CN112553087A - 一株可快速降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可快速降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉及其应用，属于微生物领域。本发明通过对原始黑曲霉进行定向诱变，筛选出了一株能够有效降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉。所述菌株与玉米赤霉烯酮结合速度快，降解效率高，可在28h内降解95％以上的玉米赤霉烯酮，使用较低的量可达到较高的降解效果，降解同样浓度的玉米赤霉烯酮，为原始菌株用量的1/10，且所述菌株为食品级菌株，可以用于实现玉米、大麦等谷物中玉米赤霉烯酮的降解。

Description

一株可快速降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉及其应用
技术领域
本发明涉及一株可快速降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉及其应用，属于微生物领域。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一类污染范围广，具有类雌激素活性的镰刀菌属真菌毒素。ZEN在世界范围内能广泛污染玉米、谷物等粮食作物，不仅给食品和饲料行业带来巨大的经济损失，还可以通过食物链在动物体或人体中积累，进而引起动物或人等发生急性中毒和慢性中毒。许多研究表明，玉米赤霉烯酮不但能引起人和动物生殖系统紊乱，还具有较强的免疫毒性、细胞毒性以及肝毒性，且可通过污染的农作物进入到食物链中，长期食用被其污染的食品还可能引发癌症，这严重威胁着动物和人类的健康。
此前已有研究表明，黑曲霉对于ZEN毒素具有较好的降解作用。但是目前用于降解ZEN的黑曲霉菌株虽然对于ZEN降解有较高的降解率，但是需要长时间的作用才能达到极高的降解率，短时间内降解效果非常不理想。根据此前的研究，发现了能够完全降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉菌株，若按照1×107CFU/mL的孢子悬液1-2％的接种量接种并培养后，该培养物能在3-5天内才能对玉米赤霉烯酮达到比较好的降解效果，但是作用时间过长不利于原料的保存。因此需要通过诱变方法来改变黑曲霉性状，使其在较短时间内降解原料中的玉米赤霉烯酮。
发明内容
本发明获得了一株可以在28h内，对玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率达到95％以上的黑曲霉(FS-10-YJ)，同时菌株添加量可以由1×107CFU/mL降低至1×106CFU/mL。
本发明提供了一株黑曲霉(Aspergillus niger)，已于2020年10月22日保存于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.20745。
本发明提供了一种降解玉米赤霉烯酮的方法，利用所述黑曲霉降解玉米赤霉烯酮。
在一种实施方式中，所述菌株的浓度不低于103CFU/mL。
在一种实施方式中，在25-30℃下培养。
在一种实施方式中，培养时的转速为150-250rpm。
在一种实施方式中，反应时间不少于16h。
本发明提供了一种制备含有所述黑曲霉的孢子悬液的方法，所述方法是将所述黑曲霉加入培养基中，在25-30℃下培养。
在一种实施方式中，所述培养基包括PDA和PDB培养基。
在一种实施方式中，培养结束后挑取至盐水中，制成孢子悬液。
本发明提供了所述黑曲霉在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮来源于谷物，所述谷物包括玉米、小麦、大米、大麦、小米、荞麦、高粱和燕麦。
本发明的有益效果：
1.黑曲霉(FS-10-YJ)与玉米赤霉烯酮结合速度快，降解效率高，可在28h内降解95％以上的玉米赤霉烯酮；
2.黑曲霉(FS-10-YJ)使用较低的量可达到较高的降解效果，降解同样浓度的ZEN，为原黑曲霉用量的1/10；
3.黑曲霉属于食品级微生物，具有较高的食品安全性，可以实现真菌毒素的生物高效降解。
生物材料保藏
本发明所提供的黑曲霉，分类命名为黑曲霉Aspergillus niger，已于2020年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20745，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为筛选过程中降解率比较图。
图2为黑曲霉降解ZEN动态变化图。
具体实施方式
下述实施例中的出发菌株黑曲霉FS-Z1公开于授权公告号为CN103937681B的专利文献中。
实施例1：突变黑曲霉的获得
诱变步骤：
诱变方法：采用高浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对黑曲霉FS-Z1进行24h刺激诱变，并循环5次，比较各代的降解率进行筛选，选取降解率最高的即为FS-10-YJ。
