CN112587579B - 一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物及其制备方法和应用。该中药挥发油组合物包括吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油、肉豆蔻挥发油。本发明提供的中药挥发油组合物的制备方法简单，挥发油提取率高；本发明提供的中药挥发油组合物中的吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油配伍合理，各组分缺一不可，各组分能够协同效治疗溃疡性结肠炎，能够通过调节Tfh细胞水平维持机体免疫平衡；本发明的中药挥发油组合物还能制成纳米乳液、滴丸、喷雾剂、胶囊等剂型，有助于该挥发油在治疗溃疡结肠炎过程中的使用，并提高其疗效。

Description

一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物及其制备方法和应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn'sdisease,CD)。近年来，亚太地区UC的发病率逐步上升，其中中国成为亚洲发病率较高的国家之一，发病率为11.6/10万。临床表现以腹痛、里急后重、下痢赤白脓血为主，据其时发时止、迁延复发的发病特点，临床分型中以慢性复发型溃疡性结肠炎最多见。现代研究关于UC的发病机制尚不完全明确，治疗上也并未取得突破性进展，但针对UC的中医药治疗却有其独特优势。
现有的治疗溃疡性结肠炎的药物多为氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等，毒副作用大，复发率高，患者耐受性差。中医药从辨证论治和整体观念两个角度出发，可有效治疗溃疡性结肠炎，且毒副作用小、复发率低，患者耐受性好。中药挥发油是中药重要的有效组分，其治疗溃疡性结肠炎鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物及其制备方法和应用，以解决上述技术问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供的一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物包括吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油、肉豆蔻挥发油，其中，所述吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油的重量比为(0.1～5):(1～5):(2～8):(1～5)。
优选的，所述吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油的重量比为(1～2.5):(2～3):(3～4):(2～3)。
进一步优选的，所述吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油的重量比为1:2:4:2。
第二方面，本发明提供的一种如第一方面所述的治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用超声辅助蒸汽蒸馏吴茱萸制得的吴茱萸挥发油；
(2)采用超声辅助蒸汽蒸馏五味子制得的五味子挥发油；
(3)采用超声辅助蒸汽蒸馏补骨脂制得的补骨脂挥发油；
(4)采用超声辅助蒸汽蒸馏肉豆蔻制得的肉豆蔻挥发油；
(5)将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油混合均匀，制得中药挥发油组合物。
优选的，所述步骤(1)具体包括：将吴茱萸粉碎后过20～200目筛，将制得的吴茱萸粉末加入无机盐溶液A中，在功率200～800W、温度60～80℃、超声频率10～30kHz下超声处理20～120min，然后水蒸气蒸馏0.5～4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到吴茱萸挥发油。
进一步优选的，所述步骤(1)中的无机盐溶液A的质量浓度为5～20％；更进一步优选为10％。
进一步优选的，所述步骤(1)中的无机盐溶液A选自氯化钠溶液、氯化镁溶液、硫酸钾溶液、氯化钾溶液、硫酸钠溶液、硫酸镁溶液中的任意一种或多种；更进一步优选为氯化钠溶液。
进一步优选的，所述步骤(1)中的吴茱萸粉末的重量与无机盐溶液A的体积的比1:(5～20)；更进一步优选为1:8。
优选的，所述步骤(2)具体包括：将五味子粉碎后过20～200目筛，将制得的五味子粉末加入无机盐溶液B中，在功率200～800W、温度60～80℃、超声频率10～30kHz下超声处理20～120min，然后水蒸气蒸馏0.5～4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到五味子挥发油。
进一步优选的，所述步骤(2)中的无机盐溶液B的质量浓度为5～15％，更进一步优选为12％。
进一步优选的，所述步骤(2)中的无机盐溶液B选自氯化钠溶液、氯化镁溶液、硫酸钾溶液、氯化钾溶液、硫酸钠溶液、硫酸镁溶液中的任意一种或多种；更进一步优选为氯化钠溶液。
进一步优选的，所述步骤(2)中的五味子粉末的重量与无机盐溶液B的体积的比1:(5～20)；更进一步优选为1:15。
优选的，所述步骤(3)具体包括：
将补骨脂粉碎后过20～200目筛，将制得的补骨脂粉末加入无机盐溶液C中，在功率200～800W、温度60～80℃、超声频率10～30kHz下超声处理20～120min，然后水蒸气蒸馏0.5～4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到补骨脂挥发油。
进一步优选的，所述步骤(3)中的无机盐溶液C选自氯化钠溶液、氯化镁溶液、硫酸钾溶液、氯化钾溶液、硫酸钠溶液、硫酸镁溶液中的任意一种或多种；更进一步优选为硫酸钾溶液。
进一步优选的，所述步骤(3)中无机盐溶液C的质量浓度为1～10％；更进一步优选为4％。
进一步优选的，所述步骤(3)中的补骨脂粉末的重量与无机盐溶液C的体积的比1:(5～20)；更进一步优选为1:12。
优选的，所述步骤(4)具体包括：
将肉豆蔻粉碎后过20～200目筛，将制得的肉豆蔻粉末加入无机盐溶液D中，在功率200～800W、温度60～80℃、超声频率10～30kHz下超声处理20～120min，然后水蒸气蒸馏0.5～4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到肉豆蔻挥发油。
进一步优选的，所述步骤(4)中的无机盐溶液D选自氯化钠溶液、氯化镁溶液、硫酸钾溶液、氯化钾溶液、硫酸钠溶液、硫酸镁溶液中的任意一种或多种；更进一步优选为硫酸钾溶液。
