CN112578131A - 测定脂蛋白的吸收能力的方法及测定用试剂、以及测定脂蛋白的吸收能力中的稳定化试剂 - Google Patents

测定脂蛋白的吸收能力的方法及测定用试剂、以及测定脂蛋白的吸收能力中的稳定化试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测定脂蛋白的吸收能力的方法及测定用试剂、以及测定脂蛋白的吸收能力中的稳定化试剂。本发明的课题在于，提供用于以更高的再现性测定脂蛋白的甾醇吸收能力的方法及试剂。通过在包含具有至少一个碳‑碳不饱和键的烃链的化合物(其中甾醇除外)和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物的存在下制备吸收了标记甾醇的脂蛋白、并测定脂蛋白的标记甾醇的吸收能力来解决所述课题。

Description

测定脂蛋白的吸收能力的方法及测定用试剂、以及测定脂蛋 白的吸收能力中的稳定化试剂
技术领域
本发明涉及测定脂蛋白的吸收能力(取り込み能；uptake capacity)的方法。另外，本发明涉及脂蛋白吸收能力测定用试剂。进一步地，发明涉及测定脂蛋白的吸收能力中的稳定化试剂。
背景技术
近年来，反映脂蛋白的功能的指标受到关注。作为调查脂蛋白的功能的方法，已知有例如专利文献1及2中记载的方法。在这些文献的方法中，使试样中的脂蛋白与带有标签的胆固醇接触而形成吸收了带有标签的胆固醇的脂蛋白，检测来自所吸收的带有标签的胆固醇的信号，由此测定脂蛋白的胆固醇吸收能力。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2017/0315112号说明书
专利文献2：美国专利申请公开第2016/0109469号说明书
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提高脂蛋白的甾醇吸收能力的测定的再现性。
用于解决课题的手段
本发明提供一种测定脂蛋白的吸收能力的方法，其包括下述工序：在包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物(其中甾醇除外)和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物的存在下将试样中的脂蛋白和标记甾醇混合，由此制备吸收了该标记甾醇的脂蛋白的工序；和，基于该脂蛋白所吸收的标记甾醇的标记测定脂蛋白的甾醇吸收能力的工序。
另外，本发明提供一种脂蛋白吸收能力测定用试剂，其包含：标记甾醇以及包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物(其中甾醇除外)和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物。
进一步地，本发明提供一种脂蛋白吸收能力测定的稳定化试剂，其含有：包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物(其中甾醇除外)和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物。
发明的效果
根据本发明，可以提高脂蛋白的甾醇吸收能力的测定的再现性。
附图说明
图1A为示出本实施方式的测定用试剂或稳定化试剂的外观的一例的图。
图1B为示出本实施方式的测定用试剂盒的外观的一例的图。
图2A为示出本实施方式的测定用试剂盒的外观的一例的图。
图2B为示出本实施方式的测定用试剂盒的外观的一例的图。
图2C为示出本实施方式的测定用试剂盒的外观的一例的图。
具体实施方式
[1.测定脂蛋白的吸收能力的方法]
本实施方式的测定脂蛋白的吸收能力的方法(以下也称为“测定方法”)中，首先在包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物(其中甾醇除外)和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物的存在下将试样中的脂蛋白和标记甾醇混合。由此，脂蛋白和标记甾醇在上述化合物的存在下进行接触，标记甾醇被脂蛋白吸收。
以下，也将“包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物(其中甾醇除外)”称为“第1添加剂”。另外，也将“不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物”称为“第2添加剂”。在本实施方式的测定方法中，如后述的实施例所示，通过在添加剂存在下将试样中的脂蛋白和标记甾醇混合，由此，与不使用添加剂时相比，可降低脂蛋白的吸收能力的测定值的偏差。即，本实施方式的测定方法能够提高脂蛋白的吸收能力的测定的再现性。
(包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物)
在第1添加剂中，具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链为具有末端的链状结构的部位，化合物分子内不形成环。例如，杯芳烃(カリクサレン)等环式化合物为具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链在分子内形成了环的结构，因此这类环式化合物被排除在第1添加剂之外。具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链只要是具有末端的链状结构，在链内可以包含环式结构。作为环式结构，可列举例如碳数3～8的非芳香环及碳数6～12的芳香环。作为非芳香环，可列举环式烃、环状醚、环状酯(内酯)等。作为芳香环，可列举苯核、萘核等。环式结构可以包含选自N、S、O及P中的1个以上杂原子。其中，第1添加剂为甾醇以外的化合物。例如，胆固醇及本实施方式的测定方法中使用的标记甾醇等被排除在第1添加剂之外。在优选的实施方式中，第1添加剂为链式化合物。
具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链可以为直链状，也可以为支链状。在本实施方式中，具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的主链的碳数为例如8以上且30以下，优选为10以上且26以下，更优选为14以上且22以下。在此，具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的主链是指：基于IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry；国际理论(化学)与应用化学联合会)命名规则对第1添加剂进行命名时所确定的、碳数最多的链。
在第1添加剂中，烃链所具有的碳-碳不饱和键的数量可以为1个，也可以为多个。碳-碳不饱和键可以为双键，也可以为三键。在碳-碳不饱和键为多个时，第1添加剂的烃链可以包含双键及三键这两种。
第1添加剂优选具有至少1个亲水基。亲水基的位置没有特别限定，具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链优选具有亲水基。亲水基可以包含在该烃链的主链及侧链中的任一者中。作为亲水基，可列举例如酰胺基、羟基、氨基、羧基、磺基、硫醇基、羰基、酯基、醚基、及这些的组合。
第1添加剂可以为例如下述的式(I)所示的化合物。
R1-CH＝CH-R2···(I)
(式中，R1与R2相同或不同，为-R3-(C＝O)-NH2、-R3-OH、-R3-NH2、-R3-(C＝O)-OH、-R3-SO2-OH、-R3-SH、-R3-O-(C＝O)-OH、-R3-NH-(C＝O)-NH2、主链的碳数为1以上且28以下的取代或未取代的烷基、或氢原子，其中，在R1为上述烷基或氢原子时，R2不为上述烷基及氢原子，R1与R2的主链的碳数之和为6以上且28以下，R3为连接键、或主链的碳数为1以上且28以下的取代或未取代的亚烷基)
关于R1及R2，主链的碳数为1以上且28以下的取代或未取代的烷基可以具有支链(侧链)。在此，主链是指上述烷基中最长的碳链。在上述烷基中，碳数为1以上且28以下的主链是指：选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基及二十八烷基中的作为直链烷基而命名的部分。在R1和/或R2是主链的碳数为1以上且28以下的取代烷基时，以碳数为1以上且28以下的直链状的碳链成为主链的方式来选择取代基。
关于R3，连接键是指中间不介由其它原子、而是直接结合。关于R3，主链的碳数为1以上且28以下的取代或未取代的亚烷基可以具有支链(侧链)。在此，主链是指上述亚烷基中最长的碳链。在上述亚烷基中，碳数为1以上且28以下的主链是指：选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、亚十一烷基、亚十二烷基、亚十三烷基、亚十四烷基、亚十五烷基、亚十六烷基、亚十七烷基、亚十八烷基、亚十九烷基、亚二十烷基、亚二十一烷基、亚二十二烷基、亚二十三烷基、亚二十四烷基、亚二十五烷基、亚二十六烷基、亚二十七烷基及亚二十八烷基中的作为直链亚烷基命名的部分。在R3是主链的碳数为1以上且28以下的取代亚烷基时，以碳数为1以上且28以下的直链状的碳链成为主链的方式来选择取代基。
作为R1、R2及R3中的取代基，可列举例如氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、-SH、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、及硫醚基等。R1、R2及R3分别可以具有多个取代基。卤素表示氟、氯、溴或碘。烷氧基表示-O-烷基。取代基中的烷基是碳数为1以上且5以下、优选碳数为1或2的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。
式(I)所示的化合物可以为顺式体，也可以为反式体。在本实施方式中，作为式(I)所示的第1添加剂，可列举例如具有1个碳-碳双键、且碳数为8以上且30以下的直链状的不饱和脂肪族酰胺、不饱和脂肪族醇及不饱和脂肪族胺。具体而言，可列举顺式-4-癸烯酸酰胺、棕榈油酸酰胺、油酸酰胺、反油酸酰胺、芥酸酰胺、顺式-4-癸烯-1-醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、油醇、反9-十八烯醇、顺-13-二十二烯醇、顺式-4-癸烯胺、(9Z)-9-十六碳烯胺、油基胺、反式-9-十八碳烯胺、顺式-13-二十二碳烯胺。它们中，优选油酸酰胺、芥酸酰胺、油醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、顺式-4-癸烯-1-醇、反9-十八烯醇及油基胺。
(不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物)
第2添加剂为不具有磷酸二酯键、且不具有碳-碳不饱和键的脂肪族化合物。在此，脂肪族化合物是指芳香族化合物以外的化合物。第2添加剂不具有磷酸二酯键，因此例如磷脂及具有类似于磷脂的结构的饱和脂肪族化合物等被排除在第2添加剂之外。第2添加剂可以是分子内不具有环式结构的链式化合物，也可以是环式化合物。作为环式结构，可列举例如碳数3～8的非芳香环。作为非芳香环，可列举环式烃、环状醚、内酯等。环式结构可以包含选自N、S、O及P中的1个以上杂原子。
作为第2添加剂，优选主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族化合物。在此，作为第2添加剂的饱和脂肪族化合物的主链是指：基于IUPAC命名规则对第2添加剂进行命名时所确定的、碳数最多的链。作为这类饱和脂肪族化合物，可列举主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族酰胺、饱和脂肪族醇及饱和脂肪族胺。优选的第2添加剂是碳数为8以上且30以下的直链状的饱和脂肪族酰胺、饱和脂肪族醇及和脂肪族胺。
