CN112585446A - 用于纯化或分离微泡和外泌体的方法与组合物 - Google Patents

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J·帕尔默
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Abstract

本发明提供了用于分离或提取外泌体或微泡的方法和组合物。所述方法和组合物可包括提供装置，所述装置包括布置在基底表面上的呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体。所述方法和组合物可包括提供装置，所述装置包括具有表面的基底与附接至所述基底的多种聚合物以及布置在所述多种聚合物上的呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体。

Description

用于纯化或分离微泡和外泌体的方法与组合物
技术领域
本发明涉及细胞微泡、特别是外泌体，涉及分子建模并且涉及用于分离和隔离分子的色谱方法，包括离子交换色谱法。
发明背景
本说明书中对任何现有技术的引用不是并且也不应被视为承认或以任何形式暗示这种现有技术构成澳大利亚或任何其他管辖区域的公知常识的一部分。
微泡是由膜结合的生物结构的异质集合。这些结构具有脂质双层，并且它们可存在于细胞内或细胞外环境中。微泡的大小在约20nm至1000nm的范围内。
外泌体是小的脂质双层囊泡，由多种细胞类型分泌，并且直径在20至约150nm的范围内(如通过电子显微镜(EM)所测定)。与其他细胞来源的微泡不同，外泌体在细胞内空间内形成，并且然后由细胞分泌(Raposo和Stoorvogel，2013)。
外泌体的脂质组成不同于起源细胞的脂质组成，但仍然是它们所起源的细胞类型的某种特征。此外，外泌体显示一些与其起源无关的常见脂质特征(Urbanelli等人，2013)。
取决于它们的起源，外泌体可含有多种“货物”，包括但不限于肽、蛋白质、脂质、转录调控因子，信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)和双链DNA(dsDNA)。
外泌体现在被认为是在诸如神经元突触、免疫调控、血管生成、组织再生和表观遗传调节的情况下，起源细胞(即外泌体所起源的细胞)可与靶细胞通讯的手段。这种通讯可以是本地化的或远程的。实际上，来自母乳的外泌体可调节新生儿的免疫和其他功能。这种通讯甚至可以是跨物种，例如但不限于调节人的免疫和其他功能的牛乳外泌体。
外泌体可来源于各种生物流体，包括唾液、尿液、血液、血浆、(乳房)乳汁、滑液、腹水、汁液和果实提取物。
综上所述，似乎外泌体的独特特征由它们的大小、通过内吞作用的细胞摄取、它们的“货物”驱动，并且它们递送在靶细胞中具有生物活性的“信息”。
存在越来越多的证据表明外泌体可在各种疾病的发病和持续中起作用。从生物样品收集的外泌体可提供关于疾病当前状态的诊断信息。外泌体中RNA的浓度可比从体液(如血液)中直接提取的RNA的浓度高多达60倍，从而驱动它们在诊断学中的效用的潜力。例如，鉴定从人体液分离的外泌体内的致癌性RNA标志可潜在地在侵袭性癌症发展之前良好地产生异常状态的诊断。
最近已经表明，治疗性间质型细胞的功能不依赖于细胞本身，而是由细胞产生的旁分泌因子(包括外泌体)，从而确定外泌体是循环细胞分泌因子的一部分，所述循环细胞分泌因子可介导在一些细胞疗法中以无细胞方式观察到的作用(Rani等人，2015)。
从经历体外培养的细胞的条件培养基收集的治疗上有用的外泌体也可用作无细胞治疗剂，但是需要从其源液中分离的稳健、灵活的方法(Chen等人，2010)。
此外，当基于细胞的表达系统专门定制时，外泌体可提供填充有治疗性蛋白质和RNA的天然递送载体。
在常规光学显微镜下，外泌体是不可见的。用于检测这些超微观粒子如外泌体和微泡的技术包括电子显微镜(EM)、流式细胞术、动态光散射(DLS)和纳米粒子跟踪分析(NTA)。据报道，根据所使用的方法，报告的一升血液中细胞外囊泡的绝对数量可变化多达五个数量级(van der Pol等人，2010)。
虽然外泌体是丰富的并且预期在诊断或治疗意义上有用，但是用于分离和纯化外泌体的方式限制了它们迄今为止的临床应用。
通常，用于外泌体分离的现有方法特征在于以下两组：
(i)由于囊泡的某些(可能是独特的)选择性外部特征(例如糖蛋白标记物、跨膜蛋白如四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)和MHC I类和II类以及细胞溶质蛋白如热休克蛋白(HSP-70和HSP-90))所致的亲和力捕获
(ii)基于外泌体的一些生物物理性质(例如大小、密度、ζ电位、含有脂质包装缺陷的高度弯曲的表面、膜曲率传感器)的分离或纯化
这些技术的局限性列于下表中
Figure BDA0002841041980000021
US2013/0273544(Vlassov)和US2015/0192571(Ghosh)两者均公开了包括聚乙二醇和某些多糖的聚合物作为体积排除聚合物以用于从溶液中沉淀微泡的用途。US20160216253公开了肝素用于分离细胞外囊泡的用途。
需要一种用于分离外泌体的改进的方法，特别是提供提高的外泌体产率并且可扩展用于外泌体的药物级制造或生产并避免上述现有技术的其他限制的方法。
发明内容
本发明试图解决一种或多种上述需求或限制，并且在一个实施方案中提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底，
-附接至所述基底的多种聚合物，
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上以结合至外泌体，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
其中：
所述基底是琼脂糖，所述聚合物是葡聚糖，并且所述外泌体结合配体是硫酸酯(例如，Capto DeVirS或CaptoS(GE Healthcare Biosciences AB))；或
所述基底是聚乙烯醚，所述聚合物是聚丙烯酰胺，并且所述外泌体结合配体是磺基异丁基(SO3-)(例如，Eshmuno S(Merck,KGaA))；或
所述基底是聚甲基丙烯酸酯，所述聚合物是聚丙烯酰胺，并且所述外泌体结合配体是磺基异丁基(SO3-)(例如Fractogel EMD SO3-(Merck,KGaA))；或
所述基底是聚甲基丙烯酸酯，所述聚合物是聚丙烯酰胺，并且所述外泌体结合配体是羧乙基(例如Fractogel COO-(Merck,KGaA))；或
所述基底是改性的亲水性聚醚砜(polyetherslfone)，所述聚合物是交联的聚合物涂层，并且所述外泌体结合配体是SO3磺酰基(例如，Mustang S,(Pall Corp.))；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底，
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述基底表面上以结合至外泌体，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
其中：
所述装置选自以下产品的组：
所述基底是琼脂糖，并且所述配体是磺丙基(硫酸酯)(例如SP琼脂糖凝胶(GEHealthcare Lifesciences))；
所述基底是琼脂糖，并且所述配体是羧基(例如，CM琼脂糖凝胶(GE HealthcareLifesciences))；
所述基底是聚甲基丙烯酸酯，并且所述配体是硫酸酯(例如，Toyopearl硫酸酯(Tosoh Biosciences))；
