BR112020026067A2 - métodos e composições para purificação ou isolamento de microvesículas e exossomas - Google Patents
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Abstract
A invenção fornece métodos e composições para o isolamento ou extração de exossomas ou microvesículas. Os métodos e composições podem envolver o fornecimento de um dispositivo que inclui ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos numa superfície de substrato. Os métodos e composições podem envolver o fornecimento de um dispositivo que inclui um substrato que tem uma superfície, com uma pluralidade de polímeros fixada ao substrato e ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na pluralidade de polímeros.
Description
[001] A invenção se refere a microvesículas celulares, particularmente exossomas, para modelagem molecular e para métodos cromatográficos para separação e isolamento de moléculas, incluindo cromatografia de troca iônica.
[002] A referência a qualquer técnica anterior no relatório descritivo não é e não deve ser tomada como um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica anterior forme parte do conhecimento geral comum na Austrália ou qualquer outra jurisdição.
[003] As microvesículas são uma coleta heterogênea de estruturas biológicas ligadas por membranas. Estas estruturas têm uma bicamada de lipídio e que podem residir dentro de uma célula ou num ambiente extracelular. As microvesículas têm uma faixa de tamanho de cerca de 20 nm a 1000 nm.
[004] Os exossomas são pequenas vesículas de bicamada de lipídio, secretadas por múltiplos tipos de célula e estão na faixa de diâmetro de 20 a aproximadamente 150 nm (conforme determinado por microscopia eletrônica (EM)). Diferente de outras microvesículas derivadas de célula, os exossomas são formados dentro do espaço intracelular e, então, secretados pela célula (Raposo e Stoorvogel, 2013).
[005] A composição lipídica de exossomas é distinta daquela da célula de origem, mas é ainda um tanto característico do tipo de célula do qual os mesmos se originam. Adicionalmente, os exossomas mostram alguns recursos lipídicos comuns independentemente de sua origem (Urbanelli et al., 2013).
[006] Dependendo de sua origem, os exossomas podem conter uma ampla variedade de “carga”, incluindo, porém sem limitação, peptídeos,
proteínas, lipídios, reguladores de transcrição, RNA mensageiro (mRNA), RNA de não codificação (ncRNA) e DNA de fita dupla (dsDNA).
[007] Os exossomas são agora considerados como um meio pelo qual uma célula de origem (isto é, a célula da qual o exossoma se origina) pode se comunicar com uma célula alvo, em situações, tais como sinapses neuronais, regulação imune, angiogênese, regeneração de tecido e modulação epigenética. Tal comunicação pode ser localizada ou remota. De fato, os exossomas de leite materno podem modular funções imunes e outras no recém-nascido. Tal comunicação pode ser, ainda, entre espécies, por exemplo, porém sem limitação, exossomas de leite bovino que modulam funções imunes e outras em seres humanos.
[008] Os exossomas podem ser originados de vários biofluidos, incluindo saliva, urina, sangue, plasma sanguíneo, lente (materno), ascites de fluido sinovial, seiva e extratos de frutas.
[009] Em resumo do anterior, parece que as características exclusivas de exossomas são acionadas por seu tamanho, absorção celular por endocitose, sua “carga”, e que os mesmos distribuem “mensagens” que se tornam biologicamente ativas na célula alvo.
[010] Há cada vez mais evidências de que os exossomas podem exercer um papel no início e na perpetuação de várias doenças. Os exossomas coletados de amostras biológicas podem fornecer informações diagnósticas sobre o estado atual de uma doença. A concentração de RNA em exossomas pode ser até 60 vezes maior que aquela extraída diretamente de fluidos corporais, tal como sangue, impulsionando o potencial para sua utilidade em diagnóstico. Por exemplo, a identificação de assinatura oncogênica de RNA dentro de exossomas isolados de fluidos humanos poderia potencialmente produzir um diagnóstico de um estado anormal muito antes de câncer invasivo se desenvolver.
[011] Recentemente, foi mostrado que a função de células do tipo mesenquimal terapêuticas não depende da própria célula, mas, em vez disto, de fatores parácrinos produzidos pela célula, incluindo exossomas, estabelecendo que exossomas são uma parte dos fatores secretados por células em circulação que podem mediar o efeito visto em algumas terapias celulares de uma maneira sem célula (Rani et al., 2015).
[012] Os exossomas terapeuticamente úteis coletados do meio condicionado de células que passam por cultura in vitro podem ser também usados como um produto terapêutico sem célula, mas há uma necessidade de um método flexível e robusto de isolamento de seus fluidos de fonte (Chen et al., 2010).
[013] Adicionalmente, os exossomas poderiam produzir um veículo de distribuição natural encapsulado com proteínas terapêuticas e RNA quando sistemas de expressão à base de célula são customizados especificamente.
[014] Os exossomas são invisíveis sob microscópio óptico normal. As tecnologias usadas para detecção destas partículas ultramicroscópicas como exossomas e microvesículas incluem microscopia eletrônica (EM), citometria de fluxo, dispersão dinâmica de luz (DLS) e análise por rastreamento de nanopartícula (NTA). Foi relatado que, dependendo do método usado, o número absoluto relatado de vesículas extracelulares num litro de sangue pode variar em tanto quanto cinco ordens de magnitude (van der Pol et al., 2010).
[015] Embora os exossomas sejam abundantes e se espere que sejam úteis num sentido diagnóstico ou terapêutico, os meios para isolar e purificar exossomas tem limitado sua aplicação clínica até a presente data.
[016] Em geral, os métodos existentes para isolamento de exossoma são caracterizados por dois grupos:
[017] (i) captura por afinidade devido a algum (possivelmente exclusivo) recurso externo seletivo da vesícula (por exemplo, marcador de glicoproteína, proteína transmembrânicas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81 e CD82) e MHC classe I e II e proteínas citosólicas como proteínas de choque térmico (HSP-70 e HSP-90))
[018] (ii) isolamento ou purificação com base em alguma propriedade biofísica do exossoma (por exemplo, tamanho, densidade, potencial zeta, superfície altamente curvada que contém defeitos de encapsulamento lipídico, sensores de curvatura de membrana)
[019] As limitações destas técnicas são apresentadas na tabela abaixo.
Método Aplicação Limitações Centrifugação diferencial Escalabilidade, Ultracentrifugação Centrifugação por gradiente complexidade operacional, (UC) de densidade (Greening et al., agregação de EV 2015) Coprecipitação de Precipitação Precipitação à base de contaminantes proteicos auxiliada por polietileno glicol (Rider et al., necessária para remoção polímero 2016) de polímeros após precipitação Isolamento de Captura baseada em subpopulação de anticorpo CD9, CD63, CD81 e exossomas, falta de Captura por EpCam (Greening et al., marcador padrão único imunoafinidade o 2015) (Pedido de Patente n para exossoma, problemas US 20150010913) com remoção de anticorpo ligado a exossoma Requisito de etapas Filtração de fluxo Filtração sequencial adicionais para purificação tangencial (Heinemann et al., 2014) adicional de exossomas.
[020] Tanto o documento no US2013/0273544 (Vlassov) quanto o documento no US2015/0192571 (Ghosh) divulgam o uso de polímeros incluindo polietileno glicol e certos polissacarídeos como polímeros de exclusão de volume para a precipitação de microvesículas de uma solução. O documento n o US20160216253 divulga o uso de heparina para isolamento de vesículas extracelulares.
[021] Há uma necessidade de um método aprimorado para isolamento de exossomas, em particular um método que fornece um rendimento aprimorado de exossomas, e que é escalonável para fabricação e produção em grau farmacêutico de exossomas, e que evita outras limitações da técnica anterior discutida acima.
[022] A invenção busca solucionar uma ou mais das necessidades ou limitações mencionadas acima e, numa modalidade, fornece um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou de microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[023] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[024] - fornecer um dispositivo de ligação a exossomas ou a microvesículas, sendo que o dispositivo inclui
[025] um substrato que tem uma superfície,
[026] uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato,
[027] ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispositivos na pluralidade de polímeros dispostos na pluralidade de polímeros de ligação a exossomas, desse modo possibilitando que os exossomas ou microvesículas se liguem ao dispositivo;
[028] em que
[029] o substrato é agarose, os polímeros são dextrano e o ligante de ligação a exossoma é sulfato (por exemplo, Capto DeVirS ou CaptoS (GE Healthcare Biosciences AB)); ou
[030] o substrato é poliviniléter, sendo que os polímeros são poliacrilamida e o ligante de ligação a exossoma é sulfoisobutila (SO3-) (por exemplo, Eshumo S (Merck, KGaA)); ou
[031] o substrato é polimetacrilato, os polímeros são poliacriamida e o ligante de ligação a exossoma é sulfoisobutila (SO3-) (por exemplo, Fractogel EMD SO3- (Merck, KGaA)); ou
[032] o substrato é polimetacrilato, os polímeros são poliacrilamida e o ligante de ligação a exossoma é carboxietila (por exemplo, Fractogel COO- (Merck, KGaA)); ou
[033] o substrato é polietersulfona hidrofílica, os polímeros são um revestimento polimérico reticulado e o ligante de ligação a exossoma é Sulfonila SO3 (por exemplo, Mustang S, (Pall Corp.));
[034] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou de microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[035] - separar o dispositivo do líquido;
[036] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
[037] Em outra modalidade, é fornecido um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[038] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[039] - fornecer; dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[040] - um substrato que tem uma superfície
[041] - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na superfície de substrato para ligação a exossomas, desse modo, possibilitando exossomas ou microvesículas para ligação ao dispositivo.
[042] em que
[043] o dispositivo é selecionado a partir do grupo de produtos;
[044] o substrato é agarose, e o ligante é sulfopropil(sulfato) (por exemplo, SP) Sepharose (GE Healthcare Lifesciences));
[045] o substrato é agarose e o ligante é carboxila (por exemplo, CM Sepharose (GE Healthcare Lifesciences));
[046] o substrato é polimetacrilato, e o ligante é sulfato (por exemplo, Toyopearl Sulfate (Tosoh Biosciences))
[047] o substrato é poli(glicidil metacrilato – coetileno dimetacrulato) e o ligante é SO3 (sulfonil) por exemplo CIMmultus SO3 (BIA);
[048] o substrato é celulose, e o ligante é ácido sulfônico (R-CH- SO3-). (por exemplo, Sartobind S (Sartorious))
[049] o substrato é celulose, e o ligante é sulfato (por exemplo, Sartobind SC (Sartorious));
[050] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[051] - separar o dispositivo do líquido;
[052] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
[053] Em outra modalidade, é fornecido um método para obter um isolado ou uma composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[054] - fornecer um líquido que inclui exossomas e microvesículas;
[055] – fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[056] - um substrato que tem uma superfície;
[057] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[058] - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ricos em elétrons dispostos na pluralidade de polímeros;
[059] - a pluralidade de polímeros se estende da superfície de substrato para a posição em que o ligante de ligação a exossoma numa localização que está separada da superfície de substrato para ligação a exossomas ou microvesículas, desse modo, possibilitando que exossomas ou microvesículas se liguem ao dispositivo;
[060] – colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou de microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[061] - separar o dispositivo do líquido;
[062] obtendo-se, assim, um isolado ou uma composição de exossomas ou microvesículas.