作为碳数为8以上且30以下的直链状的饱和脂肪族酰胺，可列举例如：辛酸酰胺、壬酸酰胺、癸酸酰胺、十一酸酰胺、十二酸酰胺、十四酸酰胺、十六酸酰胺(棕榈酸酰胺)、十八酸酰胺(硬脂酸酰胺)、二十酸酰胺、二十二酸酰胺、二十四酸酰胺、二十六酸酰胺、二十八酸酰胺、三十酸酰胺等。作为碳数为8以上且30以下的直链状的饱和脂肪族醇，可列举例如正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇、正十二醇、正十四醇、正十六醇、正十八醇、正二十一醇、正二十二醇、正二十四醇、正二十六醇、正二十八醇、正三十醇等。作为碳数为8以上且30以下的直链状的饱和脂肪族胺，可列举例如辛基胺、壬基胺、癸基胺、十一烷基胺、十二烷基胺、十四烷基胺、十六烷基胺、十八烷基胺、二十烷基胺、二十二烷基胺、二十四烷基胺、二十六烷基胺、二十八烷基胺、三十烷基胺等。优选的第2添加剂为硬脂酸酰胺及棕榈酸酰胺。
(包含脂蛋白的试样)
在本实施方式中，试样只要包含哺乳动物的脂蛋白、优选人的脂蛋白就没有特别限定。作为这类试样，可列举例如血液试样。作为血液试样，可列举例如血液(全血)、血浆、血清等。在本实施方式中，可以通过超离心分离法、聚乙二醇(PEG)沉淀法等公知的方法对包含脂蛋白的试样进行分离或分级，取得包含规定的脂蛋白的级分。可以使用如此得到的包含规定的脂蛋白的级分作为包含脂蛋白的试样。
脂蛋白可以为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、或乳糜微粒(CM)中的任一种。HDL为具有1.063g/mL以上的密度的脂蛋白。LDL为具有1.019g/mL以上且小于1.063g/mL的密度的脂蛋白。IDL为具有1.006g/mL以上且小于1.019g/mL的密度的脂蛋白。VLDL为具有0.95g/mL以上且小于1.006g/mL的密度的脂蛋白。CM为具有小于0.95g/mL的密度的脂蛋白。在本实施方式中，优选测定HDL的甾醇吸收能力。
已知脂蛋白将胆固醇酯化、从而吸收。在使用后述的标记胆固醇作为标记甾醇时，可以向试样中添加由脂蛋白进行胆固醇的酯化反应时所必需的脂肪酸或包含这种脂肪酸的组合物(例如脂质体)。该脂肪酸或包含这种脂肪酸的组合物可以添加到后述的试样稀释用试剂、包含标记甾醇的溶液、及包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂中的任一者中。
在本实施方式中，可以对包含脂蛋白的试样进行稀释。例如，为了调整脂蛋白浓度，可以使用对上述的血液试样或包含规定的脂蛋白的级分进行稀释而得到的液体作为试样。在稀释试样时，可以使用水性介质或试样稀释用试剂。水性介质只要不抑制脂蛋白所进行的吸收反应就没有特别限定。作为这类水性介质，可列举例如水、生理盐水、缓冲液等。作为缓冲液，可列举例如磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris-HCl、GOOD’S缓冲液等。试样稀释用试剂是指：使上述水性介质中包含对脂蛋白的甾醇吸收能力的测定有用的物质而成的液体。作为对测定有用的物质，可列举例如不具有环状结构的表面活性剂、环状寡糖、对与测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分、封闭剂等。
作为脂蛋白的构成成分的载脂蛋白的浓度成为生物试样中的脂蛋白浓度的指标。在本实施方式中，可以基于载脂蛋白的浓度来稀释包含脂蛋白的试样，从而调整试样中的脂蛋白浓度。载脂蛋白的浓度可以通过公知的免疫学测定方法(例如免疫比浊法)来测定。作为载脂蛋白的浓度，特别优选ApoAI的浓度。特别优选取包含脂蛋白的试样的一部分作为测定试样使用，将载脂蛋白的测定与本实施方式的甾醇吸收能力的测定分开进行。
在本实施方式中，可以在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下对包含脂蛋白的试样进行稀释。例如，可以用在上述水性介质或试样稀释用试剂中包含第1添加剂和/或第2添加剂的液体对包含脂蛋白的试样进行稀释。通过将如此稀释后的试样与后述的标记甾醇混合，从而使脂蛋白与标记甾醇在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下进行接触。
在本实施方式中，可以在不具有环状结构的表面活性剂的存在下对包含脂蛋白的试样进行稀释。例如，可以用包含不具有环状结构的表面活性剂的试样稀释用试剂对包含脂蛋白的试样进行稀释。通过使用不具有环状结构的表面活性剂，可促进由脂蛋白进行的甾醇吸收反应。另外，不具有环状结构的表面活性剂还发挥封闭剂的作用。因此，可以不使用牛血清白蛋白(BSA)等在免疫学测定中通常作为封闭剂使用的动物源蛋白。在此，不具有环状结构的表面活性剂是指作为非环式化合物的表面活性剂。不具有环状结构的表面活性剂的详细情况将在后文说明。
在本实施方式中，可以在环状寡糖的存在下对包含脂蛋白的试样进行稀释。例如，可以用包含环状寡糖的试样稀释用试剂对包含脂蛋白的试样进行稀释。作为环状寡糖，可列举例如环糊精、羟丙基环糊精等。环状寡糖包合来自于试样的胆固醇，作为封闭剂而起作用。
在本实施方式中，可以在对与测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分的存在下对包含脂蛋白的试样进行稀释。例如，可以用包含该成分的试样稀释用试剂稀释包含脂蛋白的试样。作为对与测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分，可列举例如杯芳烃等。杯芳烃与LDL、VLDL及CM结合但不与HDL结合。在测定HDL的吸收能力时，通过向试样中添加杯芳烃，可以封闭来自于试样的LDL、VLDL及CM。
在本实施方式中，可以在用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂的存在下对包含脂蛋白的试样进行稀释。例如，可以用包含这类封闭剂的试样稀释用试剂稀释包含脂蛋白的试样。通过添加封闭剂，抑制标记甾醇非特异性地吸附于例如后述的固相、捕捉体。作为用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂，可列举例如2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。该聚合物可以为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的均聚物，也可以为与其它单体的共聚物。作为其它单体，优选具有作为疏水性基团的碳数1～20的烷基的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物在市场上有售。可列举例如日油株式会社的Lipidure(商标)系列，这些中，特别优选Lipidure-BL203、Lipidure-SF08。
(标记甾醇)
标记甾醇为具有标记物质的甾醇。以下也将标记甾醇所具有的标记物质称为“第1标记”。标记甾醇中使用的甾醇只要可被脂蛋白吸收就没有特别限定。作为这类甾醇，可列举例如胆固醇及其衍生物。作为胆固醇衍生物，可列举例如胆汁酸的前体、类固醇的前体等。具体而言，优选3β-羟基-Δ5-胆烯酸、24-氨基-5-胆烯-3β-醇等。
在本实施方式中，标记甾醇优选具有标记物质的胆固醇(以下也称为“标记胆固醇”)。标记胆固醇中的胆固醇部分可以具有天然存在的胆固醇结构，或者，可以具有从结合于天然存在的胆固醇的C17位的烷基链除去1个以上的亚甲基和/或甲基而成的胆固醇(也称为降胆甾醇)结构。
脂蛋白将胆固醇酯化而吸收，因此优选可经脂蛋白而酯化的标记胆固醇。在本实施方式中，在与生物试样混合时，在该试样中所含的来自于生物体的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)作用下，标记胆固醇被酯化。确认脂蛋白将标记胆固醇酯化的方法本身在该技术中是公知的，本领域技术人员可以按照惯例来进行。
第1标记只要是能够检测脂蛋白所吸收的标记甾醇的标记物质就没有特别限定。第1标记例如可以是其本身成为检测对象的标签，也可以是产生可检测的信号的物质(以下也称为“信号发生物质”)。
作为第1标记的标签只要不抑制脂蛋白吸收甾醇、且存在或可得到能够与该标签特异性结合的物质就没有特别限定。以下，也将添加了作为第1标记的标签的甾醇称为“带有标签的甾醇”。同样地，也将添加了作为第1标记的标签的胆固醇称为“带有标签的胆固醇”。带有标签的胆固醇本身在该技术领域中是公知的，例如专利文献1(US2017/0315112A1)中有记载。
作为带有标签的胆固醇，可列举例如下述的式(II)所示的带有标签的胆固醇。
【化1】
Figure BDA0002708716170000101
(式中，R4为可具有甲基的碳数1～6的亚烷基，X与Y相同或不同，表示-R5-NH-、-NH-R5-、-R5-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R5-、-R5-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R5-、-R5-(C＝O)-、-(C＝O)-R5-、-R5-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R5-、-R5-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R5-、-R5-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R5-、-R5-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R5-、-R5-O-、-O-R5-、-R5-S-、或-S-R5-，在此，R5分别独立地表示连接键、可具有取代基的碳数1～10的亚烷基、可具有取代基的碳数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者可具有取代基的碳数3～8的亚环烷基或杂环亚烷基，L表示-(CH2)d-[R6-(CH2)e]f-、或-[(CH2)e-R6]f-(CH2)d-，在此，R6为氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，TAG为标签，a与c相同或不同，为0～6的整数，b为0或1，d与e相同或不同，为0～12的整数，f为0～24的整数。)
式(II)中a、b及c均为0时，该式所示的带有标签的胆固醇不具有接头，标签与胆固醇部分直接结合。式(II)中a、b及c均不为0时，该式所示的带有标签的胆固醇中，在标签与胆固醇部分之间具有接头(-[X]a-[L]b-[Y]c-)。认为：通过接头，露出到脂蛋白的外表面的标签与捕捉体更容易结合。以下对式(II)的各取代基进行说明。
R4以碳数为1以上且6以下的亚烷基为主链，可以在任一位置具有甲基。R4相当于结合在天然存在的胆固醇的C17位的烷基链。在本实施方式中，就R4而言，在碳数为1以上且5以下的情况下，优选在天然存在的胆固醇的C20的位置具有甲基。在R4的碳数为6的情况下，优选为与天然存在的胆固醇的C20位～C27位的烷基链相同的结构。
[X]a相当于R4与L、[Y]c或标签的连接部分。[Y]c相当于R4、[X]a或L与标签的连接部分。X及Y可根据将胆固醇部分与接头结合的反应及将接头与标签结合的反应的种类来决定。
关于R5，连接键是指中间不介由其它原子、而是直接结合。在R5为碳数1～10的亚烷基时，作为这类亚烷基，可列举例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚戊基、亚新戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、2-乙基亚己基、亚壬基及亚癸基等基团。它们中，优选碳数为1以上且4以下的亚烷基。在R5为具有取代基的亚烷基时，上述的碳数中不包括取代基的碳数。
