CN112592885A - 一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：从健康胎盘上剥离羊膜并进行清洗，随后剪成小块，得到羊膜样品；将羊膜样品置于胶原酶I溶液中进行消化并去除消化液，再进行清洗，得到消化样品；将消化样品置于胰蛋白酶溶液中进行酶解、分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；将滤液进行离心、过滤，再添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；将胎盘亚全能干细胞种子进行原代培养，得到原代胎盘亚全能干细胞；将原代胎盘亚全能干细胞接种至传代培养基中进行传代培养，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；该方法得到的干细胞具有较高的纯度和得率，且增殖快，活性高。

Description

一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法。
背景技术
胎盘(placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。胎盘还是一味中药，称之为紫河车，又叫人胎衣、胞衣、衣胞、胎衣、胎膜。
然而，胎盘中年可以分离出大量胎盘亚全能干细胞，其发育阶段与胚胎干细胞接近，具备全能干细胞的生物学特征，可以定向分化成上皮干细胞、神经干细胞、心肌细胞、骨细胞等等。
现有胎盘亚全能干细胞的分离方法大多包括羊膜处理、酶解和离心，但现有分离方法分离得到的胎盘亚全能干细胞中存有杂细胞较多，导致纯度较低，而且由于消化不彻底，导致得率较低。
此外，分离得到的胎盘亚全能干细胞需要经过培养扩增得到足够的胎盘亚全能干细胞，然而，随着胎盘亚全能干细胞的扩增代数的增加，导致胎盘亚全能干细胞的活力、分化能力降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法分离得到的胎盘亚全能干细胞具有较高的纯度和得率；而且具有增值快和较高的分化活力。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明实施例第一方面提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：
(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm3的小块，得到羊膜样品；
(b)将羊膜样品置于胶原酶I溶液中进行消化并去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；
(c)将消化样品置于胰蛋白酶溶液中进行酶解、分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；
(d)将滤液进行离心、过滤，再添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；
(e)将胎盘亚全能干细胞种子进行原代培养，得到原代胎盘亚全能干细胞；
(f)将原代胎盘亚全能干细胞接种至传代培养基中进行传代培养，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存。
优选地，所述胶原酶I溶液中胶原酶I的浓度为1～2mg/ml。
优选地，所述消化温度为37℃，消化时间为10～20min。
优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶浓度为0.2％。
优选地，所述酶解温度为37℃，酶解是时间为30～40min。
优选地，所述原代培养包括：
将胎盘亚全能干细胞种子以1×104的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞。
优选地，所述传代培养包括：
采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2000～2500cell/cm2的接种密度接种于滚瓶中，在20～30r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞。
优选地，所述传代培养基为包括浓度为1～5g/ml的人血白蛋白、2～4g/ml的转铁蛋白、0.2～0.5ng/ml的亚油酸、0.2～0.5ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.6～1.0ng/ml的人血小板源生长因子和0.8～1ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
优选地，所述传代培养基为包括浓度为3g/ml的人血白蛋白、3g/ml的转铁蛋白、0.3ng/ml的亚油酸、0.3ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.8ng/ml的人血小板源生长因子和0.9ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明分离培养得到的胎盘亚全能干细胞具有较高的纯度和得率，而且通过特定传代培养基的选择，使得传代扩增后的胎盘亚全能干细胞增殖快，活性高。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法包括如下步骤：
(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm3的小块，得到羊膜样品；
(b)将羊膜样品置于1mg/ml的胶原酶I溶液中，并在37℃下消化20min，随后去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；
(c)将消化样品置于0.2％的胰蛋白酶溶液中，并在37℃下酶解40min，然后，分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；
(d)将滤液以2000rpm转速进行离心、过滤，再向沉淀物中添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；
(e)将胎盘亚全能干细胞种子以1×104的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞；
