CN112553125A - 一种益生菌模拟物及其制备方法 - Google Patents
一种益生菌模拟物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112553125A CN112553125A CN202011576802.9A CN202011576802A CN112553125A CN 112553125 A CN112553125 A CN 112553125A CN 202011576802 A CN202011576802 A CN 202011576802A CN 112553125 A CN112553125 A CN 112553125A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probiotic
- cells
- medium
- supernatant
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 61
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims abstract description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 9
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 claims description 9
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 claims description 9
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 9
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 9
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 claims description 9
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 9
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 9
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 5
- 108010073361 BioXtra Proteins 0.000 claims description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 4
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 abstract description 18
- 229960001252 methamphetamine Drugs 0.000 abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 abstract description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 abstract description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 7
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 6
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 6
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 4
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 4
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 4
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 4
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 3
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 3
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 3
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 201000006152 substance dependence Diseases 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000605894 Porphyromonas Species 0.000 description 2
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 2
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 208000029790 metamphetamine dependence Diseases 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 244000018436 Coriandrum sativum Species 0.000 description 1
- 235000002787 Coriandrum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 241000735588 Gaultheria Species 0.000 description 1
- 241000235796 Granulicatella Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000160321 Parabacteroides Species 0.000 description 1
- 241000095588 Ruminococcaceae Species 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000000698 schizophrenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于益生菌模拟物制备技术领域，公开了一种益生菌模拟物及其制备方法。所述益生菌模拟物制备方法，包括：在补充胎牛血清的改良的培养基中培养细胞；在细胞第30±10代时，进行TEER的测量；生长48小时后，进行中压隔离；将醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用高纯水洗涤三次，然后重悬于高纯水中；将MV悬浮液与纯化珠和PBS混合，进行MV包覆微粒的制备。本发明通过上述方法可实现MVs的高浓度递送。发明制备的PBMs作为一种抗炎制剂，显著降低促炎性TNF‑α，PBMs能改善炎症引起的肠道屏障功能丧失，通过此方法可以实现对甲基苯丙胺的戒断作用，从而对戒毒产生积极影响。
Description
技术领域
本发明属于益生菌模拟物制备技术领域，尤其涉及一种益生菌模拟物及其制备方法。
背景技术
目前，毒品滥用问题非常严重。药物依赖与酒精依赖等物质依赖的神经学原理类似，益生菌或益生元调节肠道微生物群是治疗物质依赖的一种有前途和安全的方法。为了评估益生菌和/或益生元对物质依赖的影响，尤其是对成瘾的不同行为方面，如抑郁、焦虑、压力反应、认知、冲动和药物寻求行为的影响，肯定需要进行前瞻性、随机、安慰剂对照的临床试验。
甲基苯丙胺成瘾者肠道菌群改变，宁婷婷建立了对甲基丙苯胺(MA)产生依赖的大鼠的条件性位置偏爱模型，然后收集大鼠的粪便，进行16srDNA测序发现，在对甲基丙苯胺成瘾的大鼠的肠道微生物与普通饲养的大鼠比较，许多特异的微生物类群发生了变化，其中值得引起注意的有厚壁菌门(产丙酸)的属的相对含量在对冰毒成瘾的大鼠体内下降。后续的气相色谱-质谱检测进一步证实了肠道内丙酸含量也显著下降。因为丙酸与脑-肠轴功能存在密切的关系，而且更为重要的是通过饮食添加丙酸可以显著改善多种精神症状。除此之外，瘤胃菌科的两个属的含量因为对冰毒成瘾而上升，瘤胃菌科被报道与位置记忆呈负相关，与压力呈正相关。因此，该菌类群的变化可以部分说明MA成瘾的一些症状的原因。Fulcher等的研究也表明，甲基苯丙胺的使用是导致肠道微生物改变的重要因素。在这项纳入37名人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)阳性的男性同性性行为受试者的研究中，甲基苯丙胺的使用与肠道微生物中卟啉菌属(Porphyromonas)以及颗粒链菌属(Granulicatella)细菌丰度的升高，瘤胃球菌属(Ruminococcus)、柯林斯氏菌属(Collinsella)以及副杆状菌属(Parabacteroides)细菌丰度的降低有关。
目前尚未发现肠道微生物在甲基苯丙胺依赖中的作用或调控机制的相关研究。基于有限的证据，Prakash等提出如下假设：甲基苯丙胺的使用导致肠道屏障及血脑屏障的通透性增高，使肠道微生物及其代谢产物能够穿过被削弱的屏障结构，在循环系统的介导下从肠道进入大脑，并引起一系列的外周及中枢神经系统的免疫炎症反应。上述假设提示，在甲基苯丙胺的作用下，肠道会产生炎症导致肠道屏障功能丧失等一系列肠道疾病问题。针对由甲基苯丙胺引发的肠道疾病问题进行缓解和治疗，可能会对甲基苯丙胺产生正面积极的戒断作用。
益生菌对于甲基苯丙胺成瘾的作用，益生菌目前已经被证实可以改善不同人群的生理和心理状态。益生菌的摄入，有助于改善个体对疼痛和负面情绪的整体认知性反应。定期服用含有双歧杆菌和乳杆菌的制剂，较低了肠易激综合征(IBS)患者的焦虑情绪，并降低了大脑杏仁核和额叶边缘区域对于负面情绪刺激的反应。Taylor等人发现成人健康女性的焦虑情绪与双歧杆菌数成反比；补充益生菌，同时接受适度的抵抗力训练对于老年人的认知及焦虑功能有显著改善；对于IBS患者以及精神分裂症患者，接受益生菌制剂的治疗后其焦虑情况均得到了好转。目前尚没有关于物质成瘾人群服用益生菌后心理状态变化的报导，但结合之前的研究可以得出益生菌可能对于成瘾者心理状态有调节作用的结论。