所述基底是聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)，并且所述配体是SO3(磺酰基)(例如CIMmultus SO3(BIA))；
所述基底是纤维素，并且所述配体是磺酸(R-CH2-SO3-)；(例如，Sartobind S(Sartorious))；
所述基底是纤维素，并且所述配体是硫酸酯(例如，Sartobind SC(Sartorious))；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-所述多种聚合物从所述基底表面延伸以将外泌体结合配体定位在与所述基底表面间隔开的位置处以结合至外泌体或微泡，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-其中所述多种聚合物具有与所述基底不同的化学成分；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
本发明还提供了一种能够执行上述方法的设备或装置，所述设备或装置包括如上所述的基底。
前述一般描述与下文的详细描述均仅仅是示例性和解释性的，并且意图对所要求保护的本发明提供进一步的解释。附图被包括来提供对本发明的进一步理解，并且被并入本说明书中并构成本说明书的一部分，说明了本发明的若干实施方案，并且与描述一起用于解释本发明的原理。
附图说明
图1-硫酸纤维素/cellufine的预测结构：(A)投影端视图；和(B)侧视图；以及纤维素/cellufine磷酸盐：(C)投影端视图；和(D)侧视图。
图2-壳聚糖的预测结构：(A)投影端视图；和(B)侧视图。
图3–聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)的预测结构。
图4-肝素的预测结构。
图5-3-APBA的预测结构。
图6-透明质酸预测结构。
图7-硫酸软骨素预测结构。
图8-聚乙烯硫酸酯预测结构。
图9-聚谷氨酸预测结构。
图10-聚天冬氨酸预测结构。
图11-聚丝氨酸预测结构。
图11(A)-生物素-C3-聚-4-羟基丁基-β-天冬酰胺预测结构。
图11(B)生物素-C3-聚-4-羟基苄基-β-天冬酰胺预测结构
图12-聚D L丝氨酸硫酸酯预测结构。
图13-通用结构模型。
具体实施方式
本发明涉及用于改进从生物来源分离细胞外囊泡、尤其是外泌体的试剂和方法的设计，所述生物来源包括条件细胞培养基、体内流体、组织和活检物以及其提取物或级分或分离物。特别地，本发明涉及提供改进的从来源捕获细胞外囊泡和改进的释放、从而产生可再现地更高细胞外囊泡产率的试剂和方法。如本文所述，本发明人已经确定了用于从生物来源获得提高的细胞外囊泡、特别是外泌体的产率的物质中所需的迄今为止未知的特征。这项工作使得能够选择和或设计用于分离微泡和外泌体的方法中的物质。
“细胞外囊泡(EV)或微囊泡(MV)”通常是指直径为约20至1000nm的膜结合生物结构的异质体内集合。
“外泌体”通常是指如通过EM测量的具有脂质双层并且直径为约20至200nm的囊泡。
“结合效率”通常是指由基底结合的外泌体的比例的量度。它是在应用本发明方法之后样品中剩余的外泌体的量与应用本发明方法之前样品中外泌体的量的差异。
“洗脱效率”通常是指从基底洗脱的外泌体的比例的量度。它是在根据本发明的方法洗脱之后洗脱液中外泌体的量与结合至基底的外泌体的理论量的差异。
“产率”通常是指在应用本发明方法之前从洗脱液释放的外泌体的数量占外泌体的总数的比例。
“包含”和所述术语的变化形式，如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并不意图排除其他添加剂、组分、整数或步骤。
在本发明的第一实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-其中所述多种聚合物具有与所述基底不同的化学成分；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
短语“多种聚合物具有与基底不同的化学成分”通常是指就聚合物和基底的相应成分而言，所述基底与所述聚合物不同。例如，基底可以是肽，并且聚合物可以是碳水化合物。当基底和聚合物是碳水化合物时，基底可例如是纤维素，并且聚合物可例如是右旋糖酐。
根据上述实施方案，提供了具有表面的基底。所述外泌体结合配体以或多或少有序排列的形式(也称为“阵列”)提供在基底表面上，以便当所述液体与所述装置接触时，使所述外泌体结合配体能够与微泡的外表面或膜接触。通常，所述阵列采用多种外泌体结合配体的形式，所述多种外泌体结合配体跨基底表面的至少一部分或区域定位。
阵列可呈平面阵列或线性阵列的形式。
平面阵列通常在2个维度上延伸，以便限定区域。平面阵列通常可包括密度为每nm2约1至10个配体、优选每nm2约5个配体的外泌体结合配体的区域。这种间隔可例如通过原子力显微镜来确定。所述阵列的其他区域可具有更高或更低密度的外泌体结合配体。因此，在一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的组合物或分离物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上以在基底表面上形成外泌体结合配体的平面阵列；
-其中所述多种聚合物具有与所述基底不同的化学成分；
其中所述平面阵列优选地包括密度为每nm2约1至10个配体、更优选每nm2约5个配体的外泌体结合配体的区域；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
线性阵列通常在一个维度上延伸。在一个实施方案中，可形成线性阵列，其中外泌体结合配体被提供在聚合物上，所述聚合物在基底表面上具有总体线性布置或者当从基底表面向外延伸至溶剂中时。
在线性阵列中，所述外泌体结合配体通常以每nm 1至5个配体、优选每nm约2个配体的范围提供。这种间隔可例如通过原子力显微镜或质谱法来确定。因此，在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的组合物或分离物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-所述聚合物从所述基底表面延伸以在与所述基底表面间隔开的位置处形成外泌体结合配体的线性阵列以结合至外泌体或微泡，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
-其中所述外泌体结合配体通常以每nm 1至5个配体、优选每nm约2个配体的范围提供；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上以在基底表面上形成外泌体结合配体的线性阵列；
-其中所述多种聚合物具有与所述基底不同的化学成分；
-其中所述外泌体结合配体通常以每nm 1至5个配体、优选每nm约2个配体的范围提供；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
在其他实施方案中，已经发现具有与微泡外膜表面相接的外泌体结合配体的阵列的装置(其中外泌体结合配体与另一个外泌体结合配体间隔不超过约3.5至10埃)形成高效的外泌体结合表面。如下文进一步解释的，在所述阵列通过一种或多种包含外泌体结合配体的聚合物提供的情况下，关于外泌体结合配体的间隔的3.5至10埃、优选大于2埃、特别是约4至6埃的测量值是指如通过本文例示的方法测定的在聚合物的最低能态下观察到的间隔。
如本文进一步所述，本发明提供了外泌体结合配体的布置的结构模型，所述结构模型预测为高效外泌体结合物的装置。根据所述模型，高效外泌体结合物通常是具有如根据所述结构模型所基于的方法测量的间隔约4至6埃的阴离子基团或富电子基团的装置。本发明使得能够通过鉴定阴离子基团或富电子基团并通过利用本文中结构模型的推导的方法对装置的聚合物组分的结构进行建模来预测用于外泌体或微泡的装置的结合效率。