进一步优选的，所述步骤(4)中无机盐溶液D的质量浓度为1～10％；更进一步优选为3％。
进一步优选的，所述步骤(4)中的肉豆蔻粉末的重量与无机盐溶液D的体积的比1:(5～20)；更进一步优选为1:10。
第三方面，本发明提供的一种如第一方面所述的治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
优选的，所述治疗溃疡性结肠炎药物包括如第一方面所述的中药挥发油组合物，还包括辅料。
优选的，所述治疗溃疡性结肠炎药物的剂型选自乳液、滴丸剂、喷雾剂、胶囊剂、固体粉末、水溶液、颗粒剂、冲剂、散剂、口服液、片剂、微丸剂、灌肠剂、栓剂、凝胶剂中的任意一种。所述片剂选自糖衣片、薄膜衣片及肠溶衣片中的任意一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的中药挥发油组合物的制备方法简单，挥发油提取率高；
(2)本发明提供的中药挥发油组合物中的吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油配伍合理，各组分缺一不可，各组分能够协同效治疗溃疡性结肠炎，能够通过调节Tfh细胞水平维持机体免疫平衡；
(3)本发明的中药挥发油组合物还能制成纳米乳液、滴丸、喷雾剂、胶囊等剂型，有助于该挥发油在治疗溃疡结肠炎过程中的使用，并提高其疗效。
附图说明
图1为本发明效果实施例1提供的小鼠疾病活动指数(DAI)评分图；
图2为本发明效果实施例1提供的不同剂量中药挥发油组合物对UC小鼠结肠长度的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图3为本发明效果实施例1提供的不同剂量中药挥发油组合物对UC小鼠结肠重量的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图4为本发明效果实施例1提供的不同剂量中药挥发油组合物对UC小鼠单位长度重量的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图5为本发明效果实施例1提供的不同剂量中药挥发油组合物对UC小鼠结肠重量指数的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图6为本发明效果实施例1提供的不同剂量中药挥发油组合物对UC小鼠结肠长度的影响的实物图，其中，Normal为正常组，DSS为UC模型组，DSS+SSP-H为DSS+中药挥发油组合物高剂量治疗组，DSS+SSP-M为DSS+中药挥发油组合物中剂量治疗组，DSS+SSP-L为DSS+中药挥发油组合物低剂量治疗组，DSS+5-ASA为DSS+美沙拉嗪对照组；
图7为本发明效果实施例1提供的正常组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图8为本发明效果实施例1·提供的模型组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图9为本发明效果实施例1提供的美沙拉嗪组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图10为本发明效果实施例1提供的中药挥发油组合物高剂量组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图11为本发明效果实施例1提供的中药挥发油组合物中剂量组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图12为本发明效果实施例1提供的中药挥发油组合物低剂量组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图13为本发明效果实施例2提供的中药挥发油组合物对复发型结肠炎小鼠Tfh细胞分化水平的调控作用；
图14为本发明效果实施例2提供的各组复发型UC小鼠结肠长度的实物图；
图15为本发明效果实施例2提供的各组复发型UC小鼠结肠长度的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图16为本发明效果实施例2提供的各组复发型UC小鼠结肠重量的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图17为本发明效果实施例2提供的各组复发型UC小鼠单位长度重量的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图18为本发明效果实施例2提供的各组复发型UC小鼠结肠重量指数的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图19为本发明效果实施例2提供的正常组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图20为本发明效果实施例2提供的模型组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图21为本发明效果实施例2提供的中药挥发油组合物组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图22为本发明效果实施例2提供的美沙拉嗪组小鼠结肠组织病理学观察图(HE染色，×50)；
图23为本发明效果实施例2提供的各组复发型溃疡性结肠炎小鼠IFN-γ+CXR5+CD4+T细胞的调节作用的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图24为本发明效果实施例2提供的各组复发型溃疡性结肠炎小鼠IL-9+CXR5+CD4+T细胞的调节作用的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图25为本发明效果实施例2提供的各组复发型溃疡性结肠炎小鼠IL-10+CXR5+CD4+T细胞的调节作用的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图26为本发明效果实施例2提供的各组复发型溃疡性结肠炎小鼠IL-17+CXR5+CD4+T细胞的调节作用的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图27为本发明效果实施例2提供的各组复发型溃疡性结肠炎小鼠IL-21+CXR5+CD4+T细胞的调节作用的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图28为本发明效果实施例2提供的各组药物对复发型溃疡性结肠炎小鼠FoxP3+CXR5+CD4+T细胞的调节作用的柱状统计图，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图29为本发明效果实施例2提供的各组对小鼠结肠组织IL-4表达的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图30为本发明效果实施例2提供的各组对小鼠结肠组织IL-10表达的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图31为本发明效果实施例2提供的各组对小鼠结肠组织IL17A表达的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图32为本发明效果实施例2提供的各组对小鼠结肠组织IL-21表达的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
