CN112557349A - 一种基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统 - Google Patents

一种基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS‑CoV‑2实时体外快速检测系统，属于生物检测技术领域。包括制备SARS‑CoV‑2 N蛋白作为待测样本、制作RNA\DNA寡聚物作为适配体和氧化石墨烯(GO)包覆锥形光纤作为传感器。所述RNA\DNA适配体可以在体外有效捕捉SARS‑CoV‑2 N蛋白；所述氧化石墨烯涂层的微光纤可以实时检测SARS‑CoV‑2 N蛋白。由于界面增敏效应与氧化石墨烯的化学增强作用，微纤表面的能量密度显著增强，最低检测极限为6.25×10‑19M。结果表明，该方法可用于实时体外快速检测新型冠状病毒‑19(COVID‑19)。

Description

一种基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外 快速检测系统
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统。
背景技术
COVID-19即新冠肺炎，由SARS-CoV-2病毒引起，传播速度极快且无有效治疗方法。为了阻止病毒的快速传播，必须对SARS-CoV-2进行高效的筛查、检测。目前SARS-CoV-2检测包括核酸检测和抗体检测，然而现有的这两种方法存在可用性差、社区医院缺乏PCR基础设施来适应高样本量、无法识别先前感染等局限性。
光纤传感技术是一种高灵敏、实时、可远距离分析的微量分析技术，具有体积小、成本低、抗电磁干扰、抗震及信息传输容量大等特点，在水质监测、医疗卫生、生物化学和军工等领域具有广阔应用潜力和发展前景。
通常的表面等离子体共振传感器采用棱镜作为光波导耦合器件激发表面等离子体共振波。金膜是表面等离子体共振传感器上最常用的金属膜。但是，棱镜体积大，结构复杂而庞大，操作不够灵活。为了提高表面等离子体共振传感器性能，光纤被运用来取代棱镜，激发表面等离子体共振波，构成光纤SPR传感器。透出纤芯的倏逝波能与其周围物质产生互相作用，周围物质吸收纤芯表面的倏逝波，光纤内部的能量随之衰减。通过分析光纤接收端光的变化，就可以对倏逝场区域的不同介质特征做出判断，推算周围物质的浓度。通常而言，光纤SPR传感器中的纤芯形状，未经处理时是圆柱形，逝场的穿透深度和穿透能量是有限的。这种光纤SPR传感器的检测灵敏度还有待进一步提高。
因此，可以将光纤纤芯进行研磨处理为锥形，改变光纤纵向折射率分布，使倏逝场的穿透深度和穿透能量加大；再将锥形光纤与功能型石墨烯薄膜材料结合，利用石墨烯薄膜与倏逝波的互相作用来提高检测灵敏度，具有结构简单、体积小的特点，且具有高灵敏度，能够满足不同领域对光信号的在线分析、实时分析和活体分析等工作要求，实现光纤传感器检测灵敏度的提高。
发明内容
本发明目的是提供一种体积小、重量轻、方便快捷、响应时间短、可用于实时检测SARS-CoV-2N蛋白的氧化石墨烯包覆微纤传感器。该传感器灵敏度高，检测极限低，可用于检测SARS-CoV-2病毒。
为实现上述目的，本发明通过EMSA分析和SPR实验证实SARS-CoV-2N蛋白的RNA\DNA适配体适用于捕获SARS-CoV-2N蛋白，并将RNA\DNA适配体分别孵育在氧化石墨烯加工过的锥形光纤上，浸入N蛋白溶液中，通过改变蛋白溶液浓度，分析光谱红移现象，实现实时检测。为证明所选适体具有特异性，将RNA\DNA适配体修饰的传感器分别对高浓度BSA溶液进行监测，对比高浓度BSA溶液和低浓度N蛋白溶液的光谱红移现象。
上述方案中，所述的SARS-CoV-2N蛋白是将合成N蛋白的相应核苷酸序列克隆到His载体中，在大肠杆菌中表达，N蛋白通过亲和层析纯化。
上述方案中，所述的RNA\DNA寡氨酸使用MFold程序分析选定最稳定的适体二级结构。
上述方案中，所述BSA溶液浓度为6.25×10-5M。
上述方案中，所述的微光纤是通过熔融拉锥法制成。
上述方案中，所述的氧化石墨烯包覆微光纤，是通过用食人鱼溶液和APTES溶液对二氧化硅微纤维的表面进行了胺化处理，形成了富含正电荷的表面。并对改性微纤进行GO包覆，通过GO上含氧基团与超细纤维上氨基之间的静电吸引作用，使二氧化硅超细光纤表面功能化。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的一种可用于实时检测SARS-CoV-2N蛋白的氧化石墨烯包覆微纤传感器，提供一种体外检测的方法，可以防止病毒侵袭，降低他人感染的风险。所述传感器具有尺寸小、质量轻、结构简单、响应时间短、实时性等优点，比现有试剂盒技术更方便，快捷，效率更高。
(2)本发明所述的一种可用于实时检测SARS-CoV-2N蛋白的氧化石墨烯包覆微纤传感器，具有极低的检测极限6.25×10-19M，可成功地检测到患病初期存在的超低浓度SARS-CoV-2N蛋白。
附图说明
图1是SARS-CoV-1N蛋白(uniprotkbp59595)和SARS-CoV-2N蛋白(uniprotkbp0dtc)的多序列比对分析图。
图2是与SARS-CoV-2N蛋白结合的RNA-AP和DNA-AP的序列和二级结构图。
