CN112592895A - 一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法及应用 - Google Patents

一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：步骤一、制备具有孔隙结构的光子晶体微球；步骤二、药物装载：将光子晶体微球浸泡在含药物的水凝胶溶液中，通过紫外光照射将水凝胶固化并锁定药物，获得光子晶体水凝胶杂化载药微球；药物为细胞因子；步骤三、抗体修饰：将光子晶体水凝胶杂化载药微球浸泡在含单克隆抗体的缓冲液中，通过化学接枝反应将单克隆抗体偶联至光子晶体水凝胶杂化载药微球表面，获得激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球。本发明制备的微球可承载激活性抗体和促细胞生长等细胞因子，能够在体外促进T细胞的活化，实现T细胞的体外扩增。

Description

一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方 法及应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种载药微球，尤其涉及一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法及应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗方案，是通过激活肿瘤患者自身免疫系统增强自身抗肿瘤能力的一种强有力的肿瘤杀伤治疗手段，具有副作用小、适应症广等优势。然而，肿瘤内部的免疫抑制微环境总是削弱T细胞对肿瘤的杀伤过程。在临床上，这一问题主要是通过向病人体内输注经体外激活的免疫效应细胞来解决，这一治疗方法又称为过继性细胞疗法(ACT)。临床治疗需要的免疫效应细胞数量极大，需要非常有效的体外扩增体系来制备大量的免疫细胞。
光子晶体(Photonic Crystal,PhC)是指具有光子带隙特性的胶体粒子结构材料。由于其具有特征性的结构色，光子晶体微球作为编码元素用于高通量分析。此外，通过一定的修饰改造，光子晶体微球也可以用于细胞捕获和细胞培养。作为细胞微载体，其具有良好的细胞附着表面，可以用于细胞的三维培养。T细胞体外扩增主要是通过模拟体内树突状细胞提呈抗原活化T细胞的过程，通过抗体刺激活化T细胞，使得T细胞在体内增殖。然而，目前体外扩增免疫效应细胞的系统常为纳米支架材料，容易对免疫效应细胞产生毒性，其扩增效率也有待提高。因此，具有良好生物相容性的免疫细胞扩增支架仍有待研发。因此，通过构建免疫细胞扩增支架，体外大规模扩增T细胞能力，并作为肿瘤免疫治疗的载药平台在肿瘤免疫治疗中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法及其在制备细胞扩增药物中的应用，基于水凝胶载药微球，通过药物装载和表面抗体修饰使其仿生树突状细胞，能够负载药物并进行药物的可控释放，具有应用于T细胞体外激活和扩增的能力，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：
步骤一、制备具有孔隙结构的光子晶体微球；
步骤二、药物装载：将步骤一制备的光子晶体微球浸泡在含药物的水凝胶溶液中，通过紫外光照射将水凝胶固化并锁定药物，获得光子晶体水凝胶杂化载药微球；所述药物为细胞因子；
步骤三、抗体修饰：将步骤二制备的光子晶体水凝胶杂化载药微球浸泡在含单克隆抗体的缓冲液中，通过化学接枝反应将单克隆抗体偶联至光子晶体水凝胶杂化载药微球表面，获得激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球；所述单克隆抗体为anti-CD3和anti-CD28中的至少一种。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述光子晶体微球为二氧化硅微球。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一光子晶体微球的制备方法为：采用微流控技术制备二氧化硅液滴，通过加热烘干使二氧化硅液滴中的水分完全蒸发，再经过高温煅烧获得所述光子晶体微球。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，所述细胞因子选自IL-2、IL-15和IL-21中一种或多种，细胞因子的浓度为100-1000ng/mL。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，所述水凝胶溶液为甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、明胶中的一种或两种以上材料混合的水溶液。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，所述水凝胶溶液的浓度为5-10％v/v。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，所述水凝胶溶液中混合有光引发剂，光引发剂的体积为水凝胶溶液体积的1％。
