CN112546068B - 一种钛酸锰纳米材料用作模拟酶活性材料的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗癌纳米材料技术领域，提供了一种钛酸锰纳米材料，具有模拟酶活性，能够基于模拟酶活性以及多种模拟酶活性的级联反应以杀伤癌细胞，从而解决传统化学动力学疗法(chemodynamic Therapy,CDT)抗癌能力不足，癌细胞杀伤困难等诸多缺陷。

Description

一种钛酸锰纳米材料用作模拟酶活性材料的用途
技术领域
本发明属于抗癌纳米材料开发技术领域，涉及一种钛酸锰纳米材料基于模拟酶活性抗癌的用途。
背景技术
癌症，又称为恶性肿瘤，是指由于细胞的不正常增生，并带有侵犯身体的其他组织或器官的性质，由控制细胞增殖的相关机制失调而引起的一种疾病。对于人类而言，目前已知的癌症种类超过一百种，且长期以来一直被认为是无法治愈的疾病，极大危害了人类的生命安全与降低了人类的生活质量。目前对于癌症的临床疗法包括手术治疗、化疗与放疗等。手术治疗只能在早期对癌组织进行切除，但术后若干年仍有可能出现大面积复发与转移。化疗与放疗对癌细胞缺乏特异性，往往在杀伤癌细胞的同时杀伤正常细胞，给患者带来严重的副作用。由此，研究出一种对癌细胞有特异性杀伤且杀伤效率较高的抗癌材料迫在眉睫。
纳米材料是指在三维空间中，至少在一个维度上处于纳米尺寸(1～100nm)的材料。与常见的宏观材料不同，纳米尺寸为纳米材料提供了极大的表面与界面效应，这体现在其比表面积的增大与其表面活性位点的增多上。当抗癌材料达到纳米尺度时，可具有多种优势，例如更高的癌细胞杀伤效率、更低的材料使用量、更多的反应位点、生物相容易代谢等。因此，人类也致力于开发各种新型纳米材料并尝试应用于抗癌领域。
由于肿瘤微环境具有低氧、高浓度过氧化氢(H2O2)蓄积、还原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)的高表达与呈现弱酸性(pH＜7)等特征，这为人类提供了“对症下药”的治疗机会。近年来衍生出了以具有模拟酶活性的抗癌纳米材料来消耗肿瘤微环境中的高浓度的物质产生毒性的活性氧(reactive oxygen species,ROS)如羟基自由基(·OH)或超氧阴离子自由基(O2·-)杀伤癌细胞的化学动力学疗法。这种疗法的优势在于反应底物来源于肿瘤微环境中的各种内源性物质，在治疗过程中无需人为干预，且在纳米尺度下酶促反应速度更快，癌细胞杀伤率更高。目前已开发多种具有模拟过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、氧化酶(oxidase,OXD)等活性的抗癌纳米材料，然而它们对反应需要的环境pH值往往有严格要求，且微环境中反应底物如过氧化氢的浓度水平有限，消耗后无法及时补充，不能保证癌细胞杀伤的持续性，这在一定程度上限制了化学动力学疗法的疗效。
发明内容
针对现有的化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题，本发明目的在于，提供一种钛酸锰纳米材料用作模拟酶活性的材料并基于其优异的模拟酶活性杀伤肿瘤细胞的应用。
一种钛酸锰纳米材料的应用，将其用作模拟酶活性的材料。
本发明首次发现，钛酸锰纳米材料具有模拟酶活性。
作为优选，所述的应用，将其用作具有模拟过氧化物酶、模拟过氧化氢酶、模拟氧化酶中的至少一种模拟酶活性的材料。本发明研究发现，所述的钛酸锰纳米材料具有模拟过氧化物酶、模拟过氧化氢酶、模拟氧化酶中的至少一种模拟酶活性。
进一步优选，所述的应用，将其用作具有模拟过氧化物酶、模拟过氧化氢酶、模拟氧化酶中的两种或三种模拟酶级联反应活性的材料。本发明研究还发现，所述的钛酸锰纳米材料具有多种模拟酶活性，能够促使各模拟酶级联反应(串联反应)。
本发明中，将所述的钛酸锰纳米材料用作细胞内的模拟酶活性的材料；所述的细胞优选为肿瘤细胞。本发明研究发现，所述的钛酸锰纳米材料在细胞内能够模拟酶的作用。
本发明中，优选的钛酸锰纳米材料的应用方案，将其用于制备抗肿瘤的药物。
作为优选，将钛酸锰纳米材料用于制备基于肿瘤细胞中的模拟酶活性机制抗肿瘤的药物。本发明中，可以基于钛酸锰纳米材料的肿瘤细胞内的特异的所述的模拟酶活性，可以制备化学动力学疗法的抗癌纳米材料。
进一步优选，将钛酸锰纳米材料用于制备基于模拟过氧化物酶、模拟过氧化氢酶、模拟氧化酶中的两种或三种模拟酶级联反应机制抗肿瘤的药物。
