CN114196503A - 一种基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，该方法基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片，分离富集体液或培养基中外泌体。外泌体富集芯片构成如下：上层为直通道液路层，下层为三角柱混流液路层；具体设置有下述结构：样品进样口、样品分离区以及样品出口。本发明通过壳聚糖在不同pH溶液中所带电荷不同，来实现样本中外泌体的捕获与释放，简化了外泌体分离富集流程，极大的提高了外泌体分离的效率，取得了较好的外泌体分离富集效果。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体分离领域，尤其涉及一种基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法。
背景技术
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调整过程而形成的细胞外纳米级囊泡。其在人体内分布广泛，人体的尿液、汗液、血液、乳汁等均含有外泌体。外泌体在人体内主要扮演两个角色，第一种是有免疫活性的外泌体，其主要在抗原呈递和共刺激中发挥作用，具有信息传递功能。第二种为含有数量可观的RNA并介导细胞间的遗传物质交流的外泌体，具有物质传递功能。随着研究的深入，人们发现外泌体在适应性免疫、炎症过程、胚胎形成、肿瘤的发生与发展过程中均发挥了重要的作用。就肿瘤来说，一百多年前，经过解剖人们发现特定的肿瘤细胞总是倾向于转移到特定的组织器官，并由此提出了著名的“种子与土壤”转移假说，认为肿瘤细胞只能在适宜的组织器官环境中才能形成转移灶。随着技术的发展肿瘤的转移机制在不断被完善，人们发现肿瘤可以通过分泌外泌体主动改变转移灶微环境，外泌体可以通过调节免疫功能，促进肿瘤血管新生以及肿瘤转移，或者直接作用于肿瘤细胞影响肿瘤进展。因此，对外泌体进行研究，有望为我们在肿瘤早期诊断和抑制肿瘤的发展等方面提供一个新思路。
微流控芯片技术是21世纪非常重要的一个技术，其核心是利用微流控芯片将样品预处理、生物和化学反应、分离检测等基本操作单元集成在具有微米或纳米微通道网络的芯片上，通过操控流体完成复杂的分析过程，具有样品和试剂消耗量少、分析时间短、高通量、容易实现大规模平行测定等优点。利用微流控分析技术可方便的实现分析系统的小型化、集成化和便携化。目前，该系统被广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域。此外，因其具有的微型、自动、使用试剂微量、高通量、可实现多功能集成等特点使其也成为了进行外泌体研究的潜在平台。目前使用微流控芯片对外泌体进行分离的技术主要有两类，一种是基于尺寸的分离技术，主要包括使用纳米孔膜、纳米阵列、微过滤器等器件结构直接对样品进行作用，分离出外泌体。另一种是基于免疫捕获的分离技术，主要包括平面免疫捕获和微珠免疫捕获。但想要高效的获得高纯度外泌体以及对外泌体进行分析与检测仍是一个难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片及其应用方法，以解决以往外泌体分离与检测过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等局限。
本发明提供了一种基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，该方法基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片，分离富集体液或培养基中外泌体。
所述体液为血液、尿液、唾液、乳汁、羊水等多种生物液体。
本发明提供了一种基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片，该芯片由上下两层芯片组成，其中：上层为直通道液路层，下层为三角柱混流液路层；
所述直通道液路层设置有下述结构：
——进样口：位于整个直通道液路层最上游；
——直通道区：布置在进样口和出口之间用于沟通两者；
——样品出口：位于整个直通道液路层最下游；
所述三角柱混流液路层位于直通道液路层正下方，三角柱混流液路和直通道区液路重合。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述直通道液路层和三角柱混流液路层的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，直通道液路层和三角柱混流液路层厚度相同，均为1-5mm；
其二，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道高度均为100-1000μm；
其三，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道宽度相同，均为0.1-1cm；
其四，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道长度相同，均为1-5cm；
其五，所述三角柱为“Y”形三角柱，三角柱尺寸为10-200μm。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求：
所述直通道液路层是在制作成功的直通道液路层模板上浇上一层高于模板1-5mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述三角柱混流液路层是在制作成功的三角柱混流液路模板上浇上一层高于模板1-5mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述进样口和样品出口由直径0.5-1mm的打孔器打孔所得；所述直通道液路层有结构一侧和三角柱混流液路层有结构的一侧通过氧等离子体封接到一起。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求：先通过进样口在通道中注入0.1％-2％的壳聚糖水溶液，4摄氏度放置4-24h后，用去离子水冲洗去通道中多余的壳聚糖水溶液，得到基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片的应用方法步骤如下：