优选地，外泌体结合配体与另一个外泌体结合配体间隔超过2埃。更优选地，外泌体结合配体与所述阵列中的另一个外泌体结合配体间隔3.5至6、或4至6埃，更优选3.5、4、5或6埃。
通常，大多数配体，优选60％、或70％或80％、更优选90％、仍然更优选95％、96％、97％、98％或99％的配体与所述阵列中的另一个配体间隔超过2埃并且不超过约10埃，优选3.5至6、或4至6埃。
根据本发明，所述阵列中外泌体结合配体的布置可具有不同的有序水平。在一个实施方案中，可存在阵列内外泌体结合配体的非常高有序的布置。例如，每个配体可与阵列中的其他配体间隔4埃的精确距离。此外，每个配体的位置和/或配体之间的空间可限定特定的图案。在这种较高有序布置中，通常所有配体在阵列中均匀间隔开。如本文所述，已发现具有较高有序布置的外泌体结合配体阵列的装置通常具有可再现地更高的外泌体或微泡结合效率。
在其他实施方案中，可存在阵列内外泌体结合配体的较低有序布置。例如，大多数、但并非所有配体可与阵列中的另一配体彼此间隔超过2埃并且不超过约10埃，优选3.5至6、或4至6埃。此外，在大多数配体中，阵列中这些配体的间隔之间可能存在差异。例如，一些配体可与其他配体间隔3.5埃、与其他配体间隔4埃、与其他配体间隔5埃、与其他配体间隔6埃。在这种布置中，每个配体的位置和/或配体之间的空间可能不限定可辨别的图案。然而，已经发现这种较低有序阵列对于结合外泌体具有有用的结合效率。
应理解，外泌体结合配体之间的有序程度可被认为是局部序(local-order)和元序(meta-order)。这意味着在远处观察外泌体结合配体的阵列，配体的位置似乎是随机性的(即它们不在明确的正交阵列中)(元序)，但是配体之间的平均距离可能相对紧密地分布在平均值附近(局部序)。在本发明中，发现优选较高有序的局部序，而元序的程度不太重要。因此，在某些实施方案中，阵列可包括元序区域，条件是所述阵列含有至少一个局部序区域。
可通过各种方法形成阵列。在要在基底表面上形成阵列的情况下，可通过在基底表面上的精确位置沉积外泌体结合配体来形成较高有序阵列。实例包括使用光刻、等离子体浸没离子注入和沉积(PIII&D)、原子力显微镜、激光、电蚀刻、低密度等离子体反应离子蚀刻、湿法蚀刻、电子显微镜或其他已知产生含有外泌体结合配体的功能化表面的方式的晶体硅、陶瓷或聚合物表面。此外，阵列可印刷在基底表面上。实例包括使具有化学垫的基底表面功能化，且然后用外泌体结合配体部分使此类垫进一步衍生化，所述外泌体结合配体部分现在化学结合至此类垫。在基底和包含外泌体结合配体的聚合物具有相同化学成分的情况下，这些技术可以是适用的。
在另一个实施方案中，通过一种或多种包含外泌体结合配体的聚合物提供阵列。在此实施方案中，基底可由聚合物整体形成，从而形成基底表面。在基底由聚合物形成的实施方案中，可对基底表面进行处理以活化所述聚合物来在所述聚合物上形成外泌体结合配体。
在一个实施方案中，聚合物可偶联或以其他方式结合至基底，从而形成基底表面，例如经由生物素/链霉抗生物素蛋白结合。在此实施方案中，将包含外泌体结合配体的聚合物涂覆到基底上，从而在基底表面上形成外泌体结合配体。优选地，所述聚合物具有与基底的化学成分相比不同的化学成分。例如，所述聚合物可以是葡聚糖，而基底可以是纤维素。
如上所述并且在本文中进一步详细地描述，在外泌体结合配体将通过一种或多种聚合物以阵列形式提供的情况下，那些聚合物是根据在所述配体所存在的最低能量下是否在计算机中观察到彼此间隔超过2埃并且不超过约10埃、优选3.5至6埃、或4至6埃来加以选择。简言之，计算机观察是通过聚合物的子结构单元主体化(通常是六聚体至十二聚体，但可能更大)导出，使用阴离子基团或富电子基团进行几何最小化计算(MM+算法)以便显示最稳定(最低能量)的三维结构，并且因此所述结构可能参与外泌体结合。然后可在计算机中测量配体之间的距离以确定与外泌体结合的可能性。当建模的低聚物的能量最小化结构携带合适数量的配体对时(其中富电子或阴离子配体对的分离具有2至10埃的距离)，则这种建模的低聚物所代表的聚合物将适合于结合根据本发明的外泌体或微泡。
因此，在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的组合物或分离物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-所述聚合物从所述基底表面延伸以将外泌体结合配体定位在与所述基底表面间隔开的位置处以结合至外泌体或微泡，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物；
其中在计算机中观察到所述外泌体结合配体在本文所述的能量最小化模型中彼此间隔超过2埃并且不超过约10埃，优选3.5至6埃、优选4至6埃。
在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-其中所述多种聚合物具有与所述基底不同的化学成分；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物；
其中在计算机中观察到所述外泌体结合配体在本文所述的能量最小化模型中彼此间隔超过2埃并且不超过约10埃，优选3.5至6埃、优选4至6埃。
由在一种或多种聚合物上提供的外泌体结合配体形成的阵列的顺序通常取决于所述聚合物关于每种聚合物内单体的顺序和每种聚合物的长度的不均匀性。优选地，用于本发明中的聚合物具有关于单体顺序和聚合物长度的很小不均匀性，或者或多或少的均匀性。优选地，所述聚合物是线性的。
在这方面，优选合成聚合物，而不是源自天然或生物来源的聚合物。这是因为来自生物来源的聚合物(如某些多糖)具有关于聚合物长度、支化、单体顺序和甚至单体官能化的显著不均匀性。如本文所述，这种不均匀性通常导致较低的外泌体或微泡结合效率和较低的外泌体或微泡产率。因此，在一个实施方案中，聚合物不是未分级分离的或非均匀的天然或生物来源，特别是肝素。
更优选地，关于单体含量，聚合物具有均匀的单体顺序，特别是在聚合物包含不同单体种类的情况下，并且其中仅一些单体种类含有外泌体结合配体。特别重要的是，单体顺序的均匀性在外泌体结合配体的间隔中产生均匀性，所述外泌体结合配体被提供至外泌体或微泡的外膜表面。这通常要求外泌体结合配体的均匀立体化学以用于与外泌体或微泡相互作用。
优选至少25％的形成聚合物的单体、优选50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％的形成聚合物的单体具有外泌体结合配体，所述外泌体结合配体被布置在基底表面上以能够与外泌体或微泡外膜结合。
特别优选的是，所有形成聚合物的单体都将外泌体结合配体提供至外泌体或微泡的外膜表面，所述外泌体结合配体彼此间隔约3.5至6埃、4至6埃、优选3.5、4、5或6埃。
在聚合物由多于一种单体种类组成的某些实施方案中，一种种类可提供一种类型的外泌体结合配体，并且另一种单体种类可提供另一种类型的外泌体结合配体。
此外，取决于单体种类的长度，一种单体种类可提供多于一种外泌体结合配体(其可相同或不同)，条件是在它们提供至外泌体或微泡外表面中，在所述单体种类上提供的配体彼此间隔约3.5至6埃、或4至6埃，优选3.5、4、5或6埃。
本发明的出人意料的发现是外泌体和微泡可基于电荷并且特别是外泌体或微泡上的正电荷与体内或体外形成的生物流体的其他组分分离。这是出人意料的，因为通常已经理解，大多数细胞膜和脂质双层具有净负电荷，特别是由在生理pH下通常带负电荷的脂质极性头部基团、细胞膜糖和蛋白质产生的净负电荷。