[063] Em outra modalidade, é fornecido um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[064] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[065] - fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[066] – um substrato que tem uma superfície;
[067] – uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[068] - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispositivos na pluralidade de polímeros;
[069] - em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato;
[070] – colocar o líquido em contato com o dispositivo nas condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[071] - separar o dispositivo do líquido
[072] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou de microvesículas.
[073] A invenção também fornece um aparelho ou dispositivo que inclui um substrato, conforme descrito acima, que possibilita a execução do método descrito acima.
[074] Tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplificativas e explicativas se destinam a fornecer explicação adicional da invenção conforme reivindicado. Os desenhos anexos estão incluídos para fornecer um maior entendimento da invenção e são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram diversas modalidades da invenção e, em conjunto com a descrição, servem para explicar e princípios da invenção.
[075] Figura 1 - Estrutura prevista de sulfato de celulose/celufina: (A) extremidade projetada em vista; e (B) lateral em vista; e sulfato de celulose/celufina: (C) extremidade projetada em vista; e (D) lateral em vista.
[076] Figura 2 - Estrutura prevista de quitosano (A) extremidade projetada em vista; e (B) lateral em vista.
[077] Figura 3 - Estrutura prevista de poli (éter metil vinílico- anidrido maleico).
[078] Figura 4 - Estrutura prevista de heparina.
[079] Figura 5 - Estrutura prevista para 3-APBA.
[080] Figura 6 - Estrutura prevista de ácido hialurônico.
[081] Figura 7 - Estrutura prevista de sulfato de condroitina.
[082] Figura 8 - Estrutura prevista de sulfato de polivinila.
[083] Figura 9 - Estrutura prevista de ácido poli glutâmico.
[084] Figura 10 - Estrutura prevista de ácido poli aspártico.
[085] Figura 11 - Estrutura prevista de polisserina.
[086] Figura 11(A) - Estrutura prevista de biotina-C3-poli-4- hidroxibutil- β-asparagina
[087] Figura 11(B) estrutura prevista de biotina-C3-poli-4-
hidroxibenzil- β-asparagina
[088] Figura 12 - Estrutura prevista de sulfato de poli D L serina
[089] Figura 13 - Modelo estrutural geral.
[090] A invenção se refere ao projeto de reagentes e métodos para aprimoramentos no isolamento de vesículas extracelulares, especialmente exossomas, de fontes biológicas, incluindo meios celulares condicionados, fluidos in vivo, tecidos e biópsias, e extratos ou frações ou isolados dos mesmos. Em particular, a invenção se refere a reagentes e métodos que fornecem captura aprimorada de vesículas extracelulares a partir de uma fonte e liberação aprimorada, resultando em rendimentos mais altos de modo reproduzível de vesículas extracelulares. Conforme descrito no presente documento, os inventores têm características determinadas até o momento desconhecidas necessárias em substâncias para obter rendimentos aprimorados de vesículas extracelulares, em particular, exossomas, de fontes biológicas. Este trabalho possibilita a seleção e/ou o projeto de substâncias para uso em métodos para isolar microvesículas e exossomas.
[091] “Vesículas extracelulares (EVs) ou microvesículas (MVs)", de modo geral, se refere a uma coleção heterogênea in vivo de estruturas biológicas ligadas a membrana que têm um diâmetro de cerca de 20 a 1000 nm.
[092] “Exossoma", de modo geral, se refere a uma vesícula que tem uma bicamada lipídica e um diâmetro de cerca de 20 a 200 nm, conforme medido por EM.
[093] “Eficiência de ligação”, de modo geral, se refere a uma medição da proporção de exossomas ligados por um substrato. Esta é a diferença da quantidade de exossomas remanescentes numa amostra após aplicação do método da invenção e a quantidade de exossomas numa amostra antes da aplicação do método da invenção.
[094] “Eficiência de eluição”, de modo geral, se refere a uma medição da proporção de exossomas eluídos a partir de um substrato. Esta é a diferença da quantidade de exossomas no eluído após eluição de acordo com o método da invenção e a quantidade teórica de exossomas ligados ao substrato.
[095] “Rendimento”, de modo geral, se refere ao número de exossomas liberados do eluído como uma proporção do número total de exossomas antes da aplicação do método da invenção.
[096] "Compreender" e variações do termo, tal como "que compreende”, "compreende" e "compreendido”, não se destinam a excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.
[097] Numa primeira modalidade, a invenção fornece um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[098] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[099] - fornecer um; dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[0100] - um substrato que tem uma superfície
[0101] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[0102] – ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na pluralidade de polímeros;
[0103] - em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato;
[0104] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0105] - separar o dispositivo do líquido;
[0106] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
[0107] A frase “pluralidade de polímeros tem uma diferente química do substrato” se refere geralmente ao substrato que é diferente dos polímeros com relação aos constituintes respectivos dos polímeros e do substrato. Por exemplo, o substrato pode ser um peptídeo e o polímero pode ser um carbo-hidrato. Quando o substrato e o polímero são carbo-hidrato, o substrato pode ser, por exemplo, celulose, e o polímero pode ser dextrano.
[0108] De acordo com a modalidade acima, é fornecido um substrato que tem uma superfície. O arranjo de ligantes de ligação a exossoma é fornecido na superfície de substrato numa disposição mais ou menos ordenada, de outro modo, conhecida como um “arranjo”, de modo a possibilitar o contato dos ligantes de ligação a exossoma com a superfície externa ou membrana de uma microvesícula quando o líquido é colocado em contato com o dispositivo. Tipicamente, o arranjo toma a forma de uma pluralidade de ligantes de ligação a exossoma que são posicionados através de pelo menos uma parte ou região da superfície do substrato.
[0109] Um arranjo pode estar na forma de um arranjo plano ou um arranjo linear.
[0110] Um arranjo plano, de modo geral, se estende em 2 dimensões de modo a definir uma área. Um arranjo plano pode, de modo geral, inclui uma região de ligantes de ligação a exossoma que têm uma densidade de cerca de 1 a 10 ligantes por nm 2, de preferência, cerca de 5 ligantes por nm2. Este espaçamento pode ser determinado, por exemplo, por microscópio de força atômica. Outras regiões do arranjo podem ser de uma densidade mais alta ou mais baixa de ligantes de ligação a exossoma. Assim, numa modalidade, é fornecido um método para obter uma composição ou um isolado de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0111] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0112] - fornecer; dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas; sendo que o dispositivo inclui:
[0113] - um substrato que tem uma superfície
[0114] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[0115] - ligantes de ligação a exossomas na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons na pluralidade de polímeros para formar um arranjo plano de ligantes de ligação a exossoma na superfície de substrato;
[0116] - em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato;
[0117] - em que o arranjo plano, de preferência, inclui uma região de ligantes de ligação a exossoma que têm uma densidade de cerca de 1 a 10 ligantes por nm2, mais preferencialmente, cerca de 5 ligantes por nm 2.
[0118] - colocar o líquido em contato com o dispositivo nas condições que possibilitam a ligação do exossomas ou de microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0119] - separar o dispositivo do líquido;
[0120] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas
[0121] Um arranjo linear, de modo geral, se estende numa dimensão. Numa modalidade, pode ser formado um arranjo linear em que ligantes de ligação a exossoma são fornecidos num polímero que tem uma disposição, de modo geral, linear numa superfície do substrato ou quando se estendem para fora do da superfície de substrato num solvente.
[0122] Num arranjo linear, os ligantes de ligação a exossoma são, de modo geral, fornecidos numa faixa de 1 a 5 ligantes por nm, de preferência, cerca de 2 ligantes por nm. Este espaçamento pode ser determinado, por exemplo, por microscópio de força atômica ou espectrometria de massa. Assim, em outra modalidade, é fornecido um método para obter uma composição ou um isolado de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0123] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0124] - fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui;
[0125] - um substrato que tem uma superfície;
[0126] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[0127] – ligantes de ligação a exossomas na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons na pluralidade de polímeros;
[0128] – os polímeros se estendem da superfície de substrato até um arranjo linear de ligantes de ligação a exossomas, ou a partir do mesmo, numa localização que é separada da superfície de substrato para ligação a exossomas ou microvesículas, desse modo, possibilitando que exossomas ou microvesículas se liguem ao dispositivo;
[0129] – em que os ligantes de ligação a exossoma são fornecidos geralmente numa faixa de 1 a 5 ligantes por nm, de preferência, cerca de 2 ligantes por nm;
[0130] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0131] - separar o dispositivo do líquido;
[0132] obtendo-se, assim, uma composição ou um isolado de exossomas ou microvesículas,
[0133] Em outra modalidade, é fornecido um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0134] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0135] - fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[0136] – um substrato que tem uma superfície;
[0137] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[0138] – ligantes de ligação a exossomas na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispositivos na pluralidade de polímeros para formar um arranjo linear de ligantes de ligação a exossomas na superfície de substrato;
[0139] - em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato;
[0140] em que os ligantes de ligação a exossoma são fornecidos geralmente numa faixa de 1 a 5 ligantes por nm, de preferência, cerca de 2 ligantes por nm;
[0141] – colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam que a ligação dos exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0142] - separar o dispositivo do líquido;
[0143] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
[0144] Em outras modalidades, foi constatado que um dispositivo que apresenta um arranjo de ligantes de ligação a exossoma que que forma interface com uma superfície de membrana externa de microvesícula, em que um ligante de ligação a exossoma é separado no máximo cerca de 3,5 a 10 angstroms de outro ligante de ligação a exossoma, forma uma superfície de ligação a exossoma altamente eficiente. Conforme explicado mais abaixo, em que o arranjo é fornecido por um ou mais polímeros que incluem os ligantes de ligação a exossoma, a medição de 3,5 a 10 angstroms, de preferência, maior que 2 angstroms, particularmente, cerca de 4 a 6 angstroms, com referência ao espaçamento de ligantes de ligação a exossoma, se refere ao espaçamento observado no estado de energia mais baixo do polímero, conforme determinado pelos métodos exemplificados no presente documento.
[0145] Conforme descrito adicionalmente no presente documento, a invenção fornece um modelo estrutural de uma disposição de ligantes de ligação a exossoma que prevê dispositivos que são aglutinantes de exossoma altamente eficientes. De acordo com o modelo, os aglutinantes de exossoma altamente eficientes são, de modo geral, dispositivos que têm grupos aniônicos ou ricos em elétrons separados por cerca de 4 a 6 Angstroms, conforme medido de acordo com a metodologia em que o modelo estrutural é baseado. A invenção possibilita prever a eficiência de ligação de um dispositivo para um exossoma ou microvesícula através da identificação de grupos aniônicos ou ricos em elétrons e modelando-se a estrutura do componente polimérico do dispositivo utilizando a metodologia para a derivação do modelo estrutural no presente documento.