在R5为亚芳基或杂亚芳基时，这类基团可以是任选包含选自N、S、O及P中的1个以上杂原子的、碳数为6以上且12以下的芳香环。可列举例如亚苯基、亚萘基、亚联苯基、亚呋喃基、亚吡咯基、硫代亚苯基、亚三唑基、亚噁二唑基、亚吡啶基、亚嘧啶基等基团。在R5为具有取代基的亚芳基或杂亚芳基时，上述碳数中不包括取代基的碳数。
在R5为亚环烷基或杂环亚烷基时，这类基团可以为任选包含选自N、S、O及P中的1个以上杂原子的碳数3以上且8以下的非芳香环。可列举例如亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基、亚环吡咯烷基、亚哌啶基、亚吗啉基等基团。在R5为具有取代基的亚环烷基或杂环亚烷基时，上述碳数中不包括取代基的碳数。
作为R5中的取代基，可列举例如羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、-SH、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、及硫醚等基团。R5可以具有多个取代基。在此，卤素表示氟、氯、溴、或碘。烷氧基表示-O-烷基，该烷基是碳数为1以上且5以下、优选碳数为1或2的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。
优选a及c均为1，X与Y相同或不同，为-(C＝O)-NH-、或-NH-(C＝O)-。
L相当于间隔基，具有在接头上赋予规定的长度的聚合物结构。该聚合物结构部分优选为不抑制脂蛋白吸收胆固醇、且接头部分不易被脂蛋白吸收的性质。作为这类聚合物，可列举聚乙二醇(PEG)等亲水性聚合物。在优选的实施方式中，L为-(CH2)d-[O-(CH2)e]f-、或-[(CH2)e-O]f-(CH2)d-所示的结构。在此，d与e相同或不同，为0～12的整数、优选为2～6的整数，更优选均为2。f为0～24的整数，优选为2～11的整数，更优选为4～11的整数。
标签可以为天然来源的物质及合成的物质中的任一种，可列举例如化合物、肽、蛋白质、核酸及它们的组合等。化合物只要存在或可得到能够与其特异性结合的物质，则可以为该技术中公知的标记化合物，可列举例如色素化合物等。
在该技术领域中，已知胆固醇被酯化则脂溶性增大、可促进脂蛋白的吸收。添加于胆固醇的标签可以为脂溶性或疏水性的物质。
作为标签和能够与该标签特异性结合的物质的组合，可列举例如抗原和识别该抗原的抗体、半抗原和抗半抗原抗体、肽或蛋白质和识别它们的适体、配体和其受体、寡核苷酸和具有该寡核苷酸的互补链的寡核苷酸、生物素类(包括生物素及脱硫生物素等生物素类似物)和亲和素类(包括亲和素及链霉亲和素、Tamavidin(注册商标)等亲和素类似物)、组氨酸标签(包含6～10个组氨酸残基的肽)和镍、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽等。作为标签的抗原可以为该技术中公知的肽标签及蛋白质标签，可列举例如FLAG(注册商标)、血凝素(HA)、Myc蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)等。作为标签的半抗原可列举例如2,4-二硝基苯酚等。
带有标签的甾醇可列举例如添加了下述的式(III)所示的结构或下述的式(IV)所示的结构作为标签的甾醇。
【化2】
Figure BDA0002708716170000131
【化3】
Figure BDA0002708716170000132
式(III)所示的结构为硼亚甲基二吡咯(BODIPY(注册商标))骨架。式(IV)所示的结构表示生物素的一部分。添加了式(III)或(IV)所示的结构作为标签的甾醇通常能够获得针对这些标签的捕捉体，因此是优选的。另外，添加了2,4-二硝基苯基(DNP)作为标签的甾醇也有抗DNP抗体销售，因此是优选的。
作为不具有接头的带有标签的胆固醇，可列举例如下述的式(V)所示的荧光标记胆固醇(23-(亚甲基二吡咯硼二氟化物)-24-降胆甾醇、CAS No:878557-19-8)。
【化4】
Figure BDA0002708716170000141
该荧光标记胆固醇由Avanti Polar Lipids公司以TopFluor Cholesterol的商品名销售。式(V)所示的荧光标记胆固醇中，标签(具有BODIPY骨架结构的荧光部分)直接结合在胆固醇的C23位。作为与上述具有BODIPY骨架结构的荧光部分特异性结合的捕捉体，市售有抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies公司)。
作为介由接头结合有标签的带有标签的胆固醇，可列举下述的式(VI)所示的带有生物素的胆固醇。
【化5】
Figure BDA0002708716170000142
(式中，n为0～24的整数，优选为2～11的整数，更优选为4～11的整数。)
在该带有标签的胆固醇中，标签(式(IV)所示的生物素部分)介由接头(聚乙二醇链)与胆固醇部分结合。作为与生物素部分特异性结合的捕捉体，应用亲和素或链霉亲和素。另外，也市售有结合有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等标记物质的亲和素或链霉亲和素。
另外，作为介由接头结合有标签的带有标签的胆固醇，可列举下述的式(VII)所示的带有DNP的胆固醇。
【化6】
Figure BDA0002708716170000151
在该带有标签的胆固醇中，DNP介由接头(-(C＝O)-NH-CH2-CH2-NH-)与胆固醇部分结合。作为与DNP特异性结合的捕捉体，应用抗DNP抗体。另外，也市售有结合有HRP、ALP等标记物质的抗DNP抗体。
甾醇部分与标签的结合方式没有特别限定，可以是甾醇部分与标签结合，也可以是甾醇部分与标签介由接头而结合。连接手段没有特别限定，例如，利用官能团的交联是简便且优选的。官能团没有特别限定，氨基、羧基及巯基由于可以利用市售的交联接头而优选。
就胆固醇而言，结合在C17位的烷基链上没有官能团，因此优选在标签的添加中使用在该烷基链上具有官能团的胆固醇衍生物。作为这类胆固醇衍生物，可列举例如胆汁酸的前体、类固醇的前体等。具体而言，优选3β-羟基-Δ5-胆烯酸、24-氨基-5-胆烯-3β-醇等。标签的官能团根据标签的种类而不同。例如，在使用肽或蛋白质作为标签时，可以利用氨基、羧基及巯基(SH基)，在使用生物素作为标签时，可以利用侧链的羧基。接头优选在两端具有官能团的聚合物化合物。需要说明的是，在添加生物素作为标签时，可以使用市售的生物素标记试剂。该试剂包含结合有在末端具有氨基等官能团的各种长度的间隔臂(PEG等)的生物素。
就作为第1标记的信号发生物质而言，可列举例如荧光物质、显色物质、发光物质、放射性同位素等。这些中，特别优选荧光物质。荧光物质优选包含具有极性结构的荧光团。在该技术领域中，包含具有极性结构的荧光团的荧光物质本身是公知的。
标记有信号发生物质的甾醇可以通过用公知的方法将该物质添加到甾醇上来制造。需要说明的是，甾醇中添加信号发生物质的位置没有特别限定，可根据所用的信号发生物质的种类来适宜决定。甾醇与信号发生物质的结合方式没有特别限定，优选两者介由共价键直接结合。
作为包含荧光物质的甾醇，可列举例如包含具有上述的式(III)所示的BODIPY骨架结构的荧光团的荧光标记甾醇等。在本实施方式中，可以使用市售的荧光标记甾醇。例如，作为包含具有BODIPY骨架结构的荧光团的甾醇，可列举上述的式(V)所示的荧光标记胆固醇。式(V)所示的荧光标记胆固醇在470～490nm的激发波长作用下产生波长525～550nm的荧光信号。
(吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备工序)
在该制备工序中，在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下的、脂蛋白与标记甾醇的混合例如可以通过将包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、和包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂混合来进行。混合的顺序没有特别限定。这种情况下，作为液状试剂，可列举例如在上述的水性介质或试样稀释用试剂中包含第1添加剂和/或第2添加剂的液体。或者，作为液状试剂，也可以使用在包含标记甾醇的溶液中包含第1添加剂和/或第2添加剂的液体。这种情况下，上述的混合通过将包含脂蛋白的试样与包含第1添加剂和/或第2添加剂及标记甾醇的液状试剂混合而进行。在该制备工序中，在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下，脂蛋白开始吸收标记甾醇，得到吸收了标记甾醇的脂蛋白。
混合时的温度条件及时间条件没有特别限定。例如，可以将试样与标记甾醇和液状试剂的混合液在20～48℃、优选25～42℃下孵育10秒钟～24小时、优选1分钟～2小时。孵育期间，可以将混合液静置，也可以对混合液进行搅拌或振荡。
可适宜地决定第1添加剂和/或第2添加剂的添加量。例如，通过吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备工序而得到的混合液中的第1添加剂和/或第2添加剂的浓度为1μM以上且1000μM以下，优选为13μM以上且352μM以下。在此，通过制备工序而得到的混合液是指包含脂蛋白、标记甾醇、以及第1添加剂和/或第2添加剂的液体。这类混合液例如为包含脂蛋白的试样与包含标记甾醇的溶液、包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂的混合液。或者，通过制备工序而得到的混合液可以为包含脂蛋白的试样与包含第1添加剂和/或第2添加剂及标记甾醇的液状试剂的混合液。在通过制备工序而得到的混合液中，第1添加剂和/或第2添加剂的浓度在上述的范围内时，测定值的偏差可进一步降低。
标记甾醇的添加量没有特别限定，可以稍稍过量地添加，以避免标记甾醇耗尽。例如，通过吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备工序而得到的混合液中的标记甾醇的浓度为0.1μM以上且30μM以下，优选为1μM以上且10μM以下。
在本实施方式中，试样中的脂蛋白与标记甾醇的混合可以在不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。例如，可以向包含标记甾醇的溶液或上述的液状试剂中添加不具有环状结构的表面活性剂。不具有环状结构的表面活性剂的添加量可适宜设定。例如，通过吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备工序而得到的混合液中的表面活性剂的浓度为0.001％(v/v)以上且0.5％(v/v)以下，优选为0.01％(v/v)以上且0.1％(v/v)以下。
在本实施方式中，试样中的脂蛋白与标记甾醇的混合可以在上述的环状寡糖及不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。另外，试样中的脂蛋白与标记甾醇接触可以在对与上述的测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分及不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。例如，可以向包含标记甾醇的溶液或上述的液状试剂中添加环状寡糖和/或对与测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分。
在本实施方式中，试样中的脂蛋白与标记甾醇的混合可以在用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂的存在下进行。例如，可以向包含标记甾醇的溶液或上述的液状试剂中添加该封闭剂。作为封闭剂，优选上述的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。
