CN112611739B - 可视化检测扑灭津的荧光试纸的制备方法及其检测应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可视化检测扑灭津的分子印迹‑量子点荧光试纸的制备方法及其应用，特点是具体步骤如下：将发蓝光的b‑MIP‑QDs、石墨烯量子点和发红光的r‑MIP‑QDs按体积比9:5:9的比例混合后得到RGB‑TC‑MIP‑QDs；然后将10.0 mL浓度为20.0 mg/L的RGB‑TC‑MIP‑QDs乙醇溶液经注射器注入墨盒中后，将RGB‑TC‑MIP‑QDs经过喷墨打印机打印在尼龙膜表面，即得到三色荧光试纸；将1.0 mL待测样品溶液滴加到三色荧光试纸上，在室温下暗室反应120 s后，在365 nm的紫外仪下由数码相机记录试纸颜色变化，优点是特异性强、灵敏度和准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子印迹-量子点荧光试纸，尤其是涉及一种可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法及其检测应用。
背景技术
三嗪类除草剂对水生生物、蔬菜和哺乳动物有害。三嗪类除草剂在环境中具有较高的持久性，极易转移到哺乳动物体内，所以三嗪类除草剂美国环境保护署制定为毒性II类除草剂。有研究表明，三嗪类除草剂扑灭津的短期暴露可引起各种人类疾病，例如呼吸困难，肌肉痉挛，低血压和肝或肾损伤。与此同时，扑灭津可以引发雌激素水平的增加并延迟与乳腺癌相关的乳腺的发育。此外，由于扑灭津在环境中难降解这个原因，在使用过程中，往往会通过地表径流、雨水等途径进入到养殖水环境中，并通过食物链富集等作用对人类健康造成较大的负面影响，因此开展环境及食品中的扑灭津残留检测技术研究，对于环境监测、食品安全以及进出口贸易的发展意义重大。
目前，扑灭津的常规仪器检测方法主要有气相色谱-质谱法（Gaschromatograghy-Mass spectrometry, GC-MS）、 高效液相色谱法（High performanceliquid chromatography，HPLC）、液相色谱-质谱法（Liquid chromatography-Mass, LC-MS）、酶联免疫法（ELISA）和传感器法等。虽然色谱法具有分离速度较快、重现性较好等优势，但也存在样品前处理复杂，难以满足痕量检测，不能满足样品的快速检测的要求等缺点。所以开发除草剂的快速检测方法是很有必要的。目前，除草剂的快速检测方法主要包括传感器法和免疫学等。
分子印迹-量子点荧光传感器是将QDs的高灵敏度荧光响应与MIPs相结合，其中QDs为MIPs提供一种信号响应，这种信号通过荧光光谱变化被捕捉到，与此同时QDs具有准确而对称的发射光谱，有出色的光学稳定性和溶剂分散性。目前，将具有荧光响应能力的荧光探针与试纸结合制备荧光试纸，己广泛应用于测定环境中的TNT有机磷毒物、金属离子、蛋白质和生物小分子。与单纯的荧光探针相比，荧光试纸具有灵敏度高、不受检测条件的制约、便于携带等特点。Yuan等采用发蓝光的碳量子点（CQDs）检测环境中的Hg2+，并且在CQDs表面接枝-SH使其具有特异性识别能力，加入一定浓度的Hg2+后，试纸蓝色荧光逐渐猝灭。Zhou等用发红光的CdTe QDs结合发绿光的CQDs（内标），制备出酒红色的荧光试纸，并且随着环境中As3+增加该试纸有明显的变色过程，LOD为10.0 mg/L。然而采用单一发射波长的荧光试纸条，颜色变化比较单调，而多色的荧光试纸颜色变化丰富，是目前荧光试纸条的重要发展方向，具有有较大应用空间。目前，国内外还没有公开任何关于可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法及其检测应用的相关内容研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度和准确性高的可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法及其检测应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法，具体步骤如下：将发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs 、石墨烯量子点（gGQDs ）和发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs按体积比9:5:9的比例混合后得到RGB-TC-MIP-QDs；然后将10.0 mL浓度为20.0 mg/L的RGB-TC-MIP-QDs乙醇溶液经注射器注入墨盒中后，将RGB-TC-MIP-QDs经过喷墨打印机打印在尼龙膜表面，即得到三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs。当扑灭津浓度由低到高时（0-2000μg/L）试纸颜色会由玫红色变到浅玫红色到浅棕色到深棕色到浅绿色到深绿色。