图33为本发明效果实施例2提供的各组对小鼠结肠组织IFN-γ表达的影响，其中，与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
图1～6中，Normal为正常组，DSS为UC模型组，DSS+SSP-H为DSS+中药挥发油组合物高剂量治疗组，DSS+SSP-M为DSS+中药挥发油组合物中剂量治疗组，DSS+SSP-L为DSS+中药挥发油组合物低剂量治疗组，DSS+5-ASA为DSS+美沙拉嗪对照组；
图15～18、23～33中，Normal为正常组，DSS为UC模型组，DSS+SSP为DSS+中药挥发油组合物治疗组，DSS+5-ASA为DSS+美沙拉嗪对照组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例提供的中药挥发油组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将吴茱萸粉碎后过100目筛，将制得的吴茱萸粉末加入质量浓度为10％的氯化钠溶液中，吴茱萸粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:8；在功率350W、温度75℃、超声频率25kHz下超声处理40min，然后水蒸气蒸馏1h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到吴茱萸挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.82％；
(2)将五味子粉碎后过100目筛，将制得的五味子粉末加入质量浓度为12％的氯化钠溶液中，五味子粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:15，在功率400W、温度70℃、超声频率20kHz下超声处理30min，然后水蒸气蒸馏1.5h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到五味子挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.76％；
(3)将补骨脂粉碎后过100目筛，将制得的补骨脂粉末加入质量浓度为4％的硫酸钾溶液中，补骨脂粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:12，在功率200～800W、温度70℃、超声频率20kHz下超声处理30min，然后水蒸气蒸馏0.5～4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到补骨脂挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.67％；
(4)将肉豆蔻粉碎后过100目筛，将制得的肉豆蔻粉末加入质量浓度为3％的硫酸钾溶液中，肉豆蔻粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:10，在功率500W、温度70℃、超声频率20kHz下超声处理45min，然后水蒸气蒸馏2h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到肉豆蔻挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.81％；
(5)将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照1:2:4:2的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
效果实施例1中药挥发油组合物治疗溃疡性结肠炎小鼠的剂量筛选
1.实验材料
1.1动物及分组
选用SPF级BALB/c小鼠60只，雄性，9～12周龄，体重22g±2g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[合格证号：SCXK(湘)2016-0002]。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养3d后用于实验。按随机数字表法分为以下6组，每组10只：
正常组(Normal)
UC模型组(DSS)
DSS+中药挥发油组合物高剂量治疗组(DSS+SSP-H)
DSS+中药挥发油组合物中剂量治疗组(DSS+SSP-M)
DSS+中药挥发油组合物低剂量治疗组(DSS+SSP-L)
DSS+美沙拉嗪对照组(DSS+5-ASA)
1.2实验药物
实施例1提供的中药挥发油组合物；
美沙拉嗪肠溶片购于葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司(批号：NO181003)。
1.3主要试剂
葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulpate Sodium Salt,DSS)购于美国MB生物医药公司(批号：Q5756)、吐温80(Tween 80)购于天津市大茂化学试剂厂(批号20191008)、多聚甲醛溶液购于北京雷根生物公司(批号：0510A18)、苏木素-伊红染液购于南京建成科技有限公司(批号：20190902)、无水乙醇购于西陇科学股份有限公司(批号：171116)、二甲苯购于天津市大茂化学试剂厂(批号：20180702)。
1.4主要仪器
包埋机(型号：EG1150H)、切片机(型号：RM2255)、石蜡摊片机(型号：HI1210)、干燥机(型号：HI1210)、光学显微镜均购于德国Leica公司，精密电子天平(型号：BSA124S)。
2.实验方法
2.1模型复制
用正常饮用水配制3％(w/v)DSS(35000-36000kDa)溶液，除正常组小鼠外，其余各组小鼠均予以3％DSS溶液自由饮用，连续7天。后正常饮水3天。正常组予正常饮用水。