[0146] De preferência, um ligante de ligação a exossoma é separado mais de 2 angstroms de outro ligante de ligação a exossoma. Mais preferencialmente, um ligante de ligação a exossoma é separado 3,5 a 6 ou 4 a 6 angstroms, mais preferencialmente, 3,5, 4, 5 ou 6 angstroms de outro ligante de ligação a exossoma no arranjo.
[0147] Tipicamente, a maior parte dos ligantes, de preferência, 60%, ou 70%, ou 80%, mais preferencialmente, 90%, ainda mais preferencialmente, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos ligantes está separada mais de 2 angstroms, e no máximo cerca de 10 angstroms, de preferência, 3,5 a 6, ou 4 a 6 angstroms de outro ligante no arranjo.
[0148] De acordo com a invenção, a disposição dos ligantes de ligação a exossoma no arranjo pode ter vários níveis de ordem. Numa modalidade, pode haver uma ordem muito alta de disposição de ligantes de ligação a exossoma dentro do arranjo. Por exemplo, cada ligante pode ser separado de outros ligantes no arranjo por uma distância exata de 4 angstroms. Ademais, a posição de cada ligante e/ou os espaços entre os ligantes podem definir um padrão particular. Em tal ordem mais alta de disposição, de modo geral, todos os ligantes são igualmente separados no arranjo. Conforme descrito no presente documento, foi mostrado que um dispositivo que tem um arranjo de ligantes de ligação a exossoma com uma ordem mais alta de disposição, de modo geral, tem uma eficiência de ligação a exossoma ou microvesícula mais alta de modo reproduzível.
[0149] Em outras modalidades, pode haver uma ordem mais baixa de disposição de ligantes de ligação a exossoma dentro do arranjo. Por exemplo, a maioria, mas não todos, dentre os ligantes pode estar separada um do outro por mais de 2 angstroms, e no máximo cerca de 10 angstroms, de preferência, 3,5 a 6, ou 4 a 6 angstroms de outro ligante no arranjo. Ademais, dentre esta maioria dos ligantes, pode haver variabilidade entre o espaçamento destes ligantes no arranjo. Por exemplo, alguns ligantes podem ser separados de outros por 3,5 angstroms, outros por 4 angstroms, outros por 5 angstroms, outros por 6 angstroms. Em tal disposição, a posição de cada ligante e/ou os espaços entre os ligantes podem não definir um padrão discernível. Entretanto, foi mostrado que tal arranjo de ordem mais baixa tem eficiência de ligação útil para ligar exossomas.
[0150] Conforme poderia ser percebido, a extensão de ordem entre ligantes de ligação a exossoma pode ser pensada como uma ordem local e meta-ordem. O mesmo significa que observar o arranjo de ligantes de ligação a exossoma a uma distância, pode parecer haver uma aleatoriedade na localização dos ligantes (isto é, os mesmos não estão em arranjos ortogonais claros) (meta-ordem) ainda que a distância média entre os ligantes possa ser distribuída de modo relativamente estreito em torno de um valor médio (ordem local). Nesta invenção, é revelado que uma ordem mais alta de ordem local é preferencial, enquanto a extensão de meta-ordem é de importância menor. Portanto, em certas modalidades, o arranjo pode incluir regiões de meta ordem, contanto que o arranjo contenha pelo menos uma região de ordem local.
[0151] Um arranjo pode ser formado uma variedade de métodos. Quando o arranjo deve ser formado na superfície de substrato, um arranjo de ordem mais alta pode ser formado por deposição de ligantes de ligação a exossoma em posições precisas na superfície do substrato. Os exemplos incluem silício cristalino, superfícies de cerâmica ou polímero usando litografia, implantação e deposição de íon por imersão plasmática plasma (PIII&D), microscópio de força atômica, laser, corrosão elétrica, corrosão iônica reativa a plasma de baixa densidade, corrosão a molhado, microscópio eletrônico ou outros meios conhecidos para produzir uma superfície funcionalizada contendo ligantes de ligação a exossoma. Além disso, um arranjo pode ser impresso numa superfície do substrato. Os exemplos incluem funcionalizar a superfície do substrato com um bloco químico e, então, derivar tais blocos com porções químicas de ligante de ligação a exossoma que estão agora quimicamente ligadas a tais blocos. Estas técnicas podem ser aplicáveis quando o substrato e polímero que compreendem os ligantes de ligação a exossoma têm a mesma química.
[0152] Em outra modalidade, o arranjo é fornecido por um ou mais polímeros que incluem os ligantes de ligação a exossoma. Nesta modalidade, o substrato pode ser integralmente formado a partir do polímero, formando, assim, uma superfície do substrato. Nas modalidades em que o substrato é formado a partir do polímero, a superfície do substrato pode ser tratada de modo a ativar este polímero para formação de ligantes de ligação a exossoma no polímero.
[0153] Numa modalidade, o polímero pode ser acoplado ou, de outro modo, ligado ao substrato, desse modo, formando uma superfície de substrato, por exemplo, por meio de ligação de biotina/estreptadivina. Nessa modalidade, um polímero incluindo ligantes de ligação a exossoma é revestido no substrato, formando, assim, ligantes de ligação a exossoma na superfície do substrato. De preferência, o polímero tem uma química diferente comparada à química do substrato. Por exemplo, o polímero pode ser dextrano ao passo que o substrato pode ser celulose.
[0154] Conforme determinado acima e descrito em detalhes adiante no presente documento, quando os ligantes de ligação a exossoma devem ser fornecidos num arranjo por um ou mais polímeros, estes polímeros são selecionados de acordo com se, na energia mais baixa, os ligantes que apresentam são observados in silico sendo separados um do outro por mais de 2 angstroms e no máximo cerca de 10 angstroms, de preferência, 3,5 a 6 angstroms ou 4 a 6 angstroms. Em resumo, a observação in silico é derivada de submeter uma unidade subestrutural (tipicamente hexâmero a dodecâmero, mas pode ser maior) de um polímero, completo com grupos aniônicos ou ricos em elétrons para cálculos de minimização de geometria (algoritmo MM+) de modo a exibir uma estrutura tridimensional mais estável (energia mais baixa) e, portanto, a estrutura que provavelmente está envolvida na ligação de exossoma. A distância entre ligantes pode ser, então, medida in silico para determinar a probabilidade de ligação a exossomas. Quando a estrutura com energia minimizada do oligômero modelado porta um número adequado de pares de ligantes, em que a separação de pares de ligantes ricos em elétrons ou aniônicos é de uma distância de 2 a 10 angstroms, então, o polímero que este oligômero modelado representa será adequado para ligar exossomas ou microvesículas de acordo com esta invenção.
[0155] Assim, em outra modalidade, é fornecido um método para obter uma composição ou um isolado de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0156] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0157] - fornecer um dispositivo para ligar a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[0158] – um substrato que tem uma superfície;
[0159] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[0160] - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na pluralidade de polímeros;
[0161] – os polímeros se estendem até a superfície de substrato para posicionar um ligante de ligação a exossoma numa localização que é separada da superfície de substrato para ligação a exossomas ou microvesículas, desse modo, possibilitam que os exossomas ou microvesículas se liguem ao dispositivo;
[0162] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0163] - separar o dispositivo do líquido;
[0164] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas,
[0165] em que os ligantes de ligação a exossoma são observados in silico como sendo separados um do outro por mais de 2 angstroms, e no máximo cerca de 10 angstroms, de preferência, 3,5 a 6 angstroms, de preferência, 4 a 6 angstroms, num modelo de minimização de energia, descrito no presente documento.
[0166] Em outra modalidade, é fornecido um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0167] – fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0168] - fornecer um dispositivo para se ligar a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui
[0169] – um substrato que tem uma superfície;
[0170] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato;
[0171] - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na pluralidade de polímeros;
[0172] - em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato;
[0173] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitem a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0174] – separar o dispositivo do líquido;
[0175] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas;
[0176] em que os ligantes de ligação a exossoma são observados in sílico como sendo separados um do outro por mais de 2 angstroms, e no máximo cerca de 10 angstroms, de preferência, 3,5 a 6 angstroms, de preferência, 4 a 6 angstroms, num modelo de minimização de energia, descrito no presente documento.
[0177] A ordem de um arranjo formado a partir de ligantes de ligação a exossoma fornecidos num ou mais polímeros é, de modo geral, dependente da heterogeneidade dos polímeros em relação à ordem de monômeros dentro de cada polímero e o comprimento de cada polímero. De preferência, os polímeros para uso na invenção têm pouca heterogeneidade, ou de outro modo, mais ou menos, homogeneidade em relação à ordem de monômero e comprimento de polímero. De preferência, os polímeros são lineares.
[0178] Neste sentido, polímeros sintéticos, em vez de polímeros derivados de fontes naturais ou biológicas, são preferenciais. Isto se deve ao fato de que os polímeros de fontes biológicas, tais como certos polissacarídeos, têm heterogeneidade significativa em relação ao comprimento de polímero, ramificação, ordem de monômero e mesmo funcionalização de monômero. Conforme descrito no presente documento, esta heterogeneidade, de modo geral, contribui para uma eficiência mais baixa de ligação de exossomas ou microvesículas e um rendimento de exossoma ou microvesícula mais baixo. Portanto, numa modalidade, o polímero não é uma fonte natural ou biológica não fracionada ou heterogênea, particularmente de heparina.
[0179] Mais preferencialmente, em relação ao teor de monômero, os polímeros têm uma ordem uniforme de monômeros, particularmente quando o polímero compreende diferentes espécies de monômero, e em que apenas alguns dentre a espécie de monômero contêm ligantes de ligação a exossoma. É particularmente importante que a uniformidade de ordem de monômero crie uma uniformidade no espaçamento dos ligantes de ligação a exossoma que são apresentados à superfície de membrana externa do exossoma ou microvesícula. Isto, de modo geral, exige que haja uma estereoquímica uniforme de ligantes de ligação a exossoma para interação com os exossomas ou microvesículas.
[0180] É preferencial que pelo menos 25% dos monômeros que formam um polímero, de preferência, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% dos monômeros que formam um polímero, tenham um ligante de ligação a exossoma que é disposto na superfície do substrato para possibilitar a ligação a uma membrana externa de exossoma ou microvesícula.
[0181] É particularmente preferencial que todos os monômeros que formam um polímero apresentem ligantes de ligação a exossoma que são espaçados cerca de 3,5 a 6 angstroms, 4 a 6 angstroms, de preferência, 3,5, 4, 5 ou 6 angstroms um em relação ao outro à superfície da membrana externa de um exossoma ou microvesícula.
[0182] Em certas modalidades, em que um polímero consiste em mais de uma espécie monomérica, uma espécie pode fornecer um tipo de ligante de ligação a exossoma e outra espécie monomérica pode fornecer outro tipo de ligante de ligação a exossoma.
[0183] Ademais, dependendo do comprimento de uma espécie de monômero, uma espécie de monômero pode fornecer mais de um ligante de ligação a exossoma (que pode ser igual ou diferente), contanto que os ligantes fornecidos na espécie de monômero, em sua apresentação à superfície externa de exossoma ou microvesícula, sejam espaçados cerca de 3,5 a 6 angstroms, ou 4 a 6 angstroms, de preferência, 3,5, 4, 5 ou 6 angstroms um em relação ao outro.