(不具有环状结构的表面活性剂)
不具有环状结构的表面活性剂可以从非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂及两性表面活性剂中适宜选择，优选非离子型表面活性剂。不具有环状结构的非离子型表面活性剂没有特别限定，可列举例如：聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物、聚氧亚乙基烷基醚、聚氧亚乙基聚氧亚丙基烷基醚、聚氧亚烷基二烷基醚、聚氧亚烷基烯基醚、聚氧亚乙基支链烷基醚、聚氧亚乙基聚氧亚丙基烷基醚、聚氧亚烷基醚、聚乙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、聚丙二醇脂肪酸酯、聚氧亚乙基椰油脂肪酸甘油酯、聚氧亚乙基氢化蓖麻油、聚氧亚乙基蓖麻油、三异硬脂酸聚氧亚乙基酯、聚氧亚乙基山梨醇脂肪酸酯、聚氧亚乙基烷基胺、聚氧亚乙基聚氧亚丙基烷基胺、聚氧亚乙基烷基丙二胺、脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧亚乙基脂肪酸单乙醇酰胺等。不具有环状结构的非离子型表面活性剂可以单独使用，也可以将两种以上组合使用。
在上述的非离子型表面活性剂中，优选聚氧亚乙基烷基醚及聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。作为聚氧亚乙基烷基醚，可列举例如聚氧亚乙基月桂基醚、聚氧亚乙基鲸蜡基醚、聚氧亚乙基硬脂基醚、聚氧亚乙基山嵛基醚等。在本实施方式中，特别优选聚氧亚乙基月桂基醚。聚氧亚乙基月桂基醚有市售，可列举例如日油株式会社的NONION K-230及NONION K-220、花王株式会社的EMULGEN 123P及EMULGEN 130K等。
在本实施方式中，作为聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物，优选嵌段共聚物，更优选环氧乙烷与环氧丙烷的三嵌段共聚物。作为这类嵌段共聚物的非离子型表面活性剂，特别优选下述的式(VIII)所示的化合物。
【化7】
Figure BDA0002708716170000191
(式中，x、y及z相同或不同，为1以上的整数，聚环氧丙烷部分的分子量为2750以下)
式(VIII)所示的化合物也被称为聚丙二醇环氧乙烷加成物、聚氧亚乙基聚氧亚丙基二醇、聚氧亚乙基聚氧亚丙基嵌段聚合物、或Pluronic(商标)型非离子表面活性剂。
在式(VIII)中，聚环氧丙烷部分(以下也称为“PPO”)的分子量是指-(O-CH(CH3)-CH2)y-所示的部分的分子量，是指由分子结构式计算的分子量。在本实施方式中，PPO的分子量优选为900以上且2750以下，更优选为950以上且2750以下，特别是更优选为950以上且2250以下。Pluronic型非离子表面活性剂中的PPO的疏水性比较高，因此PPO的分子量越大则表面活性剂的疏水性也越大。因此，PPO的分子量大于2750的Pluronic型非离子表面活性剂有作用于脂蛋白、抑制胆固醇的吸收之虞。
式(VIII)所示的化合物的平均分子量优选为1000～13000。式(VIII)中，x及z之和优选为2～240。另外，式(VIII)中，y优选为15～47，更优选为16～47，特别是更优选为16～39。本说明书中，“平均分子量”为利用凝胶渗透色谱(GPC)测定的重均分子量。
Pluronic型非离子表面活性剂有市售，可列举例如BASF公司的Pluronic的系列、日油株式会社的Puronon系列、旭电化工业株式会社的ADEKA Pluronic系列等。根据纵轴取PPO的分子量、横轴取环氧乙烷(EO)含量(％)而成的Pluronic grid(例如，参照Pitto-Barry A.及Barry N.P.E.,Poly.Chem.,2014,vol.5,p.3291-3297)对Pluronic系列进行分类。Pluronic grid不仅可由学术文献、也可由各制造业者提供。在本实施方式中，可以基于Pluronic grid选择式(VIII)所示的化合物。
作为式(VIII)所示的Pluronic型非离子表面活性剂，可列举例如Pluronic L31(PPO的分子量：950、EO含有率：10％)、Pluronic L35(PPO的分子量：950、EO含有率：50％)、Pluronic F38(PPO的分子量：950、EO含有率：80％)、Pluronic L42(PPO的分子量：1200、EO含有率：20％)、Pluronic L43(PPO的分子量：1200、EO含有率：30％)、Pluronic L44(PPO的分子量：1200、EO含有率：40％)、Pluronic L61(PPO的分子量：1750、EO含有率：10％)、Pluronic L62(PPO的分子量：1750、EO含有率：20％)、Pluronic L63(PPO的分子量：1750、EO含有率：30％)、Pluronic L64(PPO的分子量：1750、EO含有率：40％)、Pluronic P65(PPO的分子量：1750、EO含有率：50％)、Pluronic F68(PPO的分子量：1750、EO含有率：80％)、Pluronic L72(PPO的分子量：2050、EO含有率：20％)、Pluronic P75(PPO的分子量：2050、EO含有率：50％)、Pluronic F77(PPO的分子量：2050、EO含有率：70％)、Pluronic L81(PPO的分子量：2250、EO含有率：10％)、Pluronic P84(PPO的分子量：2250、EO含有率：40％)、Pluronic P85(PPO的分子量：2250、EO含有率：50％)、Pluronic F87(PPO的分子量：2250、EO含有率：70％)、Pluronic F88(PPO的分子量：2250、EO含有率：80％)、Pluronic L92(PPO的分子量：2750、EO含有率：20％)、Pluronic P94(PPO的分子量：2750、EO含有率：40％)、Pluronic F98(PPO的分子量：2750、EO含有率：80％)等。
或者，环氧乙烷与环氧丙烷的三嵌段共聚物可以为下述的式(IX)所示的化合物。该化合物也被称为反式Pluronic型非离子表面活性剂。
【化8】
Figure BDA0002708716170000201
(式中，p、q及r相同或不同，为1以上的整数，聚环氧丙烷部分的分子量为2750以下)
式(IX)中，聚环氧丙烷部分的分子量是-(O-CH(CH3)-CH2)p-及-(O-CH(CH3)-CH2)r-所示的部分的分子量的合计，是指由分子结构式计算的分子量。在本实施方式中，PPO的分子量优选为900以上且2750以下，更优选为950以上且2250以下。式(IX)所示的Pluronic型非离子表面活性剂有市售，可列举例如BASF公司的Pluronic 10R5(PPO的分子量：950、EO含有率：50％)等。
式(IX)所示的化合物的平均分子量优选为1000～13000。式(IX)中，q优选为2～240。另外，在式(IX)中，p与r之和优选为15～47，更优选为16～47，特别是更优选为16～39。
(脂蛋白与第1捕捉体的复合体的形成工序)
本实施方式的测定方法优选在上述的吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备工序与后述的吸收能力的测定工序之间包括下述工序：将吸收了标记甾醇的脂蛋白和与该脂蛋白结合的第1捕捉体混合，形成包含吸收了标记甾醇的脂蛋白和第1捕捉体的复合体的工序。通过使脂蛋白与第1捕捉体接触，第1捕捉体与脂蛋白结合而形成脂蛋白与第1捕捉体的复合体。
第1捕捉体只要是能够与脂蛋白表面的一部分特异性结合的物质就没有特别限定。作为第1捕捉体，优选与脂蛋白特异性结合的抗体，更优选能够与作为脂蛋白的构成成分的载脂蛋白特异性结合的抗体。作为这类抗体，可列举例如抗ApoAI抗体、抗ApoAII抗体等。它们中，特别优选抗ApoAI抗体。可以使用市售的抗脂蛋白抗体及抗ApoAI抗体。
抗脂蛋白抗体及抗ApoAI抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。抗体的来源没有特别限定，可以为来自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼等中的任一哺乳动物的抗体。另外，抗体的同种型可以为IgG、IgM、IgE、IgA等中的任一种，优选为IgG。作为第1捕捉体，可以使用抗体的片段及其衍生物，可列举例如Fab片段、F(ab')2片段等。
关于吸收了标记甾醇的脂蛋白与第1捕捉体的混合，例如可以通过在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、和包含第1捕捉体的溶液混合来进行。混合的顺序没有特别限定。在优选的实施方式中，在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将脂蛋白和标记甾醇混合后，进行该脂蛋白与第1捕捉体的混合。例如，在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样与包含标记甾醇的溶液混合后，将得到的混合液与包含第1捕捉体的溶液混合。优选使用上述的液状试剂进行第1添加剂和/或第2添加剂的存在下的混合。由此，可形成吸收了标记甾醇的脂蛋白与第1捕捉体的复合体。第1捕捉体的添加量没有特别限定，本领域技术人员可以根据第1捕捉体的种类等适宜设定。
在使用抗ApoAI抗体作为第1捕捉体时，可以在抗ApoAI抗体与吸收了标记甾醇的脂蛋白接触之前用氧化剂处理该脂蛋白。通过氧化剂的作用，可改善抗ApoAI抗体与脂蛋白的反应性。作为这类氧化剂，可列举例如过氧化氢、过氧化亚硝酸、二氧化氯、次氯酸等。
脂蛋白与第1捕捉体混合时的温度条件及时间条件没有特别限定。例如，可以将上述的混合液在20～48℃、优选25～42℃下孵育10秒钟～24小时、优选1分钟～2小时。在孵育期间，可以将混合液静置，也可以对混合液进行搅拌或振荡。
(复合体向固相上的固定)
在本实施方式中，可以将吸收了标记甾醇的脂蛋白与第1捕捉体的复合体固定在固相上。作为固相，优选能够捕捉复合体中的第1捕捉体的固相。复合体向固相上的固定例如可以通过在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、包含第1捕捉体的溶液、和固相混合来进行。或者，可以在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、和包含第1捕捉体的溶液混合，然后将得到的混合液和固相混合。优选首先在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样和包含标记甾醇的溶液混合，之后将得到的混合液和包含第1捕捉体的溶液混合，接着将得到的混合液和固相混合。在此，优选使用上述的液状试剂进行第1添加剂和/或第2添加剂的存在下的混合。
在本实施方式中，第1捕捉体可以预先固定在固相上。例如，可以在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、和固定有第1捕捉体的固相混合。优选在第1添加剂和/或第2添加剂的存在下将包含脂蛋白的试样和包含标记甾醇的溶液混合，然后将得到的混合液与固定有第1捕捉体的固相混合。在此，优选使用上述的液状试剂进行第1添加剂和/或第2添加剂的存在下的混合。
通过将复合体中的第1捕捉体捕捉到固相、固定在该固相的表面上，从而将复合体固定在固相上。使用固相的混合的温度条件及时间条件没有特别限定。例如，可以为与上述的脂蛋白和第1捕捉体的混合相同的条件。
固相的种类没有特别限定，可列举例如物理性地吸附抗体的材质的固相、固定有与抗体特异性结合的分子的固相等。作为与抗体特异性结合的分子，可列举蛋白A或G、特异性地识别抗体的抗体(即，二抗)等。另外，也可以使用介于抗体与固相之间的物质的组合而使两者结合。作为这样的物质组合，可列举生物素类与亲和素类、半抗原与抗半抗原抗体等组合。例如，在对第1捕捉体预先进行生物素修饰的情况下，可以利用固定有亲和素类的固相来捕捉第1捕捉体。