此外，将益生菌用于物质成瘾的治疗是物质成瘾研究的趋势。Leclercq等人提出，利用益生菌或益生元调节肠道微生物群是治疗酒精依赖的一种有前途和安全的方法。为了评估益生菌和/或益生元对酒精依赖的影响，尤其是对成瘾的不同行为方面，如抑郁、焦虑、压力反应、认知、冲动和药物寻求行为的影响，肯定需要进行前瞻性、随机、安慰剂对照的临床试验。而甲基苯丙胺成瘾与酒精成瘾的神经学机制类似，都是物质影响了人们的奖惩反应。
益生菌的施用已显示出作为改善与炎症性肠病(IBD)有关的症状的辅助疗法的功效。根据世界卫生组织的说法，益生菌被定义为“活微生物，当给予适量的微生物时，会对宿主产生健康益处。”这些细菌包括革兰氏阳性杆菌和双歧杆菌，以及一些大肠杆菌菌株，已显示出多种有益作用，例如调节宿主免疫系统，改善上皮屏障功能以及影响肝细胞的平衡。肠道中的各种细菌菌株。
将益生菌分离的膜泡(MVs)加载到微粒表面形成益生菌模拟物(PBMs)，可克服MVs在胃肠道的稀释效应和降解效应，提高MVs的递送浓度。并证明PBMs具有抗炎作用，且缓解炎症引起的肠道屏障功能丧失，具有进一步发展成为抗炎制剂的潜力。
益生菌具有广阔的发展前景，但由于它们具有增生能力，因此仍不总是适合用作治疗剂。特别是对于长期使用免疫抑制剂治疗IBD的患者，不建议同时使用益生菌，因为它会导致菌血症和败血症。一项研究报告说，大肠杆菌Nissle1917(通常用作益生菌的一种菌株)具有与其他大肠杆菌中检测到的致病性相同的基因。一旦这些沉默基因被未知触发物激活，它们可能会在患者中引起致病作用，从而大大限制了益生菌的安全性。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：益生菌对于长期使用免疫抑制剂治疗IBD的患者，会导致菌血症和败血症；同时大肠杆菌具有与其他大肠杆菌中检测到的致病性相同的基因，一旦这些沉默基因被未知触发物激活，它们可能会在患者中引起致病作用，从而大大限制了益生菌的安全性。
解决以上问题及缺陷的难度为：由于益生菌存在的增生能力，因此总是不适合用作治理剂，特别是长期使用免疫抑制治疗剂IBD的患者，使用益生菌会导致菌血症和败血症。使用益生菌则需考虑到其增生能力且不能和别的细菌同时使用，而且还需高效快速的将模拟物递送，不影响别的细菌且高效是本技术所解决问题的难度所在。
解决以上问题及缺陷的意义为：益生菌模拟物制备技术首次将MVs耦连到微粒表面上，这是一种新型的模拟细菌系统，不仅如此，益生菌模拟物在制备过程中也证明了乳杆菌在液体培养中产生大量MV的能力，这对扩大模拟物制备规模提供了便利。在悬浮液中生长的细菌可以用更大的容器培养，例如发酵罐等，这也可以很容易的增加MV的产量。益生菌模拟物的制备发掘除了仿生仿制药的巨大潜力，在未来的研究中可以进一步开发仿生药物的新型治疗剂。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种益生菌模拟物及其制备方法。本发明通过制备益生菌模拟物，作为一种抗炎制剂，来改善炎症引起的肠道屏障功能丧失，以此对甲基苯丙胺产生戒断作用，帮助吸毒人员戒毒。
本发明是这样实现的，一种益生菌模拟物制备方法，所述益生菌模拟物制备方法，包括：
步骤一，在补充胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养CaCo-2HTB-37细胞；
步骤二，在Caco-2 HTB-37细胞第30±10代时，进行TEER的测量；
步骤三，根据干酪乳杆菌和植物乳杆菌的选择培养条件，进行细胞培养；细菌的显微图像在图S1(支持信息)中找到；
步骤四，生长48小时后，进行中压隔离；细菌培养物通过离心去除残留细菌，将含EV的上清液通过聚偏二氟乙烯膜进行过滤；将上清液转移至超速离心管中离心，弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS中；
步骤五，悬浮的沉淀物通过装有Sepharose CL-2B的SEC柱纯化，收集1mL的级分，通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度；
步骤六，将醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用高纯水洗涤三次，然后重悬于高纯水中；将MV悬浮液与纯化珠和PBS混合，进行MV包覆微粒的制备。
进一步，所述步骤一中，胎牛血清为Dulbecco改良的Eagle培养基10％，其中培养基中1％非必需氨基酸混合物。
进一步，所述步骤一中，培养CaCo-2 HTB-37细胞后期管理为：每2-3天向细胞补充新鲜培养基，一周后，当细胞达到80-90％汇合时，将其分裂；THP-1细胞悬浮于RPMI-1640培养基中；每3-4天后，将2.5mL细胞悬液转移至10mL培养基中。
进一步，所述步骤一中，在TEER的测量测定之前，将THP-1细胞离心并重新分散在含有佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(7.5ng mL)的培养基中，并以每孔1×10细胞的密度接种到96孔板中；然后允许细胞分化24小时以进行存活力测试，并分化48小时以进行细胞因子测定。
进一步，所述步骤二中，TEER的测量具体过程为：将第30±10代中的Caco-2HTB-37细胞以每孔2×10细胞的密度播种在Corning Transwell插入物上；然后使细胞在37℃和5％CO下生长11d，每2-3天更换一次培养基(顶室500μL，基底外侧室1500μL)；11-12d后，在每个孔中测量TEER(t＝0)；