(f)采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2000cell/cm2的接种密度接种于滚瓶中，在20r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；
其中，传代培养基为包括浓度为1g/ml的人血白蛋白、4g/ml的转铁蛋白、0.2ng/ml的亚油酸、0.5ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.6ng/ml的人血小板源生长因子和1ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
实施例2
本实施例提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法包括如下步骤：
(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm3的小块，得到羊膜样品；
(b)将羊膜样品置于2mg/ml的胶原酶I溶液中，并在37℃下消化10min，随后去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；
(c)将消化样品置于0.2％的胰蛋白酶溶液中，并在37℃下酶解30min，然后，分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；
(d)将滤液以2000rpm转速进行离心、过滤，再向沉淀物中添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；
(e)将胎盘亚全能干细胞种子以1×104的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞；
(f)采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2500cell/cm2的接种密度接种于滚瓶中，在30r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；
其中，传代培养基为包括浓度为5g/ml的人血白蛋白、2g/ml的转铁蛋白、0.5ng/ml的亚油酸、0.2ng/ml的碱性成纤维生长因子、1.0ng/ml的人血小板源生长因子和0.8ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
实施例3
本实施例提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法包括如下步骤：
(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm3的小块，得到羊膜样品；
(b)将羊膜样品置于2mg/ml的胶原酶I溶液中，并在37℃下消化15min，随后去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；
(c)将消化样品置于0.2％的胰蛋白酶溶液中，并在37℃下酶解40min，然后，分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；
(d)将滤液以2000rpm转速进行离心、过滤，再向沉淀物中添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；
(e)将胎盘亚全能干细胞种子以1×104的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞；
(f)采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2200cell/cm2的接种密度接种于滚瓶中，在25r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；
其中，传代培养基为包括浓度为2g/ml的人血白蛋白、3g/ml的转铁蛋白、0.4ng/ml的亚油酸、0.3ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.8ng/ml的人血小板源生长因子和0.8ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
实施例4
本实施例提供一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法包括如下步骤：
(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm3的小块，得到羊膜样品；
(b)将羊膜样品置于1.5mg/ml的胶原酶I溶液中，并在37℃下消化15min，随后去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；
(c)将消化样品置于0.2％的胰蛋白酶溶液中，并在37℃下酶解35min，然后，分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；
(d)将滤液以2000rpm转速进行离心、过滤，再向沉淀物中添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；
(e)将胎盘亚全能干细胞种子以1×104的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞；
(f)采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2200cell/cm2的接种密度接种于滚瓶中，在25r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存；
其中，传代培养基为包括浓度为3g/ml的人血白蛋白、3g/ml的转铁蛋白、0.3ng/ml的亚油酸、0.3ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.8ng/ml的人血小板源生长因子和0.9ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
对照例1