所述的发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs的制备方法如下：将10.0 mL环己烷、2.4 mL的Triton-X 100和40 mg偶氮二异丁腈加入圆底烧瓶中，搅拌15min后，加入100μL 浓度为5 mg/mL 的ZnCdS/ZnS量子点溶液、50 μL正硅酸乙酯和100μL氨水，在60 ℃水浴搅拌2 h，然后加入137.5 μL的20 mg/mL的扑灭津溶液、46.6 μL 功能单体APTES（3-氨丙基）三乙氧基硅烷）、6.8 μL 甲基丙烯酸和40.0 μL 二甲基丙烯酸乙二醇酯，震荡2 h后，于60℃水浴下搅拌反应8 h；反应结束后，加入10.0 mL丙酮待沉淀，以8000 g离心10 min，去除上清液，然后加入5.0 mL双蒸水，8000g离心20 min，最后加入6.0 mL的由乙醇和乙腈按体积比8:2混合成的混合液洗脱模板，重复洗脱直至荧光值不再变化，即得到发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs。
所述的发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs的制备方法如下：将10.0 mL环己烷、2.4 mL的Triton-X 100和40 mg偶氮二异丁腈加入圆底烧瓶中，搅拌15min后，加入100μL 浓度为5 mg/mL 的CdSe/ZnS量子点溶液、50 μL正硅酸乙酯和100μL氨水，在60 ℃水浴搅拌2 h，然后加入137.5 μL的20 mg/mL的扑灭津溶液、46.6 μL 功能单体APTES（3-氨丙基）三乙氧基硅烷）、6.8 μL 甲基丙烯酸和40.0 μL 二甲基丙烯酸乙二醇酯，震荡2 h后，于60℃水浴下搅拌反应8 h；反应结束后，加入10.0 mL丙酮待沉淀，以8000 g离心10 min，去除上清液，然后加入5.0 mL双蒸水，8000g离心20 min，最后加入6.0 mL的由乙醇和乙腈按体积比8:2混合成的混合液洗脱模板，重复洗脱直至荧光值不再变化，即得到发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs。
上述可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸用于检测扑灭津方法，具体步骤如下：
（1）液体样品前处理
将待测液体样品与乙腈按体积比4:6的比例混合后，在混合液中加入乙酸直至其体积百分含量为3.0%，同时在混合液中加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，制备得到待测样品溶液；
（2）固体样品前处理
称取待测鱼肉固体样品5g匀浆5 min，然后加入10mL乙腈和1.5 g NaCl，涡旋5min，随后将该样品以4000 g离心10 min，取上清液后重复离心一次，合并收集上清液，并加入10mL由正己烷和乙腈按体积比10:1混合而成的混合液，继续涡旋1min后，于4000 g离心5min，对离心管底部固体重复提取一次，合并所有上清液，用氮气去除溶剂，最后，加入环己烷溶解，过0.45 μm的醋酸纤维素膜去除杂质，将得到的溶液与乙腈按体积比4:6的比例混合后，在混合液中加入乙酸直至其体积百分含量为3.0%，同时在混合液中加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，得到待测样品溶液；
（3）三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的测试
将1.0 mL待测样品溶液滴加到三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs上，在室温下暗室反应120 s后，在365 nm的紫外仪下由数码相机记录试纸颜色变化。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法及其检测应用，其制备了对扑灭津具有特异荧光抑制响应的两种荧光发射MIP-QDs，分别为b-MIP-QDs（发蓝光）和r-MIP-QDs（发红光），将这两种MIP-QDs与gGQDs（发绿光）按比例混合，得到RGB-TC-MIP-QDs，优化RGB-TC-MIP-QDs比例为b-MIP-QDs:gGQDs: r-MIP-QDs=9:5:9，制备了一种可依赖于颜色变化剂量分析并且具有变色范围较宽的荧光试纸检测体系（RGB-TC-MIP-QDs-FTSs），在此基础上，在最佳的测试条件下，建立b-MIP-QDs、r-MIP-QDs和gGQDs混合比率荧光测试体系，成功制备了针对扑灭津的可视化三色荧光试纸，实现对水环境和水产品中扑灭津的快速检测。
综上所述，本发明一种可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法及其检测应用，RGB-TC-MIP-QDs-FTSs对扑灭津具有优异的选择性和灵敏度，并且随着扑灭津含量的增加，所制备的试纸显示出连续的颜色变化。此外，用肉眼可观察到RGB-TC-MIP-QDs-FTSs对水环境以及水产品中对扑灭津的明显剂量反应，表明该RGB-TC-MIP-QDs-FTSs可实现对扑灭津的快速检测。
附图说明