(1)取出待分离样品10-100μL，和pH为5-6的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液混合，备用；
(2)使用注射器吸取待分离样本，并利用循环注射泵将样本从进样口注入到芯片中，在样品出口插一个100μL以上的黄色枪头以防止样品溢出，根据待分离样品体积设置循环注射泵的速率，每分钟循环0.5-2次，持续时间为10-30min；
(3)注射结束后使用MES冲洗通道1-3次除去多余样品；
(4)使用真空泵抽去通道中多余液体；
(5)使用移液枪将pH为8-9的Tris-Hcl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)缓冲液从进样口注入到通道中，静置5-10min后从样品出口吸出，即得分离好的外泌体品。
本发明所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片的用途说明：该芯片可应用于不同样本(培养基、血液、尿液、唾液等)中外泌体的富集。
本发明的优点：
1、本发明选用壳聚糖对外泌体进行捕获富集，是一种无标的外泌体富集方式，可以实现对样本中所有外泌体的富集。
2、本发明通过注射泵进行试剂引入，简化了人工操作，减少误差，实现了传统方法很难实现的时空分辨率。
3、本发明通过在芯片上引入三角柱的阵列设计，促进了待分离样本的混合，大大提高了分离效率。
4、本发明使用微流控芯片为平台，减小了反应体积，可以实现珍稀样本中外泌体的富集。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片结构示意简图；
图2为基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片上层结构示意图；
图3为基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片下层结构示意图；
图4为捕获外泌体之前基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片下层结构扫描电镜图；
图5为捕获外泌体之后基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片下层结构扫描电镜图。
其中：1为进样口；2为样品出口；3为直通道区；4为三角柱混流区。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片及其应用方法进行具体的说明。
实施例1
一种基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片，如图1所示，所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片由上下两层芯片组成，其中：上层为直通道液路层(图2)，下层为三角柱混流液路层(图3)；
所述直通道液路层设置有下述结构：
——进样口(1)：位于整个直通道液路层最上游；
——直通道区(3)：布置在进样口和出口之间用于沟通两者；
——样品出口(2)：位于整个直通道液路层最下游；
所述三角柱混流液路层位于直通道液路层正下方，三角柱混流液路区(4)和直通道区(3)重合。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述直通道液路层和三角柱混流液路层的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，直通道液路层和三角柱混流液路层厚度相同，均为3mm；
其二，所述直通道液路层高度为100μm，所述三角柱混流液路层通道高度为200μm；
其三，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道宽度相同，均为0.3cm；
其四，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道长度相同，均为3cm；
其五，所述三角柱为“Y”形三角柱，三角柱尺寸为150μm。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求：
所述直通道液路层是在制作成功的直通道液路层模板上浇上一层高于模板3mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述三角柱混流液路层是在制作成功的三角柱混流液路模板上浇上一层高于模板3mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述进样口和样品出口由直径0.6mm的打孔器打孔所得；所述直通道液路层有结构一侧和三角柱混流液路层有结构的一侧通过氧等离子体封接到一起。
所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求：先通过进样口在通道中注入1.5％的壳聚糖水溶液，4摄氏度放置12h后，用去离子水冲洗去通道中多余的壳聚糖水溶液，得到基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片。
本实施例所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片的用途说明：该芯片可应用于不同样本(培养基、血液、尿液、唾液等)中外泌体的富集。
本实施例的优点在于：
1、选用壳聚糖对外泌体进行捕获富集，是一种无标的外泌体富集方式，可以实现对样本中所有外泌体的富集。
2、通过注射泵进行试剂引入，简化了人工操作，减少误差，实现了传统方法很难实现的时空分辨率。