本发明研究发现，钛酸锰纳米材料能够选择性地在肿瘤细胞的环境中激发所述的模拟酶活性特别是能够激发多种模拟酶活性的级联反应，能够有效杀伤肿瘤细胞；可以用于制备抗肿瘤药物。本发明研究发现，基于该应用，意外地发现所述的钛酸锰纳米材料具有较高生物相容性，易于进行生物代谢，无明显毒性，且对于实体肿瘤具备优异的消融能力。
例如，本发明所述的钛酸锰纳米材料，意外地具有多种模拟酶活性，具体表现为类过氧化氢酶、类过氧化物酶与类氧化酶活性。因此，本发明所述的抗癌纳米材料能够意外地通过在肿瘤微环境中形成多种模拟酶级联反应，解决化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题，反应机理如下：
2H2O2+Mn(II)+2H+→2·OH+Mn(IV)+2H2O (a)
H2O2+Mn(IV)→Mn(II)·O2H+H+ (b)
H2O2+Mn(II)·O2H→·OH+Mn(II)+O2+H2O (c)
Mn(II)+2O2→Mn(IV)+2O2·- (d)
GSH+O2·-→GS-+HO2· (e)
2GS-+Mn(IV)→GSSG+Mn(II) (f)
2GSH+2HO2·→GSSG+2H2O2 (g)
反应式(a)是本发明所述的钛酸锰纳米材料类过氧化物酶酶促反应过程，反应式(b)、(c)是本发明所述的钛酸锰纳米材料类过氧化氢酶酶促反应过程，反应式(d)～(g)是本发明所述的钛酸锰纳米材料类氧化酶酶促反应过程。本发明研究发现，基于该过程，意外地发现肿瘤内部蓄积的过氧化氢可以通过钛酸锰纳米材料进行消耗，产生毒性的羟基自由基，起化学动力学疗法作用杀伤癌细胞。与此同时，也意外地发现过氧化氢可以通过钛酸锰纳米材料再生，弥补最初过程过氧化氢的消耗，从而不断产生毒性的羟基自由基，意外地解决化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题。更重要的是，本发明所述的抗癌纳米材料可供静脉注射，具有较高生物相容性，易于进行生物代谢，无明显毒性，对于实体肿瘤具备优异的消融能力。
本发明中，能够被细胞捕获的纳米尺寸的钛酸锰材料理论上均可用作模拟酶材料，实现细胞内模拟酶活性的作用。
作为优选，所述的钛酸锰纳米材料为二维钛酸锰纳米片。
本发明研究发现，所述的二维钛酸锰纳米片，基于材料的成分及结构形貌控制，具有更优的多种模拟酶活性，且能够意外地通过在肿瘤微环境中形成多种模拟酶级联反应，解决化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题。不仅如此，本发明所述的材料还具有较高生物相容性，易于进行生物代谢，无明显毒性，可以通过静脉注射而起到优异的抗癌活性。
作为优选，所述的钛酸锰纳米片处于纳米二维尺度，其二维平面呈现近似圆形的形貌，平面直径为150～300nm，进一步优选为180nm；
优选地，所述的钛酸锰纳米片厚度为10～30nm，进一步优选为20nm。
本发明还提供了一种二维钛酸锰纳米片，包括以下制备步骤：
步骤(1)：将包含钛酸源、醇源的溶液进行混合，搅拌形成溶液A；将包含锰源、胺源的溶液进行混合，搅拌形成溶液B；将溶液A与溶液B按照钛原子与锰原子一定的摩尔比例进行混合，搅拌形成溶液C；
步骤(2)：向溶液C中加入超纯水后进行一定条件下的溶剂热反应，即得所述的二维钛酸锰纳米片。
本发明研究发现，通过上述步骤(1)～步骤(2)，可以实现材料成分及结构形貌控制，可以制得具有多种模拟酶活性级联反应功能的二维钛酸锰纳米片；能够解决化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题。
本发明中，所述的钛酸源为钛酸酯；优选为钛酸四乙酯、钛酸四异丙酯、钛酸四正丁酯中的至少一种；
优选地，所述的醇源为二元醇，优选为乙二醇，1,3-丙二醇，1,4-丁二醇中的至少一种；
优选地，所述的锰源为二价锰离子(Mn2+)盐，优选为四水合氯化锰、一水合硫酸锰、四水合硝酸锰中的至少一种；
优选地，所述的胺源为二元胺，优选为乙二胺，1,3-丙二胺，1,4-丁二胺中的至少一种。
优选地，将包含钛酸源、醇源的溶液进行混合，搅拌形成溶液A；将包含锰源、胺源的溶液进行混合，搅拌形成溶液B；将溶液A与溶液B按照钛原子与锰原子1:2或1:1或2:1的摩尔比例进行混合，进一步优选为1:1。
本发明步骤(1)中，所述的成分与原料混合方式的控制是成功制备二维钛酸锰纳米片的前提，准确原子比例的投料能得到最高的产品产率，同时有效实现并改善多种模拟酶级联活性。