随后，将培养基吸到根尖腔中，并添加250μL新鲜培养基，其中补充了来自大肠杆菌的LPS(10μg mL)和250μL样品(微粒或EV悬浮液)中加入；使用EVOM测量TEER值3和6小时后；然后，收集上清液以定量细胞因子。
进一步，所述大肠杆菌为：0111：B4，经γ射线辐照，BioXtra，适用于细胞培养的Sigma-Aldrich；样品为微粒或EV悬浮液。
进一步，所述步骤三中，干酪乳杆菌在deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上在Ecotron HT恒温箱中于37℃下在微需氧条件下培养5d；
从该库存(储存在4℃下)中接种液体培养物，将一个菌落转移到100mL deMan-RogosaSharpe液体培养基中，使培养物在37℃下生长48小时；
植物乳杆菌在EcoMan HT孵化器中，于deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上于30℃下培养5d；从该储备板(储存于4℃)中；
使用一个菌落将液体培养物接种到100mL deMan-RogosaSharpe液体培养基中，使培养物在30℃下生长48小时。
进一步，所述步骤四中，中压隔离具体过程为：生长48小时后，将细菌培养物以9500×g离心5分钟以去除残留细菌；接下来，将含EV的上清液通过0.45μm聚偏二氟乙烯膜过滤；然后将上清液转移至超速离心管中，并在4℃下以100000×g离心2h；弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS(400μL)中；
悬浮的沉淀物通过装有35mL Sepharose CL-2B的SEC柱纯化；收集1mL的级分；通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度。
进一步，所述步骤六中，MV包覆微粒的制备过程为：将500μL的4μm醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用1mL高纯水洗涤三次，重悬于500μL高纯水中；
将300μL MV悬浮液与10μL纯化珠和690μL PBS混合，使用氢氧化钠溶液和盐酸将混合物调节至所需的pH值pH＝5和pH＝7，并在室温(RT)摇动(300rpm)下温育16h，使赖氨酸基团MV的表面蛋白质与微粒表面的醛基反应；
通过2500×g离心纯化微粒在4℃下反应5分钟，用1mL PBS交换上清液；洗涤程序重复两次；在洗涤步骤之后，将PBM重悬于1mL无菌过滤的PBS中。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述的益生菌模拟物制备方法制备的益生菌模拟物，本质是利用益生菌所具有的治疗肠道炎性疾病的巨大潜力来实现对甲基苯丙胺的戒断作用。所述益生菌模拟物通过利用醛基官能化将益生菌分离出的膜泡耦连到微粒表面，构成益生菌模拟微生物。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明中的制备方法可实现MVs的高浓度递送，发明制备的PBMs作为一种抗炎制剂，显著降低促炎性TNF-α(降低86％)，而原始MVs不能；PBMs能改善炎症引起的肠道屏障功能丧失，通过此方法可以实现对甲基苯丙胺的戒断作用，从而对戒毒产生积极影响。本发明制备所采用的的益生菌在液体中培养的乳杆菌产生大量的MVs，对其大小、蛋白质内容、形态进行观测之后发现，MVs对巨噬细胞系dTHP-1和肠细胞系Caco-2无毒，可作为治疗药物进一步开发。本发明所采取的醛基官能化将益生菌分离出的膜泡(MVs)耦连到微粒表面，由此构成益生菌模拟微生物(PBMs)可以实现而原始MVs的高浓度递送。本发明的益生菌模拟微生物作为一种抗炎制剂，可以显著降低促炎性TNF-α(降低86％)，而原始MVs不能。传统的益生菌囊泡不是最佳的给药方式，因为它们的体积小，在给药后很容易被清除，并且在口服时易于在胃肠道中快速稀释。而本发明的PBMs则会弥补这些缺点，它们将富集在肠粘膜的顶膜上，而不是像大小相似的微粒那样迅速被清除。这可能导致发生炎症的粘膜细胞上的MV浓度增加。此外，已经提出了所开发的不扩散系统具有实质性的安全优势，并且可以用于包括免疫功能低下的患者在内的多种患者中。“仿生药物”代表了一种独特而新颖的策略，将功能性生物材料与固有活性的MV结合在一起，以靶向自身免疫性炎症。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的益生菌模拟物制备方法流程图。
具体实施方式
本发明的创新理念是首次采用了对巨噬细胞样dTHP-1和肠细胞样Caco-2细胞系无毒的MV，并用全新的方法根据醛基官能团将MVs结合到微粒表面上，以获得仿生菌，因此进一步发展为抗炎剂。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种益生菌模拟物及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的益生菌模拟物制备方法，包括：
S101：在补充胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养CaCo-2HTB-37细胞。
S102：在Caco-2 HTB-37细胞第30±10代时，进行TEER的测量。
S103：根据干酪乳杆菌和植物乳杆菌的选择培养条件，进行细胞培养；细菌的显微图像在图S1(支持信息)中找到。