在上述实施方案中使用的外泌体结合配体呈阴离子或富电子基团的形式或由阴离子或富电子基团组成，其中多种聚合物具有与基底不同的化学成分，或者其中所述聚合物从基底表面延伸以使外泌体结合配体远离所述基底表面定位。外泌体通常在7.4+/-1-1.5的生理pH下稳定。因此，外泌体结合配体通常在pH约4至8或5至8下是阴离子或者富电子基团。外泌体结合配体可以是无机或有机阴离子或富电子基团。无机阴离子的实例包括含有硫、硒、硼、氮或磷原子的阴离子，并且包括硫酸盐、硒酸盐、磷酸盐、膦酸盐、次膦酸盐。优选地，所述配体是有机阴离子或富电子基团。实例包括硫酸化醇和胺、酰胺、磺酰胺、羧酸根基团、醇、醚、酸酐、硒酸盐、酰亚胺、酰基磺酰胺、膦酸盐、次膦酸盐、磷酸盐等。在一个实施方案中，根据本发明的外泌体结合配体的阵列可以是有机阴离子和无机阴离子或富电子基团的组合。
如本文所述的本发明的重要发现是，在利用聚合物来提供外泌体结合配体的阵列的情况下，基于其将均匀间隔的多种外泌体结合配体提供或展示至微泡外膜表面的能力而不是基于聚合物主链的一些其他特征来选择聚合物。在这方面，本发明区别于前面描述的其他方法，所述其他方法使用聚合物来从溶液中沉淀微泡。那些方法通常基于水溶性和体积排阻特征选择聚合物。在这些方法中使用的示例性聚合物是聚乙二醇[US2013/0273554和US2013/0337440]和多糖[US20150192571]。
根据上述实施方案，其中多种聚合物具有与基底不同的化学成分，或者其中所述聚合物从基底表面延伸以使外泌体结合配体远离所述基底表面定位，所述聚合物可以是多糖、聚对苯二甲酸乙二醇酯或具有适于用阴离子基团或富电子基团衍生化的侧链的肽，如聚天冬氨酸、聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚天冬氨酸、核酸或其他有机分子，如聚醚、(PEGS)、硫酸化聚乙烯醇、多酚、聚苯基硼酸或其他聚芳族化合物或聚杂芳族化合物，优选合成的。在聚合物源自天然或生物来源并且已知聚合物具有显著来源依赖性不均匀性(特别是关于聚合物长度、单体含量和顺序)的实施方案中，特别优选地是分级分离天然或生物来源以便降低所需长度、单体含量或顺序的聚合物的不均匀性并且增加其均匀性。通常，对于某些多糖如肝素，聚合物具有10kDa至900kDa、优选20至50kDa的分子量，或者对于某些其他分子(一个实例是壳聚糖)，聚合物具有100至200kDa的分子量。特别优选的聚合物是选自吡喃糖的基团的多糖的合成或均匀的天然或生物来源，其中单体包括(但不限于)右旋糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖以及氨基糖等。聚合物可以肽的形式提供。特别优选的肽是聚天冬氨酸。如本文所述，聚谷氨酸可能是不太优选的，因为阴离子侧链的间隔超过本发明的4至6埃的优选范围。其他优选的肽包括聚丝氨酸、聚苏氨酸、聚天冬酰胺、多半胱氨酸、聚硒代半胱氨酸以及它们的D-构型氨基酸。聚合物主链可以是水溶性的或不溶性的。在特别优选的实施方案中，聚合物含有长度接近葡萄糖单体的长度(约1.5nm)的单一单体种类，或者是长度为约1.5nm的葡萄糖单体或其衍生物，并且其中每种单体包含被布置成使得每个基团间隔约4至5埃的阴离子基团或富电子基团，并且其中所述聚合物含有约100至400个单体、优选约250至300个单体，和/或具有约40至60kDa、优选约45至55kDa的分子量。在一个优选的实施方案中，聚合物是线性链纤维素分子，其中将用于提供至外泌体外膜表面的每种单体用阴离子基团或富电子基团、优选硫酸根基团官能化。
在要在基底表面上形成阵列的情况下，整个基底表面不必被外泌体结合配体的阵列覆盖或含有外泌体结合配体的阵列。在一个实施方案中，所述基底由外泌体或微泡结合区组成，所述外泌体或微泡结合区在所述区域上具有外泌体结合配体的阵列以使外泌体或微泡能够结合至所述结合区。可对基底的其他表面进行工程化以排除外泌体的结合。例如，可构建这些“非结合”区域，以使得在使用中它们不向外泌体或微泡提供外泌体结合配体。外泌体结合区和非结合区域的这种布置可用于形成用于外泌体的产生、检测或监测的装置。此类装置可包括微流体装置，或用于细胞培养的较大装置或用于临床的医疗装置。
在一个优选的实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底，
-附接至所述基底的多种聚合物，
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述聚合物上以结合至外泌体，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
其中：
所述基底是琼脂糖，所述聚合物是葡聚糖，并且所述外泌体结合配体是硫酸酯(例如，Capto DeVirS或CaptoS(GE Healthcare Biosciences AB))；或
所述基底是聚乙烯醚，所述聚合物是聚丙烯酰胺，并且所述外泌体结合配体是磺基异丁基(SO3-)(例如，Eshmuno S(Merck,KGaA))；或
所述基底是聚甲基丙烯酸酯，所述聚合物是聚丙烯酰胺，并且所述外泌体结合配体是磺基异丁基(SO3-)(例如Fractogel EMD SO3-(Merck,KGaA))；或
所述基底是聚甲基丙烯酸酯，所述聚合物是聚丙烯酰胺，并且所述外泌体结合配体是羧乙基(例如Fractogel COO-(Merck,KGaA))；或
所述基底是改性的亲水性聚醚砜(polyetherslfone)，所述聚合物是交联的聚合物涂层，并且所述外泌体结合配体是SO3磺酰基(例如，Mustang S,(Pall Corp.))；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。在特别优选的实施方案中，所述基底是纤维素，所述聚合物是葡聚糖，并且所述外泌体结合配体是硫酸酯。一个实例是WO2008/039136的表4中所示的装置，所述装置具有仅将葡聚糖上的硫酸酯接枝在琼脂糖珠上的构造。
在另一个实施方案中，提供了一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法。所述方法包括以下步骤：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底，
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述基底表面上以结合至外泌体，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
其中：
所述装置选自以下产品组：
所述基底是琼脂糖，并且所述配体是磺丙基(硫酸酯)(例如SP琼脂糖凝胶(GEHealthcare Lifesciences))；
所述基底是琼脂糖，并且所述配体是羧基(例如，CM琼脂糖凝胶(GE HealthcareLifesciences))；
所述基底是聚甲基丙烯酸酯，并且所述配体是硫酸酯(例如，Toyopearl硫酸酯(Tosoh Biosciences))；
所述基底是聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)，并且所述配体是SO3(磺酰基)(例如CIMmultus SO3(BIA))；
所述基底是纤维素，并且所述配体是磺酸(R-CH2-SO3-)；(例如，Sartobind S(Sartorious))；
所述基底是纤维素，并且所述配体是硫酸酯(例如，Sartobind SC(Sartorious))；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
所述装置可采用一系列形状或构造的形式。所述装置的基底的表面可以是平坦的、弯曲的、锯齿状的或多孔的。所述表面可在管或孔内或在珠或膜上形成。因此，所述装置可以是膜、珠、管或孔或其他。