本发明中，将包含钛酸源、醇源的溶液进行混合，搅拌形成溶液A，实质上是将其中的钛原子转化为钛的二元醇络合物(即溶液A为溶解有二元醇钛的络合物的二元醇溶液)，从而避免了钛酸酯易于被空气中的水蒸气水解失效的问题。本发明研究发现，基于该机制，能够意外地解决钛酸酯易于被空气中的水蒸气水解失效的问题，提高体系稳定性，减少副反应，且利于后续反应的顺利进行。
作为优选，本发明中，所述的二元醇的实际用量高于其将钛酸酯完全络合的理论用量。
本发明中，将包含锰源、胺源的溶液进行混合，搅拌形成溶液B，实质上是将其中的锰原子转化为锰的二元胺络合物(即溶液B为溶解有二元胺锰的络合物的二元胺溶液)，从而避免了二价锰盐易于形成锰氧化物或锰氢氧化物沉淀的问题。本发明研究发现，基于该机制，能够意外地解决二价锰盐易于形成锰氧化物或锰氢氧化物沉淀的问题，提高体系稳定性，减少副反应，且利于后续反应的顺利进行。
作为优选，本发明中，所述的二元胺的实际用量高于其将二价锰盐完全络合的理论用量。
优选地，溶液A与溶液B中的钛原子与锰原子的浓度为0.05～1M，进一步优选为0.05～0.1M。
本发明中，将上述溶液A与溶液B混合所形成的溶液C加入超纯水，实质上是以水驱动钛的二元醇络合物和锰的二元胺络合物反应生成钛酸锰。总反应机理为：
Ti(OR1O)2+[Mn(H2NR2NH2)]2++3H2O→MnTiO3+2OR1OH+2[H2NR2NH2]+
作为优选，本发明中，所述的超纯水的实际用量高于理论用量。
优选地，所述的超纯水的使用量为5～10mL，进一步优选为5mL。
本发明中，合适的溶剂热的反应温度与时间能够对产品结构形貌进行控制，实质上是通过控制反应温度与反应时间来影响产品的“成核→溶解→再结晶”过程。本发明研究发现，基于该机制，意外地发现控制合适的溶剂热的反应温度与时间能够对产品结构形貌进行控制，得到良好的纳米片结构形貌，优化表面活性位点的排布，提升产品质量。
优选地，进行溶剂热反应的温度为150～300℃，进一步优选为200℃；
优选地，进行溶剂热反应的时间为18～30h，进一步优选为24h。
本发明中，将获得的二维钛酸锰纳米片洗涤后分散在水溶液中备用。
优选地，将其用于制备可供注射的抗癌纳米材料(抗癌药物)。所述的可供注射的抗癌纳米材料中的钛酸锰纳米材料的浓度没有特别要求，可供注射即可，优选为0.1～5mg/mL；进一步优选为1～3mg/mL。
优选地，将其用于制备可供静脉注射的抗癌纳米材料。
本发明还提供了一种抗癌纳米材料(抗癌药物)，包含药学有效量的所述的钛酸锰纳米材料。
本发明所述的抗癌纳米材料，其为可供注射的分散有所述的钛酸锰纳米材料的针剂；
优选地，所述的抗癌纳米材料中，还含有医学上允许添加的辅料。
有益效果
(1)本发明发现钛酸锰纳米材料特别是二维钛酸锰纳米片在肿瘤细胞内具有模拟酶活性，能够基于模拟过氧化物酶、模拟过氧化氢酶、模拟氧化酶活性以及多种模拟酶活性的级联达到杀伤肿瘤细胞，使肿瘤细胞消融的效果。
另外，所述的材料具有较高生物相容性，易于进行生物代谢，无明显毒性，对于实体肿瘤具备优异的消融能力；
(2)采用二维钛酸锰纳米片特别是所述制备方法制得的二维钛酸锰纳米片具有更优的生物适应性，能够表现出多种模拟酶活性，且能够激发多种模拟酶的串联级联，解决化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题，有效改善肿瘤的消融效果；
(3)本发明中所述的二维钛酸锰纳米片制备方法比较简单，反应条件相对温和，成本低，易于大规模制备。
附图说明
为了使本发明的目的、内容和有益效果更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
【图1】为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片的各项基础表征图：(a)扫描电子显微镜(SEM)图；(b)粒径分布图；(c)能量色散X射线光谱(EDS)图；(d)X射线光电子能谱(XPS)图；(e)X射线衍射(XRD)图。
【图2】(a)为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片的透射电子显微镜(TEM)图；(b)为通过实施例2的步骤制得的二维钛酸锰纳米片的透射电子显微镜图；(c)为通过实施例3的步骤制得的二维钛酸锰纳米片的透射电子显微镜图。
【图3】(a)为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片类过氧化物酶活性测试效果图；(b)为其溶液吸光度对比图。