固相的材料可以从有机高分子化合物、无机化合物、生物高分子等中选择。作为有机高分子化合物，可列举胶乳、聚苯乙烯、聚丙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等。作为无机化合物，可列举磁性体(氧化铁、氧化铬、钴及铁素体等)、二氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物高分子，可列举不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。可以将这些中的2种以上组合使用。
固相的形状没有特别限定，可列举例如粒子、微孔板、微型管、试管等。它们中，优选粒子及微孔板，特别优选磁性粒子及96孔微孔板。在固相的形状为粒子时，可以在上述混合中使用粒子的悬浮液作为固相。在固相的形状为微孔板等容器时，可以在作为固相的容器内进行上述混合。
在使用粒子的悬浮液作为固相时，通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液中的第1添加剂和/或第2添加剂的浓度为1μM以上且1000μM以下，优选为10μM以上且271μM以下。在此，在固相为粒子的情况下，通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液是指包含脂蛋白、标记甾醇、第1添加剂和/或第2添加剂、第1捕捉体和粒子的液体。在使用第2捕捉体的情况下，通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液是指包含脂蛋白、标记甾醇、第1添加剂和/或第2添加剂、第1捕捉体、后述的第2捕捉体和粒子的液体。在固相为容器的情况下，通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液是指容器内包含脂蛋白、标记甾醇、第1添加剂和/或第2添加剂和第1捕捉体的液体。在使用第2捕捉体的情况下，通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液是指容器内的包含脂蛋白、标记甾醇、第1添加剂和/或第2添加剂、第1捕捉体和第2捕捉体的液体。
通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液具体而言为包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂、包含第1捕捉体的溶液、和粒子的悬浮液的混合液。在使用第2捕捉体的情况下，上述的混合液为包含脂蛋白的试样、包含标记甾醇的溶液、包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂、包含第1捕捉体的溶液、包含第2捕捉体的溶液、和粒子的悬浮液的混合液。液状试剂可以为包含第1添加剂和/或第2添加剂、以及标记胆固醇的试剂。通过复合体形成工序而得到的、包含固相的混合液中，第1添加剂和/或第2添加剂的浓度在上述范围内时，可以进一步降低测定值的偏差。
(洗涤工序)
在本实施方式中，可以在吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备工序与后述的甾醇吸收能力的测定工序之间进行除去未反应的游离成分的洗涤工序。该洗涤工序包括B/F分离及复合体的洗涤。未反应的游离成分是指未构成吸收了标记甾醇的包含脂蛋白的复合体的成分。可列举例如未被脂蛋白吸收的游离的标记甾醇、未与脂蛋白结合的游离的第1捕捉体等。B/F分离的手段没有特别限定，例如可以通过利用超离心分离法等仅回收复合体而将复合体与未反应的游离成分分离。在不使复合体形成在固相上时，若固相为粒子，则可以通过利用离心分离、磁力分离回收粒子、除去上清而将复合体与未反应的游离成分分离。若固相为微孔板、微型管等容器，则可以通过除去包含未反应的游离成分的液体而将复合体与未反应的游离成分分离。
在除去未反应的游离成分之后，可以用适当的水性介质洗涤所回收的复合体。作为这类水性介质，可列举例如水、生理盐水、PBS、Tris-HCl、GOOD’S缓冲液等。洗涤中使用的水性介质优选包含不具有环状结构的表面活性剂。例如，可以将不具有环状结构的表面活性剂溶解于上述的水性介质而制备洗涤液，用该洗涤液洗涤所回收的复合体。在使用固相的情况下，可以用洗涤液洗涤捕捉有复合体的固相。具体而言，对回收的复合体或捕捉有复合体的固相添加洗涤液，再次进行B/F分离。
(甾醇吸收能力的测定工序)
在本实施方式的测定方法中，在制备吸收了标记甾醇的脂蛋白后，测定脂蛋白的标记甾醇吸收能力。甾醇吸收能力的测定通过检测来自脂蛋白所吸收的标记甾醇的信号来进行。该信号反映脂蛋白所吸收的标记甾醇的量，因此该信号的检测结果成为脂蛋白的甾醇吸收能力的指标。
在本说明书中，“检测......信号”包括：定性检测信号的有无、定量信号强度、及如“未产生信号”、“弱”、“强”等那样阶段性地半定量检测信号的强度。在本实施方式中，优选定量信号强度而取得测定值。
来自脂蛋白所吸收的标记甾醇的信号可以为由标记甾醇直接产生的信号。例如，在作为第1标记使用具有信号发生物质的标记甾醇时，可以检测这类信号。即，可以通过检测由脂蛋白所吸收的标记甾醇中的第1标记产生的信号来测定吸收能力。例如，在使用荧光标记甾醇的情况下，测定荧光强度即可。测定荧光强度的方法本身在该技术领域中是公知的。例如，可以使用分光荧光光度计及荧光酶标仪等公知的测定装置测定由复合体产生的荧光强度。激发波长及荧光波长可以根据所使用的荧光标记胆固醇的种类适宜决定。例如，在使用上述的式(V)的荧光标记胆固醇时，可以从激发波长为470～490nm、荧光波长为525～550nm的范围内选择。
(标记甾醇与第2捕捉体的复合体的形成工序)
来自脂蛋白所吸收的标记甾醇的信号可以为在检测脂蛋白所吸收的标记甾醇时产生的信号。为了检测脂蛋白所吸收的标记甾醇，本实施方式的测定方法优选在上述的制备工序与测定工序之间包括下述工序：将吸收了标记甾醇的脂蛋白、第1捕捉体、与标记甾醇结合的第2捕捉体混合，形成包含吸收了标记甾醇的脂蛋白、第1捕捉体和第2捕捉体的复合体。标记甾醇优选带有标签的甾醇，更优选带有标签的胆固醇。另外，第2捕捉体优选与标签特异性结合的物质。
脂蛋白所吸收的带有标签的胆固醇的检测原理如下所述。通常，胆固醇若被脂蛋白吸收则从该脂蛋白粒子的表层向中心部移动。认为：在带有标签的胆固醇中，被脂蛋白吸收的是胆固醇部分，标签会在脂蛋白的外表面露出。在此，“脂蛋白的外表面”是指脂蛋白粒子的外侧的表面。“在外表面露出”是指：存在于脂蛋白的外表面上及从脂蛋白的外表面突出这两种情况。在本实施方式中，使该在外表面露出的标签和与该标签特异性结合的第2捕捉体接触而形成复合体。然后，通过检测该复合体中的第2捕捉体来检测脂蛋白所吸收的胆固醇。
与标签特异性结合的物质可根据标签的种类适宜决定。例如，可以参照上述的标签和能够与该标签特异性结合的物质的组合而从抗体、配体受体、寡核苷酸、生物素类、亲和素类、组氨酸标签或镍、GST或谷胱甘肽等中选择。它们中，优选与标签特异性结合的抗体。这类抗体可以为市售的抗体，也可以为通过该技术中公知的方法制作的抗体。抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。抗体的来源及同种型没有特别限定，与关于抗HDL抗体而说明的情况相同。另外，可以使用抗体的片段及其衍生物，可列举例如Fab片段、F(ab')2片段等。
本实施方式的测定方法更优选在上述的复合体形成工序与测定工序之间包含下述工序：将吸收了标记甾醇的脂蛋白与第1捕捉体的复合体、以及与标记甾醇结合的第2捕捉体混合，形成包含吸收了标记甾醇的脂蛋白、第1捕捉体和第2捕捉体的复合体。特别优选的是，在固相上形成吸收了标记甾醇的脂蛋白与第1捕捉体的复合体之后，将固定于固相的复合体和第2捕捉体混合。由此形成第1捕捉体、吸收了标记甾醇的脂蛋白和第2捕捉体的复合体。在该复合体中，吸收了标记甾醇的脂蛋白处于被第1捕捉体和第2捕捉体夹持的状态。在本实施方式中，也将第1捕捉体、吸收了标记甾醇的脂蛋白和第2捕捉体的复合体称为“夹心复合体”。
标记甾醇与第2捕捉体接触时的温度条件及时间条件没有特别限定。例如，可以将包含脂蛋白和第1捕捉体的复合体的溶液与包含第2捕捉体的溶液的混合物在4～60℃、优选25～42℃下孵育1秒钟～24小时、优选1分钟～2小时。在孵育期间，可以将混合物静置，也可以对混合物进行搅拌或振荡。
(第2标记)
第2捕捉体优选用第2标记进行了标记。在第2捕捉体用第2标记进行了标记的情况下，可以通过检测来自标记甾醇与第2捕捉体的复合体中的第2标记的信号来测定甾醇吸收能力。第2标记可以为信号发生物质，也可以使用催化其它物质的反应而产生可检测的信号的物质。作为信号发生物质，可列举例如荧光物质、放射性同位素等。作为催化其它物质的反应而产生可检测的信号的物质，可列举例如酶。作为酶，可列举碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可列举异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、Alexa Fluor(注册商标)、花青系染料等荧光色素、GFP等荧光蛋白等。作为放射性同位素，可列举125I、14C、32P等。这些中，优选酶，特别优选碱性磷酸酶及过氧化物酶。
利用第2标记来标记第2捕捉体可通过使第2标记与第2捕捉体直接或间接结合来进行。例如，可以使用市售的标记试剂盒等使第2标记与第2捕捉体直接结合。另外，可以通过使用以第2标记标记能够与第2捕捉体特异性结合的抗体而得到的二抗，来使第2标记与第2捕捉体间接地结合。在本实施方式中，可以使用结合有第2标记的第2捕捉体。或者，可以使用第2捕捉体、结合有第2标记且针对第2捕捉体的抗体。
在本实施方式中，可以在进行信号检测之前进行除去未反应的游离成分的洗涤工序。作为未反应的游离成分，可列举例如未与标签结合的游离的第2捕捉体、未与第2捕捉体结合的游离的第2标记等。关于洗涤的具体手法及洗涤液，与上述的洗涤工序相同。
(来自第2标记的信号的检测)
检测来自第2标记的信号的方法本身在该技术领域中是公知的。在本实施方式中，可以根据来自第2标记的信号的种类来选择合适的测定方法。例如，在第2标记为酶时，可以通过使用公知的装置测定由酶与该酶的底物反应而产生的光、色等信号来进行。作为这类测定装置，可列举分光光度计、发光计等。
酶的底物可以根据该酶的种类从公知的底物中适宜选择。例如，在使用过氧化物酶作为酶时，作为底物，可列举鲁米诺及其衍生物等化学发光底物、2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等显色底物。另外，在使用碱性磷酸酶作为酶时，作为底物，可列举CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠)等化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚磷酸二钠、对硝基苯基磷酸等显色底物。
在第2标记为放射性同位素时，可以使用闪烁计数器等公知的装置测定作为信号的放射线。另外，在第2标记为荧光物质时，可以使用荧光酶标仪等公知的装置测定作为信号的荧光。需要说明的是，激发波长及荧光波长可根据使用的荧光物质的种类适宜决定。
在本实施方式的测定方法中，可以离体实施上述各工序。另外，以实质上无细胞的体系进行上述各工序。实质上无细胞的体系是指：为了用于脂蛋白的甾醇吸收能力的测定，不主动地添加细胞。例如，在以往的胆固醇排出功能的测定方法中，使用巨噬细胞等蓄积胆固醇的细胞。但是，在本实施方式的测定方法中，使试样中的脂蛋白直接吸收标记甾醇，因此不需要使用这类细胞。即使在试样中包含来自被检者的细胞的情况下，考虑到该细胞本身对于脂蛋白吸收标记甾醇几乎没有影响，也将测定方法视为无细胞体系。
[2.脂蛋白吸收能力测定用试剂、稳定化试剂及试剂盒]