图1为b-MIP-QDs（a），gGQDs（b），r-MIP-QDs（c）和RGB-TC-MIP-QDs（d）荧光发射波长，λex = 340 nm（插图在365 nm紫外灯下拍摄）；
图2为b-MIP-QDs，b-NIP-QDs，r-MIP-QDs，r-NIP-QDs，CdSe/ZnS QDs 和GQDs的透射电镜图（A-F），RGB-TC-MIP-QDs的扫描电镜图（G），RGB-TC-MIP-QDs在尼龙膜上的扫描电镜图（H）；
图3为B-MIP-QDs, b-NIP-QDs, r-MIP-QDs和r-NIP-QDs的红外光谱图；
图4为b-MIP-QDs（A），r-MIP-QDs （B）和gGQDs（C）的EDS能谱扫描；
图5 为b-MIP-QDs、gGQDs和r-MIP-QDs比率荧光随时间变化的I440/I510（A）和I440/I630（B），其中MIP-QDs浓度为20.0 mg/L，扑灭津浓度5.0 mg/L；
图 6为 水比例对b-MIP-QDs，b-NIP-QDs（A），r-MIP-QDs和r-NIP-QDs （B）的荧光响应影响，扑灭津浓度为5.0 mg/L；
图7为乙酸在水比乙腈溶剂（v/v=4:6）中比例对（A）b-MIP-QDs和b-NIP-QDs，（B）r-MIP-QDs和r-NIP-QDs荧光响应能力的影响，扑灭津的浓度为5.0 mg/L；
图8为不同PBS缓冲液浓度对（A） b-MIP-QDs和b-NIP-QDs，（B）r-MIP-QDs和r-NIP-QDs的荧光响应的影响，扑灭津浓度为5 mg/L；
图9为加入不同浓度的扑灭津后对gGQDs荧光强度的影响示意图；
图10 为gGQDs的荧光稳定性示意图；
图11为RGB b-MIP-QDs:gGQDs:r-MIP-QDs=5:5:5（A），b-MIP-QDs:gGQDs:r-MIP-QDs=9:5:14（B），b-MIP-QDs:gGQDs:r-MIP-QDs=9:5:9（C）下荧光光谱，插图为三色传感器紫外下拍摄；
图12为b，r-MIP-QDs（A），b-MIP-QDs@gGQDs（B）和r-MIP-QDs@gGQDs（C）双色荧光传感器以箭头方向添加扑灭津浓度为0、0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.200 mg/L，插图为扑灭津在紫外灯下纸基上的颜色变化；
图13为RGB-TC-MIP-QDs和RGB-TC-NIP-QDs对扑灭津、莠去津、扑草净、炔苯酰草胺和异丙隆的选择性，插图为RGB-TC-MIP-QDs-FTSs和RGB-TC-NIP-QDs-FTSs在紫外灯下荧光颜色变化（其中扑灭津、莠去津、扑草净、炔苯酰草胺和异丙隆的浓度都为20.0 mg/L）；
图14为 锡纸包裹试纸在4℃冰箱中27天内的荧光稳定性，图片为在紫外线灯下拍摄；
图15为不同扑灭津浓度与比率荧光I510/（I450+I630）值的线性关系；
图16为不同扑灭津浓度与三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs显示的颜色之间的对应关系。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
1、可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法，其具体步骤如下：
将发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs 、石墨烯量子点（gGQDs ）和发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs按体积比9:5:9的比例混合后得到RGB-TC-MIP-QDs；然后将10.0 mL浓度为20.0 mg/L的RGB-TC-MIP-QDs乙醇溶液经注射器注入墨盒中后，将RGB-TC-MIP-QDs经过喷墨打印机打印在尼龙膜表面，即得到三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs。当扑灭津浓度由低到高时（0-2000μg/L）试纸颜色会由玫红色变到浅玫红色到浅棕色到深棕色到浅绿色到深绿色。
在此具体实施例中，发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs的制备方法如下：将10.0 mL环己烷、2.4 mL的Triton-X 100和40 mg偶氮二异丁腈加入圆底烧瓶中，搅拌15 min后，加入100μL 浓度为5 mg/mL 的ZnCdS/ZnS量子点溶液、50 μL正硅酸乙酯和100μL氨水，在60 ℃水浴搅拌2 h，然后加入137.5 μL的20 mg/mL的扑灭津溶液、46.6 μL功能单体APTES（3-氨丙基）三乙氧基硅烷）、6.8 μL 甲基丙烯酸和40.0 μL 二甲基丙烯酸乙二醇酯，震荡2 h后，于60℃水浴下搅拌反应8 h；反应结束后，加入10.0 mL丙酮待沉淀，以8000 g离心10 min，去除上清液，然后加入5.0 mL双蒸水，8000g离心20 min，最后加入6.0 mL的由乙醇和乙腈按体积比8:2混合成的混合液洗脱模板，重复洗脱直至荧光值不再变化，即得到发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs。发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs的合成方法与b-MIP-QDs相似，其中只是将ZnCdS/ZnS QDs（发蓝光）换成CdSe/ZnS QDs（发红光），加入浓度体积不变。非印迹聚合物（blue-，red-non-imprinted quantum dots，b-NIP-QDs，r-NIP-QDs）的合成与上述步骤相同，只是将模板分子扑灭津换成相同体积的环己烷。