【图4】(a)为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片类过氧化氢酶活性测试效果图；(b)为其溶液溶解氧量的对比图。
【图5】(a)为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片类氧化物酶活性(超氧阴离子自由基的形成)测试效果图；(b)为其溶液吸光度对比图。
【图6】(a)为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片类氧化物酶活性(谷胱甘肽的氧化)测试效果图；(b)为其溶液吸光度对比图。
【图7】(a)为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片类氧化物酶活性(过氧化氢的生成)测试效果图；(b)为其溶液吸光度对比图。
【图8】为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片在胞内产生活性氧水平测试的胞内活性氧染色图片。
【图9】为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片对癌细胞杀伤能力测试的细胞死活染色图片。
【图10】为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片作为抗癌纳米材料消融肿瘤能力测试的(a)小鼠肿瘤曲线图与(b)小鼠肿瘤体积曲线图。
【图11】为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片作为抗癌纳米材料消融肿瘤能力测试的第14天时小鼠肿瘤评估图。
【图12】为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片作为抗癌纳米材料生物安全性测试的小鼠主要器官——心、肝、脾、肺、肾的苏木精/伊红染色图。
具体实施方式
以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述：应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定。
第一部分：二维钛酸锰纳米片的制备
实施例1
步骤(1)：将1.25mmol钛酸正四丁酯与16mL乙二醇进行混合，搅拌以形成溶液A；将1.25mmol一水合硫酸锰与4mL乙二胺进行混合，搅拌以形成溶液B；在剧烈搅拌下，将上述溶液A与溶液B完全进行混合，形成溶液C；
步骤(2)：在剧烈搅拌下，向上述溶液C中缓慢滴加5mL超纯水后，将之转移至50mL带有聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜中，在200℃下反应24h后，自然冷却至室温。通过离心收集产物，并使用乙醇和水洗涤数次以除去杂质。最后使用真空干燥箱进行干燥得到浅黄色粉末，即为二维钛酸锰纳米片。
图1为通过实施例1的步骤制得的二维钛酸锰纳米片的各项基础表征图。
由图1(a)可见，该二维钛酸锰纳米片呈现近似圆形的形貌，平面直径约为180nm，平度厚度约为20nm；
由图1(b)可见，该二维钛酸锰纳米片的粒径分布较为均匀，平均粒径约为180nm；
由图1(c)可见，该二维钛酸锰纳米片中锰原子数与钛原子数与氧原子数之比约为1:1:3，符合钛酸锰分子的各原子比例；
由图1(d)可见，该二维钛酸锰纳米片锰元素的分峰拟合曲线峰位与峰强度符合文献值，锰元素呈现+2价，符合钛酸锰中锰元素的价态；
由图1(e)可见，该二维钛酸锰纳米片的各角度X射线衍射峰均与钛酸锰X射线衍射的标准卡片(JCPDS no.29-0902)中各角度X射线衍射峰匹配，这证实了产物为二维钛酸锰纳米片。
实施例2
与实施例1相比，主要区别在于溶剂热温度为150℃，且溶剂热时间为18h(溶剂热温度有所降低，溶剂热时间有所减少)。
步骤(1)：将1.25mmol钛酸正四丁酯与16mL乙二醇进行混合，搅拌以形成溶液A；将1.25mmol一水合硫酸锰与4mL乙二胺进行混合，搅拌以形成溶液B；在剧烈搅拌下，将上述溶液A与溶液B完全进行混合，形成溶液C；
步骤(2)：在剧烈搅拌下，向上述溶液C中缓慢滴加5mL超纯水后，将之转移至50mL带有聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜中，在150℃下反应18h后，自然冷却至室温。通过离心收集产物，并使用乙醇和水洗涤数次以除去杂质。最后使用真空干燥箱进行干燥得到浅黄色粉末，即为二维钛酸锰纳米片。