在另一实施方式中，提供用于本实施方式的测定方法的试剂。即，提供包含标记甾醇以及第1添加剂和/或第2添加剂的脂蛋白吸收能力测定用试剂(以下也称为“测定用试剂”)。另外，提供包含第1添加剂和/或第2添加剂的、脂蛋白吸收能力测定的稳定化试剂(以下也称为“稳定化试剂”)。标记甾醇、第1及第2添加剂的详细情况如上所述。在此，本说明书中的“稳定化试剂”是指提高测定的再现性的试剂。本实施方式的“测定用试剂”为在“稳定化试剂”中含有标记甾醇的试剂。
第1添加剂例如可以为上述的式(I)所示的化合物。作为式(I)所示的第1添加剂，可列举例如具有1个碳-碳双键、且碳数为8以上且30以下的直链状的不饱和脂肪族酰胺、不饱和脂肪族醇及不饱和脂肪族胺。优选的第1添加剂为油酸酰胺、芥酸酰胺、油醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、顺式-4-癸烯-1-醇、反9-十八烯醇及油基胺。
第2添加剂例如可以是主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族化合物。作为这类饱和脂肪族化合物，可列举主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族酰胺、饱和脂肪族醇及饱和脂肪族胺。优选的第2添加剂是碳数为8以上且30以下的直链状的饱和脂肪族酰胺、饱和脂肪族醇及和脂肪族胺。特别优选为硬脂酸酰胺及棕榈酸酰胺。
标记甾醇优选上述带有标签的甾醇或上述具有信号发生物质的甾醇。作为带有标签的甾醇，可列举上述的式(II)所示的带有标签的胆固醇。它们中，优选上述的式(V)、(VI)及(VII)所示的带有标签的胆固醇。作为具有信号发生物质的甾醇，可列举荧光标记甾醇。作为荧光标记甾醇，可列举例如上述的式(V)所示的荧光标记胆固醇。
本实施方式的测定用试剂及稳定化试剂优选为液状的组合物。作为溶剂，可列举例如水、生理盐水、PBS、Tris-HCl、GOOD’S缓冲液等水性介质。本实施方式的测定用试剂及稳定化试剂通常收容于容器而提供给用户。收容试剂的容器可以放入箱或袋中而提供给用户。箱或袋中可以一起装入记载试剂的使用方法等的添附文件。
本实施方式的测定用试剂可以为包含标记甾醇和第1添加剂和/或第2添加剂这两者的单组分试剂形态。或者，本实施方式的测定用试剂可以为具备包含标记甾醇的第1试剂、以及包含第1添加剂和/或第2添加剂的第2试剂的双组分试剂的形态。在为双组分试剂的形态时，可以将第1试剂和第2试剂分别提供给用户。或者，可以将第1试剂和第2试剂一起装入箱等中而以试剂盒形式提供给用户。在单组分试剂的形态及双组分试剂的形态中的任一情况下，均可以与记载有试剂的使用方法等的添附文件一起提供给用户。
图1A示出作为单组分试剂的形态的测定用试剂或稳定化试剂的外观的一例。图中，10表示收容测定用试剂或稳定化试剂的容器，11表示包装箱，12表示添附文件。图1B示出试剂盒的外观的一例。该试剂盒包含作为双组分试剂的形态的测定用试剂的第1试剂及第2试剂且将其一起装入箱中。图中，20表示试剂盒，21表示收容包含标记甾醇的第1试剂的第1容器，22表示收容包含第1添加剂和/或第2添加剂的第2试剂的第2容器，23表示包装箱，24表示添附文件。
关于各试剂中的第1添加剂和/或第2添加剂的浓度，只要为在将测定用试剂与包含脂蛋白的试样混合时、或将稳定化试剂与包含脂蛋白的试样和包含标记胆固醇的溶液混合时可以使混合液中的添加剂的浓度达到1μM以上且1000μM以下、优选13μM以上且352μM以下的浓度即可。测定用试剂中的第1添加剂和/或第2添加剂的浓度例如为1μM以上且1000μM以下，优选为15μM以上且392μM以下。稳定化试剂中的第1添加剂和/或第2添加剂的浓度为例如10μM以上且10000μM以下，优选为178μM以上且1779μM以下。
测定用试剂中的标记甾醇的浓度只要为在将测定用试剂与包含脂蛋白的试样混合时可以使混合液中的标记甾醇的浓度达到0.1μM以上且30μM以下、优选1μM以上且10μM以下的浓度即可。测定用试剂中的标记甾醇的浓度为例如0.2μM以上且600μM以下，优选为1μM以上且200μM以下。
本实施方式的测定用试剂及稳定化试剂可以进一步包含对脂蛋白的甾醇吸收能力的测定有用的物质。作为对测定有用的物质，可列举例如不具有环状结构的表面活性剂、环状寡糖、对与测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分、封闭剂等。这些物质的详细情况如上所述。
作为不具有环状结构的表面活性剂，可列举例如聚氧亚乙基月桂基醚及聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物等。试剂中的该表面活性剂的浓度没有特别限定，例如为0.002％(v/v)以上且10％(v/v)以下，优选为0.005％(v/v)以上且5％(v/v)以下。作为环状寡糖，可列举例如环糊精、甲基-β-环糊精、羟丙基环糊精等。试剂中的环状寡糖的浓度没有特别限定，例如为0.2mM以上且20mM以下，优选为1mM以上且10mM以下。作为对与测定对象的脂蛋白不同的脂蛋白结合的成分，可列举例如杯芳烃等。试剂中的该成分的浓度没有特别限定，在使用杯芳烃时，例如为0.1μM以上且0.1mM以下，优选为1μM以上且5μM以下。作为封闭剂，可列举例如2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。试剂中的该封闭剂的浓度没有特别限定，在使用2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物时，例如为0.01％(w/w)以上且5％(w/w)以下，优选为0.05％(w/w)以上且2％(w/w)以下。
在另一实施方式中，提供标记胆固醇以及第1添加剂和/或第2添加剂的用于制造脂蛋白吸收能力测定用试剂的应用。另外，提供第1添加剂和/或第2添加剂的用于制造脂蛋白吸收能力测定的稳定化试剂的应用。另外，提供第1添加剂和/或第2添加剂的用于上述的脂蛋白吸收能力测定方法的应用。
上述的试剂盒可以进一步具备第1捕捉体、第2捕捉体、固相及试样稀释用试剂中的至少1种。试剂盒中所含的试剂类优选分别收容在不同的容器中。标记甾醇、第1及第2添加剂、第1捕捉体、第2捕捉体、固相及试样稀释用试剂的详细情况如上所述。
图2A示出本实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，30表示试剂盒，31为收容包含标记甾醇的溶液的第1容器，32表示收容包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂的第2容器，33表示收容包含第1捕捉体的溶液的第3容器，34表示收容包含作为固相的粒子的悬浮液的第4容器，35表示包装箱，36表示添附文件。
图2B示出另一实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，40表示试剂盒，41表示收容包含标记甾醇的溶液的第1容器，42表示收容包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂的第2容器，43表示收容包含第1捕捉体的溶液的第3容器，44表示收容包含第2捕捉体的溶液的第4容器，45表示收容包含作为固相的粒子的悬浮液的第5容器，46表示包装箱，47表示添附文件。
图2C示出另一实施方式的试剂盒的外观的一例。图中，50表示试剂盒，51表示收容试样稀释用试剂的第1容器，52表示收容包含标记甾醇的溶液的第2容器，53表示收容包含第1添加剂和/或第2添加剂的液状试剂的第3容器，54表示收容包含第1捕捉体的溶液的第4容器，55表示收容包含第2捕捉体的溶液的第5容器，56表示收容包含作为固相的粒子的悬浮液的第6容器，57表示包装箱，58表示添附文件。
本实施方式的试剂盒可以具备微孔板，以代替收容包含粒子的悬浮液的容器。本实施方式的试剂盒可以具备收容标记甾醇以及第1添加剂和/或第2添加剂这两者的容器。本实施方式的试剂盒可以具备收容悬浮液的容器，所述悬浮液包含预先将第1捕捉体固定在粒子上、从而固定有第1捕捉体的粒子。在第2标记为酶的情况下，本实施方式的试剂盒可以进一步包含酶的底物、及酶反应所需的缓冲液。
在另一方式中，提供标记胆固醇以及第1添加剂和/或第2添加剂的用于制造脂蛋白吸收能力测定用试剂盒的应用。
以下通过实施例详细地说明本发明，但是本发明不受这些实施例限制。以下，“HISCL”为希森美康株式会社的注册商标。
【实施例】
实施例1：添加剂的效果的研究(1)
向包含标记甾醇的反应缓冲液中添加添加剂，测定脂蛋白的胆固醇吸收能力，研究对测定的再现性的效果。作为第1添加剂，使用油酸酰胺(花王株式会社)及芥酸酰胺(东京化成工业株式会社)，作为第2添加剂，使用硬脂酸酰胺(花王株式会社)及棕榈酸酰胺(东京化成工业株式会社)。基于使用磁性粒子作为固相的ELISA法，利用全自动免疫测定装置HI-1000(希森美康株式会社)进行吸收能力的测定。
(1)包含脂蛋白的试样
向健康人的血清(0.1mL)中混合等量的22％聚乙二醇4000(富士フイルム和光纯药株式会社)，得到悬浮液。将得到的悬浮液在室温下静置20分钟后，在室温下以3000rpm离心分离15分钟。回收得到的上清，作为HDL级分。将回收的HDL级分分成等分成多份，冷冻保存至用于测定。
(2)试剂
(2.1)试样稀释用试剂
试样稀释用试剂的组成如下所述：0.02％(v/v)NONION K-230(日油株式会社)、0.018％(v/v)Pluronic P84(BASF公司)、及PIPES缓冲液。
(2.2)R1试剂(包含标记甾醇的溶液)
包含添加剂的R1试剂的组成如下所述：0.003％(w/v)添加剂、1％(v/v)PluronicF68(Thermo公司)、0.3％(v/v)Lipidure(商标)SF08(日油株式会社)、1mM甲基-β-环糊精、0.05％(v/v)脂质体、0.008％(v/v)NONION K-230、1μM带有生物素的胆固醇、及PBS。添加剂为油酸酰胺、芥酸酰胺、硬脂酸酰胺及棕榈酸酰胺中的任一种。作为对照，制备了除了不含添加剂以外与上述组成相同的R1试剂。脂质体的组成为2mM二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、2mM胆固醇及4mM氢化大豆磷酰胆碱。将Phosphate buffered saline tablet(Sigma-Aldrich公司)溶解于水而制备PBS。参照专利文献1制备带有生物素的胆固醇(PEG7-Biotin)。
(2.3)R2试剂(固定有第1捕捉体的固相)
作为R2试剂，制备了固定有抗ApoAI抗体的磁性粒子。具体如下所述。相对于磁性粒子添加WSC(Dojindo)及NHS(キシダ化学株式会社)，接着添加抗ApoA1抗体(clone8E10)，从而使抗ApoA1抗体与磁性粒子表面的羧基结合。由此得到作为R2试剂的、包含固定有抗ApoAI抗体的磁性粒子的悬浮液。
(2.3)R3试剂(具有第2标记的第2捕捉体)
作为R3试剂，使用碱性磷酸酶(ALP)标记链霉亲和素溶液(Vector Laboratories公司)。
(2.4)R4试剂(测定用缓冲液)及R5试剂(底物溶液)
作为R4试剂，使用HISCL R4试剂(希森美康株式会社)。作为R5试剂，使用包含ALP的化学发光底物即CDP-Star(注册商标)(Applied Biosystems公司)的HISCL R5试剂(希森美康株式会社)。
(3)吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备
(3.1)试样的稀释
从上述的HDL级分中取出一部分，使用ApoAI测定用试剂盒(N-Assay TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)测定ApoAI浓度。浓度测定的具体操作按照该试剂盒附带的手册来进行。测定后，将HDL级分用试样稀释用试剂进行稀释，制备ApoAI浓度为1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。