图3是所示的RNA-AP(A)和DNA-AP(B)进行EMSA，它们与RNA-AP和DNA-AP(2-5道；200，400，600，800fmol)一起孵育以形成适体/蛋白质复合物。
图4是RNA-AP(A)和DNA-AP(B)与SARS-CoV-2N蛋白的结合亲和力测定结果图。
图5是氧化石墨烯包覆微纤生物传感器制作过程图。
图6是检测设备图。
图7、图8是RNA-AP传感器的透射光谱和波长和浓度关系图。
图9、图10是DNA-AP传感器的透射光谱和波长和浓度关系图。
图11、图12是RNA-AP和DNA-AP传感器对纯水(Ref)、BSA和SARS-CoV-2N蛋白溶液的透射光谱图以及N蛋白质溶液和BSA溶液的光学响应对比图。
图13是氧化石墨烯包覆微纤传感器示意图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
如图1所示，SARS-CoV-2中N蛋白的基因序列与SARS-CoV的核衣壳蛋白相似性在90％以上，对准是用CLUSTALW2程序完成。
所述SARS-CoV-2N蛋白的制备方法如下：
1)在37℃下，在200mL LB培养基中培养细胞至OD值为0.6。
2)添加0.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，然后在16℃下培养过夜。
3)制备裂解缓冲液：50mM Tris HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，20mM咪唑(pH 8.0)将细胞颗粒置于裂解缓冲液中，用高压细胞裂解器裂解。
4)离心细胞裂解物12000×g，4℃，20min。
5)上清液用Ni2+琼脂糖小球纯化，然后用含有50mM Tris HCl(pH 8.0)，500mMNaCl和300mM咪唑(pH 8.0)的缓冲液洗脱。
图2是与N蛋白结合的RNA-AP和DNA-AP的序列和二级结构。所选适体的二级结构稳定性最好，用Mfold程序预测。
图3、图4通过SPR和EMSA分析证实了SARS-CoV-2N蛋白的RNA-AP和DNA-AP也适用于SARS-CoV-2N蛋白。
如图5所示，光纤生物传感器的制备方法如下：
1)对单模光纤使用熔融拉锥法，将光纤两边固定在步进电机上，使用氢氧火焰对纤芯局部加热，同时电机向两边拉伸，得到锥部直径10μm左右的拉锥光纤。本实例中分别采用的是锥部直径为9.03μm和7.82μm的光纤。
2)配置食人鱼溶液(H2SO4:H2O2＝3:1)，将混合后滚烫的溶液滴至光纤腰椎，全覆盖，静置15min。
3)稀释硅烷连接剂(APTES:C2H6O＝1:4)，将其覆盖光纤锥部，静置30min。
4)超声GO分散液20min，用去离子水稀释至0.5mg/ml，覆盖光纤，静置时间30min。
5)在湿盒中将制备完成的RNA\DNA寡氨酸蛋白孵育在光纤传感器上。
图6是检测所需设备，测试溶液覆盖的锥形光纤由ASE宽带光源发出的光激发，并用光学光谱分析仪监测其干涉光谱。
图7、图8是RNA探针微光纤检测N蛋白结果，传感器暴露在浓度为10-18～10-7M的N蛋白溶液中时，随着N蛋白溶液浓度的增加，光谱透射带明显红移，灵敏度为1.2048nm/LogM，线性度为98.3879％，检测限为6.25×10-18M。
图9、图10是DNA探针微光纤检测N蛋白结果，传感器探测浓度为10-19～10-7M的N蛋白溶液，随着N蛋白溶液浓度的增加，光谱透射带明显红移，灵敏度为1.2082nm/Log M，线性度为99.7277％，检测限为6.25×10-19M。
图11是对所述的光纤传感器进行特异性对比，RNA-AP传感器区分了低浓度N蛋白溶液(10-7M)和高浓度干扰成分牛血清蛋白(BSA,10-5M)。其中，N蛋白引起的波长偏移为～45.04nm，而BSA为～0.32nm。
图12是DNA-AP传感器可区分低浓度N蛋白溶液(10-11M)和高浓度干扰成分BSA(10-5M)。其中，N蛋白引起的波长偏移为～46.40nm，BSA引起的波长偏移为～11.52nm，远远小于N蛋白引起的光响应。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于所述氧化石墨烯包覆微纤传感器上孵育可捕捉SARS-CoV-2N蛋白的RNA适配体(RNA-AP)和DNA适配体(DNA-AP)，实现对N蛋白的超低浓度实时检测。
2.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于所述N蛋白的超低浓度实时检测是将合成SARS-CoV-2N蛋白的相应核苷酸序列克隆到His载体中，在大肠杆菌中表达，N蛋白通过亲和层析纯化。
3.根据权利要求2所述的基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统其特征在于所述SARS-CoV-2N蛋白的制备包括以下步骤：
1)200mL LB培养基中37℃培养细胞至OD值＝0.6；
2)添加0.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，16℃谣传下培养过夜；
