质体的粒径及表面电位
Figure BDA0002695855250000151
实验结果表明，本发明制备的双载药脂质体表面带正电荷，且电荷绝对值大，脂质体多分散系数较小，稳定性高；载药脂质体粒径为176nm，有利于在体内循环，适用于注射等途径。对比例2中制备的无包覆无载药脂质体粒径小，表面带负电，而对比例1中的无载药有包覆脂质体粒径增大至136nm，表面电荷变为正电荷，这是由于壳聚糖带正电荷，其与脂质体通过静电吸附作用结合，附着在脂质体表面，对其进行修饰保护，改变了脂质体表面电荷性，并且增加了粒径大小。结合附图4电镜观察，可见脂质体外有一层物质包覆，证明了本发明中使用叶酸壳聚糖交联物对脂质体进行包覆修饰的可行性。
实施例5：
双载药脂质体细胞毒理分析实验：
(1)使用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，用DMEM培养基将细胞稀释至5*103cells/ml，吹打均匀后向96孔板每孔接种100μl的细胞悬液，培养过夜；
(2)细胞贴壁后，弃去步骤1中旧培养基，分别向各孔加入100μl含实施例3中双载药脂质体、对比例1中空白脂质体、相同浓度的两种游离药物的培养基，每个处理设置3个平行孔，对照孔加入空白培养基，培养48h；
(3)将步骤2中细胞培养基弃去，每孔加入含10％CCK-8试剂的DMEM培养基，培养箱中孵育2h；
(4)使用酶标仪检测步骤3中96孔板吸光度，测试波长450nm；
实验结果如图4，结果显示：
无载药的空白脂质体对于细胞几乎没有影响，证明本发明的脂质体具有良好的生物亲和性；在癌细胞中，载药脂质体相对于同浓度的游离药物，对癌细胞抑制效果显著提高约20％，而对正常细胞中影响较小，证明本发明制备的脂质体有助于提高协同药物的抗癌效果。
实施例6：
双载药脂质体荧光分析实验：
(1)使用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，用DMEM培养基将细胞稀释至5*105cells/ml，吹打均匀后向6孔板每孔接种1ml的细胞悬液，培养过夜；
(2)细胞贴壁后，弃去步骤1中旧培养基，分别向各孔加入1ml实施例3中含双载药脂质体、对比例1中空白脂质体、相同浓度的两种游离药物的培养基，每个处理设置3个平行孔，对照孔加入空白培养基，培养3h；
(3)将步骤2中细胞培养基弃去，使用PBS缓冲液缓慢清洗细胞，随后用4％多聚甲醛将细胞固定15min，再用PBS进行清洗；
(4)将步骤3中固定后的细胞用DAPI染料在黑暗环境中常温孵育5min，随后用PBS进行清洗；
(5)使用荧光倒置显微镜观察细胞中的荧光信号。
实验结果如图5，结果显示：
空白脂质体处理组以及对照组中均未发现红色荧光信号(由药物阿霉素产生，颜色信号越强，证明药物浓度越高)，且细胞核蓝色荧光信号清晰(由DAPI染料产生，标记细胞核位置，证明此处存在一个活细胞)，证明该实验中不存在环境影响，且细胞活力正常；游离药物处理组在细胞核蓝色荧光附近，可见轻微红色荧光信号，证明在3h处理后，癌细胞少量摄入药物；双载药脂质体处理组，在细胞质部位及细胞核部位均可发现强烈的荧光信号，说明本发明的脂质体有助于提高药物在癌细胞中的聚集速度，在更短的时间内将有效浓度的药物输送到癌细胞中，因此有助于提高药物的抗癌效果。

Claims (10)

1.一种含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体，其由负载毛兰素和盐酸阿霉素的脂质体和叶酸-壳聚糖交联物修饰外层组成。
2.如权利要求1所述的含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体，其特征在于：毛兰素与盐酸阿霉素的摩尔比为2:25-1:50。
3.如权利要求1所述的含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体，其特征在于：毛兰素与盐酸阿霉素的摩尔比为2:25-1:37.5。
4.如权利要求1所述的含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体，其特征在于：所述含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体通过如下方法制得：
(1)将卵磷脂、胆固醇、毛兰素溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂为氯仿和无水乙醇的混合溶剂，得到有机相，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；
(2)将盐酸阿霉素水溶液加入脂质体膜材中，水化、超声得到粗脂质体水溶液；
(3)将粗脂质体水溶液与叶酸-壳聚糖交联物的醋酸溶液混合避光搅拌2-4h，随后用0.22-0.45μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(4)所得均匀脂质体使用pH＝7.2～7.6的PBS水溶液以截留分子量1-10kDA透析袋透析除去杂质得到含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体。
5.一种如权利要求1-3之一所述的含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将卵磷脂、胆固醇、毛兰素溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂为氯仿和无水乙醇的混合溶剂，得到有机相，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，制成均匀透明薄膜得到脂质体膜材；
(2)将盐酸阿霉素水溶液加入脂质体膜材中，水化、超声得到粗脂质体水溶液；
(3)将粗脂质体水溶液与叶酸-壳聚糖交联物的醋酸溶液混合避光搅拌2-4h，随后用0.22-0.45μm水系滤膜挤出多次得到均匀脂质体；
(4)所得均匀脂质体使用pH＝7.2～7.6的PBS水溶液以截留分子量1-10kDA透析袋透析除去杂质得到含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述卵磷脂与胆固醇摩尔比为(1.5～4):1；所述卵磷脂与盐酸阿霉素摩尔比为(10～15):1；所述卵磷脂与叶酸壳聚糖交联物质量比为4:1-3:1。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为氯仿与无水乙醇的混合溶剂，其中氯仿与乙醇体积比为(1～4)：1；所述卵磷脂与有机溶剂质量体积比为(10～12)mg：1mL。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的水化的条件为：38-45℃，30-120min。
9.如权利要求1所述的含毛兰素-阿霉素双药共载脂质体在制备抗癌药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7或MDA-MB-231。
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