实施例3
与实施例1相比，主要区别在于溶剂热温度为250℃，且溶剂热时间为30h(溶剂热温度有所升高，溶剂热时间有所增长)。
步骤(1)：将1.25mmol钛酸正四丁酯与16mL乙二醇进行混合，搅拌以形成溶液A；将1.25mmol一水合硫酸锰与4mL乙二胺进行混合，搅拌以形成溶液B；在剧烈搅拌下，将上述溶液A与溶液B完全进行混合，形成溶液C；
步骤(2)：在剧烈搅拌下，向上述溶液C中缓慢滴加5mL超纯水后，将之转移至50mL带有聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压反应釜中，在250℃下反应30h后，自然冷却至室温。通过离心收集产物，并使用乙醇和水洗涤数次以除去杂质。最后使用真空干燥箱进行干燥得到浅黄色粉末，即为二维钛酸锰纳米片。
图2(a)为实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片的透射电子显微镜图；图2(b)为实施例2所制得的二维钛酸锰纳米片的透射电子显微镜图；图2(c)为实施例3所制得的二维钛酸锰纳米片的透射电子显微镜图。
对比图2(a)～图2(c)可以看出溶剂热温度为200℃，且溶剂热时间为24h时，所制得的二维钛酸锰纳米片直径分布更为平均(约180nm)，整体形貌较好，且不易发生聚集。溶剂热温度为150℃，且溶剂热时间为18h与溶剂热温度为250℃，且溶剂热时间为30h时，所制得的二维钛酸锰纳米片直径分布较为广泛(150～300nm)，整体形貌不尽均一，且易发生聚集等现象。因此，实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片的整体形貌与质量优于实施例2与实施例3所制得的二维钛酸锰纳米片，这能为模拟酶酶促反应提供了更多反应位点，使其拥有更好的多种模拟酶效果，为其制备为可供注射的抗癌纳米材料提供了前提。
第二部分：二维钛酸锰纳米片多种模拟酶活性测试
将实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片溶于超纯水中备用(2.5mg/mL)，并配制pH6的磷酸缓冲溶液以调节测试环境pH而模拟肿瘤微环境。
类过氧化物酶活性测试：取pH 6的磷酸缓冲溶液1mL，加入10μL 10mg/mL3,3',5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液与60μL 30％过氧化氢并混合均匀后，加入10μL上述溶于超纯水的二维钛酸锰纳米片，震荡反应1min后测试溶液在652nm处的吸光度；
类过氧化氢酶活性测试：取pH 6的磷酸缓冲溶液3mL，加入180μL 30％过氧化氢并混合均匀后，加入200μL上述溶于超纯水的二维钛酸锰纳米片，震荡混合均匀后使用溶氧仪测试10min时的溶液溶解氧量；
类氧化酶活性测试：取pH 6的磷酸缓冲溶液1mL，加入10μL 10mg/mL3,3',5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液并混合均匀后，加入10μL上述溶于超纯水的二维钛酸锰纳米片，震荡反应1min后测试溶液在652nm处的吸光度；取pH 6的磷酸缓冲溶液1mL，加入10μL3mg/mL谷胱甘肽的水溶液并混合均匀后，加入30μL上述溶于超纯水的二维钛酸锰纳米片，震荡反应30min。反应完成后离心除去二维钛酸锰纳米片，加入10μL4 mg/mL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的二甲基亚砜溶液，震荡反应5min后，测试溶液在412nm处的吸光度；取pH 6的磷酸缓冲溶液1mL，加入100μL 3mg/mL谷胱甘肽的水溶液、10μL 2.5mg/mLAmplexRed的二甲基亚砜溶液与0.2U的辣根过氧化物酶并混合均匀后，加入30μL上述溶于超纯水的二维钛酸锰纳米片，震荡反应30min后离心除去纳米粒，测试溶液在571nm处的吸光度。
将在各测试条件下进行的测试标记为实验组(Experimental group)。
参比测试——对比例1
与上述各测试条件相比，区别仅有未添加二维钛酸锰纳米片这一不同，将之标记为空白组(Blank group)。
图3(a)为二维钛酸锰纳米片类过氧化物酶活性测试效果图，图3(b)为其溶液吸光度对比图。其中实验组为所述的测试条件，而空白组仅有未添加二维钛酸锰纳米片这一不同；