3)制备裂解缓冲液：50mM Tris HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，20mM咪唑(pH 8.0)。将细胞颗粒置于裂解缓冲液中，用高压细胞裂解器裂解；
4)离心细胞裂解物:12000×g，4℃，20min；
5)上清液用Ni2+琼脂糖小球纯化，然后用含有50mM Tris HCl(pH 8.0)，500mM NaCl和300mM咪唑(pH 8.0)的缓冲液洗脱。
4.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统其特征在于所述RNA\DNA适配体是利用EMSA分析该适配体与N蛋白的亲和力，以及通过SPR实验分析二者的结合能力，同时使用MFold程序分析选定最稳定的适配体二级结构。
5.根据权利要求4所述基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于所述SPR实验中RNA-AP和DNA-AP与N蛋白有很强的结合能力，其平衡解离常数(KD)分别为33.4nm(RNA-AP)和35.1nm(DNA-AP)。
6.根据权利要求4所述的基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于所选适体二级结构稳定性最好，ΔG＝-23.92Kcal/mol(RNA-AP)和ΔG＝-10.31Kcal/mol(DNA-AP)。
7.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于所述传感器制备方式包括以下步骤：
1)配置食人鱼溶液(H2SO4:H2O2＝3:1)，将混合后滚烫的溶液覆盖光纤腰椎部分，静置15～20min。
2)稀释硅烷偶联剂(APTES:C2H6O＝1:4)，将其覆盖光纤锥部，静置25～35min。
3)超声GO分散液10～20min，用去离子水稀释至0.25～0.5mg/ml，覆盖光纤，静置时间25～40min。
8.根据权利要求1所述的基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于所述RNA适配体微纤传感器的最低检测极限为6.25×10-18M，DNA适配体微纤传感器的最低检测极限为6.25×10-19M。
9.根据权利要求1所述基于氧化石墨烯包覆微纤传感器的SARS-CoV-2实时体外快速检测系统，其特征在于RNA探针光纤传感器分别检测高浓度BSA溶液(10-5M)与低浓度N蛋白溶液(10-7M)，光谱分别红移～0.32nm和～45.04nm；DNA探针光纤传感器分别检测高浓度BSA溶液(10-5M)与低浓度N蛋白溶液(10-11M)，光谱分别红移～11.52nm和～46.40nm。
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Address after: 401123 rooms 1 and 2, floor 1-2, building 1, No.2, Huizhu Road, Yubei District, Chongqing

Applicant after: Chongqing Research Institute of East China Normal University

Applicant after: SHANGHAI LANGYAN OPTOELECTRONICS TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant after: EAST CHINA NORMAL University

Applicant after: Chongqing Huapu Quantum Technology Co.,Ltd.

Applicant after: Chongqing Huapu Environmental Protection Technology Co.,Ltd.

Applicant after: Yunnan Huapu quantum Material Co.,Ltd.

Applicant after: Chongqing Menghe Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 401123 rooms 1 and 2, floor 1-2, building 1, No.2, Huizhu Road, Yubei District, Chongqing

Applicant before: Chongqing Research Institute of East China Normal University

Applicant before: SHANGHAI LANGYAN OPTOELECTRONICS TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant before: EAST CHINA NORMAL University

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GR01 Patent grant
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