在一个实施方案中，使用合适的纳米技术分析技术如原子力显微镜、透射电子显微镜(TEM)、俄歇发射光谱(AES)激光质谱法、X射线光子光谱学，使装置表面与一个或多个传感器连通以感测与这种装置结合的外泌体或微泡的存在、性质或大小。
在另一个实施方案中，使所述装置的基底表面与测量装置连通以通过诸如(a)电探针、(b)嵌入式激光、(c)电场力显微术、(d)磁力显微术、(e)扫描栅显微术或其他合适的技术中的一种或多种的方式测定外泌体-基底(或微泡-基底)组合的有用参数，如以下中的一种或多种：(i)外泌体的存在或不存在(以及由此外泌体的数量和密度)，(ii)外泌体的大小，(iii)外泌体的传导性，(iv)外泌体的表面标记物，(v)外泌体的刚性，(vi)外泌体的电荷或(vii)一些其他有用的参数。所述装置可形成测量装置。
本发明的方法利用上文定义的包括外泌体结合配体的装置来基于电荷从生物来源分离微泡、特别是外泌体。如上所述，本发明人出人意料地发现，外泌体和微泡可基于电荷、并且特别是基于外泌体或微泡的正电荷与生物流体的其他组分分离。基于这一发现，本发明人已经利用了离子交换色谱方法来分离外泌体和微泡。
根据本发明，使含有外泌体或微泡的液体在能够使液体中的外泌体或微泡结合至外泌体结合配体的条件下与装置接触。这然后使外泌体或微泡结合至装置，这是随后从液体中分离外泌体或微泡的基础，如由装置与液体的分离所引起。
使外泌体或微泡能够结合至外泌体结合配体的条件通常需要考虑含有所述外泌体或微泡的液体的盐含量和pH。通常，液体的pH由外泌体或微泡的pH稳定性限定，并且这种pH稳定性在约4至8的范围内。
在一些实施方案中，含有外泌体或微泡的液体可在与装置接触之前进行预加工。这种加工可包括例如pH调节以优化与外泌体结合配体的结合相互作用。例如，可能需要将溶液的pH调节至7.2至7.4的生理pH水平。这确保了由外泌体结合配体结合的外泌体或微泡上的部分是阳离子的并且能够结合至外泌体结合配体的阴离子或另外富含电子基团。
加工还可包括在使液体与装置接触之前的盐调节，可能地例如通过透析步骤使液体盐最小化。
通常，含有外泌体或微泡的液体在与基底接触之前将具有在7.2至7.4范围内的pH和0.1至0.5M、优选0.15M的盐含量以及0.01M的磷酸盐含量。
可能需要进一步加工以除去可能干扰外泌体或微泡与外泌体结合配体的结合的细胞碎片或污染。这种加工可包括在500g下离心，有或无过滤至约0.22微米。
在一个实施方案中，液体可呈生物流体的形式，将所述生物流体离心以形成上清液和含有微泡的团块，并且丢弃上清液且将所述团块重新悬浮于离子交换结合缓冲液中以与装置接触。这样的缓冲液通常具有在7.2至7.4范围内的pH和在0.1M至0.2M范围内的盐含量。
在液体与装置接触之前，也可采用过滤来从液体中消除特定大小的微泡。例如，在液体与装置接触之前，可将液体分级分离以除去直径大于100nm的外泌体。或者，此步骤可在完成从外泌体结合配体洗脱微泡时进行(如下文进一步描述的)。
使液体和装置接触足以使外泌体能够结合至外泌体结合配体的时间段。通常这是1分钟至16小时并且可以在大约15分钟内。它可以少于1分钟，例如少于30秒。
液体与装置的接触可以各种形式建立。例如，液体可通过固体树脂或珠渗滤，捕获，并且渗滤和捕获循环重复预定数量的循环。
如上所述，本发明的特别的优点在于揭示，带电聚合物(特别是源自具有固有不均匀性的天然来源的那些)关于它们结合至外泌体或微泡的能力之间存在差异，并且通过明智地选择根据本文中本发明的基底或聚合物，有可能获得结合效率的显著提高。特别是在本文所述的工作中，本发明人已经表明，对于外泌体或微泡结合可能被认为同样有效的聚合物(因为它们共同在生理pH下都是带负电的)具有不同的效率水平，并且不同的结合效率水平可通过提供至外泌体或微泡的外膜表面的负电荷的布置来解释。
特别地，如本文所述，本发明人已经确定，主要由理论结合效率的差异引起的总体分离产率在约4.3％(如针对透明质酸所观察到)至高达98％(如针对硫酸cellufine所观察到的)的范围内。此外，通过确定针对结合效率进行测试的聚合物的结构和结合模型，已经根据提供至外泌体外膜表面的阴离子和富电子基团的布置来解释了结合效率的差异，从而使得能够选择最佳基底或聚合物用于外泌体结合，并且特别是更可能提供更高结合效率的那些。
通过在外泌体或微泡分离程序中实施这项工作，本发明能够实现比可另外用于获得外泌体或微泡的可接受产率的更广泛范围的结合选择。当对可在结合缓冲液中应用的pH或盐条件存在限制时，这是特别有用的。
此外，本发明能够实现更有效的结合程序，从而潜在地能够实现更短的结合周期，或者在否则将需要多个结合循环的情况下，更少的结合循环。这些改进使外泌体或微泡分离的离子交换方法能够可靠地转化为高通量加工，这是实现外泌体的药物规模生产将最终需要的制造实践。
如上所述，所述方法的结合阶段中的最终步骤是使装置与液体分离，从而从液体中分离外泌体(所述外泌体结合至装置上的外泌体结合配体)。这种分离可通过从液体中除去装置(例如通过离心呈珠形式的装置)来主动实现，或者通过使液体在装置上通过而被动地实现(从而在液体与装置分离时从液体中消除外泌体)。
本发明的特别重要的优点是它能够从生物来源洗脱外泌体和/或微泡，以便产生主要由外泌体和/或微泡以及洗脱缓冲液组成的洗脱液。这对于调节最终产物的质量控制尤其重要。相比之下，迄今为止用于分离外泌体的其他方法导致用例如呈聚乙二醇或多糖或其片段形式的沉淀剂与用于降解多糖的酶一起纯化外泌体。这些方法需要最终产物的进一步操作以除去这些污染物，并且这种进一步操作如离心或过滤可能有害地影响外泌体。
本发明的出人意料的发现是，经由更高亲和力或更高亲合力相互作用与本发明的装置结合的外泌体和微泡可从外泌体结合配体均匀地洗脱，从而能够从所述配体中释放外泌体。具体地，如本文所述，已发现所选择的、但不相关的基底，即硫酸cellufine、壳聚糖和聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)具有改进的外泌体结合效率，并且通过利用洗脱缓冲液可通常洗脱与其结合的外泌体，所述洗脱缓冲液具有一系列盐浓度或pH范围，在所述盐浓度或pH范围内外泌体保持稳定。
因此在一个实施方案中，所述方法包括从所述外泌体结合配体洗脱外泌体或微泡以在所述基底与所述液体分离后从所述装置释放所述外泌体或微泡的另一步骤。
根据本发明，可通过装置与洗脱缓冲液的接触来洗脱外泌体或微泡。通常，洗脱缓冲液具有约0.5至4M或0.5至2M的盐含量，这取决于缓冲系统的pH。这种盐含量在洗脱缓冲液中的阴离子物质与外泌体或微泡的外膜之间建立优先结合，从而导致洗脱。
在其他实施方案中，洗脱缓冲液的盐含量可与结合缓冲液相同，并且洗脱缓冲液可具有比结合缓冲液更高的pH。当缓冲系统的pH接近结合至外泌体结合配体的外泌体或微泡上的部分的等电点时，这导致外泌体或微泡从外泌体结合配体中洗脱。因此，在一个实施方案中，洗脱缓冲液具有约0.5至2M的盐含量和约7.2至7.4pH单位的pH。
在另一个实施方案中，洗脱缓冲液可包含形成基底表面的聚合物的低聚物，所述低聚物具有比聚合物上的外泌体结合配体更高的阴离子电荷或更高的电势，从而导致外泌体或微泡的洗脱。例如，当外泌体结合配体以硫酸纤维素多糖的形式提供在基底表面上时，洗脱缓冲液可包含具有更高硫酸化量的短链纤维素低聚物。
在另一个实施方案中，洗脱缓冲液可包含竞争性配体，所述竞争性配体比基底上的外泌体结合配体对外泌体或微泡具有更高的亲和力。例如，可使用含有过量糖(优选果糖)的洗脱缓冲液从硼酸聚合物中洗脱外泌体，所述糖比硼酸对外泌体具有更高的亲和力，从而从基底洗脱外泌体。
在一个实施方案中，洗脱缓冲液仅施加至基底一次。在其他实施方案中，洗脱缓冲液可连续循环预定数量的循环。