在此具体实施例中，为了使荧光试纸达到可视化的荧光亮度，将该尼龙膜反复打印30次后将试纸放置在洁净的烘箱中干燥，最后将荧光试纸置于波长为365 nm的紫外灯下观察，试纸发出玫红色的荧光。将b-MIP-QDs和r-MIP-QDs混合制备的双发射荧光试纸定义为b-，r-MIP-QDs-FTSs，b-MIP-QDs和石墨烯量子点gGQDs（发绿光）混合制备的荧光试纸定义为b-MIP-QDs@gGQDs-FTSs，r-MIP-QDs和gGQDs混合定义为r-MIP-QDs@gGQDs-FTSs。每次测试前将试纸用打孔器打成大小一致的圆形备用。
2、RGB-TC-MIP-QDs的表征
（1）RGB-TC-MIP-QDs的荧光光谱分析
RGB-TC-MIP-QDs荧光分析如图1所示，其中b-MIP-QDs、gGQD和r-MIP-QDs分别在450 nm、510 nm和630 nm处显示最大荧光发射波长，并且在365 nm UV灯下分别发出明亮的蓝色、绿色和红色荧光。RGB-TC-MIP-QDs可在单一波长340 nm的激发下在450 nm、510 nm和630 nm处显示三元发射光谱，在紫外灯下并显示浅玫红色荧光（图1插图d），这与单一的b-MIP-QDs，gGQD和r-MIP-QDs的荧光颜色不同。
（2）MIP-QDs的形貌特征分析
通过SEM和TEM对b-MIP-QDs、r-MIP-QDs、gGQDs、b-NIP-QDs和r-NIP-QDs的形貌特征进行观察。如图2所示，b-MIP-QDs、r-MIP-QDs、b-NIP-QDs和r-NIP-QDs为核壳结构，大小均一的球形，粒径大小约为95±15 nm。gGQDs似片状石墨烯结构，大小在10 nm左右。与此同时，SEM可以观察到聚合物表面粗糙。结果表明SiO2印迹层成功包覆在r-MIP-QDs和b-MIP-QDs上。
（3）FT-IR分析
为证明通过反相微乳液聚合成功获得SiO2印迹层，进一步通过FT-IR对b-MIP-QDs、r-MIP-QDs、b-MIP-QDs和r-NIP-QDs的表面功能基团进行分析。结果如图3所示，在1000-1250 cm-1左右出现了较强的吸收峰，为Si-O-Si的不对称伸缩振动，805 cm-1处的吸收峰对应Si-O伸缩振动，1560 cm-1和2990 cm-1吸收峰分别对应了CH2-N弯曲振动和C-H的伸缩振动，3420 cm-1附近的吸收峰来自于功能单体MAA上的-OH的伸缩振动，1560 cm-1附近的吸收峰是由于N-H键的伸缩振动引起，同时也证明了样品中有功能单体APTES提供的-NH2存在。上述结果表明由功能单体APTES所提供的-NH2和MAA提供的-OH接枝在b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的SiO2印迹层。由于合成方法相似NIP-QDs与MIP-QDs红外光谱没有明显区别。
（4）元素分析
为了证明QDs被成功包裹在SiO2印迹层中，进一步通过EDS能谱研究了b-MIP-QDs和r-MIP-QDs中的元素组成。如图4所示，b-MIP-QDs中含有S、Cd和Zn等元素（图4A）均来自于ZnCdS/ZnS QDs，而r-MIP-QDs中含有Cd、Se、Zn和S元素（图4B），这些元素均来自于CdSe/ZnSQDs。在b-MIP-QDs和r-MIP-QDs中均扫描出Si、O元素，结果表明QDs已经被SiO2印迹层成功包覆，进一步表明了b-MIP-QDs和r-MIP-QDs成功合成。由于gGQDs本身为石墨烯材料，所以只扫描出单一的C元素。由于相邻的C的吸收，APTES提供的官能团-NH2中的N元素峰被掩盖，图4C中Pt元素均来自喷金。
综上所述，本发明将三种荧光颜色不同的聚合物（b-MIP-QDs，gGQDs和r-MIP-QDs）按比例混合集成到一个系统中，提出了一种独特的荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的测试体系，这不仅确保了最宽的色彩变化范围，而且还表现出更加丰富的色彩变化。在三元发射波长的三色试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs检测体系中，gGQDs具有很强的荧光稳定性，并且对扑灭津浓度不敏感。因此，gGQDs为检测扑灭津的比色检测提供了可靠的参考信号内标。但发蓝光和红光的b-MIP-QDs和r-MIP-QDs能够在加入一定浓度扑灭津之后产生相应的荧光猝灭，这种比率荧光猝灭会产生相应的荧光颜色变化。
具体实施例二
