CN112543633A - Trpv1调节中使用的大麻素和/或萜烯 - Google Patents

Abstract

描述了通过施用至少一种大麻素和/或萜烯化合物来调节TRPV1离子通道的活化的方法。

Description

TRPV1调节中使用的大麻素和/或萜烯

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年5月22日提交的美国临时申请号62/674,843、2018年11月20日提交的美国临时申请62/769,743号和2019年5月17日提交的美国临时申请62/849,719号的权益。这些申请的内容各自通过引用并入本文。

背景技术

瞬时受体超家族(TRP)的通道，诸如TRPV1、TRPM8和TRPA1，是将钙和钠传导到哺乳动物的多种细胞类型中的非选择性阳离子通道。它们存在于感觉神经元上，并且由于它们在分子水平上对为拟痛药(nociomimetic)的植物次生代谢产物(例如辣椒素)以及对另外刺激性和模拟性灼热或凉爽感的化合物(例如大蒜素、肉桂醛、薄荷醇)的响应能力，最初被鉴定为在伤害感受中起作用。

已知TRPV1离子通道与某些类型的疼痛有关，并且是基于辣椒素的局部镇痛药的分子靶标。它也与心脏肥大有关，并且已经描述了通过施用TRPV1激动剂如辣椒素和拮抗剂如BCTC和辣椒平来治疗心脏肥大的方法。参见美国专利号9,084,786。

需要寻找调节TRPV1活化和失活的新化合物。这样的新化合物将提供新颖且更有效的治疗与TRPV1通道相关的各种疾病的方法，所述疾病包括慢性炎症性疼痛病症、周围神经病变、心血管疾病、尿道膀胱炎、哮喘和听力损失。

发明概述

本文提供了通过施用至少一种大麻素或萜烯化合物来调节TRPV1离子通道的活化的方法。

在一方面，本文提供了调节TRPV1通道渗透性的方法，所述方法包括使表达TRPV1的细胞与至少一种具有预定的TRPV1状态相关的激动剂性质的化合物外部接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的较早步骤。在一个实施方案中，可以在治疗上优化在规定的时程内用不同的激动剂调节TRPV1的能力，所述规定的时程包括预治疗、初次治疗和/或二次治疗，在治疗之间有或没有清除期(wash-out period)。在各种实施方案中，所述至少一种化合物是多种化合物，所述多种化合物的每一种具有不同的TRPV1状态相关的激动剂性质。

在一些实施方案中，所述预定性质是离子选择性。在一个实施方案中，所述离子选择性是Na⁺和Ca²⁺离子的相对渗透性。在一个实施例中，所述离子选择性是Ca²⁺流入的量。在一个实施方案中，所述离子选择性是Na⁺选择性。在一个实施方案中，所述离子选择性是Ca²⁺选择性。在一个实施方案中，所述预定性质是孔扩张状态。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道活化性能。在另一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道失活性能。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1诱导的离子电流量。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道活化动力学。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道失活动力学。在一个实施方案中，所述预定性质是钙依赖性失活。在一个实施方案中，预定性质是钙非依赖性失活。

在各种实施方案中，至少一种化合物中的至少一种是大麻素。在一个实施方案中，大麻素是大麻酚(CBN)。在另一个实施方案中，大麻素是大麻二酚(CBD)。在一个实施方案中，大麻素是大麻萜酚(CBG)。在一个实施方案中，其中大麻素是次大麻二酚(CBDV)。

在各种实施方案中，至少一种化合物中的至少一种是萜烯。在一个实施方案中，所述萜烯是月桂烯。在一个实施方案中，所述萜烯是柠檬烯。在一个实施方案中，所述萜烯是芳樟醇。在一个实施方案中，所述萜烯是叶绿醇。在一个实施方案中，所述萜烯是橙花叔醇。在一个实施方案中，所述萜烯为蒎烯。

在各种实施方案中，接触所述细胞杀死所接触的细胞。在一些实施方案中，接触所述细胞不杀死所接触的细胞。在各种实施方案中，所述接触在体内进行。

在各种实施方案中，使细胞与TRPV1状态相关激动剂接触诱导钙依赖性细胞信号传导途径。在一个实施方案中，信号传导途径导致二级介质的分泌。在一个实施方案中，信号传导途径导致酶活化。在一些实施方案中，信号传导途径导致基因表达。在一个实施方案中，信号传导途径导致基因调节。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞生长。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞死亡。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞复制。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞运动。

在本文提供的另一方面，将所述至少一种化合物配制成药物组合物，并且所述方法进一步包括向需要其的受试者施用所述药物组合物。在一些实施方案中，受试者患有TRPV1介导的疼痛。在其他实施方案中，受试者患有TRPV1介导的心脏肥大。在另一个实施方案中，受试者患有TRPV1介导的哮喘。在另一个实施方案中，受试者患有TRPV1介导的听力损失。在另一个实施方案中，受试者患有TRPV1介导的尿道膀胱炎。在另一个实施方案中，受试者患有TRPV1介导的哮喘。在另一个实施方案中，受试者患有TRPV1介导的听力方式。在另一个实施方案中，受试者患有TRPV1介导的尿道膀胱炎。

在另一方面，本文提供治疗疼痛的方法，包括向患有疼痛的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，其中所述至少一种化合物外部接触促进受试者的疼痛感的表达TRPV1的细胞。

在另一方面，本文提供治疗心脏肥大的方法，包括向患有心脏肥大的受试者全身施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，其中所述至少一种化合物外部接触表达TRPV1的心脏细胞。

在另一方面，本文提供治疗哮喘的方法，包括向患有哮喘的受试者全身施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，其中所述至少一种化合物外部接触表达TRPV1的感觉神经元细胞。在各个实施方案中，感觉神经元支配平滑肌细胞、血管、气管、支气管或肺泡。

在另一方面，本文提供治疗与抗肿瘤药物治疗有关的听力损失的方法，包括向患有听力损失的受试者全身施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，其中所述至少一种化合物外部接触表达TRPV1的感觉神经元。在一个实施方案中，抗肿瘤药物是顺铂。在一个实施方案中，感觉神经元在Corti器官中。在另一个实施方案中，感觉神经元在内耳的螺旋神经节细胞中。

在另一方面，本文提供治疗尿道膀胱炎的方法，包括向患有尿道膀胱炎的受试者全身施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，其中所述至少一种化合物外部接触支配膀胱或尿道的表达TRPV1的感觉神经元。

附图说明

通过以下描述和附图将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：

图1A显示用TRPV1通道蛋白转染的HEK细胞中的辣椒素(Cap)活化电流。未转染野生型(WT)HEK细胞中没有激活电流。图1B显示经历线性转变的电流-电压(IV)关系：在辣椒素应用的早期阶段，通道向外整流(开放通道状态1；图1B，曲线1和2)，但随时间IV关系变为线性化，表明通道转变为开孔扩张状态(状态2；图1B曲线3)。

图2A-2B显示在存在(图2A)或不存在(图2B)内部10mM BAPTA和150nM Ca²⁺的情况下，用TRPV1通道蛋白转染的HEK细胞中的辣椒素(Cap)活化电流。图2C-2D显示辣椒素诱导的活化后的通道的两种状态：开放通道状态1(图2C)和开放扩张状态2(图2D)。状态1和状态2均可被辣椒平(CPZ，一种众所周知的TRPV1通道阻滞剂)阻滞。

图3A-3D显示用对照缓冲液、50μM大麻二酚(CBD)或1μM辣椒素(Cap)孵育后TRPV1的活化。图3A显示在每个离散数据点处进行的电流测量。图3B-3D显示三种孵育的电流-电压关系(IV)。选择每个IV曲线以说明TRPV1通道选择性。对照(图3B)和CBD(图3C)IV曲线向外整流并且在略微负电势下反转(状态1)。相比之下，由于转变为TRPV1孔扩张状态(状态2，图3D)，辣椒素的IV曲线被线性化并且反转接近零mV。