图4(a)为二维钛酸锰纳米片类过氧化氢酶活性测试效果图，图4(b)为其溶液溶解氧量的对比图。其中实验组为所述的测试条件，而空白组仅有未添加二维钛酸锰纳米片这一不同；
图5(a)、图6(a)、图7(a)为二维钛酸锰纳米片类氧化酶活性测试效果图，图5(b)、图6(b)、图7(b)为其溶液吸光度对比图。其中实验组为所述的测试条件，而空白组仅有未添加二维钛酸锰纳米片这一不同。
由图3可见，实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够催化过氧化氢分解产生羟基自由基，使溶液显蓝色，而不添加二维钛酸锰纳米片的溶液并未显色。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片具有良好的过氧化物酶活性；
由图4可见，实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够催化过氧化氢分解产生大量氧气，伴随有气泡的生成，而不添加二维钛酸锰纳米片的溶液并未出现明显变化。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片具有良好的过氧化氢酶活性；
由图5可见，实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够利用空气中的氧气，将之转化为超氧阴离子自由基，使溶液显蓝色，而不添加二维钛酸锰纳米片的溶液并未显色。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片具有转化氧气为超氧阴离子自由基的能力，进而可以进行下一步类氧化酶酶促反应；
由图6可见，实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够氧化谷胱甘肽，使溶液颜色变淡显浅黄色，而不添加二维钛酸锰纳米片的溶液仍为黄色。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片具有良好的氧化酶活性；
由图7可见，实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够利用空气中的氧气，将之转化为超氧阴离子自由基，同时利用超氧阴离子自由基氧化谷胱甘肽产生过氧化氢，使溶液显红色，而不添加二维钛酸锰纳米片的溶液并未出现明显显色。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片具有良好的氧化酶活性，最终产生过氧化氢形成循环级联反应，弥补上述类过氧化物酶与类过氧化氢酶对过氧化氢的消耗，为解决化学动力学疗法反应底物浓度水平有限与对癌细胞的杀伤能力不足等问题提供了基础。
第三部分：二维钛酸锰纳米片抗癌效果测试
以小鼠乳腺癌细胞(4T1)作为癌细胞模型，探究二维钛酸锰纳米片胞内产生活性氧(羟基自由基)的能力。使用细胞96孔板作为培养基底，按大约104细胞数/孔进行种植。使用DMEM培养基，按大约100μL/孔进行培养12h。
将实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片分别溶于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2)与DMEM培养基中备用(100μg/mL)。
胞内活性氧水平测试：取上述培养12h的96孔板，去除原培养基，加入100μL上述溶于磷酸盐缓冲液的二维钛酸锰纳米片，并共培养12h，使癌细胞充分吸收二维钛酸锰纳米片。再加入含2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯的DMEM培养基，培养4h后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次并使用荧光倒置显微镜进行成像；
癌细胞杀伤能力测试：取上述培养12h的96孔板，去除原培养基，加入100μL上述溶于DMEM培养基的二维钛酸锰纳米片，并共培养24h。除去培养基，再加入含钙黄绿素-AM与碘化丙啶的DMEM培养基培养30min后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次并使用荧光倒置显微镜进行成像。
将在各测试条件下进行的测试标记为实验组。
参比测试——对比例2
与上述各测试条件相比，区别仅在于使用磷酸盐缓冲液或DMEM培养基代替含二维钛酸锰纳米片的磷酸盐缓冲液或DMEM培养基，将之标记为空白组。