可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸用于检测扑灭津的方法，步骤如下：
1、液体样品前处理
将待测液体样品与乙腈按体积比4:6的比例混合后，在混合液中加入乙酸直至其体积百分含量为3.0%，同时在混合液中加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，制备得到待测样品溶液；
2、固体样品前处理
鱼肉取自杭州湾海域，称取待测鱼肉固体样品5g匀浆5 min，然后加入10mL乙腈和1.5 g NaCl，涡旋5 min，随后将该样品以4000 g离心10 min，取上清液后重复离心一次，合并收集上清液，并加入10mL由正己烷和乙腈按体积比10:1混合而成的混合液，继续涡旋1min后，于4000 g离心5 min，对离心管底部固体重复提取一次，合并所有上清液，用氮气去除溶剂，最后，加入环己烷溶解，过0.45 μm的醋酸纤维素膜去除杂质，将得到的溶液与乙腈按体积比4:6的比例混合后，在混合液中加入乙酸直至其体积百分含量为3.0%，同时在混合液中加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，制备得到待测样品溶液；
3、三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的测试
将1.0 mL待测样品溶液滴加到三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs上，在室温下暗室反应120 s后，在365 nm的紫外仪下由数码相机记录试纸颜色变化。
RGB-TC-MIP-QDs-FTSs对扑灭津具有优异的选择性和灵敏度，并且随着扑灭津含量的增加，所制备的试纸显示出连续的颜色变化，当扑灭津浓度由低到高时（0-2000μg/L）试纸颜色会由玫红色变到浅玫红色到浅棕色到深棕色到浅绿色到深绿色。此外，用肉眼可观察到RGB-TC-MIP-QDs-FTSs对水环境以及水产品中对扑灭津的明显剂量反应。表明该RGB-TC-MIP-QDs-FTSs可实现对扑灭津的快速检测。
具体实施例三
采用以下指标作为荧光检测体系选择性评价依据，对RGB-TC-MIP-QDs荧光响应体系进行优化：荧光猝灭计算参考Stern-Volmer方程：F0/F=1+KSV[Q]，F0为RGB-TC-MIP-QDs未加抑制剂前的荧光值，F为加了抑制剂之后荧光值，印迹因子IF值为MIP-QDs和NIP-QDs的KSV的比值（KSV,MIP-QDs/KSV,NIP-QDs），用来评估MIP-QDs对扑灭津的选择性；[Q]为抑制剂浓度。RGB-TC-MIP-QDs在450nm、510 nm和630 nm三处发射波长均被记录下来。b-MIP-QDs、gGQDs和r-MIP-QDs的比率荧光强度的荧光分别记录为I450、I510和I630。以gGQDs的绿色荧光作为稳定的荧光内标，平衡时间用比率荧光I510/I450和I510/I630记录，选择性和标准曲线的荧光测试分别用比率荧光I510/（I450+I630）记录。
实施例1
RGB-TC-MIP-QDs荧光响应时间：首先研究了RGB-TC-MIP-QDs对扑灭津的响应时间。如图5所示，加入扑灭津后，由于b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的荧光猝灭，所以I510/I450和I510/I630的荧光强度比率值立即增加，并在120 s内反应达到平衡。如此快速的响应归因于MIP-QDs的SiO2印迹层的疏水作用力以及印迹孔穴中的特异结合位点内部分氢键和静电引力的共同作用。
实施例2
水比例对b-MIP-QDs和r-MIP-QDs体系荧光响应的影响
为构建最佳效应体系，研究水与乙腈比例、乙酸在体系中的比例和PBS缓冲液浓度对b-MIP-QDs、r-MIP-QDs荧光猝灭的影响。如图6所示在水体积比为40%时，b-MIP-QDs和r-MIP-QDs都有最佳的荧光猝灭效果（F 0 /F），这归因于b-MIP-QDs和r-MIP-QDs合成方法相同，聚合物表面特异性结合位点的数量与性质相近。虽然非印迹聚合物b-NIP-QDs和r-NIP-QDs也有较小的荧光猝灭，但是与b-，r-MIP-QDs相比并没有显著的荧光猝灭。由于扑灭津存在疏水作用力，相对应的IF值先升高后降低在水体积百分比为40%时达到最大。
实施例3
乙酸比例对b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的荧光响应的影响
由于MIP-QDs表面印迹层对模板分子的选择性和特异性荧光猝灭受表面环境的影响。因此，本发明研究了0、1%、2%、3%、4%、5%（v/v）的乙酸比例分别对b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的选择性荧光猝灭的影响。如图7，在乙酸比例为2%（v/v）时，b-MIP-QDs获得了最佳荧光猝灭效果，印迹因子IF值最大为4.70。与此同时，r-MIP-QDs在乙酸比例为3%（v/v）时，获得最佳荧光响应效果，IF值为3.75。说明在体系中乙酸比例为3%时的条件下r-MIP-QDs对模板分子扑灭津具有最佳的特异性识别效果。