图4A-4D显示了用对照缓冲液、50μM大麻酚(CBN)或1μM辣椒素(Cap)孵育后TRPV1的活化。图4A显示在每个离散数据点处进行的电流测量。图4B-4C显示从对照、CBN和辣椒素选择的数据点绘制的三组IV关系。对照(图4B)和CBN(图4C)IV曲线显示出向外整流的关系，其中向内电流小于向外电流。相比之下，辣椒素施用后的线性化IV曲线(图4D)显示向内电流振幅接近于向外电流振幅。

图5A-5D显示用10μMCBN孵育导致从状态1到状态2的部分状态转变。辣椒素刺激物显示线性IV曲线，其指示扩张的通道状态2。

图6A-6D显示了用对照缓冲液、50μM次大麻二酚(CBDV)或1μM辣椒素(Cap)孵育后TRPV1的活化。图6A显示在每个离散数据点处进行的电流测量。图6B-6C显示从对照、CBDV和辣椒素选择的数据点绘制的三组IV关系。对照(图6B)和CBDV(图6C)阐明TRPV1通道的状态1。相比之下，辣椒素将IV转换成内向电流和外向电流之间的线性关系(图6D)。

图7A-7D显示了用对照缓冲液，50μM大麻萜酚(CBG)和1μM辣椒素孵育后TRPV1的活化。图7A显示在每个离散数据点处进行的电流测量。图7B-7C显示了从对照、CBG和辣椒素选择的数据点绘制的三组IV关系。对照(图7B)和CBG(图7C)阐明TRPV1通道的状态1。相比之下，辣椒素将IV转换成内向电流和外向电流之间的线性关系(图7D)。

图8A-8C显示用增加量的月桂烯(M)孵育后的TRPV1离子通道活化。图8A显示暴露于5μM月桂烯后在离散数据点处的电流测量。图8B显示暴露于10μM月桂烯后在离散数据点处的电流测量，以及图8C显示暴露于150μM月桂烯后在离散数据点处的电流测量。

图9A-9E显示用5μM月桂烯(M)和1μM辣椒素(Cap)孵育后TRPV1的活化。图9A和图9B显示在添加月桂烯和辣椒素之前和之后细胞的向内和向外的离子电流(nA)。图9B是图9A的放大图以进一步显示月桂烯诱导的响应。图9C-9E显示在添加月桂烯或辣椒素之前(图9C)、或者在添加5μM月桂烯(图9D)或1μM辣椒素之后(图9E)的细胞的电流/电压关系曲线。

图10A-10D显示用对照缓冲液、50μM月桂烯和1μM辣椒素孵育后TRPV1的活化。图10A显示在每个离散数据点处进行的电流测量。图10B-10C显示从对照、月桂烯和辣椒素选择的数据点绘制的三组IV关系。对照(图10B)和月桂烯(图10C)阐明TRPV1通道的状态1。相比之下，辣椒素将IV转换成内向电流和外向电流之间的线性关系(图10D)。

图11A-11C显示用对照缓冲液、150μM月桂烯和1μM辣椒素孵育后TRPV1的活化。图11A显示在每个离散数据点处进行的电流测量。图11B-11C显示从对照、月桂烯和辣椒素选择的数据点绘制的三组IV关系。对照(图11B)和月桂烯(图11C)阐明TRPV1通道的状态1。相比之下，辣椒素将IV转换成内向电流和外向电流之间的线性关系(图11D)。

图12A-12I显示TRPV1的Ca²⁺剂量依赖性失活。图12A显示0mM内部钙下以及外部孵育10μM月桂烯和随后施加1μM辣椒素时的电流发展图。图12B显示外部孵育10μM月桂烯之后提取的电流/电压关系以及图12C显示施加1μM辣椒素后提取的电流/电压关系。图12D显示180mM内部钙下以及外部孵育10μM月桂烯和随后施用1μM辣椒素时的电流发展图。图12E显示外部孵育10μM月桂烯之后提取的电流/电压关系，和图12F显示施加1μM辣椒素后提取的电流/电压关系。图12G显示620mM内部钙下以及外部孵育10μM月桂烯和随后施加1μM辣椒素时的电流发展图。图12H显示外部孵育10μM月桂烯之后提取的电流/电压关系，和图12I显示施加1μM辣椒素后提取的电流/电压关系。内部(细胞溶质)钙浓度的增加(0、180nM和620nM)降低由外部孵育10μM月桂烯和随后施加1μM辣椒素活化的TRPV1电流峰值幅度。另外，内部钙水平的增加水平显示对月桂烯的下降相或失活动力学的影响较小，但对辣椒素诱导的失活的影响较大。

图13A-13F显示TRPV1的Ca2+剂量依赖性失活。图13A显示0mM内部钙下以及外部孵育50μM CBN时的电流发展图。图13B显示0mM内部钙下以及外部孵育单独的50μM CBN、50μMCBN和1μM辣椒素以及单独的1μM辣椒素时的电流发展图。图13C显示180mM内部钙下以及外部孵育50μM CBN时的电流发展图。图13D显示180mM内部钙下以及外部孵育单独的50μMCBN、50μM CBN和1μM辣椒素以及单独的1μM辣椒素时的电流发展图。图13E显示620mM内部钙下以及外部孵育50μM CBN时的电流发展图。图13F显示620mM内部钙下以及外部孵育单独的50μM CBN、50μM CBN和1μM辣椒素以及单独的1μM辣椒素时的电流发展图。内部(细胞溶质)钙浓度的增加(0、180nM和620nM)降低通过外部孵育单独的50μM CBN、50μM CBN和1μM辣椒素以及单独的1μM辣椒素而活化的TRPV1电流峰值幅度。结果类似于图12A-12I。CBN降低峰值电流幅度，但对失活或下降相动力学没有很大影响。与CBN和辣椒素的混合物相比，内部0nM Ca²⁺去除下降相动力学或失活。相比之下，620nM的高内部Ca²⁺表现出电流幅度的显著降低和失活动力学的加速。

图14显示用10μM的α-没药醇、α-蒎烯、月桂烯、莰烯、芳樟醇、罗勒烯、蛇麻烯、β-石竹烯、β-蒎烯、柠檬烯或橙花叔醇处理后，HEK-TRPV1细胞系中TRPV1介导的钙进入。

图15A-D显示在钙进入测定中10μM月桂烯对TRPA1(图15A)、TRPM8(图15B)、TRPV1(图15C)或TRPV2(图15D)的影响。

图16A-H分别显示通过大麻二酚(图16A)、大麻酚(图16B)、次大麻二酚(图16C)、大麻萜酚(图16D)、大麻萜酚酸(图16E)、大麻色原烯(图16F)、大麻二酚酸(图16G)和辣椒素(图16H)引发过表达HEK-TRPV1的细胞中的钙流入。大麻萜酚和大麻酚未引发钙流入。

图17A-D显示辣椒素-和大麻素诱导的电导对辣椒平(CPZ)的敏感性。图17A显示电流发展图，以及图17B分别提供在用50nM辣椒素刺激然后施加10μM CPZ的HEK-TRVP1中的提取的电流/电压关系。图17C显示电流发展图，以及图17D分别提供用30μM的大麻素(CBD)刺激的HEK-TRVP1中的提取电流/电压关系。记录溶液的内部和外部Ca均为0，并且n的测定为5-6膜片。图17A和17C的电流发展图通过提取在-80mV和+80mV的电压下的电流来产生。

图18A-C显示在各种剂量的CBD(封闭圆)、CBDV(开放圆)、CBN(星号)和CBG(十字)下暴露120秒的HEK-TRPV1的电流发展图。图18A显示以30μM单独给药大麻素的结果。图18B显示以50μM单独给药大麻素的结果。图18C显示以150μM单独给药大麻素的结果。

图19A-L显示在各种剂量的CBD、CBDV、CBN和CBG下暴露120秒的HEK-TRPV1的单个电流发展图。图19A-C显示分别以30μM(图19A)、50μM(图19B)和150μM(图19C)的CBD给药的HEK-TRVP1的电流发展图。图19D-F显示分别以30μM(图19D)、50μM(图19E)和150μM(图19F)给药CBDV的HEK-TRVP1的电流发展图。图19G-I显示分别以30μM(图19G)、50μM(图19H)和150μM(图19I)给药CBN的HEK-TRVP1的电流发展图。图19J-L示出了分别以30μM(图19J)、50μM(图19K)和150μM(图19L)给药CBG的HEK-TRVP1的电流发展图。