[0184] Uma constatação surpreendente da invenção é que os exossomas e microvesículas podem ser separados de outros componentes de um fluido biológico formado in vivo ou in vitro com base na carga e, em particular, uma carga positiva no exossoma ou microvesícula. Isto é surpreendente devido ao fato de que foi entendido, de modo geral, que a maioria das membranas celulares e bicamadas lipídicas tenha uma carga líquida negativa, particularmente, surgindo de grupos de cabeça polar lipídicos, açúcares e proteínas de membrana que são, de modo geral, negativamente carregados em pH fisiológico.
[0185] O ligante de ligação a exossoma utilizado nas modalidades descritas acima em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato, ou em que os polímeros se estendem da superfície de substrato para localizar remotamente o os ligantes de ligação a exossoma da superfície de substrato, está na forma de ou consiste num grupo rico em elétrons. Os exossomas são, de modo geral, estáveis em pH fisiológico de 7,4 +/- 1 a 1,5. Portanto, o ligante de ligação a exossoma é, de modo geral, um ânion ou, de outro modo, um grupo rico em elétrons, num pH de cerca de 4 a 8 ou 5 a 8. O ligante de ligação a exossoma pode ser um ânion ou grupo rico em elétrons inorgânico ou orgânico. Os exemplos de ânions inorgânicos incluem ânions que contêm um átomo de enxofre, selênio, boro, nitrogênio ou fósforo e inclui sulfatos, selenatos, fosfatos, fosfonatos, fosfinatos. De preferência, o ligante é um ânion ou grupo rico em elétrons orgânico. Os exemplos incluem álcoois e aminas sulfatados, amidas, sulfonamidas, grupos carboxilato, álcoois, éteres, anidridos, selenatos, imidas, acilsulfonamidas, fosfonatos, fosfinatos, fosfatos, etc. Numa modalidade, um arranjo de ligantes de ligação a exossoma de acordo com a invenção pode ser uma combinação de ânions ou grupos ricos em elétrons orgânicos ou inorgânicos.
[0186] Uma constatação importante da invenção, conforme descrito no presente documento, é que, quando um polímero é utilizado para fornecer o arranjo de ligantes de ligação a exossoma, o polímero é selecionado com base em sua capacidade para apresentar ou exibir uma pluralidade uniformemente espaçada de ligantes de ligação a exossoma a uma superfície de membrana externa de microvesícula, em vez de com base em alguma outra característica da cadeia polimérica principal. Neste sentido, a invenção é distinguida de outras abordagens, descritas anteriormente, que utilizavam polímeros para precipitar microvesículas da solução. Estas abordagens têm tipicamente polímeros selecionados com base nas características de solubilidade aquosa e exclusão de volume. Os polímeros exemplificativos utilizados nestas abordagens são polietileno glicol [US2013/0273554 e US2013/0337440] e polissacarídeos [US20150192571],
[0187] De acordo com as modalidades descritas em que a pluralidade de polímeros têm uma química diferente ao substrato, ou em que os polímeros se estendem da superfície de substrato para localizar remotamente os ligantes de ligação a exossoma da superfície de substrato, o polímero pode ser um polissacarídeo, tereftalato de polietileno ou peptídeo com cadeias laterais adequadas para derivatização com grupos aniônicos ou ricos em elétrons, tal como ácido poliaspártico, polisserina, politreonina, poliasparagina, ácido nucleico ou outra molécula orgânica, tais como poliéteres, (PEGS), álcool polivinílico sulfatado, polifenóis, ácidos polifenilborônicos ou outros poliaromáticos ou poli-heteroaromáticos, de preferência, sintéticos. Nas modalidades em que o polímero é derivado de uma fonte natural ou biológica, e o polímero é conhecido por ter heterogeneidade dependente de fonte significativa, especificamente em relação ao comprimento do polímero, teor de monômero e ordem, é particularmente preferencial fracionar a fonte natural ou biológica de modo a diminuir a heterogeneidade e aumentar a homogeneidade para um polímero de comprimento, teor de monômero ou ordem desejados. Tipicamente, o polímero tem um peso molecular de 10 kDa a 900 kDa, de preferência, 20 a 50 kDa para certos polissacarídeos, tal como heparina, ou 100 a 200 kDa para certas outras moléculas, em que um exemplo é quitosano. Os polímeros particularmente preferenciais são fontes naturais ou biológicas sintéticas ou homogêneas de polissacarídeos selecionado a partir do grupo de piranoses, em que os monômeros incluem (porém sem limitação) dextrose, glicose, galactose, glucosamina, galactosamina, manose, ribose, arabinose, xilose, lixose e amino açúcares dos mesmos. Os polímeros podem ser fornecidos na forma de peptídeos. Um peptídeo particularmente preferencial é ácido poliaspártico. Conforme descrito no presente documento, ácido poli glutâmico pode ser menos preferencial dado que o espaçamento das cadeias laterais aniônicas excede a faixa preferencial da invenção de 4 a 6 angstroms. Outros peptídeos preferenciais incluem polisserina, politreonina, poliasparagina, ácido policisteico, ácido polisselenocisteico e aminoácidos D-configurados dos mesmos. A cadeia polimérica principal pode ser solúvel ou insolúvel aquosa. Numa modalidade particularmente preferencial, o polímero contém uma espécie de monômero único que tem um comprimento que se aproxima ao comprimento de um monômero de glicose (cerca de 1,5 nm) ou é um monômero de glicose ou derivado do mesmo que tem um comprimento de cerca de 1,5 nm, e em que cada monômero inclui um grupo aniônico ou rico em elétrons disposto de modo que cada grupo seja separado por cerca de 4 a 5 angstroms, e em que o polímero contém cerca de 100 a 400 monômeros, de preferência, cerca de 250 a 300 monômeros, e/ou tem um peso molecular de cerca de 40 a 60 kDa, de preferência, cerca de 45 a 55 kDa. Numa modalidade preferencial, o polímero é uma molécula de celulose de cadeia linear em que cada monômero para apresentação a uma superfície de membrana externa de exossoma é funcionalizado com um grupo aniônico ou grupo rico em elétrons, de preferência, um grupo sulfato.
[0188] Quando o arranjo deve ser formado na superfície de substrato, não é necessário que a entidade da superfície do substrato deva ser coberta por ou conter o arranjo dos ligantes de ligação a exossoma. Numa modalidade, o substrato consiste numa região de ligação a exossoma ou microvesícula que tem um arranjo de ligantes de ligação a exossoma na região para possibilitar que exossomas ou microvesículas se liguem à região de ligação. Outras superfícies de um substrato podem ser projetadas de modo a impedir a ligação de exossomas. Por exemplo, estas regiões de “não ligação” podem ser construídas de modo que, em uso, não apresentem ligantes de ligação a exossoma a exossomas ou microvesículas. Tal disposição de regiões de ligação e não ligação a exossoma pode ser útil na formação de dispositivos para produção, detecção ou monitoramento de exossomas. Tais dispositivos podem incluir dispositivos microfluídicos ou dispositivos maiores para cultura celular ou dispositivos médicos para uso clínico.
[0189] Numa modalidade preferencial, é fornecido um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0190] - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0191] - fornecer um dispositivo para ligar a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui:
[0192] - um substrato que tem uma superfície,
[0193] - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato,
[0194] - ligantes de ligação a exossomas na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos nos polímeros para ligação a exossomas, desse modo, possibilitando exossomas ou microvesículas para ligação ao dispositivo;
[0195] em que
[0196] o substrato é agarose, os polímeros são dextrano e o ligante de ligação a exossoma é sulfato (por exemplo, Capto DeVirS ou CaptoS (GE Healthcare Biosciences AB)); ou
[0197] o substrato é poliviniléter, os polímeros são poliacrilamida, e o ligante de ligação a exossoma é sulfosiobutila (SO3-) (por exemplo, Eshmuno S (Merck, KGaA)); ou
[0198] o substrato é polimetacrilato, os polímeros são poliacrilamida e o ligante de ligação a exossoma é sulfosiobutila (SO3-) (por exemplo, Fractogel EMD SO3- (Merck, KGaA)); ou
[0199] o substrato é polimetacrilato, os polímeros são poliacrilamida e o ligante de ligação a exossoma é carboxietila (por exemplo, Fractogel COO- (Merck, KGaA)); ou
[0200] o substrato é polietersulfona hidrofílica, os polímeros são um revestimento polímero reticulado e o ligante de ligação a exossoma é Sulfonila SO3 (por exemplo, Mustang S, (Pall Corp.))
[0201] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesívulas aos ligantes de ligação a exossoma;
[0202] - separar o dispositivo do líquido
[0203] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. numa modalidade particularmente preferencial, o substrato é celulose, o polímero é dextrano e o ligante de ligação a exossoma é um sulfato. Um exemplo é o dispositivo mostrado na tabela 4 do documento n° WO2008/039136 da construção que envolve sulfato em enxerto dextrano apenas na microesfera de agarose.
[0204] Em outra modalidade, é fornecido um método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas. O método inclui as seguintes etapas:
[0205] – fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas;
[0206] - fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesívuilas, sendo que o dispositivo inclui:
[0207] - um substrato que tem uma superfície,
[0208] - ligantes de ligação na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na superfície de substrato para ligação a exossomas, desse modo, possibilitando exossomas ou microvesículas para ligação ao dispositivo;
[0209] em que
[0210] o dispositivo é selecionado a partir do grupo de produtos:
[0211] o substrato é agarose e o ligante é sulfopropil(sulfato) (por exemplo SP Sepharose (GE Healthcare Lifesciences));
[0212] o substrato é agarose e o ligante é carboxila (por exemplo, CM Sepharose (GE Healthcare Lifesciences));
[0213] o substrato é polimetacrilato, e o ligante é sulfato (por exemplo, Toyopearl Sulfate (Toosoh Bioscences));
[0214] o substrato é poli(glicidil metacrilato – coetileno dimetacrulato) e o ligante é SO3 (sulfonil) por exemplo, CIMmultus SO3 (BIA));
[0215] o substrato é celulose, e o ligante é ácido sulfônico (R- CH2-SO3-); (por exemplo, Startobind S (Startorious));
[0216] o substrato é celulose, e o ligante é sulfato (por exemplo, Startodind SC (Startorious));
[0217] - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma.
[0218] - separar o dispositivo do líquido;
[0219] obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
[0220] O dispositivo pode assumir a forma de uma faixa de formato ou configurações. A superfície do substrato do dispositivo pode ser plana, curvada, endentada ou porosa. A superfície pode ser formada dentro, tubo ou cavidade ou numa microesfera ou membrana. Desse modo, o dispositivo pode ser uma membrana, microesfera, tudo ou cavidade ou outro..