由于乙酸比例分别为2%（v/v）和3%（v/v）中r-MIP-QDs与b-MIP-QDs的IF最大值不一致。单独对b-MIP-QDs，r-MIP-QDs与RGB-TC-MIP-QDs中的b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的IF值进行方差分析（数据处理采用SPSS13.0统计软件处理）。如表1所示，结果表明2%（v/v）和3%（v/v）的乙酸比例对结果没有显著影响（P＞0.05）；而单独的b-MIP-QDs、r-MIP-QDs和RGB-TC-MIP-QDs中的b-MIP-QDs和r-MIP-QDs之间的IF值差异较大，最终选择3%（v/v）乙酸比例作为最终测试条件。
表 1乙酸比例与不同的MIP-QDs的双因素方差分析
。
实施例4
缓冲盐浓度对b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的影响
缓冲盐浓度不仅仅对MIP-QDs的印迹位点和模板分子之间的特异性识别有影响，而且对量子点与模板分子之间动态电子转移荧光猝灭有一定的影响，因此研究了不同浓度的缓冲盐浓度对b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的影响。如图8所示，在PBS缓冲液浓度为4.0 mmol/L的条件下，b-MIP-QDs与r-MIP-QDs都具有最佳的荧光猝灭效果，并且IF因子在之前优化条件的基础下分别增加到7.18和3.22，结果表明离子浓度对MIP-QDs的选择性有显著影响。
实施例5
gGQDs荧光稳定性
如图9所示，发绿光的gGQDs荧光在加入不同浓度的扑灭津分子之后未产生荧光猝灭。如图10，在30 d的荧光测试中，gGQDs在510 nm处的荧光强度基本未受到影响，且荧光稳定性较强。因此gGQDs是能够在RGB-TC-MIP-QDs中对扑灭津特异性识别作为稳定绿色荧光内标。
实施例6
三色比率荧光检测体系配比
如图11所示，分别加入0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L扑灭津溶液后，b-MIP-QDs和r-MIP-QDs的荧光强度（在450 nm和630 nm处）逐渐猝灭，而gGQDs在510 nm处荧光强度仍保持稳定。如图11A所示，在b-MIP-QDs：gGQDs：r-MIP-QDs=5:5:5时加入扑灭津并没有使荧光试纸产生明显的颜色变化。但如图11B所示，当b-MIP-QDs：gGQDs：r-MIP-QDs=9:5:14时，RGB-TC-MIP-QDs-FTSs在低浓度的扑灭津中观察不出明显的颜色变化，这是由于r-MIP-QDs的浓度较高，当开始加入的扑灭津浓度较低时，RGB-TC-MIP-QDs-FTSs前部分颜色变化主要为粉红色并且变色范围较窄。当在b-MIP-QDs：gGQDs：r-MIP-QDs=9:5:9时（图11C），由于三种发射波长处荧光强度呈比率的衰减，导致该RGB-TC-MIP-QDs-FTSs颜色变化差异显著（从浅粉红色到浅鲑鱼色，再从深橙色到橄榄色，最后从深橄榄绿色到深绿色）。显然，即使在450 nm和630 nm处的荧光发射光谱对扑灭津剂量敏感并观察到明显的颜色变化。因此在b-MIP-QDs：gGQDs：r-MIP-QDs=9:5:9这个比例下混合时，制备的RGB-TC-MIP-QDs-FTSs在便携式UV灯下更便于可视化检测扑灭津。
本文通过添加不同浓度的扑灭津将RGB-TC-MIP-QDs-FTSs与双发射荧光试纸（dual-emission FTSs）颜色范围进行对比研究。如图12A所示，双发射荧光试纸b-，r-MIP-QDs-FTSs的颜色从浅玫红色变为浅粉色，颜色变化不明显。与此同时，如图12B所示，加入不同浓度的扑灭津之后b-MIP-QDs@gGQDs-FTSs的颜色从蓝色变为深蓝色最终变为绿色，但是在加入较高浓度的扑灭津时，该双发射荧光试纸颜色变化依旧不明显。这是由于蓝色和绿色的发射光谱位置较近，导致荧光色差不明显。如图12C，在加入一定浓度扑灭津后r-MIP-QDs@gGQDs-FTSs的颜色从橙色变为土黄色最终变为绿色，这归因于gGQDs与r-MIP-QDs的发射波长之间差距较大，可以获得较宽的颜色变化范围，但依然存在扑灭津检测浓度范围较小的缺陷。所以证明了上述双发射荧光试纸并不能完全获得检测扑灭津较宽的颜色变化范围。三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs比双发射或单发射的荧光试纸可视化颜色范围更大。
实施例7
RGB-TC-MIP-QDs的选择性分析
为了评估三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的选择性，将MIP-QDs对扑灭津与其结构类似物莠去津、扑草净、异丙隆和炔苯酰草胺在相同浓度下的荧光猝灭响应效果进行对比。如图13所示，莠去津、扑草净、炔苯酰草胺和异丙隆的荧光强度（I450+I630）/I510在添加扑灭津之后没有产生明显的选择性荧光猝灭。但对于RGB-TC-MIP-QDs来说扑灭津引起荧光猝灭显著，并且RGB-TC-MIP-QDs-FTSs从玫红色荧光变为绿色荧光。相反，对于莠去津、扑草净、异丙隆和炔苯酰草胺仅产生轻微的荧光强度变化。这是由于MIP-QDs表面存在着和扑灭津结构互补的特异性分子印迹腔。同时，由于比率荧光作用和RGB-TC-NIP-QDs表面不存在扑灭津的印迹腔，所以RGB-TC-NIP-QDs与扑灭津之间不存在特异性荧光猝灭响应，并且没有从RGB-TC-NIP-QDs-FTSs中观察到明显的颜色变化。