S104：生长48小时后，进行中压隔离；细菌培养物通过离心去除残留细菌，将含EV的上清液通过聚偏二氟乙烯膜进行过滤；将上清液转移至超速离心管中离心，弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS中。
S105：悬浮的沉淀物通过装有Sepharose CL-2B的SEC柱纯化，收集1mL的级分，通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度。
S106：将醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用高纯水洗涤三次，然后重悬于高纯水中；将MV悬浮液与纯化珠和PBS混合，进行MV包覆微粒的制备。
本发明实施例提供的S101中，胎牛血清为Dulbecco改良的Eagle培养基10％，其中培养基中1％非必需氨基酸混合物。
本发明实施例提供的S101中，培养CaCo-2 HTB-37细胞后期管理为：每2-3天向细胞补充新鲜培养基，一周后，当细胞达到80-90％汇合时，将其分裂；THP-1细胞悬浮于RPMI-1640培养基中；每3-4天后，将2.5mL细胞悬液转移至10mL培养基中。
本发明实施例提供的S101中，在TEER的测量测定之前，将THP-1细胞离心并重新分散在含有佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(7.5ng mL)的培养基中，并以每孔1×10细胞的密度接种到96孔板中；然后允许细胞分化24小时以进行存活力测试，并分化48小时以进行细胞因子测定。
本发明实施例提供的S102中，TEER的测量具体过程为：
将第30±10代中的Caco-2 HTB-37细胞以每孔2×10细胞的密度播种在CorningTranswell插入物上；然后使细胞在37℃和5％CO下生长11d，每2-3天更换一次培养基(顶室500μL，基底外侧室1500μL)；11-12d后，在每个孔中测量TEER(t＝0)；
随后，将培养基吸到根尖腔中，并添加250μL新鲜培养基，其中补充了来自大肠杆菌的LPS(10μg mL)和250μL样品(微粒或EV悬浮液)中加入。使用EVOM测量TEER值3和6小时后；然后，收集上清液以定量细胞因子。
所述大肠杆菌为：0111：B4，经γ射线辐照，BioXtra，适用于细胞培养的Sigma-Aldrich；样品为微粒或EV悬浮液。
本发明实施例提供的S103中，干酪乳杆菌在deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上在Ecotron HT恒温箱中于37℃下在微需氧条件下培养5d；
从该库存(储存在4℃下)中接种液体培养物，将一个菌落转移到100mL deMan-RogosaSharpe液体培养基中，使培养物在37℃下生长48小时。
本发明实施例提供的S103中，植物乳杆菌在EcoMan HT孵化器中，于deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上于30℃下培养5d。从该储备板(储存于4℃)中；
使用一个菌落将液体培养物接种到100mL deMan-RogosaSharpe液体培养基中，使培养物在30℃下生长48小时。
本发明实施例提供的S104中，中压隔离具体过程为：生长48小时后，将细菌培养物以9500×g离心5分钟以去除残留细菌；接下来，将含EV的上清液通过0.45μm聚偏二氟乙烯膜(Stericup-HV 150mL Durapore PVDF 0.45滤瓶，德国达姆施塔特默克)过滤；然后将上清液转移至超速离心管中，并在4℃下以100000×g离心2h；弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS(400μL)中。
本发明实施例提供的S105中，悬浮的沉淀物通过装有35mL Sepharose CL-2B的SEC柱(德国不伦瑞克GE Healthcare)纯化。收集1mL的级分。通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度。
本发明实施例提供的S106中，MV包覆微粒的制备过程为：将500μL的4μm醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用1mL高纯水洗涤三次，重悬于500μL高纯水中；
将300μL MV悬浮液与10μL纯化珠和690μL PBS混合，使用氢氧化钠溶液和盐酸将混合物调节至所需的pH值pH＝5和pH＝7，并在室温(RT)摇动(300rpm)下温育16h，使赖氨酸基团MV的表面蛋白质与微粒表面的醛基反应；
通过2500×g离心纯化微粒在4℃下反应5分钟，用1mL PBS交换上清液。洗涤程序重复两次；在洗涤步骤之后，将PBM重悬于1mL无菌过滤的PBS中。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明所用菌种干酪乳杆菌和植物乳杆菌，(干酪乳杆菌编号为H1410，植物乳杆菌编号为JI22133)购买于信阳市中检计量生物科技有限公司。
1、细胞培养