图8为胞内活性氧染色图片，蓝色区域为Hoechst 33342染料所染的细胞核，代表了细胞所在位置，绿色区域为2',7'-二氯二氢荧光素被活性氧氧化后的产物所发出的荧光，荧光强度反映了活性氧量的多少。其中实验组为所述的测试条件，而空白组区别仅在于使用磷酸盐缓冲液代替了含二维钛酸锰纳米片的磷酸盐缓冲液；
图9为细胞死活染色图片，绿色区域为活细胞中钙黄绿素发出的荧光，红色区域为死细胞中碘化丙啶发出的荧光，二者荧光所占比例反映了活细胞与死细胞所占比例。其中实验组为所述的测试条件，而空白组区别仅在于使用DMEM培养基代替了含二维钛酸锰纳米片的DMEM培养基。
由图8可见实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够在癌细胞内发生多种模拟酶的级联反应，进而在癌细胞内产生毒性的活性氧——羟基自由基，而不添加二维钛酸锰纳米片时，癌细胞内并无明显活性氧——羟基自由基的产生。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够在癌细胞内发生多种模拟酶的级联反应，进而在癌细胞内产生毒性的活性氧——羟基自由基；
由图9可见实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够在癌细胞内发生多种模拟酶的级联反应，在癌细胞内产生毒性的羟基自由基，进而杀伤癌细胞。而不添加二维钛酸锰纳米片时，癌细胞并未明显被杀伤。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片能够在癌细胞内发生多种模拟酶的级联反应，在癌细胞内产生毒性的羟基自由基，进而杀伤癌细胞。
第四部分：二维钛酸锰纳米片作为抗癌纳米材料消融肿瘤能力测试
在中南大学湘雅医学院实验动物中心的批准下，按照道德与伦理学规范进行了动物实验。
以小鼠乳腺癌细胞荷瘤Balb/c小鼠(雄性，4周龄)作为动物模型，当肿瘤大小达到125mm3以上时开始实验。
将实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片溶于生理盐水(0.9％氯化钠的水溶液)(2mg/mL)作为抗癌纳米材料以供注射用。
消融肿瘤能力测试：自开始实验后持续共计14天。在第3天与第10天时由小鼠尾静脉注射100μL上述溶于生理盐水的二维钛酸锰纳米片，且每隔两天记录一次小鼠肿瘤体积与小鼠体重；在第14天时处死小鼠并切除肿瘤，对肿瘤情况进行评估。
生物安全性测试：自开始实验后持续共计14天。在第3天与第10天时由小鼠尾静脉注射100μL上述溶于生理盐水的二维钛酸锰纳米片，并在第14天时处死小鼠，切除小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)进行苏木精/伊红染色，对生物安全性进行评估。
将在各测试条件下进行的测试标记为实验组。
参比测试——对比例3
与上述各测试条件相比，区别仅在于使用生理盐水代替含二维钛酸锰纳米片的生理盐水，将之标记为空白组。
图10(a)为小鼠肿瘤曲线，图10(b)为小鼠体重曲线，两图记录了14天内小鼠肿瘤体积与体重变化过程。其中实验组为所述的测试条件，而空白组区别仅在于使用生理盐水代替含二维钛酸锰纳米片的生理盐水；
图11为第14天时小鼠肿瘤评估图，代表了14天内消融肿瘤的最终程度。其中实验组为所述的测试条件，而空白组区别仅在于使用生理盐水代替含二维钛酸锰纳米片的生理盐水；
图12为小鼠主要器官——心、肝、脾、肺、肾的苏木精/伊红染色图，能直接反映小鼠各主要器官的受损程度。其中实验组为所述的测试条件，而空白组区别仅在于使用生理盐水代替含二维钛酸锰纳米片的生理盐水。
由图10可见，注射了上述溶于生理盐水的实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，而未注射二维钛酸锰纳米片时，肿瘤生长未受到明显抑制；
由图11可见，注射了上述溶于生理盐水的实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片的小鼠肿瘤最终明显小于未注射二维钛酸锰纳米片的小鼠肿瘤。这证实了实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片具有明显的抑制肿瘤生长的能力，在一定程度上可以消融肿瘤；