实施例8
RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的荧光稳定性和方法可重复性
三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的荧光稳定性至关重要。因此本发明将RGB-TC-MIP-QDs-FTSs储存在4℃冰箱中，该荧光试纸在30 d内保持荧光稳定，荧光强度几乎没有变化（如图14），证明该RGB-TC-MIP-QDs-FTSs检测体系具有良好的荧光稳定性。
方法可重复性通过用相同的方法制备三批RGB-TC-MIP-QDs-FTSs，结果显示其中b-MIP-QDs和r-MIP-QDs在相同的测试条件下对扑灭津的选择性并没有大的变化，b-MIP-QDs的IF值为6.98±0.25，r-MIP-QDs的IF值为3.10±0.15。RGB-TC-MIP-QDs-FTSs选择性荧光猝灭与之前的一批相比，可视化检测相同浓度的扑灭津结果一致。证明合成方法和测试条件的可重复性较好。
实施例9
标准曲线制作：配制不同浓度0、1、5、10、50、100、200μg/L扑灭津溶液，测定在不同浓度下RGB-TC-MIP-QDs 和RGB-TC-NIP-QDs荧光值，以扑灭津浓度为横坐标，RGB-TC-MIP-QDs 在450 nm、510 nm和630nm三处发射波长均被记录下来，用比率荧光I510/（I450+I630）值为纵坐标绘制标准曲线。
图15显示了I510/（I450+I630）随扑灭津浓度变化，在扑灭津浓度在0.005-2.000 mg/L范围内，线性方程为y=0.0082C+0.4668，R2= 0.9941，表明该方法具有良好的线性。同时，检出限根据LOD=3σ/S计算（其中σ是十次空白测量的标准偏差，S为标准曲线的斜率），计算其检出限为0.001 mg/L。
实施例10
为进一步验证三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs在实际样品中的应用效果，通过对海水与鱼肉样品进行加标实验。
海水样品取自杭州湾，保存在4℃冰箱中。首先，将海水样品过0.45 μm的醋酸纤维素膜去除海水样品中的颗粒物，储存在干净的玻璃瓶中待检测。鱼肉取自杭州湾海域，精确称取鱼肉样品5.0 g匀浆5 min，然后加入10.0 mL乙腈和1.5 g NaCl，涡旋5 min，随后将该样品以4000 g离心10 min，取上清液后重复离心一次。收集上清液，并加入10.0 mL由正己烷和乙腈按体积比10:1混合而成的混合液，继续涡旋1min后，于4000 g离心5 min，对离心管底部固体重复提取一次，合并所有上清液，用氮气去除溶剂。最后，加入环己烷溶解，过0.45 μm的醋酸纤维素膜去除杂质备用。
通过GC-MS/MS未检出上述待测样品溶液中存在扑灭津，然后进行加标回收实验，加标浓度分别为5.0、10.0、15.0、50.0 μg/L。将待测样品溶液与乙腈按体积比4:6的比例混合后，加入乙酸使其体积百分含量为3.0%和加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，最后将浓度分别5.0、15.0和50.0 μg/L的扑灭津添加到海水样品中以进行分析。
表2 RGB-TC-MIP-QDs-FTSs检测体系在海水和鱼类样品中进行扑灭津检测的回收率，相对标准偏差（RSD，n = 3）和颜色变化
实验结果如表2所示，海水样品回收率为92.0-96.4%，相对标准偏差（RSD）小于5.7%，鱼肉样品回收率在104.0-114.6%之间，RSD小于6.3%。结果表明RGB-TC-MIP-QDs-FTSs检测体系具有较好的准确度和精密度，可实现对水样和鱼样品中扑灭津残留进行快速、有效的检测。不断稀释鱼肉和海水样品中扑灭津浓度，鱼肉和海水样品的检出限分别为5.0 μg/L和1.0 μg/L，在表2中将三色荧光试纸与其他同类型荧光试纸的方法比较，RGB-TC-MIP-QDs-FTSs有着更宽的变色范围，更低的检出限，在低浓度的待检物质中颜色变化明显，表明该方法在实际样品中有良好的的实用性。
表3与已报道的MIPs荧光传感器的构建策略和变色范围的比较
备注：文献1：WEI X, ZHANG Z, QIN L, et al. Template-free preparation ofyeast-derivedthree-dimensional hierarchical porous carbon for highlyefficient sulfamethazine adsorption from water[J]. Journal of the TaiwanInstitute of Chemical Engineers, 2019, 95:532-540.