图20A-D显示来自图20A-L所示数据的Imax数据的柱状图。图20A显示以10μM给药大麻素的Imax数据。图20B显示了以30μM给药大麻素的Imax数据。图20C显示了以50μM给药大麻素的Imax数据。图20D显示了以150μM给药大麻素的Imax数据。记录条件为NaR、Ca 1mM和未缓冲的内部钙(FCa)，并且n的测定范围为5-10膜片，如图20A-D所示。

图21A-D显示针对TRPV1的CBD(图21A)、CBDV(图21B)、CBN(图21C)和CBG(图21D)的剂量响应和EC 50计算。

图22A-C显示内部和外部钙水平对CBD诱导的TRPV1电流的影响。具体而言，图20A-C显示30μM的CBD以及外部钙浓度为0mM(红色)、1mM(黑色)和3mM(蓝色)且内部钙浓度缓冲为0nM(图22A)、180nM(图22B)时的标准化电流发展图(Imax百分比)，并且分别由流入(FCa，游离钙)测定(图22C)。

图23A-D显示恒定外部钙和变化的分别为0nM(图23A)、180nM(图23B)、620nM(图23C)和FCa(图23D)的内部Ca²⁺浓度下的CBD响应。

图24A-D显示恒定外部钙和变化的分别为0nM(图24A)、180nM(图24B)、620nM(图24C)和FCa(图24D)的内部Ca²⁺浓度中的CBN响应。

图25A-B显示在恒定外部钙浓度和0nM的内部Ca²⁺浓度下不同CBD浓度的响应的比较。图25A显示CBD浓度为30μM的结果。图25B显示CBD浓度为150μM的结果。

图26A-B显示在恒定外部钙浓度和180nM的内部Ca²⁺浓度下不同CBD浓度的响应的比较。图26A显示CBD浓度为30μM的结果。图26B显示CBD浓度为150μM的结果。

图27A-B显示在恒定外部钙浓度和0nM的内部Ca²⁺浓度下不同CBDV浓度的响应的比较。图27A显示CBDV浓度为30μM的结果。图27B显示CBDV浓度为150μM的结果。

图28A-B显示在恒定外部钙浓度和180nM的内部Ca²⁺浓度下不同CBDV浓度的响应的比较。图28A显示CBDV浓度为30μM的结果。图28B显示CBDV浓度为150μM的结果。

图29A-C显示响应于辣椒素通过TRPV1剂量依赖性获得孔扩张状态。具体地，图29A-C显示电流发展图和提取的I/V曲线，表明对于浓度为30nM(图29A)、100nM(图29B)和500nM(图29C)的辣椒素，随着剂量/电流幅度的增加，从整流状态转变为非整流状态。

图30通过表明增加的Na电流幅度显示线性化的I/V关系对应于孔扩张状态。

图31A-C分别显示针对浓度为30nM(图31A)、100nM(图31B)和500nM(图31C)辣椒素的电流发展图和提取的电流/电压关系。这些图表明，即使以最低的辣椒素剂量也存在一定的孔扩张(N-甲基-D-葡糖胺渗透)。

图32A-C显示在各种浓度的辣椒素存在下分别在60秒(图32A)、90秒和120秒(图32B)以及105秒和180秒(图32C)的不同时间的钠和N-甲基-D-葡糖胺(NMDG)渗透的Imax柱状图，表明存在不同的状态。

图33A-D分别显示0小时(图33A)、8小时(图33B)、10小时(图33C)和13小时(图33D)的各种四环素诱导期后30μM时CBD的电流发展图。

图34显示图33A-D所示结果的Imax柱状图。

图35分别显示CBD和辣椒素以50μM和1μM的浓度引起的电流。诱导时间为25小时，CBD以50μM给药，随后是辣椒素以1μM给药。

图36A-C显示对照(图36A)、50μM的CBD持续360秒(图36B)，以及1μM的辣椒素持续360秒(图36C)的I/V关系。

图37分别显示CBDV和辣椒素以50μM和1μM的浓度引起的电流。诱导时间为25小时，CBDV以50μM给药，随后是辣椒素以1μM给药。

图38A-C显示对照(图38A)、50μM的CBDV持续180秒(图38B)，以及1μM的辣椒素持续360秒(图38C)的I/V关系。

图39分别显示CBG和辣椒素以50μM和1μM的浓度引起的电流。诱导时间为25小时，CBG以50μM给药，随后是辣椒素以1μM给药。

图40A-C显示对照(图40A)、50μM的CBG持续180秒(图40B)，以及1μM的辣椒素持续360秒(图40C)的I/V关系。

图41A-G显示各种大麻素如CBD(图41A)、CBN(图41B)、CBDV(图41C)、CBC(图41D)、CBDA(图41E)、CBG(图41F)和CBGA(图41G)在过量表达疼痛TRPV2的细胞中的响应。

图42A-G显示各种大麻素如CBD(图42A)、CBN(图42B)、CBDV(图42C)、CBC(图42D)、CBDA(图42E)、CBG(图42F)和CBGA(图42G)在过量表达疼痛TRPM8的细胞中的响应。

图43A-G显示各种大麻素如CBD(图43A)、CBN(图43B)、CBDV(图43C)、CBC(图32D)、CBDA(图32E)、CBG(图32F)和CBGA(图32G)在过量表达疼痛TRPA1的细胞中的响应。

发明详述

定义

除非另有说明，否则权利要求和说明书中使用的术语定义如下。

“月桂烯”(同义词“β-月桂烯”)是7-甲基-3-亚甲基辛-1,6-二烯。

“萜烯”是指alpha-没药醇(α-没药醇)、alpha-蛇麻烯(α-蛇麻烯)、alpha-蒎烯(α-蒎烯)、β-石竹烯(β-石竹烯)、月桂烯、(+)-beta-蒎烯(β-蒎烯)、莰烯、柠檬烯、芳樟醇和橙花叔醇。

“状态相关性质”是指TRPV1离子通道打开状态的化学或物理性质。状态相关的示例性性质包括但不限于单价或二价离子选择性或非选择性、电流整流性能、离子通道活化性能、离子通道失活性能、离子通道活化动力学、离子通道失活动力学、离子流入、打开状态选择性或TRPV1离子电流的大小或幅度。

化合物的“TRPV1状态相关激动剂性质”是指化合物通过调节通道的至少一种状态相关性质来调节TRPV1通道渗透性的能力，包括将TRPV1通道从一个状态改变或诱导到另一状态的变化，或将通道保持在特异性非扩张状态，而不转变为第二状态。

“药物活性成分”(同义词，活性药物成分)是指打算用于制造药物产品，并且当用于生产药物时，成为药物产品中的活性成分的任何物质或物质混合物。此类物质旨在在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理活性或其他直接作用，或影响身体的结构和功能。此类物质或物质混合物最好是根据《联邦食品、药品和化妆品法》501(a)(2)(B)部分，按照动态药品生产管理规范(CGMP)的规定生产。

如果药物活性成分含有少于0.3％(w/w)的δ-9四氢大麻酚，则该药物活性成分“基本上不含THC”。如果药物组合物包含少于0.3％(w/v)的δ-9四氢大麻酚，则该药物组合物“基本上不含THC”。

“大麻(Cannabis sativa)提取物”是通过流体和/或气体提取，例如通过用CO₂的超临界流体提取(SFE)从大麻植物材料中获得的组合物。大麻提取物通常含有月桂烯、大麻素和萜烯，并且还可以包含植物大麻素和次生代谢产物。

“疼痛疾病”包括引起疼痛作为其症状之一的各种疾病-包括但不限于由于化学疗法或放射而与以下相关的疼痛疾病：劳损(strain)，扭伤，关节炎或其他关节疼痛，挫伤，背痛，纤维肌痛，子宫内膜异位，手术后疼痛，糖尿病神经病变，三叉神经痛，疱疹后神经痛，丛集性头痛，牛皮癣，肠易激综合症，慢性间质性膀胱炎，外阴痛，外伤，肌骨失常，带状疱疹，镰状细胞病，心脏病，癌症，中风或口腔溃疡。