2.2给药方法
造模第1天进行预防性给药，中药挥发油组合物高、中、低剂量组分别予以111.22μL·kg-1、55.61μL·kg-1、27.805μL·kg-1，中药挥发油组合物混悬液灌胃；美沙拉嗪组予300mg·kg-1美沙拉嗪混悬液灌胃给药；正常组和模型组均给予等容积的生理盐水灌胃，每日1次，共10d。
2.3标本采集及处理
连续给药10d后，次日戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，选用摘眼球取血法收集外周血，抗凝后待检测；后小鼠安乐死，取出肛门至回盲部结肠，测量结肠长度；用预冷的PBS溶液洗净肠内容物，滤纸吸干，结肠称重并计算结肠重量指数；截取结肠近端2cm予以4％多聚甲醛溶液固定，余下组织液氮速冻，后转移至-80℃冰箱，待实验所用。
2.4观察指标
2.4.1小鼠一般体征观察及体重变化率
自造模之日起，每日记录小鼠体质量变化，计算老鼠体重变化率[体重变化率＝小鼠每日体重(g)/初始体重(g)*100％]，同时观察小鼠精神状态、粪便性状、有无便血、毛发及活动状态等，用疾病活动指数(Disease active index,DAI)进行评价，按如下评分标准执行。
疾病活动指数评分标准
Figure GDA0003752392380000081
Figure GDA0003752392380000091
2.4.2小鼠结肠长度测量、结肠单位长度重量、结肠重量指数
分离并截取小鼠肛门至回盲部结肠，称重后将组织平铺于冰块上测量其长度，并计算小鼠结肠单位长度重量和结肠重量指数
注：结肠单位长度重量＝结肠重量(g)/结肠长度(cm)*100％
结肠重量指数＝结肠重量(g)/动物体重(g)×100％
2.4.3小鼠病理形态学观察
2.4.3.1结肠组织病理切片制作
·取材：剪取长约5cm结肠放入包埋盒，流水冲洗3h；
·脱水：乙醇50％1h，75％1h，85％30min，95％30min，100％(Ⅰ)10min、100％(Ⅱ)5min；
·透明：二甲苯与无水乙醇混合液(1:1)混合液15min，二甲苯(Ⅰ)10min，二甲苯(Ⅱ)5min；
·浸蜡：65℃石蜡溶液中浸泡2h；
·包埋：取出结肠组织放入模具中加入石蜡溶液，冷却后形成蜡块；
·切片：将组织切成4μm厚的切片，置于摊片机37℃温水中展开，用载玻片捞起，放于40℃烤片机上蒸干水分。
2.4.3.2结肠组织切片HE染色和封固
·烤片：60℃烤片30min；
·脱蜡：将切片置于二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中各10min；
·复水：乙醇100％(Ⅰ)、100％(Ⅱ)、95％、85％、75％各3min，水洗1min；
·苏木素染色1min，清水漂洗1min；
·分化与反蓝：1％盐酸酒精分化3s，清水漂洗1min；0.3％碳酸氢钠溶液反蓝3s，清水漂洗1min；
·伊红复染：伊红溶液1min，清水漂洗1min；
·脱水：乙醇50％、75％、85％、95％、100％(Ⅰ)、100％(Ⅱ)各3min，无水乙醇与二甲苯溶液(1:1)5min，二甲苯透明10min；
·封固：中性树胶封片，晾干，放置光学显微镜下观察。
2.5统计方法
采用SPSS 22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以
Figure GDA0003752392380000101
表示，采用独立样本t检验或单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnet检验用于多重比较组间差异，以P<0.05表示统计结果差异具有统计学意义。
3实验结果
3.1小鼠一般状态变化
正常组小鼠体重正常增长，精神佳，活动灵敏，毛发有光泽，饮食量及大便等均正常。与正常组比较，其余各组小鼠从造模第2天起体重开始下降，逐渐表现出懒动、倦卧，饮食减少，毛发欠光泽；造模第5天，懒动、倦卧、消瘦等情况加重，毛发杂乱，肉眼可见小鼠大便稀溏、肛周污秽、出血，DAI评分上升；到第8天，治疗组小鼠精神状态、进食量、毛色等情况均有不同程度改善，DAI评分明显降低(P<0.05)，中药挥发油组合物低剂量组和美沙拉嗪对照组DAI评分下降较明显。(如图1所示)
3.2小鼠结肠长度、结肠重量、单位结肠重量与结肠重量指数的影响
表1各组小鼠结肠长度、结肠重量、肠重指数及单位长度重量的方差比较(n＝10,
Figure GDA0003752392380000102
)
Figure GDA0003752392380000103
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
根据表1和图2～6的结果显示，与正常组小鼠相比，经DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度明显缩短，结肠重量、单位长度重量与结肠重量指数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，中药挥发油组合物低剂量组的结肠长度明显增长；中药挥发油组合物高、中、低剂量组的结肠重量、单位长度重量与结肠重量指数均明显下降，结果具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
3.3不同剂量中药挥发油组合物对溃疡性结肠炎小鼠的结肠粘膜组织形态的影响
如图7～12所示，正常组小鼠结肠上皮与粘膜完整无缺损，腺体排列整齐，肠粘膜层未见炎症细胞浸润与糜烂性溃疡，浆膜层与基底层也未见充血与水肿。而模型组小鼠明显可见结肠腺体变形与缺损，大量炎症细胞浸润，且结肠粘膜可见明显糜烂甚至溃疡，浆膜层与基底层水肿明显。相比模型组，中药挥发油组合物高中低剂量组与美沙拉嗪对照组均可见上皮组织修复，腺体增生、排列相对规整，无明显充血、水肿与溃疡，偶见少量炎性细胞浸润。
4结论
DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠经中药挥发油组合物干预治疗后，精神及活动状态、进食量、消瘦及便血等症状得到明显改善，DAI评分降低，小鼠结肠长度恢复，结肠重量、单位长度重量及结肠重量指数明显下降，镜下可见小鼠结肠粘膜组织损伤明显修复。因此，上述实验结果表明，中药挥发油组合物能有效缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎，以中药挥发油组合物低剂量效果最明显。
效果实施例2中药挥发油组合物对复发型结肠炎小鼠Tfh细胞分化水平的调控作用