进一步，本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，所述单克隆抗体的浓度为10-100ng/mL。
本发明的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球用于制备细胞扩增药物。
本发明的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球用于制备T细胞体外扩增药物。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种基于光子晶体微球和水凝胶构建的光子晶体水凝胶杂化微球，光子晶体微球由二氧化硅粒子组装成，具有稳定的结构和良好的生物相容性；光子晶体微球的尺寸大于人大多数免疫细胞，不可被细胞吞噬，可通过细胞筛除去，使得细胞制品保持绝对的单一性；选用的单克隆抗体和细胞因子能够提供T细胞活化所需的激活信号，实现T细胞的体外增殖。
其中，水凝胶可以缓释药物，避免传统T细胞扩增过程中需要多次添加细胞因子的缺陷。此外，本发明的微球仿生体内的树突状细胞，为T细胞扩增提供了三维平台，且由于表面抗体的作用，细胞和载体之前可以形成免疫突触，进一步刺激T细胞的活化。因此，本发明微球扩增的T细胞，其肿瘤杀伤效果要优于传统方法扩增的T细胞。
附图说明
图1为光子晶体微球和光子晶体水凝胶杂化微球的扫描电镜图；
图2为光子晶体水凝胶杂化微球的药物释放图,其中(a)为光子晶体水凝胶杂化微球随时间变化的药物释放图，(b)为光子晶体水凝胶杂化微球随时间变化的药物释放曲线；
图3为光子晶体水凝胶杂化载药微球的表面抗体修饰，(a)(i)为抗体修饰的光子晶体水凝胶杂化载药微球的明场图，(a)(ii)为抗体修饰的光子晶体水凝胶杂化载药微球的荧光图，(b)为不同单克隆抗体浓度与光子晶体水凝胶杂化载药微球的荧光强度关系图；
图4为T细胞的扩增情况图，其中(i)为anti-CD3与T细胞共培养时T细胞的生长情况图，(ii)为表面修饰有单克隆抗体anti-CD3的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球与T细胞共培养时T细胞的生长情况图，(iii)为表面修饰有单克隆抗体anti-CD3和anti-CD28的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球与T细胞共培养时T细胞的生长情况图；
图5为不同处理扩增后T细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤检测，活死细胞染色法检测MDA-MB-231细胞的杀伤情况。
具体实施方式
本发明提供一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备二氧化硅光子晶体微球。
二氧化硅光子晶体微球的制备，主要分为五步：(1)微流控芯片的制作及微流控平台的搭建；(2)单分散液滴的制备；(3)液滴干燥固化；(4)正己烧清洗硅油；(5)高温锻烧。具体的，采用微流控芯片和蠕动泵以二氧化硅溶液为水相、以硅油为流动相制备二氧化硅液滴，并收集于器皿中，将盛有硅油且其中收集了二氧化硅液滴的器皿静置于75℃烘箱中12小时，二氧化硅液滴从乳白色渐渐变为透明。为确保二氧化硅液滴中的水分完全蒸发，将烘箱温度升高至95℃并保持2小时。从烘箱中取出器皿，待冷却后回收上层的硅油。然后使用正己烷缓慢冲洗直到二氧化硅微球滚动到器皿底部，再用胶头滴管将二氧化硅微球转移到称量瓶内，用正己烷清洗，每隔30分钟清洗1次，共清洗3次，以确保二氧化硅微球中的硅油被去除干净。将二氧化硅微球转移坩埚内，待多余的正己烷溶液挥发干净后，放入马弗炉，800℃煅烧4小时，升温和降温时间均设为3小时，最终获得二氧化硅光子晶体微球。煅烧可提高二氧化硅光子晶体微球的机械强度。
本实施例中，二氧化硅微球也可以替换为其他具有孔隙结构的光子晶体微球。
二氧化硅光子晶体微球的扫描电镜图片如图1中的(a)、(b)和(c)所示，其中(b)和(c)为(a)的局部图，从图中可以看出二氧化硅光子晶体微球具有孔隙结构。
步骤二、药物装载，制备光子晶体水凝胶杂化载药微球。