本文中使用的术语“治疗(treatment，treating)”等通常是指获得所需的药理和/或生理作用。就完全或部分预防疾病、病情或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或对于疾病或病情的部分或完全治愈和/或归因于疾病或病情诸如症状的不良作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人的疾病或病情的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病或病情在可能易患该疾病或病情但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病或病情(例如，阻止其发展)；或(c)缓解疾病或病情(例如，导致疾病或病情消退，从而改善一种或多种症状)。根据本领域已知的标准方法和技术，可以容易地评估任何病情的改善。通过该方法治疗的受试者群体包括患有不良病情或疾病的受试者，以及处于患该病情或疾病的风险中的受试者。

术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”是指产生期望效果所施用的剂量或量。确切的剂量或量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lloyd(2012)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding，第四版)。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为可以将预防视为治疗。

术语“足够量”是指足以产生期望效果的量。

术语“改善”是指在疾病状态例如免疫紊乱的治疗中的任何治疗有益结果，包括预防、减轻其严重性或进展，缓解或治愈该疾病状态。术语“原位”是指与活生物体分开生长的活细胞中发生的过程，例如在组织培养物中生长。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛、马和猪。

其他解释约定

必须注意，如说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式的“一”，“一个”和“所述”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。

本文中描述的范围应被理解为该范围内所有值的简写形式，包括所描述的端点。例如，范围1到50应该理解为包括来自下组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36，37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。

除非另有说明，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物是指其每种立体异构体以及立体异构体的所有组合。

调节TRPV1活化的方法

我们已经发现，各种大麻素和萜烯对TRPV1具有激动作用，并且可以通过对TRPV1表达细胞的电生理分析将每种化合物的激动作用彼此区分开，以及与目前的治疗用途中主要TRPV1激动剂辣椒素中的作用区分开。因此，这些化合物可单独使用或与每种其他或与辣椒素或与其他合适的化合物相互组合使用，以调节TRPV1的渗透性。我们的数据支持用于选择具有期望治疗特性的TRPV1激动剂和激动剂混合物的多变量模型。所述方法允许根据电流幅度、离子渗透特性和活化/失活动力学的期望范围来允许制剂的定制设计。这些激动剂或激动剂混合物可以根据其预定的TRPV1状态相关激动剂性质来选择，以急性激活TRPV1、通过长期施用使TRPV1脱敏或两者，实现治疗效果。

因此，在第一方面，提出用于调节TRPV1通道渗透性的方法。所述方法包括将TRPV1表达细胞与至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物外部接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的较早步骤。在一些实施方案中，所述至少一种化合物包括多种化合物，该多种化合物中的每一种具有不同的TRPV1状态相关性质。

在一些实施方案中，所述预定性质是离子选择性。在一个实施方案中，所述离子选择性是Na⁺和Ca²⁺离子的相对渗透。在一个实施例中，所述离子选择性是Ca²⁺流入的量。在一个实施方案中，所述离子选择性是Na⁺选择性。在一个实施方案中，离子选择性为Ca²⁺选择性。在一个实施方案中，所述预定性质是孔扩张状态。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道活化性能。在另一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道失活性能。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1诱导的离子电流量。在一个实施方案中，所述预定性质是TRPV1通道活化动力学。在一个实施方案中，预定性质是TRPV1通道失活动力学。在一个实施方案中，所述预定性质是钙依赖性失活。在一个实施方案中，所述预定性质是钙非依赖性失活。

在各种实施方案中，用所述至少一种化合物接触细胞杀死所接触的细胞。在各种实施方案中，接触细胞不杀死所接触的细胞。在一些实施方案中，所述接触在体内进行。

在各种实施方案中，使细胞与TRPV1状态相关激动剂接触诱导钙依赖性细胞信号传导途径。在一个实施方案中，信号传导途径导致二级介质的分泌。在一个实施方案中，信号传导途径导致酶活化。在一些实施方案中，信号传导途径导致基因表达。在一个实施方案中，信号传导途径导致基因调节。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞生长。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞死亡。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞复制。在一个实施方案中，信号传导途径导致细胞运动。

在各种实施方案中，所述方法进一步包括施用包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的药物组合物。

化合物

所述至少一种化合物可以是大麻素或萜烯。

在各种实施方案中，所述至少一种化合物是大麻素。在一实施方案中，大麻素为大麻酚(CBN)。在一个实施方案中，大麻素是大麻二酚(CBD)。在一个实施方案中，大麻素是大麻萜酚(CBG)。在一个实施方案中，大麻素为次大麻二酚(CBDV)。

在各种实施方案中，所述至少一种化合物是萜烯。在一个实施方案中，萜烯是月桂烯。在一个实施方案中，萜烯为柠檬烯。在一个实施方案中，萜烯为芳樟醇。在一个实施方案中，萜烯为叶绿醇。在一个实施方案中，萜烯为蒎烯。在一个实施方案中，萜烯是橙花叔醇。

药物组合物

在另一方面，提供药物组合物。所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。在药物组合物的上下文中，具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的至少一种化合物是组合物的活性药物成分。

药物活性成分的含量

在典型的实施方案中，所述活性成分以至少0.01mg/ml、至少0.1mg/ml、至少0.5mg/ml或至少1mg/ml的浓度存在于药物组合物中。在某些实施方案中，活性成分以至少1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml的浓度存在于药物组合物中。在某些实施方案中，活性成分以至少30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的浓度存在于药物组合物中。

一般制剂

所述药物组合物可以是适于人或兽药的任何形式，包括液体、油、乳剂、凝胶、胶体、气雾剂或固体。

所述药物组合物可以被配制用于通过适用于人或兽药的任何施用途径进行施用，包括肠内和肠胃外施用途径。

在各种实施方案中，将药物组合物配制成用于通过吸入施用。在某些这些实施方案中，将药物组合物配制成用于通过蒸发器施用。在某些这些实施方案中，将药物组合物配制成用于通过喷雾器施用。在某些这些实施方案中，将药物组合物配制成用于通过雾化器施用。

在各种实施方案中，将药物组合物配制用于经口施用、用于经颊施用或用于舌下施用。

在一些实施方案中，将药物组合物配制成用于静脉内、肌内或皮下施用。

在一些实施方案中，将药物组合物配制成用于鞘内或脑室内施用。

在一些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用。

适于通过吸入施用的药物组合物

在一些实施方案中，提供了本文所述的药物组合物的单位剂型，其适合于通过蒸发器、喷雾器或雾化器施用药物组合物。在一些实施方案中，剂型是小瓶、安瓿，任选地刻痕以允许使用者打开。在特定的实施方案中，喷雾器是喷射喷雾器或超声喷雾器。

可吸入组合物通常在水溶液中例如作为鼻喷雾剂或肺喷雾剂施用。在美国专利No.4,511,069中公开了用于分配液体作为鼻喷雾剂的优选系统。可以通过将根据本发明的组合物溶于水中以产生水溶液，并使溶液无菌来方便地制备这种制剂。制剂可以存在于多剂量容器中，例如在美国专利No.4,511,069中公开的密封分配系统中。其他合适的鼻喷雾剂递送系统已经在以下文献中描述过：Transdermal Systemic Medication，Y.W.Chien编，Elsevier出版社，纽约，1985年；M.Naef等的Development and pharmacokineticcharacterization of pulmonal and intravenous delta-9-tetrahydrocannabinol(THC)in humans,J.PHARM.SCI.93,1176-84(2004)；和美国专利号4,778,810、6,080,762、7,052,678和8,277,781(每篇文献均通过引用并入本文)。另外的气雾剂递送形式可以包括例如压缩空气喷雾器、喷射喷雾器、超声喷雾器和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮在药物溶剂例如水、乙醇或其混合物中的生物活性剂。