Tfh细胞是一类能够辅助B细胞产生抗体反应的新型CD4+T细胞亚群，其正常分化发育在维持机体正常的免疫应答和内环境稳态中起着关键性作用。溃疡性结肠炎是一种自身免疫性疾病，是多种因素共同作用下导致机体免疫状态的紊乱。Tfh细胞主要功能包括参与和维持生发中心(germinal centre,GC)的形成以及在B细胞分泌抗体、抗体的类别转换及体细胞高频突变过程中提供活化信号，其功能缺失或亢进都会导致机体免疫状态的紊乱。Tfh过表达会对B细胞产生过强的辅助信号，针对自身抗原反应的B细胞活化，分泌大量针对自身抗原的抗体，从而导致自身抗体介导的自身免疫性疾病[13]。
本发明通过效果实施例1证实中药挥发油组合物对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有较好的改善作用，而中药挥发油组合物治疗UC的作用机制是否与Tfh细胞的分化水平相关尚不清楚。因此，本效果实施例通过DSS复制复发型UC小鼠模型来研究中药挥发油组合物对Tfh细胞分化水平的调控作用。
1.实验材料
1.1实验动物及分组
选用SPF级BALB/c小鼠40只，雄性，9-12周龄，体重22g±2g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(合格证号：SCXK(湘)2016-0002)。清洁级动物房饲养，统一光照时间为06:00～18:00，恒温，恒湿，自由饮水，饲固体饲料。适应性喂养1周后用于实验。按随机数字表法分为以下4组，每组10只：
正常组(Normal)
UC模型组(DSS)
DSS+中药挥发油组合物治疗组(DSS+SSP)
DSS+美沙拉嗪对照组(DSS+5-ASA)
1.2主要药物
中药挥发油组合物；美沙拉嗪肠溶片购于葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司(批号：NO181003)。
1.3实验试剂
1.3.1疗效评价主要试剂
葡聚糖硫酸钠(DSS)购于美国MB生物医药公司(批号：Q5756)、吐温80(Tween 80)购于天津市大茂化学试剂厂(批号：20191008)、多聚甲醛溶液购于北京雷根生物公司(批号：0510A18)、苏木素-伊红染液购于南京建成科技有限公司(批号：20190902)、无水乙醇购于西陇科学股份有限公司(批号：171116)、二甲苯购于天津市大茂化学试剂厂(批号：20180702)。
1.3.2流式细胞术主要试剂
IL-9-PE(货号：561463)、FoxP3-PerCP-CY5.5(货号：563902)、IL-17-APC-Cy7(货号：560821)、CXCR5-FITC(货号：560577)、IFN-γ-PE-CY7(货号：557649)、IL-10-APC(货号：554468)、CXCR5-FITC(货号：560577)、CD4-APC-H7(货号：560181)、CD4-APC(货号：553051)等流式抗体均购于美国BD公司，IL-21-PE(批号：12-7211-80)购于美国Invitrogen公司。
1.3.3酶联免疫吸附试验(Elisa)试剂盒
IL-4(货号：88-7044-88)、IL-10(货号：88-7105-88)、IL-17A(货号：88-7371-88)、IL-21(货号：88-8210-88)、IFN-ganma(货号：88-7314-88)等酶联免疫吸附试验试剂盒均购于美国Thermo Fisher公司。
1.4主要仪器
Varioskan Flash全波长多功能酶标仪、台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、流式细胞仪(美国BD FACSC CantoⅡ)、旋涡混匀器(德国IKA公司)，包埋机(型号：EG1150H)、切片机(型号：RM2255)、石蜡摊片机(型号：HI1210)、干燥机(型号：HI1210)、光学显微镜均购于德国Leica公司，
2.实验方法
2.1模型复制
用正常饮用水配制3％(w/v)DSS(35000-50000kD)溶液，除正常组小鼠外，其余各组小鼠均予以3％DSS溶液自由饮用，连续5d。后正常饮水1周，再用2％DSS溶液饮用5d。正常组予正常饮用水。
2.2给药方法
造模第11d进行给药，中药挥发油组合物组予27.805μL·kg-1中药挥发油组合物混悬液灌胃；美沙拉嗪组予300mg·kg-1美沙拉嗪混悬液灌胃给药；正常组和模型组均给予等容积的生理盐水灌胃，每日1次，共10d。
2.3标本采集及处理
连续给药10d后，次日戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，选用摘眼球取血法收集外周血，抗凝后用于流式检测；后小鼠安乐死，取出肛门至回盲部结肠，测量结肠长度；用预冷的PBS溶液洗净肠内容物，滤纸吸干，结肠称重并计算结肠重量指数；截取结肠近端2cm予以4％多聚甲醛溶液固定，余下组织液氮速冻，后转移至-80℃冰箱，待实验所用。
2.4观察指标
2.4.1小鼠一般状态观察及体重变化率
自造模之日起，每日记录小鼠体质量变化，计算老鼠体重变化率[体重变化率＝小鼠每日体重(g)/初始体重(g)*100％]，同时观察小鼠精神状态、粪便性状、有无便血、毛发及活动状态等，用疾病活动指数(Disease active index,DAI)进行评价，按如下评分标准执行。
疾病活动指数评分标准
Figure GDA0003752392380000131
2.4.2小鼠结肠长度测量、结肠单位长度重量、结肠重量指数
分离并截取小鼠肛门至回盲部结肠，称重后将组织平铺于冰块上测量其长度，并计算小鼠结肠单位长度重量和结肠重量指数
注：结肠单位长度重量＝结肠重量(g)/结肠长度(cm)*100％
结肠重量指数＝结肠重量(g)/动物体重(g)×100％
2.4.3病理形态学观察及病理损伤评分
2.4.3.1结肠组织病理切片制作
·取材：剪取长约5cm结肠放入包埋盒，流水冲洗3h；
·脱水：乙醇50％1h，75％1h，85％30min，95％30min，100％(Ⅰ)10min、100％(Ⅱ)5min；
·透明：二甲苯与无水乙醇混合液(1:1)混合液15min，二甲苯(Ⅰ)10min，二甲苯(Ⅱ)5min；
·浸蜡：65℃石蜡溶液中浸泡2h；
·包埋：取出结肠组织放入模具中加入石蜡溶液，冷却后形成蜡块；
·切片：将组织切成4μm厚的切片，置于摊片机37℃温水中展开，用载玻片捞起，放于40℃烤片机上蒸干水分。
2.4.3.2结肠组织切片HE染色和封固
·烤片：60℃烤片30min；
·脱蜡：将切片置于二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中各10min；
·复水：乙醇100％(Ⅰ)、100％(Ⅱ)、95％、85％、75％各3min，水洗1min；
·苏木素染色1min，清水漂洗1min；
·分化与反蓝：1％盐酸酒精分化3s，清水漂洗1min；0.3％碳酸氢钠溶液反蓝3s，清水漂洗1min；
·伊红复染：伊红溶液1min，清水漂洗1min；