在补充了10％胎牛血清(FCS)(Gibco，Waltham，MA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Gibco，Waltham，MA)中培养CaCo-2 HTB-37(ATCC，Manassas，VA)细胞。1％非必需氨基酸混合物(马萨诸塞州沃尔瑟姆市的Gibco)。每2-3天向细胞补充新鲜培养基。一周后，当细胞达到80-90％汇合时，将其分裂。THP-1(DSMZ，不伦瑞克，德国)细胞悬浮于RPMI-1640(Gibco，Waltham，MA)培养基中。每3-4天后，将2.5mL细胞悬液转移至10mL培养基中。为了进行测定，将THP-1细胞离心并重新分散在含有佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(7.5ng mL)的培养基中，并以每孔1×10细胞的密度接种到96孔板中。然后允许细胞分化24小时以进行存活力测试，并分化48小时以进行细胞因子测定。
2、TEER的测量
将第30±10代中的Caco-2 HTB-37细胞以每孔2×10细胞的密度播种在CorningTranswell插入物上。然后使细胞在37℃和5％CO下生长11d。每2-3天更换一次培养基(顶室500μL，基底外侧室1500μL)。11-12d后，在每个孔中测量TEER(t＝0)。随后，将培养基吸到根尖腔中，并添加250μL新鲜培养基，其中补充了来自大肠杆菌(0111：B4，经γ射线辐照，BioXtra，适用于细胞培养的Sigma-Aldrich)的LPS(10μg mL)(密苏里州圣路易斯)和250μL样品(微粒或EV悬浮液)中加入。使用EVOM测量TEER值3和6小时后(世界精密仪器公司，佛罗里达州萨拉索塔)。然后，收集上清液以定量细胞因子。
3、细菌培养
干酪乳杆菌(DSMZ，不伦瑞克，德国)在deMan-Rogosa-Sharpe琼脂(Carl RothGmbH+Co.KG，德国卡尔斯鲁厄)上在Ecotron HT恒温箱中于37℃下在微需氧条件下培养5d。瑞士巴塞尔)。从该库存(储存在4℃下)中接种液体培养物，将一个菌落转移到100mLdeMan-RogosaSharpe液体培养基中。使培养物在37℃下生长48小时。植物乳杆菌(NCIMB，阿伯丁，英国)在EcoMan HT孵化器(infors，巴塞尔，瑞士)中，于deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上于30℃下培养5d。从该储备板(储存于4℃)中，使用一个菌落将液体培养物接种到100mLdeMan-RogosaSharpe液体培养基中。使培养物在30℃下生长48小时。对于两种菌株，根据供应商给出的说明选择培养条件。细菌的显微图像可以在图S1(支持信息)中找到。
4、中压隔离
生长48小时后，将细菌培养物以9500×g离心5分钟以去除残留细菌。接下来，将含EV的上清液通过0.45μm聚偏二氟乙烯膜(Stericup-HV 150mL Durapore PVDF 0.45滤瓶，德国达姆施塔特默克)过滤。然后将上清液转移至超速离心管中，并在4℃下以100000×g离心2h。然后，弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS(400μL)中。悬浮的沉淀物通过装有35mL Sepharose CL-2B的SEC柱(德国不伦瑞克GE Healthcare)纯化。收集1mL的级分。通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度。
5、MV包覆微粒的制备
将500μL的4μm醛/硫酸盐乳胶珠(Invitrogen，Waltham，MA)悬浮液用1mL高纯水(MilliQ质量)洗涤三次，然后重悬于500μL高纯水中。接下来，将300μL MV悬浮液(通过方法优化找到的量)与10μL纯化珠和690μL PBS混合。然后使用氢氧化钠溶液和盐酸将混合物调节至所需的pH值pH＝5和pH＝7，并在室温(RT)摇动(300rpm)下温育16h，使赖氨酸基团MV的表面蛋白质与微粒表面的醛基反应。然后通过2500×g离心纯化微粒在4℃下反应5分钟，然后用1mL PBS交换上清液。洗涤程序重复两次。在洗涤步骤之后，将PBM重悬于1mL无菌过滤的PBS中。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种益生菌模拟物制备方法，其特征在于，所述益生菌模拟物制备方法包括：
在补充胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养CaCo-2 HTB-37细胞；
进行TEER的测量；
根据干酪乳杆菌和植物乳杆菌的选择培养条件，进行细胞培养；
进行中压隔离；细菌培养物通过离心去除残留细菌，将含EV的上清液通过聚偏二氟乙烯膜进行过滤；将上清液转移至超速离心管中离心，弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS中；
悬浮的沉淀物通过装有Sepharose CL-2B的SEC柱纯化，收集1mL的级分，通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度；
将醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用高纯水洗涤，然后重悬于高纯水中；将MV悬浮液与纯化珠和PBS混合，进行MV包覆微粒的制备。
2.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，胎牛血清为Dulbecco改良的Eagle培养基10％，其中培养基中1％非必需氨基酸混合物。