[0221] Numa modalidade, a superfície do dispositivo é colocada em comunicação com um ou mais sensores para detectar a presença, propriedades ou tamanho de exossomas ou microvesículas ligados a tal dispositivo, usando técnicas analíticas de nanotecnologia adequadas, tal como microscópio de força atômica, microscopia eletrônica de transmissão (TEM), espectrometria de emissão de Auger (AES), espectrometria de massa a laser, espectroscopia fotônica de raios X.
[0222] Em outra modalidade, a superfície do dispositivo está em comunicação com meios de medição para determinar parâmetros úteis da combinação de exossoma-substrato (ou microvesícula-substrato), tal como um ou mais dentre (i) presença ou ausência de exossoma (e, assim, o número e a densidade de exossomas) (ii) tamanho de exossoma (iii) condutividade de exossoma (iv) um marcador superficial de exossoma (v) rigidez de exossoma
(vi) carga de exossoma ou (vii) algum outro parâmetro útil através de tais meios como um ou mais dentre (a) sondas elétricas, (b) laser embutido (c) marcador de força elétrica (d) microscopia de força magnética (e) microscopia de porta de varredura ou outras técnicas adequadas. O dispositivo pode formar os meios de medição.
[0223] O método da invenção utiliza um dispositivo que inclui ligantes de ligação a exossoma definidos acima para isolar microvesículas, em particular exossomas, de uma fonte biológica com base na carga. Conforme descrito acima, é uma constatação surpreendente dos inventores que exossomas e microvesículas podem ser separados de outros componentes de um fluido biológico com base na carga e, em particular, com base numa carga positiva do exossoma ou microvesícula. Com base nesta constatação, os inventores utilizaram uma abordagem de cromatografia por troca iônica para o isolamento de exossomas e microvesículas.
[0224] De acordo com a invenção, o líquido contendo os exossomas ou microvesículas é colocado em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas no líquido aos ligantes de ligação a exossoma. O mesmo, então, liga exossomas ou microvesículas ao substrato, que é a base para a separação subsequente de exossomas ou microvesículas do líquido, como resultante da separação do dispositivo do líquido.
[0225] As condições para possibilitar a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma, de modo geral, exigem uma consideração de teor de sal e pH do líquido que contém os exossomas ou microvesículas. De modo geral, o pH do líquido é definido pela estabilidade de pH dos exossomas ou microvesículas, e esta faixa de estabilidade de pH é cerca de 4 a 8
[0226] Em algumas modalidades, o líquido contendo os exossomas ou microvesículas pode ser pré-processado antes de entrar em contato com o dispositivo. Tal processamento pode incluir, por exemplo, um ajuste de pH para otimizar a interação de ligação com os ligantes de ligação a exossoma. Por exemplo, pode ser necessário ajustar o pH da solução ao nível de pH fisiológico de 7,2 a 7,4. Isto garante que as porções químicas nos exossomas ou microvesículas que estão ligados pelos ligantes de ligação a exossoma são catiônicos e capazes de se ligar aos ânions ou, de outro modo, grupos ricos em elétrons dos ligantes de ligação a exossoma.
[0227] O processamento pode também incluir ajuste de sal, potencialmente minimização de sal do líquido, por exemplo, por uma etapa de diálise, antes de colocar o líquido em contato com o dispositivo.
[0228] Tipicamente, o líquido contendo os exossomas ou microvesículas terá um pH na faixa de 7,2 a 7,4 e um teor de sal de 0,1 a 0,5 M, de preferência, 0,15 M, e teor de fosfato de 0,01 M antes do contato com o substrato.
[0229] Processamento adicional pode ser necessário para remover fragmentos celulares ou contaminação que podem interferir na ligação dos exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma. Este processamento pode envolver centrifugação a 500 g, com ou sem filtração a cerca de 0,22 mícron.
[0230] Numa modalidade, o líquido pode estar na forma de um fluido biológico que é centrifugado para formar um sobrenadante e um pélete contendo microvesícula, e o sobrenadante é descartado, e o pélete é ressuspenso num tampão de ligação por troca iônica para contato com o dispositivo. Tal tampão, de modo geral, tem um pH na faixa de 7,2 a 7,4 e um teor de sal na faixa de 0,1 M a 0,2 M.
[0231] A filtração também pode ser empregada para depletar microvesículas de um tamanho particular do líquido antes do contato do líquido com o dispositivo. Por exemplo, o líquido pode ser fracionado para remover exossomas com um diâmetro maior que 100 nm antes do contato do líquido com o dispositivo. Alternativamente, esta etapa poderia ser realizada na conclusão da eluição de microvesículas de ligantes de ligação a exossoma
(conforme descrito mais abaixo).
[0232] O líquido e o dispositivo são colocados em contato por um período de tempo suficiente para possibilitar que os exossomas se liguem aos ligantes de ligação a exossoma. De modo geral, isto leva de 1 minuto a 16 horas e pode levar cerca de 15 minutos. Poderia levar menos de 1 minuto, por exemplo, menos de 30 segundos.
[0233] O contato do líquido com o substrato pode ser estabelecido numa variedade de formatos. Por exemplo, o líquido pode ser percolado através de uma resina ou microesfera sólida, capturado, e o ciclo de percolação e captura repetido por um número predeterminado de ciclos.
[0234] Conforme discutido acima, uma vantagem particular da invenção se baseia na revelação de que há disparidade entre polímeros carregados, (particularmente aqueles derivados de fontes naturais que têm uma heterogeneidade inerente) vis a vis sua capacidade de se ligar a exossomas ou microvesículas, e que é possível obter aprimoramentos significativos em eficiência de ligação por seleção judiciosa de substratos ou polímeros de acordo com a invenção no presente documento. Em particular, no trabalho descrito no presente invenção, os inventores mostraram que polímeros que talvez possam ter de outro modo sido considerado igualmente eficiente para ligação a exossoma ou microvesícula - devido ao fato de que, em comum, são todos negativamente carregados em pH fisiológico - têm níveis variáveis de eficiência e que os vários níveis de eficiência de ligação podem ser explicados pela disposição das cargas negativas apresentadas à superfície da membrana externa de um exossoma ou microvesícula.
[0235] Em particular, conforme descrito no presente documento, os inventores determinaram que o rendimento de isolamento geral, que surge principalmente a partir das diferenças em eficiência de ligação teórica, está na faixa de cerca de 4,3% (conforme observado para ácido hialurônico) a até 98% (conforme observado para sulfato de celufina). Além disto, determinando-se um modelo estrutural e de ligação para os polímeros testados quanto à eficiência de ligação, as diferenças em eficiência de ligação foram explicadas em termos da disposição de ânion ou grupos ricos em elétrons apresentados à superfície da membrana externa de exossoma, possibilitando a seleção de substratos ou polímeros ideais para ligação a exossoma, e, em particular, aqueles com maior probabilidade de fornecer uma eficiência de ligação mais alta.
[0236] Implantando-se este trabalho num procedimento de isolamento de exossoma ou microvesícula, a invenção possibilita uma faixa mais ampla de opções de ligação que poderia ser, de outro modo, aplicada para obter um rendimento aceitável de exossomas ou microvesícula. Isto é particularmente útil quando há limites às condições de pH ou sal que podem ser aplicadas num tampão de ligação.
[0237] Além disto, a invenção possibilita um procedimento de ligação mais eficiente, potencialmente possibilitando períodos de ligação mais curtos ou, quando múltiplos ciclos de ligação poderiam ter sido de outro modo exigidos, menos ciclos de ligação. Estes aprimoramentos possibilitam que a abordagem de troca iônica para isolamento de exossoma ou microvesícula seja credivelmente traduzível em processamento de alto rendimento, uma prática de fabricação que será, por fim, necessária para possibilitar produção em escala farmacêutica de exossomas.
[0238] Uma etapa final na fase de ligação do método é, conforme prenunciado acima, para separar o dispositivo do líquido, separando, assim, exossomas (que são ligados aos ligantes de ligação a exossoma no dispositivo) do líquido. Esta separação pode ser atingida ativamente removendo-se o dispositivo do líquido (por exemplo, centrifugando-se um dispositivo na forma de microesferas) ou passivamente passando-se o líquido sobre o dispositivo, (depletando-se, assim, exossomas do líquido conforme o líquido se separa do dispositivo).
[0239] Uma vantagem particularmente importante da invenção é que a mesma possibilita a eluição de exossomas e/ou microvesículas a partir de uma fonte biológica de modo a produzir um eluído que consiste principalmente em exossomas e/ou microvesículas e tampão de eluição. Isto é particularmente importante para regular o controle de qualidade do produto final. Em comparação, outras abordagens até a presente data para isolamento de exossomas resultam em o exossoma ser purificado com um agente de precipitação, por exemplo, na forma de polietileno glicol, ou um polissacarídeo ou fragmento do mesmo, juntamente com uma enzima para degradação do polissacarídeo. Estas abordagens exigem manipulação adicional do produto final para remover estes contaminantes, e esta manipulação adicional, tal como centrifugação ou filtração, pode afetar de modo deletério os exossomas.
[0240] É uma constatação surpreendente da invenção que os exossomas e microvesículas que foram ligados por meio de interações de afinidade mais alta ou avidez mais alta aos dispositivos da invenção possam ser uniformemente eluídos dos ligantes de ligação a exossoma, possibilitando a liberação dos exossomas dos ligantes. Especificamente, conforme descrito no presente documento, foi constatado que substratos selecionados, mas não relacionados, a saber, sulfato de celufina, quitosano e poli (éster metil vinílico- anidrido maleico) têm uma eficiência de ligação a exossoma aprimorada e os exossomas ligados aos mesmos podem ser comumente eluídos utilizando-se tampões de eluição que têm uma faixa de concentrações de sal ou faixas de pH dentro das quais os exossomas permanecem estáveis.
[0241] Assim, numa modalidade, o método inclui a etapa adicional de eluir exossomas ou microvesículas a partir dos ligantes de ligação a exossoma para liberar os exossomas ou microvesículas a partir do dispositivo após o substrato ser separado do líquido.
[0242] De acordo com a invenção, os exossomas ou microvesículas podem ser eluídos por contato do dispositivo com um tampão de eluição. Tipicamente, o tampão tem um teor de sal de cerca de 0,5 a 4 M, ou de 0,5 a 2 M, dependendo do pH do sistema de tampão. Este teor de sal estabelece uma ligação preferencial entre espécies aniônicas no tampão de eluição e a membrana externa do exossoma ou microvesícula resultante na eluição.
[0243] Em outras modalidades, o teor de sal do tampão de eluição pode ser igual ao tampão de ligação, e o tampão de eluição pode ter um pH mais alto que o tampão de ligação. Isto resulta em eluição dos exossomas ou microvesícula dos ligantes de ligação a exossoma conforme o pH do sistema de tampão se aproxima do ponto isoelétrico das porções químicas no exossoma ou microvesícula que se liga aos ligantes de ligação a exossoma. Assim, numa modalidade, um tampão de eluição tem um teor de sal de cerca de 0,5 a 2 M e um pH de cerca de 7,2 a 7,4 unidades de pH.