由图12可见，注射了上述溶于生理盐水的实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片的小鼠主要器官与未注射二维钛酸锰纳米片的小鼠主要器官的苏木精/伊红染色图近似。这证实了注射了上述溶于生理盐水的实施例1所制得的二维钛酸锰纳米片的小鼠主要器官并未受到破坏，说明二维钛酸锰纳米片用于制备抗癌纳米材料并进行静脉注射并不会引起主要器官损伤，具有较好的生物安全性。
通过以上实施例，申请人以举例的方式证明了二维钛酸锰纳米片的制备及其在用于制备多种模拟酶级联反应化学动力学抗癌纳米材料中的应用。以上所述仅为本发明的较佳实施例,本发明的保护范围不限于上述的实施案例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化和修饰，皆应属本发明的涵盖范围，本申请所要求的保护范围如本申请权利要求书所示。

Claims (18)

1.一种钛酸锰纳米材料在用于制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的钛酸锰纳米材料为二维钛酸锰纳米片；所述的二维钛酸锰纳米片通过以下步骤制备：
步骤（1）：将包含钛酸源、醇源的溶液进行混合，搅拌形成溶液A；将包含锰源、胺源的溶液进行混合，搅拌形成溶液B；将溶液A与溶液B按照钛原子与锰原子1:2或1:1或2:1的摩尔比例进行混合，搅拌形成溶液C；
步骤（2）：向溶液C中加入超纯水后进行溶剂热反应，即得所述的二维钛酸锰纳米片；
溶剂热反应的温度为150~250 ℃，时间为18~30 h。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将其用于制备基于肿瘤细胞中的模拟酶活性机制抗肿瘤的药物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将其用于制备基于模拟过氧化物酶、模拟过氧化氢酶、模拟氧化酶中的两种或三种模拟酶级联反应机制抗肿瘤的药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，二维钛酸锰纳米片处于纳米二维尺度，其二维平面呈现近似圆形的形貌，平面直径为150~300 nm。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的钛酸锰纳米片厚度为10~30 nm。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的钛酸源为钛酸酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的钛酸源为钛酸四乙酯、钛酸四异丙酯、钛酸四正丁酯中的至少一种。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的醇源为二元醇。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的醇源为乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇中的至少一种。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的锰源为二价锰离子盐。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的锰源为四水合氯化锰、一水合硫酸锰、四水合硝酸锰中的至少一种。
12.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胺源为二元胺。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的胺源为乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺中的至少一种。
14.如权利要求1~13任一项所述的应用，其特征在于，将其用于制备可供注射的抗癌药物制剂。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，将其用于制备可供静脉注射的抗癌药物制剂。
16.一种抗癌药物，其特征在于，包含药学有效量的权利要求1~13任一项应用中制备的钛酸锰纳米材料。
17.如权利要求16所述的抗癌药物，其特征在于，所述的抗癌药物为能供注射的分散有所述的二维钛酸锰纳米片的针剂。
18.如权利要求17所述的抗癌药物，其特征在于，所述的抗癌药物中，还允许含有药学上允许添加的辅料。
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