本对照例公开一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法与实施例5中的分离培养方法基本相同，区别仅在于步骤(b)为将羊膜样品置于0.2％的胰蛋白酶溶液中，并在37℃下消化15min，随后去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品。
对照例2
本对照例公开一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，该分离培养方法与实施例5中的分离培养方法基本相同，区别仅在于步骤(f)中传代培养基为包括浓度为3g/ml的人血白蛋白、3g/ml的转铁蛋白、0.3ng/ml的亚油酸、0.3ng/ml的碱性成纤维生长因子和1.7ng/ml的人血小板源生长因子的DMEM培养基。
试验例
1、分别选取实施例1～4以及对照例1～2中的分能力培养方法中得到的胎盘亚全能干细胞种子；再将胎盘亚全能干细胞种子接种到培养瓶中，在37℃下恒温培养5天，然后，采用磷酸盐缓冲液进行冲洗，在加入0.1％的胰蛋白酶溶液进行消化，再加入磷酸盐缓冲液并吹打、离心，收集沉淀细胞，再采用完全培养基重悬细胞，然后，采用流失细胞仪分别分析胚胎亚全能干细胞表面的标志以确定细胞质量，分析结果如表1所示：
表1
组别 CD34 HLA-DR CD45 SSEA-4
实施例1 0.85 0.19 0.37 68.67
实施例2 0.76 0.27 0.24 64.28
实施例3 0.89 0.26 0.32 72.83
实施例4 0.38 0.12 0.16 76.24
对照例1 1.78 0.51 0.89 43.85
对照例2 0.42 0.10 0.22 75.18
由表1可知：
本申请实施例和对照例1相比具有更低的CD34、CD45和HLA-DR值，且小于2，可见本申请实施例制备得到的胎盘亚全能干细胞具有更加的纯度，而且具有较高的SSEA-4检测值，可见，本申请实施例具有更多的胎盘亚全能干细胞，本申请实施例分离得到的胎盘亚全能干细胞得率更高。
2、分别按照实施例1～4以及对照例1～2中的分能力培养方法进行胎盘亚全能干细胞分离培养，得到传代胎盘亚全能干细胞，将不同的干细胞按照1×104个/ml接种于96孔培养板中，培养5天后，取出4孔分别加入20μl 5mg/ml的MTT，然后孵育5h后，去掉培养液，再添加100μl异丙醇，采用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定OD值，并计算平均值，计算结果如表2所示：
表2
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对照例2 对照例2
OD值 0.55 0.53 0.58 0.67 0.51 0.32
由表2可知：
本申请实施例培养得到的胎盘亚全能干细胞OD值均高于对照例组可见，本申请实施例分离培养得到的胎盘亚全能干细胞具有更加优异的增殖能力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (9)

1.一种胎盘亚全能干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)从健康胎盘上剥离羊膜，并采用生理盐水对羊膜进行清洗，随后将羊膜剪成1～4mm3的小块，得到羊膜样品；
(b)将羊膜样品置于胶原酶I溶液中进行消化并去除消化液，再采用生理盐水进行清洗，得到消化样品；
(c)将消化样品置于胰蛋白酶溶液中进行酶解、分离，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清终止酶解、过150目筛，收集滤液；
(d)将滤液进行离心、过滤，再添加DMEM培养基进行重悬，得到胎盘亚全能干细胞种子；
(e)将胎盘亚全能干细胞种子进行原代培养，得到原代胎盘亚全能干细胞；
(f)将原代胎盘亚全能干细胞接种至传代培养基中进行传代培养，得到传代胎盘亚全能干细胞，并进行冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述胶原酶I溶液中胶原酶I的浓度为1～2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化温度为37℃，消化时间为10～20min。
4.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶浓度为0.2％。
5.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述酶解温度为37℃，酶解是时间为30～40min。
6.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述原代培养包括：
将胎盘亚全能干细胞种子以1×104的密度接种于原代培养基上，置于二氧化碳体积分数为5％、温度为37℃条件下进行细胞培养，第2天进行换液，然后间隔2天换液，待细胞长至80％～90％汇合度，收获得原代胎盘亚全能干细胞。
7.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养包括：
采用传代培养基悬浮原代胎盘亚全能干细胞，并以2000～2500cell/cm2的接种密度接种于滚瓶中，在20～30r/min转速下进行培养，间隔两天更换传代培养基，待细胞融合至80％～90％，得到传代胎盘亚全能干细胞。
8.根据权利要求7所述的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养基为包括浓度为1～5g/ml的人血白蛋白、2～4g/ml的转铁蛋白、0.2～0.5ng/ml的亚油酸、0.2～0.5ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.6～1.0ng/ml的人血小板源生长因子和0.8～1ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
9.根据权利要求8所述的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养基为包括浓度为3g/ml的人血白蛋白、3g/ml的转铁蛋白、0.3ng/ml的亚油酸、0.3ng/ml的碱性成纤维生长因子、0.8ng/ml的人血小板源生长因子和0.9ng/ml表皮生长因子的DMEM培养基。
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