[0244] Em outra modalidade, o tampão de eluição pode incluir oligômeros do polímero que forma a superfície do substrato, em que os referidos oligômeros têm uma carga aniônica mais alta ou eletropotencial mais alto que os ligantes de ligação a exossoma no polímero, resultando, assim, em eluição de exossomas ou microvesículas. Por exemplo, quando os ligantes de ligação a exossoma são fornecidos na superfície do substrato na forma de um polissacarídeo de sulfato de celulose, o tampão de eluição pode incluir oligômeros de celulose de cadeia mais curta que têm uma quantidade mais alta de sulfatação.
[0245] Em outra modalidade, o tampão de eluição pode incluir um ligante competitivo que tem uma afinidade mais alta que o ligante de ligação a exossoma no substrato para um exossoma ou microvesícula. Por exemplo, um exossoma pode ser eluído a partir de um polímero de ácido borônico usando um tampão de eluição contendo um excesso de um açúcar, de preferência, frutose, que tem uma afinidade mais alta que ácido borônico para exossomas, eluindo, assim, exossomas do substrato.
[0246] Numa modalidade, o tampão de eluição é aplicado ao substrato apenas uma vez. Em outras modalidades, o tampão de eluição pode ser continuamente ciclado por um número predeterminado de ciclos.
[0247] Numa modalidade, o método pode incluir a etapa adicional de separar os exossomas ou microvesículas liberadas a partir do dispositivo.
Esta etapa é particularmente necessária quando os exossomas ou microvesículas permanecem na solução com o substrato na conclusão da eluição. Um exemplo é quando os exossomas ou microvesículas são eluídos de ligantes de ligação a exossoma dispostos num dispositivo na forma de uma microesfera e a microesfera deve ser removida dos exossomas ou microvesículas liberadas. Em outras modalidades, a separação física pode resultar simplesmente dos exossomas que são eluídos do dispositivo, como, por exemplo, pode ocorrer numa cromatografia em coluna.
[0248] Será entendido que a invenção divulgada e definida neste relatório descritivo se estende a todas as combinações alternativas de dois ou mais recursos individuais mencionados ou evidentes a partir do texto ou desenhos. Todas estas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 - ISOLAMENTO DE EXOSSOMA USANDO
1.1. MATERIAIS DE TESTE
[0249] O material de teste usado foi meio condicionado de cultura celular derivado de linhagem de células neuronais hipotalâmicas murinas GT 1- 7 cultivada em meio de cultura completo Opti-MEM (Meio Sérico Reduzido Opti-MEM® + 10% de soro fetal de bezerro depletado de exossoma + Penicilina-Estreptomicina + GlutaMAX) por 48 a 72 horas.
1.2. MÉTODO DE TESTE
[0250] O meio condicionado de cultura recém-coletado foi centrifugado (500xg por 5 minutos) para remover células e detritos grandes, então, o sobrenadante foi filtrado usando filtro de seringa de 0,22 µm para remover vesículas grandes e corpos apoptóticos. O meio condicionado filtrado foi quantificado para concentração de partículas usando análise por rastreamento de nanopartícula (NTA) em NanoSight NS300.
[0251] A Tabela 1 descreve um painel de substratos à base de polímero para os quais a eficiência de ligação e eluição e rendimentos de isolamento gerais foram determinados.
[0252] O quitosano foi quitosano de 200 kDa (Biotin-) (personalizado). As microesferas Viroadem foram Ademtech Viro-Adembeads. Superdex® 75 foi da Sigma Aldrich no S6657. As microesferas de BA foram da Chemicell 1504-5 SiMAG-partículas magnéticas de ácido borônico. PEG- Controle: Biotina-PEG24 (como controle para 3-APBA I 4-APBA, que estritamente falando, são Biotina-PEG24-3APBA e Biotina-PEG24-4APBA (personalizado). O Controle de Microesfera Mag foi das Partículas Magnéticas Revestidas com Avidina Spherotech SVM-40-10. Um Kit de Purificação de Exossoma de Meio de Cultura Norgen Biotek (no 60600) foi usado. Quitosano, heparina, 3- APBA, 4-APBA, controle de PEG e ácido hialurônico foram Biotina- X acoplada a Partículas Magnéticas Revestidas com Avidina Spherotech SVM- 40-10.
[0253] O ligante imobilizado em substrato em concentração otimizada foi incubado com 1 ml de material de teste quantificado por 5 horas a 4°C num rotador de tubo (100 rpm) para testar a capacidade de capturar por afinidade exossomas. O ligante imobilizado em substrato sólido foi separado após incubação e a concentração das partículas foi determinada em solução após a captura (exossomas não ligados) usando NTA em NanoSight NS300. O ligante imobilizado separado em substrato sólido ligado a exossomas foi incubado em solução de eluição de um dia para o outro a 4°C num rotador de tubo (100 rpm) para eluir exossomas ligados. O ligante imobilizado em substrato sólido foi separado após incubação por eluição e a concentração das partículas foi determinada em solução usando NTA em NanoSight NS300.
1.3. AQUISIÇÃO DE DADOS
[0254] A concentração de partículas foi determinada usando NTA em NanoSight NS300. A estratégia de aquisição de dados empregada foi para adquirir 5 vídeos x 30 segundos em operação em modo estático. O software NanoSight, então, analisou as 5 aquisições de vídeo de 30 segundos para preparar um relatório experimental com os dados de concentração de partículas média (+/- erro padrão).
1.4. LEITURAS DE TESTE
[0255] Foi medida a concentração de partículas em três estágios experimentais.
[0256] (i) Separação pré-afinidade (isto é, concentração de partículas em material de teste antes da captura)
[0257] (ii) Após a captura por afinidade em solução (isto é, concentração de partículas em material de teste após captura que representa exossomas ligados)
[0258] (iii) Após eluição (isto é, concentração de partículas em solução após eluição de partículas capturadas por ligante)
1.5. METODOLOGIAS DE ANÁLISE DE DADOS
[0259] Os dados de leitura de teste obtidos foram usados para determinar quatro parâmetros:
[0260] • eficiência de ligação de ligante (isto é, número de partículas no material de teste capturado por exposição ao substrato sólido imobilizado por ligante)
[0261] • eficiência de eluição de ligante (isto é, proporção daquela partícula capturada por ligante que foi eluída)
[0262] • o rendimento de processo geral
1.6. RESULTADOS
[0263] Na condição de ligação otimizada, ligante de sulfato de celulose, na forma de sulfato de celufina, mostrou uma eficiência de ligação teórica de 77,90% com o número de partículas ligadas teóricas sendo 1,31 x 1010 (Tabela 1). O número de partículas recuperadas após a eluição de microesferas de sulfato de celufina foi 1,64 x 1010 com a eficiência de eluição sendo quantificada pelo instrumento a 125% (Tabela 1). O rendimento de processo geral para ligante de sulfato de celufina foi 98% (Tabela 1). Nota-se que a eficiência de eluição de 125% foi submetida a uma variedade de variância de dados de quantificação devido a fatores operacionais e outros. Poderia ser esperado que a eficiência de eluição real tenda a menos de 100%.
[0264] Viro-Adembeads mostram uma eficiência de ligação teórica de 66,13% com o número de partículas ligadas teóricas sendo 1,11 x 1010 (Tabela 1). Nas condições de eluição testadas, se pode eluir 41% das partículas capturadas por Viro-Adembeads com um tamanho médio de 232,4 nm (Tabela 1). O rendimento de processo geral para Viro-Adembeads foi 27% (Tabela 1).
[0265] Inesperadamente, o rendimento de isolamento de partícula geral para isolamento de exossoma baseado em ultracentrifugação foi 7,5% (Tabela 1). Este rendimento foi drasticamente mais baixo em comparação ao rendimento de isolamento geral observado com ligantes relatados nesta invenção. Nordin et al relatou rendimento de exossoma por ultracentrifugação sendo 10% (Nordin et al., 2015). Além disto, 4 l de CM derivado de célula- tronco de adipose renderam 0,9 mg de exossomas por ultracentrifugação, exigindo 23 l de CM e 276 a 280 horas de processamento para gerar uma dose humana única provavelmente sendo 5 mg. Em comparação, o ligante descrito nesta invenção com um rendimento de exossoma de 80% poderia gerar uma única dose humana de 5 mg a partir de menos de 4 l de CM derivado de célula- tronco de adipose com tempo de processamento mais curto quando processados em modo de cromatografia. Isto destaca, ainda, a superioridade dos ligantes descritos nesta invenção para isolar exossomas em comparação com o método de isolamento padrão de ouro atual de ultracentrifugação. EXEMPLO 2 - DETERMINAÇÃO DE MODELO ESTRUTURAL E
[0266] Para determinar a probabilidade de ligação a exossoma ideal entre polímeros funcionalizados, um protocolo de minimização de energia in silico foi seguido. Um oligômero que representa uma subseção do polímero, que pode estar na faixa de um hexâmero a um dodecâmero em tamanho, foi desenhado usando a configuração estereoquímica correta de ligantes, quando conhecida, tal como no caso de quitosano ou sulfato de celufina, ou definida, tal como no caso de ácido poliaspártico.
Quando a configuração foi aleatória ou desconhecida, tal como no caso de poli (éter metil vinílico-anidrido maleico), então, uma estrutura oligomérica aleatória foi usada similarmente.
As estruturas foram, então, submetidas a cálculos de minimização de energia (modelo de mecânica molecular MM+ ou AMBER, HyperChem versão 7.5), usando uma função descendente Polak-Ribiere.
O número de iterações computacionais necessárias para determinar o mínimo de energia foi tipicamente 1000 a 2000, mas, se um mínimo de energia não tiver sido atingido, permitiu-se que o cálculo continuasse até tal mínimo ter sido atingido.
Neste ponto, a disposição foi vista a partir de diversos ângulos e o posicionamento dos ligantes foi avaliado em termos de distância mútua entre, por exemplo, átomos de enxofre no caso de polissacarídeos sulfatados, ou carbonil oxigênios anidridos, no caso de poli (éter metil vinílico-anidrido maleico.
A estrutura secundária do polímero nestes casos ilustra a disposição da cadeia principal, que consiste nas 6 a 12 unidades monoméricas, num formato helicoidal mediante o qual as porções químicas se projetam para fora.
Deve-se entender que estes cálculos de minimização de energia representam subseções fracionárias dos polímeros, em vez dos polímeros como um todo, devido a limitações de software/processamento, e também qualquer variabilidade em tamanho de polímero geral.
Ademais, os cálculos de tipo de MM+/AMBER são conduzidos na ausência de moléculas de solvatação, tal como água ou outros componentes provavelmente encontrados in vivo ou num sentido prático.
Devido ao fato de que estes cálculos são de fato realizados apenas no sentido dos próprios oligômeros funcionalizados por ligante, o método elimina inconsistências e componentes não previsíveis que poderiam estar presentes em meios mais complexos e, assim, podem ser considerados internamente consistentes.
Além disto, os resultados obtidos, com espaçamento de ligante dentro das estruturas minimizadas, exibem um padrão consistente com observações de eficiência de ligação a exossoma.