文献2：LV P, XIE D, ZHANG Z. Magnetic carbon dots based molecularlyimprinted polymers forfluorescent detection of bovine hemoglobin[J].Talanta,2018, 188:145-151.
文献3：TAN L, HUANG C, PENG R, et al. Development of hybrid organic-inorganic surfaceimprinted Mn-doped ZnS QDs and their application as asensing material for target proteins[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2014,61:506-511.
文献4：HUANG X, ZHOU Y, LIU C, et al. A single dual-emissivenanofluorophore test paper for highly sensitivecolorimetry-basedquantification of blood glucose[J].Biosensors and Bioelectronics, 2016, 86:530-535。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs 、石墨烯量子点和发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs按体积比9:5:9的比例混合后得到RGB-TC-MIP-QDs；然后将10.0 mL浓度为20.0 mg/L的RGB-TC-MIP-QDs乙醇溶液经注射器注入墨盒中后，将RGB-TC-MIP-QDs经过喷墨打印机打印在尼龙膜表面，即得到三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs，所述的发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs的制备方法如下：将10.0 mL环己烷、2.4 mL的Triton-X 100和40 mg偶氮二异丁腈加入圆底烧瓶中，搅拌15 min后，加入100μL 浓度为5 mg/mL 的ZnCdS/ZnS量子点溶液、50 μL正硅酸乙酯和100μL氨水，在60 ℃水浴搅拌2 h，然后加入137.5 μL的20 mg/mL的扑灭津溶液、46.6 μL 功能单体APTES（3-氨丙基）三乙氧基硅烷、6.8 μL 甲基丙烯酸和40.0 μL 二甲基丙烯酸乙二醇酯，震荡2 h后，于60℃水浴下搅拌反应8 h；反应结束后，加入10.0 mL丙酮待沉淀，以8000g离心10 min，去除上清液，然后加入5.0 mL双蒸水，8000 g离心20 min，最后加入6.0 mL的由乙醇和乙腈按体积比8:2混合成的混合液洗脱模板，重复洗脱直至荧光值不再变化，即得到发蓝光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物b-MIP-QDs，所述的发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs的制备方法如下：将10.0 mL环己烷、2.4 mL的Triton-X 100和40mg偶氮二异丁腈加入圆底烧瓶中，搅拌15 min后，加入100μL 浓度为5 mg/mL 的CdSe/ZnS量子点溶液、50 μL正硅酸乙酯和100μL氨水，在60 ℃水浴搅拌2 h，然后加入137.5 μL的20mg/mL的扑灭津溶液、46.6 μL 功能单体APTES（3-氨丙基）三乙氧基硅烷、6.8 μL 甲基丙烯酸和40.0 μL 二甲基丙烯酸乙二醇酯，震荡2 h后，于60℃水浴下搅拌反应8 h；反应结束后，加入10.0 mL丙酮待沉淀，以8000 g离心10 min，去除上清液，然后加入5.0 mL双蒸水，8000 g离心20 min，最后加入6.0 mL的由乙醇和乙腈按体积比8:2混合成的混合液洗脱模板，重复洗脱直至荧光值不再变化，即得到发红光的扑灭津分子印迹-量子点聚合物r-MIP-QDs。
2. 一种权利要求1所述的制备方法制备得到的可视化检测扑灭津的分子印迹-量子点荧光试纸用于检测扑灭津方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）液体样品前处理
将待测液体样品与乙腈按体积比4:6的比例混合后，在混合液中加入乙酸直至其体积百分含量为3.0%，同时在混合液中加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，制备得到待测样品溶液；
（2）固体样品前处理
称取待测鱼肉固体样品5g匀浆5 min，然后加入10mL乙腈和1.5 g NaCl，涡旋5 min，随后将该样品以4000 g离心10 min，取上清液后重复离心一次，合并收集上清液，并加入10mL由正己烷和乙腈按体积比10:1混合而成的混合液，继续涡旋1min后，于4000 g离心5 min，对离心管底部固体重复提取一次，合并所有上清液，用氮气去除溶剂，最后，加入环己烷溶解，过0.45 μm的醋酸纤维素膜去除杂质，将得到的溶液与乙腈按体积比4:6的比例混合后，在混合液中加入乙酸直至其体积百分含量为3.0%，同时在混合液中加入PBS缓冲液使其浓度为4.0 mmol/L，得到待测样品溶液；
（3）三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs的测试
将1.0 mL待测样品溶液滴加到三色荧光试纸RGB-TC-MIP-QDs-FTSs上，在室温下暗室反应120 s后，在365 nm的紫外仪下由数码相机记录试纸颜色变化。
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