1、准备无菌培养皿，在无菌操作台内(点燃台内酒精灯)倒入PDA培养基，培养基量超过培养皿容量一半，制备5个空白平板。待其凝固后，进行倒置。
2、吸取冷冻管内菌液(黑曲霉FS-Z1)0.25mL于PDA平板上，利用涂布器涂布均匀，在28℃培养箱内培养2-3d。
3、待平板上长出黑曲霉，用棉签刮取孢子，在灭过菌的生理盐水中润洗，制作成菌孢子悬液，调节浓度为106CFU/mL。
4、将调节好浓度的黑曲霉孢子悬液分装于2个20mL离心管中，每个离心管中孢子悬浮液10mL。
6、将每个离心管中加入纯ZEN毒素(2500ppm)8μL。
7、将离心管放入28℃，180rpm的摇床中摇床培养24h。
8、PDA培养基灭菌，随后凝固后倒平板静置。
9、吸取含有毒素的孢子悬液1mL接种于平板上，加入1mL的毒素并涂布均匀。平板放入28℃培养箱中培养5天。
10、重复3-9步骤5次，可得到第五代诱变菌株，从中挑选ZEN降解率最高的菌株，将菌株送至公司测序。
培养条件：PDA培养基，生理盐水(加0.05％吐温80)，无菌离心管若干，无菌操作台，无菌棉签，无菌涂布器，真菌恒温培养箱，微生物培养摇床，FS10黑曲霉悬液。
将测序结果在NCBI数据库中进行比对分析，发现与黑曲霉基因同源率高达99％，因此，得到的诱变菌株为黑曲霉，故将其命名为黑曲霉FS-10-YJ，并送至保藏中心保藏。
实施例2：黑曲霉FS-10-YJ降解ZEN
降解PDB培养基中500ppb的ZEN毒素。
1、配制PDB培养基20mL于真菌培养瓶中，加入ZEN毒素，并控制培养基中毒素含量为500ppb，共培养60h；
2、加入诱变黑曲霉孢子悬液，并控制培养基中孢子浓度为103、104、105、106CFU/mL；
3、将培养瓶放入28℃，180rpm的真菌摇床中培养，每隔4h，取出相应样品，利用氯仿进行提取，并采用高效液相色谱进行毒素含量检测。
高效液相色谱条件：
高效液相色谱种类：Agilent Technologies 1260infinity；
色谱柱：C18柱，柱长：150mm，内径：4.6mm，黏度：4μm；
流动相：乙腈：水：甲醇＝46:46:8；
流速：1.0mL/min；
检测波长：激发光波长：274nm，发射波长：440nm。
4、降解率计算：(500-残余浓度)/500×100％。
表1不同孢子浓度下菌株的降解率
Figure BDA0002841137100000031
Figure BDA0002841137100000041
由表1可知，当孢子浓度达到105CFU/mL以上时，对于ZEN的降解率可达95％以上。
按照上述步骤，在100ppb、10ppm、100ppm的低、中、高三种浓度的ZEN中，分别加入106CFU/mL的菌株进行处理，每隔4小时取样一次，共培养60小时。
由图2可知，在100ppb、10ppm、100ppm的低、中、高三种毒素浓度中，该诱变黑曲霉都可以在28h内达到95％以上的降解率，由此证明该黑曲霉可以较快地降解真菌毒素。
实施例3：黑曲霉FS-10-YJ的传代稳定性
将该诱变黑曲霉进行PDA培养基平板涂板，传代5代，按照实施例2中方法(菌浓为106CFU/mL，ZEN浓度为1ppm)，利用黑曲霉FS-10-YJ处理ZEN溶液36h，测定反应后的降解率。由表2可知，本诱变黑曲霉在传代5代后，降解率可以稳定在95％以上，遗传稳定性较好。
表2黑曲霉FS-10-YJ的传代稳定性
第1代 第2代 第3代 第4代 第5代
ZEN降解率％ 95.24％ 96.84％ 95.16％ 96.84％ 96.84％
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株黑曲霉(Aspergillus niger)，已于2020年10月22日保存于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.20745。
2.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，利用权利要求1所述黑曲霉降解玉米赤霉烯酮。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌株的浓度不低于103CFU/mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在25-30℃下培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养时的转速为150-250rpm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应时间不少于16h。
7.一种制备含有权利要求1所述黑曲霉的孢子悬液的方法，其特征在于，将所述黑曲霉加入培养基中，在25-30℃下培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养结束后挑取至盐水中，制成孢子悬液。
9.权利要求1所述黑曲霉在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮来源于谷物，所述谷物包括玉米、小麦、大米、大麦、小米、荞麦、高粱和燕麦。
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