粘膜制剂以干粉制剂的形式施用，例如，其包含合适粒度或在合适粒度范围内的干燥的、通常冻干形式的生物活性剂，用于鼻内递送。适于鼻或肺部通道内沉积的最小粒径通常为约0.5微米质量中位当量空气动力学直径(MMEAD)，通常为约1微米MMEAD，更通常为约2微米MMEAD。适合于鼻通道内沉积的最大粒径经常为约10微米MMEAD，通常为约8微米MMEAD，更通常为约4微米MMEAD。这些尺寸范围内的鼻内可吸入粉末可通过多种常规技术来生产，例如喷射研磨、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界流体冷凝等。这些合适的MMEAD的干粉可以通过常规的干粉吸入器(DPI)施用于患者，该吸入器依赖患者的呼吸，经肺或鼻吸入，将粉末分散成雾化量。或者，可以通过使用外部电源将粉末分散成雾化量的空气辅助装置(例如活塞泵)来施用干粉。

适用于经口/经颊/舌下施用的药理组合物

用于口服、经颊或舌下施用的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂，或作为在水性或非水性液体中的溶液剂或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆，或作为糖果锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等，每种都包含预定量的主题多肽治疗剂作为活性成分。除活性化合物外，悬浮液还可以包含悬浮剂，诸如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶及其混合物。

在用于口服、经颊或舌下施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，一种或多种治疗剂可与一种或多种药学上可接受的载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙，和/或以下中的任何一种：(1)填料或填充剂，诸如淀粉、乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)润湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)湿润剂，诸如，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及它们的混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以用作软填充和硬填充的明胶胶囊中的填料，该胶囊使用诸如乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可以含有：本领域常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇，油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)，甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂和防腐剂。

适于注射的药理组合物

对于静脉内、肌内或皮下注射或在患处注射，活性成分将为肠胃外可接受的水溶液形式，其无热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等张赋形剂诸如氯化钠注射液、Ringer注射液、乳酸化Ringer注射液来制备合适的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

在各种实施方案中，单位剂型是小瓶、安瓿、瓶或预装注射器。在一些实施方案中，单位剂型包含0.01mg、0.1mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、25mg、50mg、75mg或100mg的大麻素组合物。在一些实施方案中，单位剂型包含125mg、150mg、175mg或200mg的大麻素组合物。在一些实施方案中，单位剂型包含250mg的大麻素组合物。

在典型的实施方案中，所述单位剂型的药物组合物为液体形式。在各种实施方案中，单位剂型包含0.1mL至50ml的药物组合物。在一些实施方案中，单位剂型包含1ml、2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、25ml或50ml的药物组合物。

在特定的实施方案中，所述单位剂型是含有1ml浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的大麻素组合物的小瓶。在一些实施方案中，所述单位剂型是含有2ml浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的大麻素组合物的小瓶。

在一些实施方案中，所述单位剂型的药物组合物为适于溶解的固体形式，例如冻干剂。

适用于皮下、皮内或肌内施用的单位剂型实施方案包括预装载的注射器、自动注射器和自动注射笔，每个均含有预定量的上述药物组合物。

在各种实施方案中，所述单位剂型是预装载的注射器，其包括注射器和预定量的药物组合物。在某些预装载的注射器实施方案中，该注射器适于皮下施用。在某些实施方案中，该注射器适合于自我施用。在特定实施方案中，预装载的注射器是一次性注射器。

在各种实施方案中，预装载的注射器包含约0.1mL至约0.5mL的药物组合物。在某些实施方案中，该注射器包含约0.5mL的药物组合物。在特定的实施方案中，该注射器包含约1.0mL的药物组合物。在特定的实施方案中，该注射器包含约2.0mL的药物组合物。

在某些实施方案中，单位剂型是自动注射笔。自动注射笔包括含有本文所述药物组合物的自动注射笔。在一些实施方案中，自动注射笔递送预定体积的药物组合物。在其他实施方案中，自动注射笔被配置成递送由使用者设置的一定体积的药物组合物。

在各种实施方案中，自动注射笔包含约0.1mL至约5.0mL的药物组合物。在特定的实施方案中，自动注射笔包含约0.5mL的药物组合物。在特定的实施方案中，自动注射笔包含约1.0mL的药物组合物。在其他实施方案中，自动注射笔包含约5.0mL的药物组合物。

适用于局部施用的药理组合物

用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必需的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可能有用。合适的局部制剂包括其中本发明特征的含大麻素的复杂混合物与局部递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。合适的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidyl ethanolamine)DOPE、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidyl choline)DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidyl choline))，带负电荷(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。根据本发明的含大麻素的复合混合物可以被包封在脂质体内或可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体。或者，含大麻素的复合混合物可以与脂质，特别是与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸酯、二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或它们药学上可接受的盐。

剂量范围

可以任选地采用体内和/或体外测定来帮助鉴定使用的最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和病情的严重性，并且应根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线外推有效剂量。

单位剂型

药物组合物可以方便地以单位剂型存在。

单位剂型通常会适于药物组合物的一种或多种特定的施用途径。

在各种实施方案中，单位剂型适于通过吸入施用。在这些实施方案的某些中，单位剂型适于通过蒸发器施用。在这些实施方案的某些中，单位剂型适于通过喷雾器施用。在这些实施方案的某些中，单位剂型适于通过雾化器施用。

在各种实施方案中，单位剂型适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。

在一些实施方案中，单位剂型适合于静脉内、肌内或皮下施用。

在一些实施方案中，单位剂型适于鞘内或脑室内施用。

在一些实施方案中，药物组合物被配制用于局部施用。

可与载体材料组合以产生单次剂型的活性成分的量通常会是产生治疗作用的化合物的量。

治疗方法

在其他方面，提供治疗方法。

在一系列实施方案中，提供治疗疼痛的方法。该方法包括向患有疼痛的受试者施用有效量的包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的药物组合物，其中所述至少一种化合物外部接触促进受试者的疼痛感的TRPV1表达细胞。

在另一系列的实施方案中，提供治疗心脏肥大的方法。该方法包括向患有心脏肥大的受试者全身施用有效量的包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的药物组合物，其中所述至少一种化合物外部接触表达TRPV1的心脏细胞。

合适的化合物在上文第5.3.1节中描述，在此通过引用并入。合适的药物组合物在上文第5.4节中描述，在此通过引用并入。

实施例

以下是用于实施本发明的具体实施方案的实施例。提供这些实施例仅出于说明性目的，而不意欲以任何方式限制本发明的范围。已经尽力确保所用数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是当然应该允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中充分解释了这种技术。例如参见：T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前版本)；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第二版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry 3^rd Ed.(Plenum Press)卷A和B(1992)。

方法

细胞培养：

将HEK TRexTRPV1在DMEM、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺，10μg/ml杀稻瘟菌素(Calbiochem,San Diego CA)、400μg/ml Zeocin(InvivoGen,San Diego CA)中培养，其中诱导转基因表达使用1μg/ml四环素16-24小时。除非另有说明，否则没有诱导的TRPV1基础表达足以进行这些研究，并在需要时与未转染的HEK进行比较。从SB Drug Discovery(Glasgow,Scotland)获得过表达人TRPV2、人TRPA1和人TRPM8的HEKTRex293，并如上所述培养。在已经用TRPV1离子通道蛋白转染的HEK细胞中测定大麻素和萜烯。这些细胞称为HEK293-V1细胞。

化学品、试剂和刺激物：

普通化学品购自VWR(West Chester,PA)和Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。PMA和离子霉素均来自Calbiochem(Gibbstown,NJ)。IgE抗DNP来自Sigma，和KLH-DNP来自Calbiochem。辣椒素和辣椒平购自Sigma Aldrich。次大麻二酚(CBDV)、大麻二烯(CBC)、大麻二酚(CBD)、大麻二酚酸(CBDA)、大麻萜酚(CBG)、大麻萜酚酸(CBGA)、大麻酚(CBN)来自Sigma Aldrich。

钙测定(容量法)：

洗涤细胞，并在以下组成(以mM计)的标准改良林格氏液中，用0.2微摩尔Fluo-4在37℃下孵育30分钟：NaCl 145、KCl 2.8、CsCl 10、CaCl₂ 10、MgCl₂ 2、葡萄糖10、Hepes·NaOH 10，pH 7.4,330mOsm。将细胞以50,000个细胞/孔转移至96孔板，并如指示进行刺激。使用Flexstation 3(Molecular Devices，Sunnydale，USA)采集钙信号。使用