·脱水：乙醇50％、75％、85％、95％、100％(Ⅰ)、100％(Ⅱ)各3min，无水乙醇与二甲苯溶液(1:1)5min，二甲苯透明10min；
·封固：中性树胶封片，晾干，放置光学显微镜下观察。
2.4.4病理组织学损伤评分
用双盲法进行评分，主要从以下两方面评分，计总分：
(1)炎细胞浸润程度0分：无浸润；1分：丙膜炎性细胞增多；2分：炎性细胞扩张黏膜下层；3分：跨壁炎性浸润；
(2)组织损伤程度0分：无粘膜损伤；1分：离散性上皮病变；2分：糜烂或局部溃疡；3分：严重的粘膜损伤伴广泛溃疡延伸至肠壁。
2.5流式细胞术检测外周血Tfh细胞分化水平
用流式细胞术测定外周血中Tfh细胞亚群IFN-γ+CXR5+CD4+T细胞(Tfh1)、IL-9+CXR5+CD4+T细胞(Tfh9)、IL-10+CXR5+CD4+T细胞(Tfh10)、IL-17+CXR5+CD4+T细胞(Tfh17)、IL-21+CXR5+CD4+T细胞(Tfh21)、FoxP3+CXR5+CD4+T细胞(Tfr)的表达含量，具体实验步骤如下：
取100μL抗凝血，加入100μL1640培养液混匀，按照0.2μL/100μL样品的量加入稀释后的cocktail，混匀后放入CO2培养箱刺激2h，加1mL 1×溶血素，避光孵育15min，加入1mLstain buffer洗涤，离心后弃上清，加1mL 1×Fix/Perm(562574或554714)，4℃孵育40-50min，混匀细胞，加1mL 1×Perm/Wash洗两次，离心后弃上清，加入100μL Perm/Wash重悬，制备胞内及胞外抗体混合液(放大10倍进行稀释)，加抗体染色，混匀，4℃孵育40min，加1mL1×Perm/Wash洗涤，离心后弃上清，加500μL stain buffer混匀，上机检测。
2.6酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测结肠局部细胞因子的表达
按照试剂盒说明书检测结肠组织匀浆中IL-4、IL-10、IL-17A、IL-21、IFN-γ的量。待测上清液、标准品使用量均为100μL，依次加样(空白孔，阴性对照孔，阳性对照孔，标准品孔，样品孔)、加酶标抗体、加底物显色、终止显色、波长450nm测定吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。
2.9统计方法
采用SPSS 22.0软件进行统计，组间比较采用对照t检验和单因素方差分析，以
Figure GDA0003752392380000151
表示，以P<0.05为差异具有统计学意义，以P＜0.01表示统计结果有极显著差异。
3.实验结果
3.1一般体征变化
正常组小鼠精神状态良好，动作反应灵活，毛色润泽，大便正常，体重正常增长；与正常组比较，造模后各组小鼠出现少食懒动、精神萎靡，毛发暗淡无光泽，大便溏稀伴便血、肛周污秽，体重下降；与模型组比较，给药后中药挥发油组合物治疗组与美沙拉嗪对照组小鼠进食量增加，活跃多动，大便逐渐成型，无便血等，体重逐渐上升，如图5所示。
3.2中药挥发油组合物对复发型溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度、结肠重量、单位长度重量及结肠重量指数的影响
表2中药挥发油组合物对复发型UC小鼠结肠长度、结肠重量、单位长度重量及结肠重量指数的影响(n＝10，
Figure GDA0003752392380000152
)
Figure GDA0003752392380000153
Figure GDA0003752392380000161
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
如表2与图14～18的结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠结肠重量与肠重指数明显升高，结肠长度显著缩短(P<0.01)；与模型组比较，中药挥发油组合物组和美沙拉嗪组结肠重量、单位长度重量和肠重指数明显下降(P<0.05或P<0.01)，结肠长度明显增长(P<0.05)，结果具有统计学意义。
3.2中药挥发油组合物对复发型结肠炎小鼠结肠组织的病理形态学影响
如图19～22所示，正常组小鼠结肠黏膜光滑，上皮完整，腺体规整，无炎症细胞浸润与溃疡，各层无充血、水肿。与正常组比较，模型组小鼠结肠上皮组织不完整，腺体紊乱、缺失，大量炎细胞浸润，溃疡形成，伴有充血、水肿；治疗组小鼠结肠上皮组织修复，腺体增生，排列相对整齐，溃疡较小，黏膜充血、水肿减轻，伴有少量炎性细胞浸润。
3.3中药挥发油组合物对复发型溃疡性结肠炎小鼠Tfh细胞分化水平的调节作用
如图23～28所示，与正常组相比，模型组小鼠外周血中Tfh1、Tfh9、Tfh17、Tfh21细胞水平均显著升高，Tfhr和Tfh10细胞水平显著降低，具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，中药挥发油组合物组和美沙拉嗪组Tfh1、Tfh9、Tfh17、Tfh21细胞水平显著降低，Tfhr、Tfh10细胞水平显著升高(P<0.01)。
3.4中药挥发油组合物对复发型溃疡性结肠炎小鼠IL-4、IL-10、IL17A、IL-21、IFN-γ细胞因子的调控作用
如图29～33所示，与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中IL-4、IL-21表达水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，IL-17A仅有上升趋势，IL-10、IFN-γ明显降低(P＜0.05或P＜0.01)；与模型组比较，中药挥发油组合物组和美沙拉嗪组IL-4、IL-21、IL-17A表达水平明显下降，IL-10、IFN-γ表达水平显著增高(P＜0.05或P＜0.01)。
4.结论
在本效果实施例2中，模型组小鼠结肠长度明显缩短，结肠重量、单位长度重量及结肠重量指数均较正常组明显升高，而经中药挥发油组合物干预治疗后，结肠长度明显延长，结肠重量、单位长度重量及结肠重量指数明显降低，镜下观察小鼠结肠粘膜组织明显修复。通过ELISA法检测小鼠结肠组织上清液可知，小鼠结肠促炎因子IL-4、IL-17A和IL-21水平明显降低，抑炎因子IL-10、IFN-γ水平明显上升，中药挥发油组合物减轻了小鼠结肠炎症症状。上述结果表明，中药挥发油组合物能有效改善DSS诱导的小鼠复发型溃疡性结肠炎。
通过流式细胞术检测小鼠外周血可知，相比模型组，中药挥发油组合物治疗组小鼠Tfh1、Tfh9、Tfh17、Tfh21细胞水平降低，Tfhr、Tfh10细胞水平升高；经中药挥发油组合物干预治疗后，Tfr、Tfh10细胞增长，Tfh1、Tfh9、Tfh17、Tfh21细胞恢复正常，表明在DSS诱导的复发型结肠炎小鼠模型中，中药挥发油组合物可以调节复发型溃疡性结肠炎小鼠Tfh细胞分化水平，并且中药挥发油组合物能有效缓解复发型溃疡性结肠炎炎症损伤可能是通过调控Tfh细胞分化水平实现的。