将步骤一制备的二氧化硅光子晶体微球浸泡在含细胞因子IL-2的GelMA水凝胶溶液中，其中，GelMA水凝胶溶液的浓度为5-10％v/v，IL-2的浓度为100-1000ng/mL，GelMA水凝胶溶液中混合有光引发剂，其体积为水凝胶溶液体积的1％。当二氧化硅光子晶体微球颜色由乳白色转变为亮丽的结构色后，表明水凝胶溶液己经充分填充到纳米粒子的孔隙中。然后将含有二氧化硅光子晶体微球的水凝胶溶液通过紫外光照射15秒使水凝胶完全固化并锁定药物(细胞因子IL-2)，获得光子晶体水凝胶杂化载药微球。
其中，步骤一制备的二氧化硅光子晶体微球可保存于水中，使用其制备光子晶体水凝胶杂化载药微球时(步骤二)，为了使水凝胶预聚溶液能够充分填充到光子晶体微球二氧化硅粒子之间的孔隙内，微球需要用酒精脱水并在烘箱中干燥。干燥后的光子晶体微球呈现出乳白色。
本实施例中，药物细胞因子IL-2还可以替换为IL-2、IL-15和IL-21中一种或多种。GelMA水凝胶溶液还可以替换为甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、明胶中的一种或两种以上水凝胶混合的水溶液。
光子晶体水凝胶杂化载药微球的扫描电镜图片如图1中(d)所示，对比(b)或(c)可以看出水凝胶固化在二氧化硅光子晶体微球表面。同时，从扫描图片中还可以看到光子晶体水凝胶杂化微球表面和内部都拥有高度有序的纳米孔隙结构，且这些孔隙相互贯通，有利于细胞培养时营养物质在微球中的交换。
药物缓释性能测试：
将步骤一制备好的二氧化硅光子晶体微球浸泡在含有BSA-FITC的GelMA水凝胶溶液中24小时。浸泡结束且紫外固化后，分别取10个光子晶体水凝胶杂化载药微球平行样品，然后将它们分散在1.5mL的PBS缓冲液中，置于黑暗的室温状态下，每隔1小时利用正置荧光显微镜拍摄荧光图片，由于BSA-FITC呈绿色荧光，通过读取微球的荧光值来表征微球中包埋的药物分子(BSA)的剩余量。每次检测完后用1mL新鲜的PBS缓冲液置换微球的缓冲液，持续检测至少一周时间，以研究微球在自然条件下药物的释放情况。通过荧光显微镜的观察结果显示，光子晶体水凝胶杂化载药微球中装载的BSA-FITC能够维持至少120小时，如图2中(a)所示。随着释放时间的延长，BSA-FITC的释放会进入最低值，如图2中(b)所示。因此，可通过包埋有不同药物浓度的微球来实现对药物释放速率的调控。
步骤三、光子晶体水凝胶杂化载药微球的表面抗体修饰。
将步骤二制备的光子晶体水凝胶杂化载药微球浸泡在含单克隆抗体anti-CD3和anti-CD28的MES缓冲液(0.05mol/L)中24小时，其中单克隆抗体的浓度为10-100ng/mL，通过化学接枝反应将单克隆抗体偶联至光子晶体水凝胶杂化载药微球表面，获得激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球。
本实施例中，单克隆抗体可以为anti-CD3和anti-CD28中的至少一种。
对修饰有单克隆抗体anti-CD3的光子晶体水凝胶杂化载药微球进行测试，且该anti-CD3标记有FITC：分别取10个表面修饰FITC标记的anti-CD3抗体的光子晶体水凝胶杂化载药微球作为平行样品，然后将它们分散在1.5mL的PBS缓冲液中，置于黑暗的室温状态下，每隔1小时利用激光共聚焦荧光显微镜拍摄荧光图片，由于FITC呈绿色荧光，通过三维层扫来观察单克隆抗体在微球表面的分布情况。图3中(a)(i)为抗体修饰的光子晶体水凝胶杂化载药微球的明场图，(a)(ii)为抗体修饰的光子晶体水凝胶杂化载药微球的荧光图，结果显示，FITC标记的单克隆抗体anti-CD3能够被均匀装载在光子晶体水凝胶杂化载药微球表面。图3中(b)为不同单克隆抗体浓度与光子晶体水凝胶杂化载药微球的荧光强度关系图，结果显示，通过在微球上偶联不同浓度的抗体，微球表面的荧光强度也随之增强，提示光子晶体水凝胶杂化载药微球具有非常多的表面积来修饰抗体。因此，可通过修饰不同浓度的激活性抗体来调控T细胞活化的程度，可以实现对T细胞体外扩增速率进行调控。
本发明的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球用于制备细胞扩增药物。具体的，用于制备T细胞体外扩增药物。