EXEMPLO 3 - ESTRUTURA PREVISTAS DE SULFATO DE
[0267] O sulfato de celufina é uma partícula de sulfato de celulose sinteticamente derivada, comercialmente disponível como sulfato de celufina (JNC Corporation, Japão). O método de síntese de preparação de sulfato de celufina é parte da patente europeia EP0171086 A2. Em resumo, nenhuma partícula de celulose reticulada foi desenvolvida a partir de polímero de glicose produzido a partir de 250 a 300 unidades de glicose como polímero cru. A partícula de celulose foi, então, sulfatada usando reagentes de sulfato para microesferas de sulfato de celulose derivadas (sulfato de celufina). O teor de enxofre total nas partículas é 900 μg/g em peso seco.
[0268] O modelo de heptâmero de sulfato de celufina minimiza conforme mostrado (Figuras 1(A) e 1(B)), projetado de frente e de lado, com medições átomo-átomo de amostra entre espécies de oxigênio de sulfato vizinhas. As porções químicas de sulfato (medidas enxofre a enxofre vizinho) estão aproximadamente 6,7 a 7,9 Å de distância, com os oxigênios carregados capazes de se mover dentro de 4,5 Å (conforme indicado na projeção de lado). Este modelo sugere que para ligar exossomas, precisa haver tanto eliminação suficiente (projeção para fora da hélice) quanto capacidade de formação de ligação de hidrogênio, tal como entre uma porção química álcool e um oxigênio aniônico ou neutro, ricos em elétrons. As moléculas superficiais de exossoma às quais os ligantes formam ligações de hidrogênio são provavelmente, portanto, doadoras de ligação de hidrogênio, tais como álcoois, tais como glicóis dentro de fosfolipídios ou outros componentes principais de membranas celulares. Neste caso, um grupo álcool primário (CH2OH) é projetado entre dois grupos aniônicos, tais como sulfatos, formando uma rede de ligação de hidrogênio do tipo pinça, em que o hidrogênio do álcool pode interagir com dois átomos de oxigênio por vez. A natureza degenerada dos oxigênios do sulfato significa que a probabilidade de interação é maior, (três por sulfato, seis no total para um par de sulfatos) e, assim, aumenta a força da rede de ligação de hidrogênio para ligação. Consultar a Figura 1(A) e (B).
[0269] O fosfato de celufina, similarmente, é uma partícula de fosfato de celulose derivada. O mesmo está também comercialmente disponível como Fosfato de Celufina (JNC Corporation, Japão).Representado como um dodecâmero para propósitos de ilustração, as Figuras 1(C) e (D) indicam representam de frente e de lado da estrutura helicoidal no modelo. O modelo indica a natureza parcialmente carregada dos grupos fosfato (CH2OP(O)(OH)2) como mono ânions, efetivamente CH2OP(O)(OH)O- consistente com a faixa de pH de ligação antecipada. Neste caso, assim como para o sulfato de celufina, um grupo álcool primário (CH2OH) é projetado entre os fosfatos aniônicos para formar a rede de ligação de hidrogênio do tipo pinça. O hidrogênio do álcool pode interagir com dois átomos de oxigênio por vez. A natureza degenerada dos oxigênios do fosfato é similar àquela dos sulfatos, embora a dependência de pH do grau de protonação do fosfato determine a probabilidade de interação. Conforme mostrado nas Figuras 1(C) e 1(D), dois dos oxigênios são degenerados e aumentam a força da rede de ligações de hidrogênio para ligação. EXEMPLO 4 - ESTRUTURA PREVISTA DE POLI (ÉTER METIL VINÍLICO-ANIDRIDO MALEICO)
[0270] O polímero aniônico, poli (éter metil vinílico-anidrido maleico) (poli(MVE-MA), está comercialmente disponível como Viro- Adembeads (Ademtech, França). O método de síntese breve para Viro- Adembeads é descrito abaixo (Sakudo et al., 2009b). Pequenas (300 nm em diâmetro) partículas magnéticas de monozida (reduzindo sedimentação e oferecendo uma superfície ampla) com um alto teor de ferrita (permitindo separação de face sob um campo magnético) preparadas pela enxertia de poli(MVE-MA) em solução de sulfóxido de dimetila (DMSO)/tampão fosfato 5/95 por 3 horas a 37 °C.
[0271] No caso de poli(éter metil vinílico-anidrido maleico) (PMVEMA), a estereoquímica de substituição em ambas as substituições metóxi de cadeia principal e furandiona é aleatória e não definida. Para o propósito de obter uma estrutura com energia minimizada, uma configuração estereoquímica uniforme e consistente foi usada, resultando numa estrutura de lâmina em que porções químicas furandiona alternadas apontam para longe da cadeia principal. A separação entre carbonilas vizinhas, que poderiam atuar juntas como aceitantes de ligação de hidrogênio para interação com fosfolipídios, é aproximadamente 4,4 Å. Consultar a Figura 3. EXEMPLO 5 - ESTRUTURA PREVISTA DE QUITOSANO
[0272] Quitosano, um polissacarídeo natural resultante da N-de- acetilação de quitina, contém 60 a 100% de unidades de monossacarídeo N- desacetiladas. A estrutura com energia minimizada de quitosano forma uma hélice com os grupos amino localizados em direção à face interna, posicionando as porções químicas álcool projetadas para fora a partir da hélice, conforme mostrado, de frente. Uma projeção para o lado ilustra a posição dos grupos álcool primário vizinhos, proposta aqui como as porções químicas de ligação capazes de interação com o fosfolipídio de exossomas. Estes estão aproximadamente 4,6 a 5,0 Å de distância dispostos em torno da periferia da hélice. Consultar a Figura 2A e 2B. EXEMPLO 6 - ESTRUTURA PREVISTA DE HEPARINA
[0273] Heparina, que é menos sulfatada que heparano, consiste em porções químicas ácido glicurônico, galactosamina e ácido idurônico. A heparina contém mais ácido idurônico que heparano, que porta mais monossacarídeos de ácido glicurônico. Portanto, um modelo com energia minimizada de heparina é arbitrário visto que a previsão da geometria de porções químicas de ligação não pode ser esperada que seja consistente por toda a estrutura polimérica. Suposições são, portanto, previstas numa disposição arbitrária de unidades de monossacarídeo, no entanto, a estrutura com energia minimizada também forma uma superestrutura helicoidal, a partir da qual os grupos sulfato são projetados para fora. As distâncias entre átomos de enxofre vizinho estão entre 5 e 6 Å, conforme ilustrado. Dado que a heparina poderia conter menor sulfatos do que representado, é possível que isto poderia resultar em eficiência de ligação mais baixa do que, por exemplo, sulfato de celufina, que contém uma sequência mais consistente de unidades de monossacarídeo. Consultar a Figura 4. EXEMPLO 7 - ESTRUTURAS PREVISTAS PARA 3-APBA E 4-
[0274] O composto 3-APBA se refere a ácido (PEG-24)-3- aminofenilborônico biotinilado, que, de acordo com a Tabela 1, ligados a exossomas insuficientemente. Seu análogo à base de ácido 4- aminofenilborônico (4-APBA na tabela acima) foi também ineficaz. Ambos os compostos exigem sonicação antes do uso, sugerindo que no meio os mesmos tendem a se dobrar sobre si mesmos e formar coloides ou outras suspensões que desfavorecem a ligação a exossomas. O controle de PEG (polietileno glicol simples) poderia ter diferentes características físicas em solução e poderia não se associar de maneira similar.
[0275] Os polímeros orgânicos que portam arranjos igualmente espaçados de grupos aniônicos, incluindo ácidos borônicos (tal como ácido poli-(3-acrilamidofenilborônico), ocupam geometria com energia minimizada que permite que grupos arila vizinhos se agrupam em empilhamento π, com os apêndices aniônicos dispostos em proximidade relativamente estreita. Este exemplo, com estereoquímica aleatória fora da cadeia principal de poliacrilamida nuclear, ilustra ambos os recursos, com átomos de boro vizinhos a menos de 4 Å de distância. Consultar a Figura 5. EXEMPLO 8 - ESTRUTURA PREVISTA DE ÁCIDO HIALURÔNICO
[0276] Ácido hialurônico, que consiste em unidades de sacarídeo alternadas conectadas através da posição 3 e 4, pode não formar facilmente uma estrutura helicoidal firme, em que os carboxilatos negativamente carregados formam uma conformação similar àqueles grupos aniônicos presentes, por exemplo, em sulfato de celufina ou heparina. Os dissacarídeos alternados se minimizam a um arranjo não helicoidal menos ordenado,
posicionando os carboxilatos em posições relativamente aleatórias. Esta falta de ordem pode contribuir para a incapacidade do composto de se ligar a exossomas eficientemente. Aqui, os carboxilatos são ilustrados em verde num modelo de preenchimento de espaço para ilustrar sua falta de proximidade entre si. Consultar a Figura 6. EXEMPLO 9 - ESTRUTURA PREVISTA DE SULFATO DE
[0277] Sulfato de condroitina existe em várias formas de 100 ou mais unidades de ácido glicurônico e N-acetilgalactosamina alternadas, em que as unidades de monossacarídeo alternadas são unidas em várias posições. Por esta razão, é impossível criar um modelo específico pelo qual se pode prever sua capacidade de se ligar a exossomas. Entretanto, um modelo minimizado MM2+- de um octâmero ilustra que grupos sulfato e carboxilato vizinhos que se projetam para fora a partir da cadeia principal podem ser suficientemente expostos para facilitar a interação com fosfolipídios. Consultar a Figura 7. EXEMPLO 10 - ESTRUTURA PREVISTA DE POLIAMINOÁCIDOS
[0278] Os poliaminoácidos, outro tipo de ligante de ligação a exossoma potencial, incluem ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, polisserina e similares.
[0279] É previsto que o ácido gama-poliglutâmica adote uma forma de lâmina com grupos carboxilato situados perpendicularmente à cadeia principal, aproximadamente 12 Å de distância: esta distância entre porções químicas de ligação potenciais pode não ser suficiente para permitir interação eficiente com fosfolipídios. Portanto, é previsto que este polímero seja um aglutinante a exossoma de baixa eficiência.
[0280] Ácido poliaspártico pode ser preparado todo em forma de L, todo em forma de D ou como uma mistura configuracional por várias metodologias sintéticas. Para propósitos de ilustração, um octâmero do poli-L- Asp é representado como N-acetil-Asp7NH2. Neste caso, a molécula com energia minimizada aparece como uma série de laços alternados, mediante os quais os carboxilatos se projetam para fora, com grupos CO 2 vizinhos entre 4,5 e 5,0 Å de distância (distância de carbono a carbono). De acordo com o modelo estrutural, é previsto que o ácido poliaspártico seja um aglutinante a exossoma eficiente.
[0281] Derivados de poli-β-asparagina podem ser preparados todos em forma de L, todos em forma de D ou como uma mistura configuracional por várias metodologias sintéticas, conforme descrito no exemplo 11.