Pro 5(Molecular Devices)分析数据。如有指示，通过制备含有1mM EGTA的0mM CaCl₂林格氏液，实现名义上不含钙的外部条件。

膜片钳方法：

该技术用于研究来自HEK293-V1的离子电流。控制跨细胞膜的电压，并测量与电压变化相关的离子电流。将微量移液器吸头的直径拉至几微米，然后加热吸头以产生光滑的表面，这有助于与细胞膜形成高阻密封。为了获得这种高阻密封，将微量移液器压在细胞膜上并施加抽吸。然后，薄膜熔化在玻璃表面上，在千兆欧姆范围内产生高阻。这使得可以电子分离跨膜片或跨整个细胞测得的离子电流。

电生理学：

在21至25℃下以全细胞配置进行膜片钳实验。膜片移液管的电阻为2-3MΩ。使用控制EPC-9放大器的PatchMaster软件(HEKA,Lambrecht,德国)获取数据。在500ms-180秒(3分钟)的时段内，以0.5Hz的速率从0mV的保持电位传递跨越-100至100mV的电压范围的50ms的电压斜升。校正了10mV液接电位的电压。电流以2.9kHz滤波并以100μs间隔数字化。在每个电压斜升之前确定并校正电容电流。通过测量在-80mV和+80mV的电压下的电流幅度，从各个斜升电流记录中提取给定电位的电流发展。数据使用FitMaster(HEKA，Lambrecht，德国)和IgorPro(WaveMetrics，LakeOswego，美国)进行分析。在适用的情况下，平均数据的统计误差以平均值±s.e.m和n的测定给出。激活的电流幅度由nA而不是pA/pF分析。做出此决定是因为通道的TRPV1转染产生高电流幅度(1-6nA)。同样，选择用于膜片的细胞大小为9-12pF范围内。比较nA和pA/pF的分析并且未发现明显差异，这主要归因于一致的细胞大小选择和nA范围内的高电流幅度。

对于膜片钳记录，将HEK293细胞保持在标准的包含以下(mM)的基于钠的外部林格氏液中：140NaCl、1CaCl₂、2MgCl₂、2.8KCl、11葡萄糖、10HEPES-NaOH，pH为7.2和渗透压为300mOsmol。为了评估外部钙(Ca)对TRPV1失活动力学的影响，测试了不同水平的Ca，包括0、1和3mM。在外部Ca为零的实验中，添加10mM EGTA，并将Na浓度降低至130mM以将标准渗透条件维持在300mOsmol。为了快速进行外部溶液施加和交换，我们使用SmartSquirt递送系统(Auto-Mate Scientific,San Francisco CA,USA)，该系统包括四个冷冻管，允许在一个膜片中交换溶液。该系统在电子阀和EPC10放大器(HEKA,Lambrecht,德国)之间包括ValveLink TTL接口。该电子构建允许通过PatchMaster软件(HEKA,Lambrecht,德国)来更改可编程方案。

用包含以下(mM)的细胞内膜片移液器溶液灌注细胞溶质：140Cs-谷氨酸、8NaCl、1MgCl₂、3MgATP、10HEPES-CsOH。将移液器溶液的pH调节至pH 7.2，并在300mOsmol下测量渗透压。使用WebMaxC http://www.stanford.edu/～cpatton/webmaxcS.htm)提供的计算器调节细胞溶质中游离的未缓冲Ca的水平。用WebMaxC计算并如文中指示，分别用10mM Cs-BAPTA和Ca 4.5或7.4mM将细胞溶质[Ca₂₊]_i缓冲至180和620nM。每当添加10mM Cs-BAPTA时，我们将外部Cs-谷氨酸盐从140mM降低至120mM以保持一致的300mOsmol的渗透压。当需要使用排除BAPTA和Ca的无缓冲Ca(在结果中标识为Fca)的实验目的时，这种缓冲的缺失允许主要由外部Ca渗入细胞溶质测定的内部Ca的自由积累。

溶液：

通过膜片钳实验在过表达大鼠TRPV1的单个HEK293细胞中评估通道电流。将HEK293细胞保持在含有140mM NaCl、1mM CaCl₂、2mM MgCl₂、2.8mM KCl、11mM葡萄糖和10mMHEPES-NaOH，pH 7.2和渗透压300mOsmol的钠基细胞外林格氏液中。用包含140mM Cs-谷氨酸、8mM NaCl、1mM MgCl₂、3mM MgATP和10mM HEPES-CsOH的细胞内膜片移液器溶液灌注细胞的细胞溶质。用4mM Ca²⁺和10mM BAPTA将标准内部Ca²⁺浓度缓冲至180nM。使用WebMaxC(http://www.stanford.edu/～cpatton/webmaxcS.htm)提供的计算器调节游离的无缓冲Ca²⁺的水平。将最终溶液的pH调节至pH 7.2，并在300mOsmol下测量渗透压。通过将大麻素、萜烯或辣椒素添加到上述外部溶液中来激活TRPV1电流。

用SmartSquirt递送系统(Auto-Mate Scientific,San Francisco)进行快速的细胞外溶液的施加和交换。该系统在电子阀和EPC-9放大器(HEKA,Lambrecht,德国)之间包括ValveLink TTL接口。这种构建允许通过PatchMaster软件(HEKA,Lambrecht,德国)来更改可编程方案。

分析

结果通常显示为平均值+标准偏差。电生理结果误差线显示平均值标准误差(SEM)。根据Student的t-检验或ANOVA测定统计学显著性。与各图中的数据点相邻，记录的显著差异如下：单星号，p<0.05；双星号，p<0.01；三星号，p<0.001；无符号，p>0.05。实验是至少3个的所有n。

实施例1–辣椒素的TRPV1状态相关激动剂性质

许多之前的研究表明TRPV1可以经历通道性质的动力学变化，这可有助于疼痛超敏性的机制。通过通道性质的动力学变化，我们是指TRPV1离子通道的离子选择性。在生物物理术语中，离子选择性是指通道对选定离子物种具有高渗透性的能力。认为标准离子通道的离子选择性在各种生理条件下不会改变。这种理解被最近对TRPV1的研究挑战，TRPV1对特定离子的选择性可以从开孔(状态1)变为扩张孔(状态2)。在状态1中，该通道对Na⁺和Ca²⁺均为非离子选择和可渗透的。暴露于激动剂辣椒素导致孔扩张为状态2，其中除了允许大阳离子(例如N-甲基-D-葡糖胺(NMDG))的渗透外，该孔还允许Ca²⁺和Na⁺离子的高通量。

为证实该发现，我们对野生型和TRPV1转染的HEK细胞进行全细胞膜片钳实验。将内部钙缓冲至150μM。将细胞与10μM辣椒素孵育59s。在60s时用不含辣椒素的洗涤缓冲液代替该缓冲液(图1A)。一旦去除辣椒素，辣椒素诱导的电流恢复为基线(用“洗涤”表示)。在野生型细胞中未观察到离子通道电压，这表明辣椒素诱导的电压是由于外源TRPV1通道诱导。

在12s、20s和30s进行电压斜升(图1A中的箭头1、2和3，结果如图1B所示)。在辣椒素施加的早期阶段，通道处于开放状态(状态2，图1B，线1和2)，但随时间IV关系变得线性化，这表明通道经历了向扩张状态的转变(状态2，图1B，线3)。

接下来，评估辣椒素激活TRPV1的动力学选择性(图2A-2D)。在存在或不存在内部10mM BAPTA和150nM Ca²⁺的情况下，将细胞与10μM辣椒素一起孵育。BAPTA是一种细胞内钙螯合剂。

在每个实验中在70s处进行电压斜升(图2A和2B中的箭头)，并且相关的IV曲线示于图2C和2D。在内部BAPTA和Ca²⁺存在下，辣椒素诱导Na⁺离子选择性TRPV1活化(状态1，图2A和2C)，而在不存在内部BAPTA和Ca²⁺的情况下，辣椒素诱导Ca²⁺离子选择性TRPV1活化(状态2，图2B和2C)。在这两个实验中，添加已知的TRPV1抑制剂辣椒平(CPZ)导致TRPV1通道快速失活，这表明TRPV1抑制剂可以阻断状态1和状态2的活化。这些结果还表明，实验数据是由于TRPV1通道的特异性激活，而不是由于细胞膜完整性的破坏。