在一个实施方案中，所述方法可包括使释放的外泌体或微泡与装置分离的另一步骤。当外泌体或微泡在洗脱完成时与基底一起保持在溶液中时，特别需要这一步骤。一个实例是其中外泌体或微泡从布置在呈珠形式的装置上的外泌体结合配体洗脱，并且所述珠将从释放的外泌体或微泡中除去。在其他实施方案中，物理分离可简单地由外泌体从装置洗脱产生，如例如可在柱色谱法中发生。
应了解的是，在本说明书中公开和定义的本发明延伸至两个或更多个提及的或根据正文或图式显而易见的个别特征的所有替代性组合。所有这些不同组合构成本发明的各个替代性方面。
实施例
实施例1-使用基于聚合物的基底的外泌体分离
1.1测试材料
所使用的测试材料是源自在Opti-MEM完全培养基(
Figure BDA0002841041980000162
血清减少型培养基+10％外泌体消减的胎牛血清+青霉素-链霉素+GlutaMAX)中培养48-72小时的鼠下丘脑神经元细胞系GT 1-7的细胞培养条件培养基。
1.2测试方法
将新鲜收获的细胞培养条件培养基离心(500xg持续5分钟)以除去细胞和大的碎片，然后使用0.22μm注射器过滤器过滤上清液以除去大的囊泡和凋亡小体。使用NanoSightNS300上的纳米粒子跟踪分析(NTA)对过滤的条件培养基的粒子浓度进行定量。
表1描述了一组基于聚合物的基底，测定了所述基底的结合和洗脱效率以及总体分离产率。
壳聚糖是200kDa(生物素-)壳聚糖(定制的)。Viroadem珠是Ademtech Viro-Adembead。
Figure BDA0002841041980000161
75来自Sigma Aldrich#S6657。BA-Magbead来自Chemicell 1504-5SiMAG-硼酸磁性粒子。PEG-对照：生物素-PEG24(作为3-APBA/4-APBA的对照，其严格来说是生物素-PEG24-3APBA和生物素-PEG24-4APBA(定制的)。Mag Bead对照来自SpherotechSVM-40-10抗生物素蛋白包被的磁性粒子。使用Norgen Biotek细胞培养基外泌体纯化试剂盒(#60600)。壳聚糖、肝素、3-APBA、4-APBA、PEG对照和透明质酸是与Spherotech SVM-40-10抗生物素蛋白包被的磁性粒子偶联的生物素-X。
将以优化的浓度固定在基底上的配体与1ml定量测试材料在4℃下在管旋转器(100rpm)上孵育5小时，以测试亲和力捕获外泌体的能力。在孵育后分离配体固定的固体基底，并在NanoSight NS300上使用NTA在捕获后溶液中测定粒子的浓度(未结合的外泌体)。将与外泌体结合的分离的配体固定的固体基底在4℃下在管旋转器(100rpm)上在洗脱溶液中孵育过夜以洗脱结合的外泌体。在洗脱孵育后分离配体固定的固体基底，并在NanoSightNS300上使用NTA在溶液中测定粒子的浓度。
1.3数据采集
在NanoSight NS300上使用NTA测定粒子浓度。所采用的数据采集策略是在静态模式操作中获取5x 30秒视频。NanoSight软件然后分析5个独立的30秒视频采集，以准备具有平均(+/-标准误差)粒子浓度数据的实验报告。
1.4测试读数
测量了在三个实验阶段的粒子浓度
(i)亲和分离前(即捕获前测试材料中的粒子浓度)
(ii)溶液中亲和捕获后(即捕获后测试材料中的代表未结合的外泌体的粒子浓度)
(iii)洗脱后(即洗脱配体捕获的粒子后溶液中的粒子浓度)
1.5数据分析方法
所获得的测试读数数据用于确定四个参数：
·配体结合效率(即通过暴露于配体固定的固体基底而捕获的测试材料中的粒子数量)
·配体洗脱效率(即所洗脱的配体捕获粒子的比例)
·总体过程产率
1.6.结果
在优化的结合条件下，呈硫酸cellufine形式的硫酸纤维素配体显示理论结合效率为77.90％，理论结合粒子数量为1.31x1010(表1)。从硫酸cellufine珠洗脱后回收的粒子数量为1.64x1010，通过仪器定量的洗脱效率为125％(表1)。硫酸cellufine配体的总体过程产率是98％(表1)。注意，由于操作和其他因素，125％的洗脱效率受到各种量化数据差异的影响。可预期实际洗脱效率趋向于低于100％。
Viroadembead显示理论结合效率为66.13％，理论结合粒子数量为1.11x1010(表1)。在所测试的洗脱条件下，能够洗脱由Viroadembead捕获的41％的粒子，平均大小为232.4nm(表1)。Viroadembead的总体过程产率是27％(表1)。
出人意料的是，基于超速离心的外泌体分离的总体粒子分离产率是7.5％(表1)。与用本发明中报告的配体观察到的总体分离产率相比，这一产率显著更低。Nordin等人报告通过超速离心的外泌体产率是10％(Nordin等人，2015)。此外，4L脂肪干细胞来源的CM通过超速离心产生0.9mg外泌体，从而需要23L CM和276-280小时加工以产生可能为5mg的单一人剂量。相比之下，本发明中描述的具有80％外泌体产率的配体可从少于4L的脂肪干细胞来源的CM产生5mg的单一人剂量，当以色谱模式加工时具有更短的加工时间。与现有的超速离心的金标准分离方法相比，这进一步突出了本发明中描述的配体分离外泌体的优异性。
实施例2-确定EMIT结构和功能模型
为了确定功能化聚合物之中最佳外泌体结合的可能性，遵循计算机能量最小化方案。在已知的情况下(例如在壳聚糖或cellufine硫盐的情况下)使用配体的正确立体化学构型绘制或定义(例如在聚天冬氨酸的情况下)表示聚合物的子部分的低聚物(其大小可在从六聚体至十二聚体的范围内)。在构型是随机的或未知的情况下，如在聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)的情况下，则同样使用随机低聚物结构。然后使用Polak-Ribiere下降函数对结构进行能量最小化计算(MM+或AMBER分子力学模型，HyperChem版本7.5)。确定能量最小值所需的计算迭代的次数通常是1000-2000，但如果未达到能量最小值，则允许继续计算，直到达到这种最小值。此时，从若干角度观察布置，并且就例如硫原子(在硫酸化多糖的情况下)或酸酐羰基氧(在聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)的情况下)之间的相互距离而言来评估配体的定位。在这些情况下聚合物的二级结构说明由6-12个单体单元组成的主链布置成螺旋形状，在其上结合部分向外突出。应理解，这些能量最小化计算代表聚合物的分数子部分，而不是整个聚合物，这是由于软件/加工限制以及还有总体聚合物大小的任何变化所致。此外，MM+/AMBER型计算在不存在溶剂化分子如水或其他可能在体内或在实际意义上遇到的组分的情况下进行。因为这些计算确实仅在配体官能化的低聚物本身的意义上进行，所以所述方法消除将在更复杂的介质中存在的不一致性和不可预测的组分，并且因此可被认为是内部一致的。此外，使用最小化的结构内的配体间隔获得的结果展示与外泌体结合效率的观察结果一致的图案。
实施例3-硫酸cellufine和磷酸cellufine的预测结构
硫酸Cellufine是可以Cellufine Sulfate(JNC Corporation,Japan)商购的合成衍生的硫酸纤维素粒子。硫酸cellufine制剂的合成方法是欧洲专利EP0171086A2的一部分。简言之，非交联纤维素粒子由250-300葡萄糖单元制成的葡萄糖聚合物作为原料聚合物开发。然后使用硫酸盐试剂将纤维素粒子硫酸化以得到硫酸纤维素珠(硫酸cellufine)。粒子上的硫总含量是900μg/g干重。
使硫酸cellufine七聚体模型如所示最小化(图1(A)和1(B))，端部和侧部投影，在相邻的硫酸根氧物质之间进行样品原子-原子测量。硫酸根部分(测量硫与相邻硫)相距大约