[0282] Com base neste modelo, assim como observações de estrutura secundária em regiões multiserina de proteínas de ocorrência natural, poderia ser também esperado que a polisserina sintética exista numa série de laços alternativos. Neste caso, as porções químicas de ligação a exossoma propostas, (porções químicas álcool ricas em elétrons similares àquelas de quitosano), ocupam distâncias vizinhas similares a outros polímeros de ligação a exossoma.
[0283] A sulfatação de serinas e outros aminoácidos que portam grupo hidroxila (por exemplo, tirosina, treonina), para formar sulfatos de polisserina, foi descrita na Patente no US 4444682A (1984) por Rivier e Penke do Salk Institute, por meio de sais de ácido acetilsulfúrico. A preparação de sulfato de polisserina poderia, assim, distribuir um análogo semelhante a peptídeo de polissacarídeos altamente sulfatados, tal como sulfato de celufina. A geometria desta molécula, em virtude de sua assimetria, adota um formato mais helicoidal que aquele do polipeptídeo não sulfatado. Conforme representado na forma de cadeia lateral randomizada (conforme poderia ser visto em poli-D,L-Ser-sulfato), as porções químicas sulfato vizinhas são dispostas para gora de uma maneira similar àquela exibida por polissacarídeos. As distâncias de átomo entre enxofre estão dentro de faixa similar: 4,5 a 6,5 Å. Consultar as Figuras 9 a 12. EXEMPLO 11(A). BIOTINA-C3-POLI-4-HIDROXIBUTIL-β-
ASPARAQINA E EXEMPLO 11(B) BIOTINA-C3-POLI-4-HIDROXIBENZIL-β- ASPARAGINA.
[0284] A síntese é realizada tratando-se a biotina de anidrido polimérico C3-AspAn, (biotina C3-polissuccinimida) com 1-hidroxibutilamina ou 4-fenoxietilamina, conforme indicado, resultando nos derivados de β- asparagina poliméricos com anel aberto. Para propósitos ilustrativos, um octâmero de poli-β-1-hidroxibutilasparagina, Figura 11(A), é usado para indicar a conformação com energia minimizada do exemplo 11(a) e a Figura 11 (B) ilustra a conformação com energia minimizada do exemplo 11(b). Ambos os exemplos se ligaram a exossomas, ilustrando a faixa de separação de ligante eficaz.
EXEMPLO 12 - MODELO ESTRUTURAL GERAL
[0285] Um modelo geral para ligação de polímero a exossomas pode ser, assim, representado como tal: uma hélice ou lâmina com grupos capazes de ligação de hidrogênio ou aniônicos projetados, adequadamente espaçados que se estendem para fora, em que a cadeia principal consiste num modelo de repetição, e os grupos aniônicos podem ser representados, em que R = CO2H, CH2OH, CH2OSO3H, B(OH)2 e CH2OP(O)(OH)2, ou aqueles grupos na forma ionizada conforme determinado por seu pKa relevante e similares ao qual o exossoma é capaz de ligação. O modelo explica que os polímeros com alta eficiência de ligação pra exossomas portam grupos aniônicos ou rico em elétrons em que sua separação mútua está entre 4 a 5 Å. Consultar a Figura
13. EXEMPLO 13 - ESTRUTURA PREVISTA DE SULFATO DE
[0286] Os átomos de enxofre em sulfato de polivinila se minimizam (em modelo de nonâmero) a cerca de 4,2 a 4,5 angstroms de distância. Consultar a Figura 8. EXEMPLO 14 - PREVISÃO DE EFICIÊNCIA DE LIGAÇÃO DE
[0287] O modelo estrutural geral no exemplo 11 foi utilizado para prever a eficiência de ligação de ligantes de ligação a exossoma, incluindo aqueles testados nos exemplos anteriores. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
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TABELA 1: Rendimento de isolamento geral (% Eficiência de Eficiência de de exossomas Número ligação de EAL eluição de EAL Número de recuperados = teórico de (% teórica de % teórica de Ligante de Teste exossomas Número de exossomas exossomas exossoma eluídos (F) exossomas eluídos ligados (A-C) ligados = (A- eluído (F) *100/ número de C)*100/A) (F*100/(A- C)) exossomas inseridos (A))
Sulfato de Celulose 1 1,31 x 1010 77,90% 1,64 x 1010 125% 98% ml
Quitosano (500 ug) 5 8,75 x 109 48,60% 8,75 x 109 100% 48,60% x 107
Viro-Adembeads 250 1,11 x 1010 66,13% 4,6 x 109 41% 27% ul
Heparina (500 ug) 5 x 3,5 x 109 22% 3,43 x 109 98% 21,80% 107
Superdex 200 ul Negativo 1,8 x 109 17,60%
3-APBA (500 ug) 5 x 1,5 x 109 7,20% 2,5 x 109 166% 12% 107
4-APBA (500 ug) 5 x Negativo 3,35 x 109 12% 107
BA- Magbeads (500 4,2 x 109 15,10% 3,33 x 109 79% 12% ul)
PEG-Controle (para 7,5 x 109 36,00% 2,5 x 109 33,30% 12% ligantes BA)
Ácido hialurônico (500 5 x 109 22,70% 7,8 x 108 15,60% 4,30% ug) 5 x 107
Controle de 4,0 x 109 23,80% 1,4 x 109 35% 8,30% Microesfera Mag
Norgen (1 ml de CM) Não aplicável Não aplicável 7,92 x 108 Não aplicável 7,70%
Norgen (7 ml de CM) Não aplicável Não aplicável 2,38 x 109 Não aplicável 2,20%
Ultracentrifugação (1 Não aplicável Não aplicável 1,36 x 109 Não aplicável 7,55% ml de CM)
TABELA 2: COMPARAÇÃO DE LIGANTES LEAP TESTADOS E LIGANTES
PREVISTOS POR MODELO ESTRUTURAL EMIT Cadeia Grupo de Resultado de Previsão Ligante principal ligação teste LEAP* EMIT Sulfato de Polissacarídeo Sulfato Positivo Ligação Celulose Fosfato de Polissacarídeo Fosfato Não testado Ligação celulose Quitosano Polissacarídeo -OH Positivo Ligação Heparina Polissacarídeo Sulfato Positivo Menos eficaz Ácido Polissacarídeo Carboxilato Negativo Menos eficaz hialurônico Sulfato de Sulfato e Polissacarídeo Não testado Ligação condroitina Carboxilato Dextrano Polissacarídeo -OH Não testado Menos eficaz Sulfato de Polissacarídeo Sulfato Não testado Ligação dextrano Poli(éter metil vinílico- Polímero Carbonilas Positivo Ligação anidrido sintético maleico) (PEG)24 Polímero Ácido Ácido Negativo Sem ligação sintético borônico borônico Polímero de Polímero Ácido Ácido Não testado Ligação sintético borônico Borônico
Cadeia Grupo de Resultado de Previsão Ligante principal ligação teste LEAP* EMIT
Ácido Peptídeo Carboxilato Não testado Ligação poliaspártico
Poli-β- asparagina Peptídeo -OH Positivo Ligação substituída Polisserina Peptídeo -OH Não testado Ligação
Sulfato de Peptídeo Sulfato Não testado Ligação polisserina
Observação: * Ligantes com 25% ou mais de rendimento de isolamento geral no teste de LEAP foram considerados como positivos.
Claims (22)
1. Método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas caracterizado pelo fato de que inclui: - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas; - fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui: - um substrato que tem uma superfície; - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato; - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos nos polímeros; - os polímeros se estendem até a superfície de substrato para posicionar um ligante de ligação a exossoma numa localização que é separada da superfície de substrato para ligação a exossomas ou microvesículas, desse modo, possibilitam que os exossomas ou microvesículas se liguem ao dispositivo; - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibilitam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma; - separar o dispositivo do líquido; obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os polímeros se estendem da superfície de substrato para formar um arranjo linear de ligantes de ligação a exossoma numa localização que é separado da superfície de substrato.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os ligantes de ligação a exossoma são fornecidos geralmente numa faixa de cerca de 1 a 5 ligantes por nm, de preferência, cerca de 2 ligantes por nm do polímero.
4. Método para obter um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas caracterizado pelo fato de que inclui: - fornecer um líquido que inclui exossomas ou microvesículas, - fornecer um dispositivo para ligação a exossomas ou microvesículas, sendo que o dispositivo inclui: - um substrato que tem uma superfície - uma pluralidade de polímeros fixados ao substrato; - ligantes de ligação a exossoma na forma de grupos aniônicos ou ricos em elétrons dispostos na pluralidade de polímeros; -em que a pluralidade de polímeros tem uma química diferente do substrato; - colocar o líquido em contato com o dispositivo em condições que possibiliam a ligação de exossomas ou microvesículas aos ligantes de ligação a exossoma; - separar o dispositivo do líquido; obtendo-se, assim, o dispositivo do líquido.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os ligantes de ligação a exossoma estão dispostos na pluralidade de polímeros para formar um arranjo plano de ligantes de ligação a exossoma,
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o arranjo plano inclui, de preferência, uma região de ligantes de ligação a exossoma que tem uma densidade de cerca de 1 a 10 ligantes po nm²
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polímeros incluem uma espécie de monômero que tem um ou mais ligantes de ligação a exossoma.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos 25% dos monômeros do um ou mais polímeros inclui um ligante de ligação a exossoma.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que todos os monômeros do um ou mais polímeros têm um ligante de ligação a exossoma.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada ligante do arranjo está separado no máximo cerca de 10 angstroms de outro ligante do arranjo.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os ligantes do arranjo são separados por mais de cerca de 2 angstroms.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que duas ou mais espécies monoméricas incluem um ligante de ligação a exossoma.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que parte da superfície do substrato inclui o arranjo.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polímero é um polissacarídeo ou peptídeo.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polímero é um polímero sintético.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polímeros formam o substrato.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polímeros são acoplados ao substrato.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polímeros são solúveis no líquido.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que inclui a etapa adicional de eluir exossomas ou microvesículas a partir dos ligantes de ligação a exossoma para liberar os exossomas ou microvesículas a partir do substrato após o substrato ser separado do líquido.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que inclui a etapa adicional de separar os exossomas ou microvesículas liberados a partir do substrato.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que incluir as etapas de: - colocar o líquido em contato com uma composição selecionada a partir do grupo de composições que consiste em Capto DeVirS ou CaptoS (GE Healthcare Biosciences AB)); Eshmuno S (Merck, KGaA)); Fractogel EMD SO3- (Merck, KGaA)); Fractogel COO- (Merck, KGaA)); Mustang S, (Pall Corp.)); SP Sepharose (GE Healthcare Lifesciences)); CM Sepharose (GE Healthcare Lifesciences)); Toyopearl Sulfate (Tosoh Biosciences)); CIMmultus SO3 (BIA)); Sartobind S (Sartorious)); e Sartobind SC (Sartorious)); - em condições que possibilitem a ligação de exossomas ou microvesículas para a composição; - separar o dispositivo do líquido; obtendo-se, assim, um isolado ou composição de exossomas ou microvesículas.
22. Aparelho ou dispositivo caracterizado pelo fato de que inclui um substrato conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, e possibilita a execução de um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.
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