实施例2
本实施例提供的中药挥发油组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将吴茱萸粉碎后过20目筛，将制得的吴茱萸粉末加入质量浓度为10％的氯化钠溶液中，吴茱萸粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:8；在功率200W、温度80℃、超声频率10kHz下超声处理120min，然后水蒸气蒸馏4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到吴茱萸挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.51％；
(2)将五味子粉碎后过200目筛，将制得的五味子粉末加入质量浓度为12％的氯化钠溶液中，五味子粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:15，在功率200W、温度80℃、超声频率10kHz下超声处理120min，然后水蒸气蒸馏4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到五味子挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.63％；
(3)将补骨脂粉碎后过200目筛，将制得的补骨脂粉末加入质量浓度为4％的硫酸钾溶液中，补骨脂粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:12，在功率200W、温度80℃、超声频率10kHz下超声处理120min，然后水蒸气蒸馏4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到补骨脂挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.61％；
(4)将肉豆蔻粉碎后过200目筛，将制得的肉豆蔻粉末加入质量浓度为3％的硫酸钾溶液中，肉豆蔻粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:10，在功率200W、温度80℃、超声频率10kHz下超声处理120min，然后水蒸气蒸馏4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到肉豆蔻挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.65％；
(5)将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照1:2:4:2的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
实施例3
本实施例提供的中药挥发油组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将吴茱萸粉碎后过20目筛，将制得的吴茱萸粉末加入质量浓度为10％的氯化钠溶液中，吴茱萸粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:8；在功率800W、温度60℃、超声频率30kHz下超声处理20min，然后水蒸气蒸馏0.5h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到吴茱萸挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.73％；
(2)将五味子粉碎后过20目筛，将制得的五味子粉末加入质量浓度为12％的氯化钠溶液中，五味子粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:15，在功率200W、温度60℃、超声频率30kHz下超声处理20min，然后水蒸气蒸馏0.5h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到五味子挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.61％；
(3)将补骨脂粉碎后过20目筛，将制得的补骨脂粉末加入质量浓度为4％的硫酸钾溶液中，补骨脂粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:12，在功率800W、温度60～80℃、超声频率30kHz下超声处理20min，然后水蒸气蒸馏0.5h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到补骨脂挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.63％；
(4)将肉豆蔻粉碎后过20目筛，将制得的肉豆蔻粉末加入质量浓度为3％的硫酸钾溶液中，肉豆蔻粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:10，在功率800W、温度60℃、超声频率30kHz下超声处理20min，然后水蒸气蒸馏0.5h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到肉豆蔻挥发油，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.69％；
(5)将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照1:2:4:2的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
实施例4
按照实施例1的制备方法制得吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油，将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照2.5:3:3:3的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
实施例5
按照实施例1的制备方法制得吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油，将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照2:2.5:4:2.5的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