3、通过在芯片上引入三角柱的阵列设计，促进了待分离样本的混合，大大提高了分离效率。
4、使用微流控芯片为平台，减小了反应体积，可以实现珍稀样本中外泌体的富集。
实施例2
血液样本中外泌体的分离与富集
选用实施例1中制备好的微流控芯片对血液样本中的外泌体进行分离与富集，具体步骤如下：
(1)取出待分离样品10μL，和pH为5的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液按照样本：缓冲液＝1:4混合，备用；
(2)使用注射器吸取待分离样本，并利用循环注射泵将样本从进样口注入到芯片中，在样品出口插一个100μL以上的黄色枪头以防止样品溢出，根据待分离样品体积设置循环注射泵的速率，每分钟循环1次，持续时间为20min；
(3)注射结束后使用MES冲洗通道2次除去多余样品；
(4)使用真空泵抽去通道中多余液体；
(5)使用移液枪将pH为9的Tris-Hcl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)缓冲液从进样口注入到通道中，静置5min后从样品出口吸出，即得分离好的外泌体品。
图4为捕获外泌体之前基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片下层结构扫描电镜图，图5为捕获外泌体之后基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片下层结构扫描电镜图。从图中可以看出，捕获外泌体之后，芯片表面有100nm左右的白色颗粒，和文献报道中外泌体尺寸一致。
Claims (7)
1.一种基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：该方法基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片，分离富集体液或培养基中外泌体。
2.根据权利要求1所述基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：所述体液包括血液、尿液、唾液、乳汁、羊水等多种生物液体。
3.根据权利要求1所述基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片由上下两层芯片组成，其中：上层为直通道液路层，下层为三角柱混流液路层；
所述直通道液路层设置有下述结构：
——进样口：位于整个直通道液路层最上游；
——直通道区：布置在进样口和出口之间用于沟通两者；
——样品出口：位于整个直通道液路层最下游；
所述三角柱混流液路层位于直通道液路层正下方，三角柱混流液路和直通道区液路重合。
4.按照权利要求1所述基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述直通道液路层和三角柱混流液路层的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，直通道液路层和三角柱混流液路层厚度相同，均为1-5mm；
其二，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道高度均为100-1000μm；
其三，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道宽度相同，均为0.1-1cm；
其四，所述直通道液路层和三角柱混流液路层通道长度相同，均为1-5cm；
其五，所述三角柱为“Y”形三角柱，三角柱尺寸为10-200μm。
5.按照权利要求1所述基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：所述基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片还满足下述要求：
所述直通道液路层是在制作成功的直通道液路层模板上浇上一层高于模板1-5mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述三角柱混流液路层是在制作成功的三角柱混流液路模板上浇上一层高于模板1-5mm的聚二甲基硅氧烷，固化后揭下得到；所述进样口和样品出口由直径0.5-1mm的打孔器打孔所得；所述直通道液路层有结构一侧和三角柱混流液路层有结构的一侧通过氧等离子体封接到一起。
6.按照权利要求1所述基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：先通过进样口在通道中注入0.1％-2％的壳聚糖水溶液，4摄氏度放置4-24h后，用去离子水冲洗去通道中多余的壳聚糖水溶液，得到基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片。
7.按照权利要求1所述基于外泌体富集芯片的外泌体分离富集方法，其特征在于：该方法基于壳聚糖正负电荷吸附原理的外泌体富集芯片，方法步骤如下：
(1)取出待分离样品10-100μL，和pH为5-6的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液混合，备用；
(2)使用注射器吸取待分离样本，并利用循环注射泵将样本从进样口注入到芯片中，在样品出口插一个100μL以上的黄色枪头以防止样品溢出，根据待分离样品体积设置循环注射泵的速率，每分钟循环0.5-2次，持续时间为10-30min；
(3)注射结束后使用MES冲洗通道1-3次除去多余样品；
(4)使用真空泵抽去通道中多余液体；
(5)使用移液枪将pH为8-9的Tris-Hcl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)缓冲液从进样口注入到通道中，静置5-10min后从样品出口吸出，即得分离好的外泌体品。
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