一旦暴露于辣椒素，TRPV1通道进入状态2并且电流幅度降低，这种现象称为脱敏。脱敏需要细胞外钙的高度渗透以增加细胞内钙的水平。可以通过降低外部钙水平或将内部钙缓冲至低水平来减少或消除脱敏。

实施例2–大麻素和月桂烯的TRPV1状态相关激动剂性质

接着评估各种大麻素或萜烯诱导离子选择性TRPV1活化的能力，以及在状态1或状态2条件下产生的TRPV1活化的能力。通过在数据点60处向膜片夹紧的HEK293-V1细胞的细胞外溶液中添加各种浓度的大麻素或萜烯来激活TRPV1通道。将大麻素或萜烯溶液替换为在数据点121处包含1μM辣椒素的缓冲液作为激活TRPV1的阳性对照。随时间显示内向和外向电流的发展。每个数据点(DP)对应约2秒。

大麻二酚

与通过施加辣椒素诱导的持续的7-8nA电流相比，大麻二酚(CBD)诱导持续的4-6nA的内向电流(图3A)。CBD和辣椒素也都以低于内向电流的幅度诱导外向电流。

接着分析CBD和辣椒素诱导的电流与实验电压之间的关系。在数据点1、120和180处进行电压斜升(图3A，箭头1-3)，并在添加CBD和辣椒素之前和之后评估IV关系(图3B-D)。图3B显示在存在林格液的情况下细胞的断路电流(图3A中的“1”)。图3C显示CBD诱导的TRPV1活化(图3A中的“2”)。图3D显示辣椒素诱导的TRPV1活化(图3A中的“3”)。未处理细胞以及CBD诱导的TRPV1活化后的IV曲线具有与未扩张的TRPV1一致的向外整流IV曲线(状态1)。在这些条件下，内向电流小于外向电流。相反，由于TRPV1转变为扩张状态(状态2)，辣椒素的IV曲线是线性的。在这些条件下，内向电流的幅度接近外向电流的幅度。

大麻酚

与通过施加辣椒素诱导的持续的7-8nA电流相比，大麻酚(CBN)诱导0.5-2nA的内向电流(图4A)。CBN还诱导幅度低于内向电流的外向电流。与辣椒素和CBD诱导的持续TRPV1电流相反，CBN诱导的电流迅速失活。

与CBD一样，分析CBN和辣椒素诱导的电流与实验电压之间的关系。在数据点1、60和180处进行电压斜升(图4A，箭头1-3)，并在添加CBN和辣椒素之前和之后评估IV关系(图4B-D)。图4B显示在存在林格氏液的情况下细胞的断路电流(图4A中的“1”)。图4C显示CBN诱导的TRPV1活化(图4A中的“2”)。图4D显示辣椒素诱导的TRPV1活化(图4A中的“3”)。与CBN实验一样，未处理细胞以及CBN诱导的TRPV1活化后的IV曲线具有与未扩张的TRPV1一致的向外整流IV曲线(状态1)。

与50μM CBN相比，10μM CBN导致更大的内向和外向电流幅度(图5A)。有趣的是，随着CBN浓度的降低，TRPV1离子通道从状态1到状态2活化的转变更加明显。如IV曲线所示，未诱导细胞的IV曲线的向外整流形状(图5A中的箭头1和图5B)在施加10μM CBN后变得更线性(图5A中的箭头2和图5C)，并且在添加辣椒素后完全呈线性(图5A中的箭头3和图5D)。

次大麻二酚

与通过施用辣椒素诱导的持续的7-8nA电流相比，次大麻二酚(CBDV)诱导了持续的2-3nA的内向电流(图6A)。CBDV还诱导幅度低于内向电流的外向电流。如CBD和辣椒素，CBDV诱导的电流持续并且大于CBN诱导的电流。

与其他大麻素一样，分析CBDV和辣椒素诱导的电流与实验电压之间的关系。在数据点1、90和180处进行电压斜升(图6A，箭头1-3)，并在添加CBDV和辣椒素之前和之后评估IV关系(图6B-D)。图6B显示在存在林格氏液的情况下的细胞的断路电流(图6A中的“1”)。图6C显示CBDV诱导的TRPV1活化(图6A中的“2”)。图6D显示了辣椒素诱导的TRPV1活化(图6A中的“3”)。与CBN和CBD实验一样，未处理细胞以及CBDV诱导的TRPV1活化后的IV曲线具有与未扩张的TRPV1一致的向外整流IV曲线(状态1)。

大麻萜酚

与通过施用辣椒素诱导的持续的7-8nA电流相比，大麻萜酚(CBG)诱导持续的4-5nA的内向电流(图7A)。CBG也诱导幅度低于内向电流的外向电流。如CBD、CBDV和辣椒素，CBG诱导的电流持续并且大于CBN诱导的电流。

与其他大麻素一样，分析CBG和辣椒素诱导的电流与实验电压之间的关系。在数据点1、120和180处进行电压斜升(图7A，箭头1-3)，并在添加CBG和辣椒素之前和之后评估IV关系(图7B-D)。图7B显示在存在林格氏液的情况下的细胞的断路电流(图7A中的“1”)。图7C显示CBG诱导的TRPV1活化(图7A中的“2”)。图7D显示辣椒素诱导的TRPV1活化(图7A中的“3”)。与CBN、CBD和CBDV实验一样，未经处理细胞以及CBG诱导的TRPV1活化后的IV曲线具有与未扩张的TRPV1一致的向外整流IV曲线(状态1)。

月桂烯

首先，评估各种浓度的月桂烯对TRPV1的活化。如图8A-8C所示，月桂烯在TRPV1激活中诱导剂量依赖性响应。在该图中，每个数据点(DP)对应约1秒。5μM(图8A)、10μM(图8B)和150μM(图8C)月桂烯诱导0.5-2.2nA电流，较之通过施加1μM辣椒素则诱导4-10nA电流(未显示)。月桂烯剂量的增加导致向内整流的非选择性阳离子电流，该电流以激活电流幅度(图8A-8C)和钙流入依赖性方式失活(图12A-12I)。在图10A-D中显示了用50μM月桂烯和然后1μM辣椒素诱导TRPV1活化。使用150μM月桂烯的类似实验显示于图11A-11C。

图9A显示与图8A相同的实验，但在施加月桂烯后添加1μM辣椒素。图9A显示6个独立实验的平均内向和外向电流。5μM月桂烯随时间诱导约0.5nA的内向电流，而1μM辣椒素则诱导约9nA的内向电流。月桂烯和辣椒素还以低于内向电流的幅度诱导外向电流。图9B显示月桂烯诱导电流的放大图。如CBN，与CBD、CBDV、CBG和辣椒素诱导的持续TRPV1电流相反，月桂烯诱导的电流迅速失活。

与大麻素实验一样，分析月桂烯和辣椒素诱导的电流与实验电压之间的关系。在数据点1、59、119和179处进行电压斜升(图9A，箭头1-4IV)，并在添加月桂烯和辣椒素之前和之后评估IV关系(图9C-E)。图9C显示在存在林格氏液的情况下的细胞的断路电流(图9A中的“1IV”)和早期电流发展(图9A中的“2IV”)。图9D显示月桂烯诱导的TRPV1活化(图9A中的“3IV”)。图9E显示辣椒素诱导的TRPV1活化(图9A上的“4IV”)。对于50μM月桂烯(图10B-10D，图10C是月桂烯诱导的IV曲线)和150μM月桂烯(图11B-11C，11B是月桂烯诱导的IV曲线)观察到相似的IV曲线。

结论

辣椒素是TRPV1活化和疼痛脱敏的治疗标准。然而，已知辣椒素作为局部疼痛治疗剂的治疗性应用导致脱敏之前高水平的初始不适。在这些研究中，暴露于辣椒素在几秒钟内将TRPV1通道激活为状态2扩张通道。相比之下，TRPV1暴露于大麻素和萜烯月桂烯激活通道主要进入状态1。有趣的是，在CBD、CBN、CBDV、CBG和月桂烯诱导的TRPV1活化和失活性能之间存在动力学区别。这些差异表明，可以通过将预定的一种大麻素或一种萜烯或者多种大麻素或多种萜烯的组合施加于表达TRPV1的细胞来选择性地诱导特异性的TRPV1活化或失活。此外，大麻素和萜烯仅在非选择性状态1中诱导TRPV1活化，而仍诱导类似于辣椒素的电流幅度响应。因此，与当前以扩张状态2方式激活TRPV1的辣椒素治疗方案相比，这些化合物可提供更多的治疗选择，从而以非扩张状态1方式激活TRPV1。