实施例6
按照实施例1的制备方法制得吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油，将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照5:5:8:1的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
实施例7
按照实施例1的制备方法制得吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油，将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照0.1:1:2:5的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
对比例1
按照实施例1的制备方法制得吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油，将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油按照1:2:4的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
对比例2
将吴茱萸、五味子、补骨脂和肉豆蔻按照1:2:4:2的重量比混合后粉碎后过20～200目筛，将制得的粉末加入质量浓度为10％的氯化钠溶液中，粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:8；在功率350W、温度75℃、超声频率25kHz下超声处理40min，然后水蒸气蒸馏1h，蒸馏结束后将油水混合分离，蒸馏结束后将油水混合分离，得到挥发油组合物，利用水分测定仪分析水分含量，并进一步计算出挥发油提取率，结果为0.48％。
效果实施例3
为了进一步说明本发明的有益效果，本效果实施例还按照效果实施例1的方法对实施例2～7及对比例1～2所得的挥发油组合物进行试验，结果如表3所示。
表3各组小鼠结肠长度、结肠重量、肠重指数及单位长度重量的方差比较(n＝10,
Figure GDA0003752392380000191
)
Figure GDA0003752392380000192
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。
根据表3的结果显示，与正常组小鼠相比，经DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度明显缩短，结肠重量、单位长度重量与结肠重量指数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，第1、2～9组的结肠长度明显增长；第1～9组的结肠重量、单位长度重量与结肠重量指数均明显下降，结果具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
应用实施例1
按照实施例1的方法制得中药挥发油组合物，将所得的中药挥发油组合物与乳液混合搅拌制得挥发油纳米乳液。
应用实施例2
按照实施例1的方法制得中药挥发油组合物，将水溶性基质硬脂酸钠，加热熔融后，将所得的中药挥发油组合物与硬脂酸钠基质混合后乳化，再滴入冷却液中制得挥发油滴丸。
应用实施例3
按照实施例1的方法制得中药挥发油组合物，将所得的中药挥发油组合物与蒸馏水混合成混悬液，通过喷雾器雾化制得挥发油喷雾剂。
应用实施例4
按照实施例1的方法制得中药挥发油组合物，将所得的中药挥发油组合物与等重量的茶树油混合均匀后，进行胶囊灌装(每颗胶囊0.5mL)制得挥发油胶囊。
应用实施例5
按照实施例1的方法制得中药挥发油组合物，将所得的中药挥发油组合物与等重量的茶树油混合后，取0.5mL滴加在肚脐贴上，肚脐贴贴敷使用。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物，其特征在于，包括吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油、肉豆蔻挥发油；
所述治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将吴茱萸粉碎后过100目筛，将制得的吴茱萸粉末加入质量浓度为10％的氯化钠溶液中，吴茱萸粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:8；在功率350W、温度75℃、超声频率25kHz下超声处理40min，然后水蒸气蒸馏1h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到吴茱萸挥发油；
(2)将五味子粉碎后过100目筛，将制得的五味子粉末加入质量浓度为12％的氯化钠溶液中，五味子粉末的重量与氯化钠溶液的体积的比为1:15，在功率400W、温度70℃、超声频率20kHz下超声处理30min，然后水蒸气蒸馏1.5h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到五味子挥发油；
(3)将补骨脂粉碎后过100目筛，将制得的补骨脂粉末加入质量浓度为4％的硫酸钾溶液中，补骨脂粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:12，在功率200～800W、温度70℃、超声频率20kHz下超声处理30min，然后水蒸气蒸馏0.5～4h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到补骨脂挥发油；
(4)将肉豆蔻粉碎后过100目筛，将制得的肉豆蔻粉末加入质量浓度为3％的硫酸钾溶液中，肉豆蔻粉末的重量与硫酸钾溶液的体积的比为1:10，在功率500W、温度70℃、超声频率20kHz下超声处理45min，然后水蒸气蒸馏2h，蒸馏结束后将油水混合分离，得到肉豆蔻挥发油；
(5)将吴茱萸挥发油、五味子挥发油、补骨脂挥发油和肉豆蔻挥发油按照1:2:4:2的重量比混合均匀，制得中药挥发油组合物。
2.一种如权利要求1所述的治疗溃疡性结肠炎的中药挥发油组合物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗溃疡性结肠炎药物包括中药挥发油组合物，还包括辅料。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗溃疡性结肠炎药物的剂型选自乳液、滴丸剂、胶囊剂、固体粉末、水溶液、颗粒剂、冲剂、散剂、口服液、片剂、微丸剂、中的任意一种。
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