Figure BDA0002841041980000181
其中带电氧能够在
Figure BDA0002841041980000182
内移动(如侧面投影所示)。这种模型表明，为了结合外泌体，必须存在足够的间隙(从螺旋向外突出)和形成氢键的能力，如在醇部分与阴离子或中性富电子氧之间。配体与其形成氢键的外泌体表面分子因此可能是氢键供体，如醇，如细胞膜的磷脂或其他主要组分内的二醇。在这种情况下，伯醇基团(CH2OH)投射在两个阴离子基团(如硫酸根)之间，从而形成钳型氢键网络，其中醇氢可一次与两个氧原子相互作用。硫酸根氧的简并性质意味着相互作用的可能性更大(每个硫酸根三个，对于一对硫酸根总共六个)，并且因此增加氢键网络对于结合的强度。参见图1(A)和1(B)。
类似地，磷酸Cellufine是合成衍生的磷酸纤维素粒子。它也可作为CellufinePhosphate(JNC Corporation,Japan)商购。出于说明目的表示为十二聚体，图1(C)和1(D)指示模型中螺旋结构的端部和侧部描绘。所述模型指示作为单阴离子的磷酸根基团(CH2OP(O)(OH)2)的部分带电性质，有效地CH2OP(O)(OH)O-与预期结合的pH范围一致。在这种情况下以及对于硫酸cellufine，在阴离子磷酸根之间投射伯醇基团(CH2OH)以形成钳型氢键网络。醇氢可一次与两个氧原子相互作用。磷酸根氧的简并性质与硫酸根的简并性质相似，尽管磷酸根的质子化程度的pH依赖性将决定相互作用的可能性。如图1(C)和1(D)所示，两个氧是简并的并且增加氢键网络对于结合的强度。
实施例4-聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)的预测结构
阴离子聚合物聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)(聚(MVE-MA)可作为Viroadembead(Ademtech,France)商购。用于Viroadembead的简要合成方法如下文所述(Sakudo等人，2009b)。通过在37℃在二甲基亚砜(DMSO)/磷酸盐缓冲液5/95溶液中接枝聚(MVE-MA)3小时制备小(300nm直径)的一氧化物磁性粒子(减少沉降并提供宽表面)，其具有高铁氧体含量(从而允许在磁场下的面分离)。
在聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)(PMVEMA)的情况下，呋喃二酮和主链甲氧基取代两者上的取代的立体化学是随机的和不确定的。为了获得能量最小化的结构，使用均匀且一致的立体化学构型，从而产生折叠结构，其中交替的呋喃二酮部分指向远离主链。相邻羰基(其可一起充当与磷脂相互作用的氢键受体)之间的分离是大约
Figure BDA0002841041980000192
参见图3。
实施例5-壳聚糖的预测结构
壳聚糖(一种由几丁质的N-脱乙酰化产生的天然多糖)含有60％-100％的N-脱乙酰化单糖单元。壳聚糖的能量最小化结构形成螺旋，其中氨基朝向内部面定位，从而将螺旋部分从螺旋向外投射，如下文所示，端部。侧部投影说明相邻的伯醇基团的位置，在此提出为能够与外泌体的磷脂相互作用的结合部分。这些围绕螺旋的周边间隔大约
Figure BDA0002841041980000193
布置。参见图2A和2B。
实施例6-肝素的预测结构
肝素(其比乙酰肝素更少硫酸化)由葡糖醛酸、半乳糖胺和艾杜糖醛酸部分组成。肝素含有比乙酰肝素更多的艾杜糖醛酸，乙酰肝素携带更多的葡糖醛酸单糖。因此，能量最小化的肝素模型是任意的，因为结合部分的几何形状的预测不能预期在整个聚合物结构中一致。因此假设基于单糖单元的任意布置预测，然而能量最小化结构也形成螺旋上层结构，硫酸根基团从所述上层结构向外投射。如所示，相邻硫原子之间的距离在5与
Figure BDA0002841041980000191
之间。鉴于肝素将含有比所描绘更少的硫酸根，这将有可能导致比例如含有更一致的单糖单元序列的硫酸cellufine更低的结合效率。参见图4。
实施例7-3-APBA和4-APBA的预测结构
化合物3-APBA是指生物素化的(PEG-24)-3-氨基苯基硼酸，其根据表1较差地结合外泌体。其基于4-氨基苯基硼酸的类似物(上表中的4-APBA)也是无效的。两种化合物在使用前都需要超声处理，从容表明在培养基中它们倾向于自身折叠并形成不利于结合至外泌体的胶体或其他悬浮液。PEG对照(简单聚乙二醇)在溶液中将具有不同的物理特性，并且不会以类似的方式缔合。
携带相等间隔的阴离子基团的阵列的有机聚合物，包括硼酸(如聚(3-丙烯酰胺基苯硼酸)占据允许相邻芳基π-堆叠的能量最小化的几何形状，其中阴离子附属物非常接近地布置。这一实例(具有在核心聚丙烯酰胺主链外的随机立体化学)说明两种特征，其中相邻硼原子间隔小于
Figure BDA0002841041980000201
参见图5。
实施例8-透明质酸预测结构
透明质酸(其由通过3-和4-位置连接的交替糖单元组成)不能容易地形成紧密的螺旋结构，其中带负电的羧酸根形成与存在于例如硫酸cellufine或肝素中的那些阴离子基团类似的构象。交替的二糖最小化为不太有序的非螺旋阵列，从而将羧酸根置于相对随机的位置。这种缺乏有序性可能导致化合物不能有效地结合外泌体。在此，羧酸根在空间填充模型上以绿色显示，以说明它们缺乏彼此接近。参见图6。
实施例9-硫酸软骨素预测结构
硫酸软骨素以100个或更多个交替的葡糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺单元的各种形式存在，其中交替的单糖单元在不同位置连接。出于这一原因，不可能创建通过其可预测其结合外泌体的能力的特定模型。然而，八聚体的MM2+-最小化模型说明可充分暴露从核心主链向外突出的相邻硫酸根和羧酸根基团以促进与磷脂的相互作用。参见图7。
实施例10-聚氨基酸预测结构
聚氨基酸(另一种潜在的外泌体结合配体类型)包括聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丝氨酸等。
预测γ-聚谷氨酸采用折叠形式，其中羧酸根基团垂直于主链定位，间隔大约
Figure BDA0002841041980000202
潜在结合部分之间的这种距离可能不足以允许与磷脂的有效相互作用。因此，预期这种聚合物是低效外泌体结合物。
聚天冬氨酸可通过各种合成方法以所有L-形式、所有D-形式或作为构型混合物制备。出于说明性目的，将聚-L-Asp的八聚体描绘为N-乙酰基-Asp7NH2。在这种情况下，能量最小化的分子表现为一系列交替的环，羧酸根在其上向外突出，其中相邻的CO2-基团间隔4.5与
Figure BDA0002841041980000203
之间(碳与碳的距离)。根据结构模型，预期聚天冬氨酸是有效的外泌体结合物。
聚-β-天冬酰胺衍生物可通过实施例11中所述的各种合成方法以所有L-形式、所有D-形式或作为构型混合物制备。
基于这一模型，以及对天然存在的蛋白质的多丝氨酸区域中的二级结构的观察，合成的聚丝氨酸也将预期存在于一系列交替的环中。在这种情况下，所提出的外泌体结合部分(与壳聚糖的那些相似的富电子醇部分)占据与其他外泌体结合聚合物相似的相邻距离。
在Salk研究所的Rivier和Penke的美国专利4444682A(1984)中，通过乙酰基硫酸盐描述了丝氨酸和其他携带羟基的氨基酸(例如酪氨酸、苏氨酸)的硫酸化以形成聚丝氨酸硫酸盐。因此，聚丝氨酸硫酸盐的制备将提供高度硫酸化的多糖如硫酸cellufine的肽样类似物。由于其不对称性，这种分子的几何形状采用比未硫酸化的多肽的几何形状更螺旋的形状。如随机化侧链形式所描绘(如在聚-D,L-Ser-硫酸盐中所见)，相邻硫酸根部分以类似于多糖展示的方式使它们自身向外布置。硫原子间距离在相似的范围内：