3.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，培养CaCo-2HTB-37细胞后期管理为：每2-3天向细胞补充新鲜培养基，一周后，当细胞达到80-90％汇合时，将其分裂；THP-1细胞悬浮于RPMI-1640培养基中；每3-4天后，将2.5mL细胞悬液转移至10mL培养基中。
4.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，在TEER的测量测定之前，将THP-1细胞离心并重新分散在含有佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯7.5ng mL的培养基中，并以每孔1×10细胞的密度接种到96孔板中；然后允许细胞分化24小时以进行存活力测试，并分化48小时以进行细胞因子测定。
5.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，在Caco-2 HTB-37细胞第30±10代时，进行TEER的测量，TEER的测量具体过程为：将第30±10代中的Caco-2 HTB-37细胞以每孔2×10细胞的密度播种在Corning Transwell插入物上；然后使细胞在37℃和5％CO下生长11d，每2-3天更换一次培养基，顶室500μL，基底外侧室1500μL；11-12d后，在每个孔中测量TEER，t＝0；
随后，将培养基吸到根尖腔中，并添加250μL新鲜培养基，其中补充了来自大肠杆菌的LPS，10μg mL和250μL样品中加入；使用EVOM测量TEER值3和6小时后；收集上清液以定量细胞因子。
6.如权利要求5所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为：0111：B4，经γ射线辐照，BioXtra，适用于细胞培养的Sigma-Aldrich；样品为微粒或EV悬浮液。
7.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，干酪乳杆菌在deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上在Ecotron HT恒温箱中于37℃下在微需氧条件下培养5d；
从该库存中接种液体培养物，将一个菌落转移到100mL deMan-RogosaSharpe液体培养基中，使培养物在37℃下生长48小时；
植物乳杆菌在EcoMan HT孵化器中，于deMan-Rogosa-Sharpe琼脂上于30℃下培养5d；从该储备板中；
使用一个菌落将液体培养物接种到100mL deMan-RogosaSharpe液体培养基中，使培养物在30℃下生长48小时。
8.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，压隔离具体过程为：生长48小时后，将细菌培养物以9500×g离心5分钟以去除残留细菌；接下来，将含EV的上清液通过0.45μm聚偏二氟乙烯膜过滤；然后将上清液转移至超速离心管中，并在4℃下以100000×g离心2h；弃去上清液，并将沉淀重新分散在过滤的PBS中；
悬浮的沉淀物通过装有35mL Sepharose CL-2B的SEC柱纯化；收集1mL的级分；通过纳米颗粒跟踪分析测量了用于实验的馏分的颗粒浓度。
9.如权利要求1所述益生菌模拟物制备方法，其特征在于，所述步骤六中，MV包覆微粒的制备过程为：将500μL的4μm醛/硫酸盐乳胶珠悬浮液用1mL高纯水洗涤三次，重悬于500μL高纯水中；
将300μL MV悬浮液与10μL纯化珠和690μL PBS混合，使用氢氧化钠溶液和盐酸将混合物调节至所需的pH值pH＝5和pH＝7，并在室温摇动下温育16h，使赖氨酸基团MV的表面蛋白质与微粒表面的醛基反应；
通过2500×g离心纯化微粒在4℃下反应5分钟，用1mL PBS交换上清液；洗涤程序重复两次；在洗涤步骤之后，将PBM重悬于1mL无菌过滤的PBS中。
10.一种利用如权利要求1～9任意一项所述的益生菌模拟物制备方法制备的益生菌模拟物，其特征在于，所述益生菌模拟物通过利用醛基官能化将益生菌分离出的膜泡耦连到微粒表面，构成益生菌模拟微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011576802.9A CN112553125A (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种益生菌模拟物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011576802.9A CN112553125A (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种益生菌模拟物及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112553125A true CN112553125A (zh) | 2021-03-26 |
Family