(3.2)添加剂存在下的HDL与标记甾醇的混合
将包含各添加剂的R1试剂设置在全自动免疫测定装置HI-1000(希森美康株式会社)中。在经过1小时或70小时后，向包含添加剂的R1试剂(90μL)中添加含有HDL级分的稀释液(10μL)并混合，在37℃下静置1分钟。由此，使HDL和带有生物素的胆固醇在添加剂存在下接触，促进HDL对带有生物素的胆固醇的吸收反应，得到测定用试样。另外，使用不含添加剂的R1试剂同样地得到测定用试样。
(4)磁性粒子上的HDL与抗ApoAI抗体的复合体的形成
向包含测定用试样(100μL)的比色杯中添加R2试剂(30μL)，在37℃下反应6分钟。通过磁力收集反应液中的磁性粒子，除去上清，添加0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS而洗涤磁性粒子。将该洗涤操作合计进行3次。然后通过磁力收集磁性粒子，除去上清。对于固定有吸收了带有生物素的胆固醇的HDL与抗ApoI抗体的复合体的磁性粒子，添加R3试剂(100μL)，在37℃下反应9分钟。通过磁力收集反应液中的磁性粒子，除去上清，添加0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS而洗涤磁性粒子。将该洗涤操作合计进行3次。
(5)HDL的胆固醇吸收能力的测定
洗涤后，通过磁力收集磁性粒子，除去上清。向包含磁性粒子的比色杯中添加HISCL R4试剂(50μL)及R5试剂(100μL)，在37℃下反应5分钟。反应后测定化学发光强度。为了研究测定的再现性，使用上述(1)中得到的HDL级分，与上述同样地重复进行10次含有HDL级分的稀释液的制备至胆固醇吸收能力的测定的操作。由10次测定中得到的化学发光强度计算变异系数(CV)的值。表1示出使用各添加剂的10次测定的CV值(％)。表中，“1小时后”及“70小时后”表示将R1试剂设置于装置后的经过时间。
【表1】
Figure BDA0002708716170000361
(6)结果
如表1所示，使用不含添加剂的R1试剂的情况下，10次测定的CV值为14％以上。与使用不含添加剂的R1试剂时相比，通过使用包含添加剂的R1试剂使得CV值降低。CV值越小表示测定值的偏差越小。特别地，在使用包含作为含有具有碳-碳不饱和键的烃链的化合物的、油酸酰胺及芥酸酰胺的R1试剂的情况下，CV值显著下降。这些结果表示油酸酰胺、芥酸酰胺、硬脂酸酰胺及棕榈酸酰胺提高脂蛋白的甾醇吸收能力的测定的再现性。另外，在将R1试剂设置于装置的1小时后和70小时后之间，未观察到CV值的大幅变化。因此表明吸收能力的测定的再现性几乎不受制备R1试剂起的经过时间的影响。
实施例2：添加剂的效果的研究(2)
使用包含添加剂的试剂测定脂蛋白的胆固醇吸收能力，研究对测定的再现性的效果。作为添加剂，使用油酸酰胺(花王株式会社)、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇(Sigma社)及油基胺(东京化成工业株式会社)。吸收能力的测定与实施例1同样地进行。
(1)试样及试剂
作为包含脂蛋白的试样，使用实施例1中制备的HDL级分。试样稀释用试剂、R2试剂、R3试剂、R4试剂及R5试剂与实施例1中相同。包含添加剂的R1试剂的组成如下所述：0.005％(w/v)添加剂、1％(v/v)Pluronic F68、0.3％(v/v)Lipidure(商标)SF08、1mM甲基-β-环糊精、0.05％(v/v)脂质体、0.008％(v/v)NONION K-230、1μM带有生物素的胆固醇、及PBS。添加剂为油酸酰胺、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇及油基胺中的任一种。脂质体的组成与实施例1中相同。另外，与实施例1同样地制备不含添加剂的R1试剂。
(2)吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备
与实施例1同样地将HDL级分用试样稀释用试剂稀释，制备ApoAI浓度为1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。将包含各添加剂的R1试剂设置于HI-1000。经过12天后，与实施例1同样地将R1试剂与含有HDL级分的稀释液混合，得到测定用试样。另外，使用不含添加剂的R1试剂同样地得到测定用试样。
(3)在固相上形成复合体、及测定吸收能力
与实施例1同样地使测定用试样与R2试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。然后使固定有复合体的磁性粒子与R3试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。洗涤后，通过磁力收集磁性粒子，除去上清。与实施例1同样地使磁性粒子与HISCL R4试剂及R5试剂反应，测定化学发光强度。为了研究测定的再现性，重复进行10次由含有HDL级分的稀释液的制备至胆固醇吸收能力的测定的操作。由10次测定中得到的化学发光强度计算CV值(％)。表2示出使用各添加剂的10次测定的CV值(％)。表中，“12天后”表示将R1试剂设置于装置起的经过时间。
【表2】
Figure BDA0002708716170000371
(4)结果
根据表2，与实施例1的结果同样地，通过使用包含油酸酰胺的R1试剂，10次测定的CV值显著下降。另外，在使用包含(9Z)-9-十六碳烯-1-醇及油基胺作为添加剂的R1试剂的情况下，CV值也显著下降。这些结果表明，就添加剂而言，不仅是包含具有碳-碳不饱和键的烃链的酰胺，即使是包含这类烃链的醇及胺，也提高脂蛋白的甾醇吸收能力的测定的再现性。
实施例3：添加剂的效果的研究(3)
使用包含添加剂的试剂测定脂蛋白的胆固醇吸收能力，研究对测定的再现性的效果。作为添加剂，使用油酸酰胺(花王株式会社)、油醇(东京化成工业株式会社)、顺式-4-癸烯-1-醇(东京化成工业株式会社)及反9-十八烯醇(东京化成工业株式会社)。吸收能力的测定与实施例1同样地进行。
(1)试样及试剂
作为包含脂蛋白的试样，使用实施例1中制备的HDL级分。试样稀释用试剂、R2试剂、R3试剂、R4试剂及R5试剂与实施例1中相同。包含添加剂的R1试剂的组成如下所述：0.005％(w/v)添加剂、1％(v/v)Pluronic F68、0.3％(v/v)Lipidure(商标)SF08、1mM甲基-β-环糊精、0.05％(v/v)脂质体、0.008％(v/v)NONION K-230、1μM带有生物素的胆固醇、及PBS。添加剂为油酸酰胺、油醇、顺式-4-癸烯-1-醇及反9-十八烯醇中的任一种。脂质体的组成与实施例1中相同。另外，与实施例1同样地制备不含添加剂的R1试剂。
(2)吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备
与实施例1同样地将HDL级分用试样稀释用试剂稀释，制备ApoAI浓度为1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。将包含各添加剂的R1试剂设置于HI-1000。经过40小时后，与实施例1同样地将R1试剂与含有HDL级分的稀释液混合，得到测定用试样。另外，使用不含添加剂的R1试剂，同样地得到测定用试样。
(3)在固相上形成复合体、及测定吸收能力
与实施例1同样地使测定用试样与R2试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。然后使固定有复合体的磁性粒子与R3试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。洗涤后，通过磁力收集磁性粒子，除去上清。与实施例1同样地使磁性粒子与HISCL R4试剂及R5试剂反应，测定化学发光强度。为了研究测定的再现性，重复进行10次从含有HDL级分的稀释液的制备至胆固醇吸收能力的测定的操作。由10次测定中得到的化学发光强度计算CV值(％)。表3示出使用各添加剂的10次测定的CV值(％)。表中，“40小时后”表示将R1试剂设置于装置起的经过时间。
【表3】
Figure BDA0002708716170000391
(4)结果
根据表3，与实施例1的结果同样地，通过使用包含油酸酰胺的R1试剂，10次测定的CV值显著下降。另外，在使用包含油醇、顺式-4-癸烯-1-醇及反9-十八烯醇作为添加剂的R1试剂的情况下，CV值也显著下降。在此，油醇与反9-十八烯醇为几何异构体。上述结果表明，包含具有碳-碳不饱和键的烃链的化合物为顺式体及反式体中的任一种均可。另外，顺式-4-癸烯-1-醇具有碳数10的烃链，顺式-4-癸烯-1-醇以外的添加剂具有碳数18的烃链。上述结果表明，具有碳-碳不饱和键的烃链的主链的碳数为约10即可。为了进行比较，表4中汇总了实施例1～3的结果(CV值(％))。
【表4】
Figure BDA0002708716170000401
实施例4：向试样稀释用试剂中添加添加剂
研究了向试样稀释用试剂中添加添加剂时是否也与向R1试剂中添加添加剂时同样地提高脂蛋白的胆固醇吸收能力的测定的再现性。作为添加剂，以各种浓度使用油酸酰胺(花王株式会社)。吸收能力的测定与实施例1同样地进行。
(1)试样及试剂
作为包含脂蛋白的试样，使用实施例1中制备的HDL级分。包含添加剂的试样稀释用试剂的组成如下所述：0.005％(w/v)、0.01％(w/v)或0.02％(w/v)油酸酰胺、0.02％(v/v)NONION K-230(日油株式会社)、0.018％(v/v)Pluronic P84(BASF公司)、及PIPES缓冲液。作为R1试剂，与实施例1同样地制备不含添加剂的R1试剂。R2试剂、R3试剂、R4试剂及R5试剂与实施例1中相同。
(2)吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备
使用包含添加剂的试样稀释用试剂，除此以外与实施例1同样地稀释HDL级分，制备ApoAI浓度为1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。将R1试剂设置在HI-1000(希森美康株式会社)中。经过24小时后，与实施例1同样地将R1试剂与含有HDL级分的稀释液混合，得到测定用试样。
(3)在固相上形成复合体、及测定吸收能力
与实施例1同样地使测定用试样与R2试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。然后使固定有复合体的磁性粒子与R3试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。洗涤后，通过磁力收集磁性粒子，除去上清。与实施例1同样地使磁性粒子与HISCL R4试剂及R5试剂反应，测定化学发光强度。为了研究测定的再现性，重复进行5次含有HDL级分的稀释液的制备至胆固醇吸收能力的测定的操作。由5次测定中得到的化学发光强度计算CV值(％)。表5示出使用各添加剂的5次测定的CV值(％)。
【表5】
添加剂 CV(％)
0.005％(w/v)油酸酰胺 4.5
0.01％(w/v)油酸酰胺 4.9
0.02％(w/v)油酸酰胺 5.2
(4)结果
根据表5，通过使用包含油酸酰胺的试样稀释用试剂，CV值显著下降。因此表明，在将添加剂添加到试样稀释用试剂时，也提高脂蛋白的甾醇吸收能力的测定的再现性。
实施例5：添加剂的浓度的研究
研究了对于提高吸收能力的测定的再现性而言最适宜的添加剂浓度。作为添加剂，将油酸酰胺(花王株式会社)及芥酸酰胺(东京化成工业株式会社)分别以各种浓度添加到R1试剂或试样稀释用试剂中。吸收能力的测定与实施例1同样地进行。
(1)试样及试剂
作为包含脂蛋白的试样，使用实施例1中制备的HDL级分。R2试剂、R3试剂、R4试剂及R5试剂与实施例1中相同。
包含油酸酰胺的试样稀释用试剂的组成如下所述：177.9μM、355.9μM、711.7μM、1067.6μM或1779.4μM油酸酰胺、0.02％(v/v)NONION K-230、0.018％(v/v)Pluronic P84、及PIPES缓冲液。另外，与实施例1同样地制备不含添加剂的试样稀释用试剂。