Figure BDA0002841041980000211
参见图9至12。
实施例11(a).生物素-C3-聚-4-羟基丁基-β-天冬酰胺和实施例11(b)生物素-C3- 聚-4-羟基苄基-β-天冬酰胺。
通过用所示的1-羟基丁胺或4-苯氧基乙胺处理聚合酸酐生物素C3-AspAn(生物素C3-聚琥珀酰亚胺)来完成合成，从而得到开环的聚合β-天冬酰胺衍生物。出于说明性目的，使用聚-β-1-羟基丁基天冬酰胺的八聚体(图11(A))来表示实施例11(a)的能量最小化构象，并且图11(B)示出实施例11(b)的能量最小化构象。两个实施例都结合外泌体，从而说明有效配体分离的范围。
Figure BDA0002841041980000212
实施例12-通用结构模型
因此，聚合物与外泌体结合的通用模型可这样表示：具有适当间隔的、突出的阴离子或能够氢键合基团向外延伸的螺旋或折叠，其中主链由重复模板组成，并且阴离子基团可表示其中R＝CO2H、CH2OH、CH2OSO3H、B(OH)2和CH2OP(O)(OH)2，或由它们的相关pKa所指示的呈离子化形式的那些基团，以及外泌体能够结合至其的那些基团。所述模型解释了对外泌体具有高结合效率的聚合物带有阴离子基团或富电子基团，其中它们的相互分离在
Figure BDA0002841041980000213
之间。参见图13。
实施例13-聚乙烯硫酸酯预测结构
聚乙烯硫酸酯中的硫原子自身(在九聚体模型中)最小化至间隔约4.2-4.5埃。参见图8。
实施例14-基于结构模型预测外泌体结合配体的结合效率
实施例11的通用结构模型用于预测外泌体结合配体的结合效率，包括在先前实施例中测试的那些。结果在表2中示出。
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表1：
Figure BDA0002841041980000231
表2：所测试的配体LEAP与通过EMIT结构模型预测的配体的比较
Figure BDA0002841041980000241
注意：*在LEAP测试中具有25％或更高总体分离产率的配体被认为是阳性的

Claims (22)

1.一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法，所述方法包括：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述聚合物上；
-所述聚合物从所述基底表面延伸以将外泌体结合配体定位在与所述基底表面间隔开的位置处以结合至外泌体或微泡，从而使外泌体或微泡能够结合至所述装置；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物从所述基底表面延伸，以在与所述基底表面间隔开的位置处形成外泌体结合配体的线性阵列。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述外泌体结合配体通常以每nm 1至5个配体、优选每nm所述聚合物约2个配体的范围提供。
4.一种用于获得外泌体或微泡的分离物或组合物的方法，所述方法包括：
-提供包含外泌体或微泡的液体；
-提供用于结合至外泌体或微泡的装置，所述装置包括：
-具有表面的基底；
-附接至所述基底的多种聚合物；
-呈阴离子基团或富电子基团形式的外泌体结合配体，所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上；
-其中所述多种聚合物具有与所述基底不同的化学成分；
-使所述液体与所述装置在使外泌体或微泡能够结合至所述外泌体结合配体的条件下接触；
-使所述装置与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述外泌体结合配体布置在所述多种聚合物上以形成外泌体结合配体的平面阵列。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述平面阵列优选地包括密度为每nm2约1至10个配体的外泌体结合配体的区域。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物包含具有一种或多种外泌体结合配体的单体种类。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物的至少25％的单体包含外泌体结合配体。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物的所有单体具有外泌体结合配体。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列的每个配体与所述阵列的另一个配体间隔不超过约10埃。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列的所述配体间隔超过约2埃。
12.如权利要求11所述的方法，其中两种或更多种单体种类包含外泌体结合配体。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基底表面的一部分包括所述阵列。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合物是多糖或肽。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合物是合成聚合物。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种聚合物形成所述基底。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物偶联至所述基底。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚合物可溶于所述液体中。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括从所述外泌体结合配体洗脱外泌体或微泡以在所述基底与所述液体分离后从所述基底释放所述外泌体或微泡的另一步骤。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括使所述释放的外泌体或微泡与所述基底分离的另一步骤。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：
-使所述液体与选自由以下组成的组合物的组的组合物：
·Capto DeVirS或CaptoS(GE Healthcare Biosciences AB))；
·Eshmuno S(Merck,KGaA))；
·Fractogel EMD SO3-(Merck,KGaA))；
·Fractogel COO-(Merck,KGaA))；
·Mustang S,(Pall Corp.))；
·SP琼脂糖凝胶(GE Healthcare Lifesciences))；
·CM琼脂糖凝胶(GE Healthcare Lifesciences))；
·Toyopearl硫酸酯(Tosoh Biosciences))；
·CIMmultus SO3(BIA))；
·Sartobind S(Sartorious))；以及
·Sartobind SC(Sartorious))；
-在使外泌体或微泡能够结合至所述组合物的条件下接触；
-使产物与所述液体分离；
从而获得外泌体或微泡的分离物或组合物。
22.一种设备或装置，所述设备或装置包括如前述权利要求中任一项所述的基底并且能够执行如前述权利要求中任一项所述的方法。
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