ID=75033754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011576802.9A Pending CN112553125A (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种益生菌模拟物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112553125A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080206211A1 (en) * | 2007-02-26 | 2008-08-28 | L'oreal | Composition containing a cell culture medium |
| CN112063541A (zh) * | 2019-06-11 | 2020-12-11 | 大江生医股份有限公司 | 一种加氏乳杆菌tci515或其代谢产物用于制备免疫调节组合物的用途 |
-
2020
- 2020-12-28 CN CN202011576802.9A patent/CN112553125A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080206211A1 (en) * | 2007-02-26 | 2008-08-28 | L'oreal | Composition containing a cell culture medium |
| CN112063541A (zh) * | 2019-06-11 | 2020-12-11 | 大江生医股份有限公司 | 一种加氏乳杆菌tci515或其代谢产物用于制备免疫调节组合物的用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| THOMAS KUHN等: "Probiomimetics-Novel Lactobacillus-Mimicking Microparticles Show Anti-Inflammatory and Barrier-Protecting Effects in Gastrointestinal Models", 《SMALL》 * |
| 刘蕾等: "益生菌生物被膜的研究进展", 《食品科学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113234640B (zh) | 一株长双歧杆菌mf-269及其应用 | |
| CN111560330B (zh) | 一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌及应用 | |
| WO2022110726A1 (zh) | 副干酪乳杆菌k56提升肠道细菌感染抗性和肠道免疫力的应用 | |
| CN114085792B (zh) | 一种用于防治结肠癌的副干酪乳杆菌及其应用 | |
| CN110628663B (zh) | 一株鼠李糖乳杆菌及其高密度培养方法和应用 | |
| WO2024061169A1 (zh) | 普雷沃氏菌在防治注意缺陷多动障碍中的应用 | |
| JP4527922B2 (ja) | 非病原性乳酸菌の催眠活性 | |
| TW202034776A (zh) | 長雙歧桿菌長亞種、含其的組合物及用途 | |
| CN112625979A (zh) | 一种对抗幽门螺杆菌的干酪乳杆菌及其应用 | |
| CN113215035A (zh) | 长双歧杆菌和动物双歧杆菌的制备及其在抗衰老方面的应用 | |
| CN110846253A (zh) | 一株能提高人体免疫力的乳双歧杆菌jybr-190及其在食品、药品中的应用 | |
| CN110959867A (zh) | 母乳化的复合益生菌微胶囊粉及其制备方法和应用 | |
| CN113881597B (zh) | 一株能够提高吲哚丙烯酸以调节特异性IgE的罗伊氏乳杆菌 | |
| CN113337428B (zh) | 一株植物乳杆菌hnu082及其用途 | |
| WO2019051790A1 (zh) | 单形巨单胞菌(Megamonas funiformis)及其应用 | |
| CN115029260A (zh) | 一种具有抗炎及抗氧化特性的格氏乳杆菌及应用 | |
| CN113337440A (zh) | 一株唾液乳杆菌mg-587及其应用 | |
| CN115873753B (zh) | 具有缓解特发性震颤和睡眠障碍功能的植物乳杆菌l5及其应用 | |
| CN112553125A (zh) | 一种益生菌模拟物及其制备方法 | |
| WO2017020783A1 (zh) | 脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用 | |
| KR20130049554A (ko) | 아토피 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN113897300B (zh) | 一株具有改善皮肤屏障功能损伤与皮肤敏感的动物双歧杆菌 | |
| RU2505304C2 (ru) | Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы | |
| CN114621898B (zh) | 肠膜明串珠菌及其用于制备抑制牙龈卟啉单胞菌的口腔护理用品、药品 | |
| CN115786175B (zh) | 一株粘膜乳杆菌及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210326 |