外周血来源的T细胞的提取和培养：收集志愿者外周血10mL，用等体积的生理盐水稀释外周血，将稀释好的外周血缓慢的加入装有5mL淋巴细胞分离液的离心管中，400g离心20min。离心结束后，吸取中间白膜层，加入生理盐水至10ml，300g离心5min，弃去上清。细胞沉淀中加入洗涤buffer，并细胞计数，按1×106/mL的细胞密度加入T细胞培养液，然后每隔3天补充新鲜的培养液。分为三组进行平行测试，其中一组T细胞培养液中含有单克隆抗体anti-CD3，一组T细胞培养液中含有表面修饰有单克隆抗体anti-CD3的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球，一组T细胞培养液中含有表面修饰有单克隆抗体anti-CD3和anti-CD28的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球，结果如图4所示，相对于单独的单克隆抗体anti-CD3，激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球能够很好地促进T细胞的成熟，且表面修饰有单克隆抗体anti-CD3和anti-CD28的微球能更好地促进T细胞的成熟。
T细胞的体外杀伤实验：将乳腺癌细胞株MDA-MB-231按照每孔1.5×105细胞接种到6孔板中，处理后的T细胞按照不同比例加入，E:T从1:1到5:1。分为两组进行平行测试，一组为anti-CD3处理的T细胞，一组为表面修饰有单克隆抗体anti-CD3和anti-CD28的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球处理的T细胞。在37℃，5％CO2培养箱中孵育6小时。孵育结束后，收集贴壁的肿瘤细胞，使用Calcein-AM/PI双染法标记不同效靶比下被T细胞杀伤的肿瘤细胞，通过荧光显微镜观察被PI标记的肿瘤细胞的数量，评估肿瘤细胞的杀伤效果。结果如图5所示，活死细胞染色表明本发明微球扩增的T细胞具有肿瘤杀伤能力，且相较于单独anti-CD3处理的T细胞，本发明微球处理的T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力更强。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一、制备具有孔隙结构的光子晶体微球；
步骤二、药物装载：将步骤一制备的光子晶体微球浸泡在含药物的水凝胶溶液中，通过紫外光照射将水凝胶固化并锁定药物，获得光子晶体水凝胶杂化载药微球；
所述药物为细胞因子；
步骤三、抗体修饰：将步骤二制备的光子晶体水凝胶杂化载药微球浸泡在含单克隆抗体的缓冲液中，通过化学接枝反应将单克隆抗体偶联至光子晶体水凝胶杂化载药微球表面，获得激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球；
所述单克隆抗体为anti-CD3和anti-CD28中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一中，所述光子晶体微球为二氧化硅微球。
3.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤一光子晶体微球的制备方法为：采用微流控技术制备二氧化硅液滴，通过加热烘干使二氧化硅液滴中的水分完全蒸发，再经过高温煅烧获得所述光子晶体微球。
4.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤二中，所述细胞因子选自IL-2、IL-15和IL-21中一种或多种，细胞因子的浓度为100-1000ng/mL。
5.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤二中，所述水凝胶溶液为甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、明胶中的一种或两种以上材料混合的水溶液。
6.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤二中，所述水凝胶溶液的浓度为5-10％v/v。
7.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤二中，所述水凝胶溶液中混合有光引发剂，光引发剂的体积为水凝胶溶液体积的1％。
8.根据权利要求1所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法，其特征在于：
其中，步骤三中，所述单克隆抗体的浓度为10-100ng/mL。
9.如权利要求1-8任意一项所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球在制备细胞扩增药物中的应用。
10.如权利要求1-8任意一项所述的激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球在制备T细胞体外扩增药物中的应用。
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