包含油酸酰胺的R1试剂的组成如下所述：26.7μM、53.4μM、106.8μM、160.1μM、249.1μM、320.3μM或391.5μM油酸酰胺、1％(v/v)Pluronic F68、0.3％(v/v)Lipidure(商标)SF08、1mM甲基-β-环糊精、0.05％(v/v)脂质体、0.008％(v/v)NONION K-230、1μM带有生物素的胆固醇、及PBS。脂质体的组成与实施例1中相同。
包含芥酸酰胺的R1试剂的组成如下所述：14.8μM、44.4μM、147.9μM、221.9μM或295.9μM芥酸酰胺、1％(v/v)Pluronic F68、0.3％(v/v)Lipidure(商标)SF08、1mM甲基-β-环糊精、0.05％(v/v)脂质体、0.008％(v/v)NONION K-230、1μM带有生物素的胆固醇、及PBS。脂质体的组成与实施例1中相同。
(2)吸收了标记甾醇的脂蛋白的制备
(2.1)使用包含添加剂的R1试剂的情况
与实施例1同样地将HDL级分用不含添加剂的试样稀释用试剂稀释，制备ApoAI浓度为1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。将包含各添加剂的R1试剂设置在HI-1000中。经过26小时后，与实施例1同样地在添加剂的存在下使HDL与带有生物素的胆固醇接触，得到测定用试样。
(2.2)使用包含添加剂的试样稀释用试剂的情况
使用包含油酸酰胺的试样稀释用试剂，除此以外与实施例1同样地将HDL级分稀释，制备ApoAI浓度为1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。将不含添加剂的R1试剂设置在HI-1000(希森美康株式会社)中。经过24小时后，与实施例1同样地将R1试剂与含有HDL级分的稀释液混合，得到测定用试样。
(3)在固相上形成复合体、及测定吸收能力
与实施例1同样地使测定用试样与R2试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。然后使固定有复合体的磁性粒子与R3试剂反应，对磁性粒子通过磁力收集并洗涤。洗涤后，通过磁力收集磁性粒子，除去上清。与实施例1同样地使磁性粒子与HISCL R4试剂及R5试剂反应，测定化学发光强度。为了研究测定的再现性，重复进行5次含有HDL级分的稀释液的制备至胆固醇吸收能力的测定的操作。由5次测定中得到的化学发光强度计算CV值(％)。表6～8示出使用各试剂的测定的CV值(％)。表中，“添加R1试剂后的浓度”表示包含脂蛋白的试样(HDL级分)、试样稀释用试剂和R1试剂的混合液、即测定用试样中的添加剂的浓度。另外，“添加R2试剂后的浓度”表示测定用试样与R2试剂的混合液中的添加剂的浓度。
【表6】
包含油酸酰胺的R1试剂
R1试剂中的浓度(μM) 26.7 53.4 106.8 160.1 249.1 320.3 391.5
添加R1试剂后的浓度(μM) 24.0 48.0 96.1 144.1 224.2 288.3 352.3
添加R2试剂后的浓度(μM) 18.5 37.0 73.9 110.9 172.5 221.7 271.0
CV(％) 8.6 6.3 3.7 3.9 2.1 1.8 1.9
【表7】
包含芥酸酰胺的R1试剂
R1试剂中的浓度(μM) 14.8 44.4 147.9 221.9 295.9
添加R1试剂后的浓度(μM) 13.3 39.9 133.1 199.7 266.3
添加R2试剂后的浓度(μM) 10.2 30.7 102.4 153.6 204.8
CV(％) 5.6 6.5 6.2 5.1 7.7
【表8】
包含油酸酰胺的试样稀释用试剂
试样稀释用试剂中的浓度(μM) 177.9 355.9 711.7 1067.6 1779.4
添加R1试剂后的浓度(μM) 17.8 35.6 71.2 106.8 177.9
添加R2试剂后的浓度(μM) 13.7 27.4 54.7 82.1 136.9
CV(％) 4.5 4.9 5.2 7.8 9.4
根据表6～8所示的结果，任一浓度下均可见提高测定的再现性的效果。
符号说明
10：收容测定用试剂或稳定化试剂的容器
20、30、40、50：试剂盒
21、31、41、51：第1容器
22、32、42、52：第2容器
33、43、53：第3容器
34、44、54：第4容器
45、55：第5容器
56：第6容器
11、23、35、46、57：包装箱
12、24、36、47、58：添附文件

Claims (22)

1.一种测定脂蛋白的吸收能力的方法，其包括下述工序：在包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物的存在下，将试样中的脂蛋白和标记甾醇混合，由此制备吸收了所述标记甾醇的脂蛋白的工序，其中，所述包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物不包括甾醇；和
基于所述脂蛋白所吸收的标记甾醇的标记测定脂蛋白的甾醇吸收能力的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将包含所述脂蛋白的试样、所述标记甾醇、以及包含所述具有烃链的化合物和/或所述饱和脂肪族化合物的液状试剂混合而进行所述制备工序中的混合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述具有烃链的化合物及所述饱和脂肪族化合物具有至少1个亲水基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述亲水基从酰胺基、羟基、氨基、羧基、磺基、硫醇基、羰基、酯基、醚基、及这些的组合中选择。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述烃链的主链的碳数为8以上且30以下。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述具有烃链的化合物为下述的式(I)所示的化合物，
R1-CH＝CH-R2···(I)
式中，R1与R2相同或不同，为-R3-(C＝O)-NH2、-R3-OH、-R3-NH2、-R3-(C＝O)-OH、-R3-SO2-OH、-R3-SH、-R3-O-(C＝O)-OH、-R3-NH-(C＝O)-NH2、主链的碳数为1以上且28以下的取代或非取代的烷基、或氢原子，其中，在R1为所述烷基或氢原子时，R2不为所述烷基及氢原子，R1及R2的主链的碳数之和为6以上且28以下，R3为连接键、或主链的碳数为1以上且28以下的取代或非取代的亚烷基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述具有烃链的化合物为选自油酸酰胺、芥酸酰胺、油醇、(9Z)-9-十六碳烯-1-醇、顺式-4-癸烯-1-醇、反9-十八烯醇及油基胺中的至少1种。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述饱和脂肪族化合物为选自主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族酰胺、主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族醇、及主链的碳数为8以上且30以下的饱和脂肪族胺中的至少1种。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述饱和脂肪族化合物为选自硬脂酸酰胺及棕榈酸酰胺中的至少1种。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，通过所述制备工序而得到的混合液中的所述具有烃链的化合物和/或所述饱和脂肪族化合物的浓度为1μM以上且1000μM以下。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述标记甾醇为所述标记胆固醇。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述标记胆固醇为下述的式(III)所示的带有标签的胆固醇，
Figure FDA0002708716160000021
式中，R1为可具有甲基的碳数1～6的亚烷基，X与Y相同或不同，表示-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或-S-R2-，在此，R2分别独立地为连接键、可具有取代基的碳数1以上且10以下的亚烷基、可具有取代基的碳数6以上且12以下的亚芳基或杂亚芳基、或者可具有取代基的碳数3以上且8以下的环亚烷基或杂环亚烷基，L表示-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-，在此，R3为氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，TAG为标签，a与c相同或不同，为0～6的整数，b为0或1，d与e相同或不同，为0～12的整数，f为0～24的整数。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，在所述制备工序与所述测定工序之间包括下述工序：将吸收了所述标记甾醇的脂蛋白和与所述脂蛋白结合的第1捕捉体混合，形成包含吸收了所述标记甾醇的脂蛋白和所述第1捕捉体的复合体的工序。
14.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，在所述制备工序与所述测定工序之间包括下述工序：将吸收了所述标记甾醇的脂蛋白、与所述脂蛋白结合的第1捕捉体、与所述标记甾醇结合的第2捕捉体混合，形成包含吸收了所述标记甾醇的脂蛋白、所述第1捕捉体和第2捕捉体的复合体的工序。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，在所述复合体形成工序中，所述第1捕捉体固定于固相，所述复合体被固定在所述固相上，
所述第1捕捉体为与所述脂蛋白特异性结合的抗体，被固定于所述固相的复合体包含吸收了所述标记甾醇的所述脂蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，通过所述复合体形成工序而得到的、包含所述固相的混合液中的所述具有烃链的化合物和/或所述饱和脂肪族化合物的浓度为1μM以上且1000μM以下。
17.根据权利要求13及引用权利要求13的权利要求15所述的方法，其中，所述测定工序通过检测来自所述脂蛋白所吸收的所述标记甾醇的信号而进行。
18.根据权利要求14及引用权利要求14的权利要求15所述的方法，其中，所述测定工序通过检测所述第2捕捉体而进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第2捕捉体用第2标记进行了标记，所述测定工序为检测来自所述第2标记的信号的工序。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述第2标记为酶，所述信号为由述酶与底物的反应产物产生的化学发光信号。
21.一种脂蛋白吸收能力测定用试剂，其包含：标记甾醇以及包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物，
所述包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物不包括甾醇。
22.一种脂蛋白吸收能力测定的稳定化试剂，其包含：包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物和/或不具有磷酸二酯键的饱和脂肪族化合物，
所述包含具有至少一个碳-碳不饱和键的烃链的化合物不包括甾醇。
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