实施例3–内部Ca²⁺浓度对TRPV1激活的作用

为了研究内部钙在TRPV1的活化和失活动力学中的作用，在施用月桂烯(图12A-12I)和大麻酚(CBN，图13A-13F)后，我们接着改变了HEK239-V1细胞的内部Ca²⁺并测量了TRPV1的活化。用补充有0nM、180nM或620nM Ca²⁺和10mM BAPTA的上述细胞内膜片移液器溶液灌注细胞。

Ca²⁺对月桂烯诱导的TRPV1活化的作用

在数据点60处将10μM月桂烯(图12A-12I)添加到细胞中，并在数据点120处用含1μM辣椒素的缓冲液代替。细胞溶质Ca²⁺浓度的增加降低了通过外部施加10μM月桂烯以及随后施加辣椒素激活的TRPV1V1电流峰值幅度。内部钙水平的增加对月桂烯的下降相或失活动力学影响较小，但对辣椒素诱导的失活影响较强。

在数据点65和125处进行电压斜升(图12A、12D和12G，箭头1和2)，并在添加月桂烯和辣椒素后评估IV关系。图12B和12C显示在0nM Ca²⁺存在下月桂烯(图12B)和辣椒素(图12C)IV曲线。图8E和8F显示在180nM Ca²⁺存在下月桂烯(图12E)和辣椒素(图12F)IV曲线。图12H和12I显示在620nM Ca²⁺存在下月桂烯(图12H)和辣椒素(图12I)IV曲线。

Ca²⁺对CBN诱导的TRPV1活化的作用

在数据点60处将50μM CBN(图13A-13F)添加到细胞中，在数据点120处用含50μMCBN和1μM辣椒素的缓冲液补充，并在数据点150处用含1μM辣椒素的缓冲液代替。CBN降低峰值电流幅度，但对失活或下降相动力学没有很大影响。与混合CBN和辣椒素施用相比，内部施用0nM Ca²⁺去除下降相动力学或失活。相比之下，620nM的高内部Ca²⁺表现出电流幅度的显著降低和失活动力学的加速。

实施例4–响应于萜烯的TRPV1介导的钙流入

美国专利申请号15/986,316中描述的细胞培养系统用于测试对各种萜烯的TRPV1介导的钙响应。用pcDNA6TR(Invitrogen,CA)质粒(编码四环素敏感的TREx阻遏蛋白)稳定转染HEK293细胞系，并在37℃下在潮湿5％CO2气氛中保持在DMEM+10％胎牛血清(在55℃灭活1h)+2mM谷氨酰胺中。通过在10μg/ml杀稻瘟菌素(Sigma,St Louis,MO)中连续培养来维持TRex 293细胞上的选择压力。

为了产生具有TRPV1可诱导表达的TRex HEK293细胞，将亲本细胞在pcDNA4TO载体中用大鼠TRPV1 cDNA电穿孔，并通过在400μg/ml Zeocin(Invitrogen，CA)存在下进行有限稀释来选择克隆细胞系。在37℃下使用1μg/ml四环素诱导TRPV1表达16小时。使用抗FLAGWestern印迹筛选稳定系的诱导型蛋白表达，并确认诱导型表达。

在细胞培养系统中通过钙测定法测试了TRPV1介导的钙响应。洗涤细胞，并在以下组成(以mM计)的标准改良林格氏液中，用0.2μM fluo-4乙酰氧基甲基酯(“Fluo-4”)在37℃下孵育30分钟：NaCl 145、KCl 2.8、CsCl 10、CaCl₂ 10、MgCl₂ 2、葡萄糖10、Hepes·NaOH10，pH 7.4,330mOsm。将细胞以50,000个细胞/孔转移至96孔板，并如指示进行刺激。所使用的萜烯是α-没药醇、α-蒎烯、月桂烯、莰烯、芳樟醇、罗勒烯、蛇麻烯、β-石竹烯、β-蒎烯、柠檬烯或橙花叔醇。将萜烯在DMSO中稀释并加至孔中，使最终浓度为10μM。单独的介质(DMSO)作为阴性对照，并从萜烯迹线中减去。使用Flexstation 3(Molecular Devices,Sunnydale,USA)获取钙信号。使用

Pro 5(Molecular Devices)分析数据。

图14显示了各种萜烯对TRPV1介导的钙进入的影响。月桂烯处理导致大量的钙流入，而橙花叔醇导致短暂的初始钙流入。与单独的介质相比，其余的萜烯，α-没药醇、α-蒎烯、莰烯、芳樟醇、罗勒烯、蛇麻烯、β-石竹烯、β-蒎烯和柠檬烯几乎或完全没有钙流入。

实施例5–月桂烯对TRP通道的影响

接着检测月桂烯激活各种TRP通道的作用。如前所述，用TRPA1、TRPM8和TRPV2稳定转染HEK293细胞。除TRPV1外，这些TRP通道还与感觉神经元束相关。

在细胞培养系统中通过钙测定法测试了TRPA1、TRPM8、TRPV2和TRPV1介导的钙响应。洗涤细胞，并在以下组成(以mM计)的标准改良林格氏液中，用0.2μM fluo-4乙酰氧基甲基酯(“Fluo-4”)在37℃下孵育30分钟：NaCl 145、KCl 2.8、CsCl 10、CaCl₂ 10、MgCl₂ 2、葡萄糖10、Hepes·NaOH 10，pH 7.4,330mOsm。将细胞以50,000个细胞/孔转移至96孔板，并用在DMSO中稀释的10μM月桂烯刺激。介质(DMSO)作为阴性对照。从每个细胞系的月桂烯迹线中减去介质迹线。

如图15A-D所示，月桂烯仅激活过表达TRPV1的细胞(图15C)而不激活表达TRPA1(图15A)、TRPM8(图15B)或TRPV2(图15D)的细胞，这表明月桂烯是TRPV1-通道特异性激活剂。

实施例6–由大麻素引发的HEK-TRPV1过表达细胞中的钙通量。

在过表达HEK-TRPV1的细胞中研究了响应各种大麻素的钙通量。

如图16A-H所示，除大麻萜酚和大麻酚外，多种大麻素都能在过表达HEK-TRPV1的细胞中引发Ca²⁺通量。在1mM外部Ca²⁺(作为基于群体或容量Ca²⁺)的存在下，进行单剂量(10μM浓度)的各种大麻素的比较响应，用每条迹线的测量值代表平均一式三份的100,000个细胞/样品。要注意，在大多数情况下，这些响应依赖于TRPV1的过表达，其中WT HEK293略响应于次大麻二酚和大麻萜酚酸。为了比较目的，图16H显示了辣椒素的响应。对于每种大麻素化合物，在群体水平上进行了剂量影响。剂量浓度为30-50μM的CBG模拟小的钙通量。浓度为30-50μM的CBN引发小的瞬时钙瞬态通量。该系统中可检测的钙响应的下限为10-100nM(CBDV，CBGA)至1-10μM。

实施例7–在辣椒平存在下，由辣椒素和CBD引起的TRPV1电导。

在辣椒平存在下测试响应于辣椒素和CBD的TRPV1电导。

首先使用全细胞膜片钳实验检查辣椒素和CBD对TRPV1电导的影响。验证了HEK-TRVP1表达系统的保真度，用于检测TRPV1电导。如图17A和17B所示，当施加50nM浓度的辣椒素(Cap)60秒时，记录到向外整流的TRPV1电流，而施加10μM浓度的辣椒平(CPZ)在随后的30秒施加内减小了内向和外向电流。此外，如图17C和17D所示，当将浓度为30μM的CBD施加于TRPV1过表达系统时，记录到向外整流电流，并且其随后在30秒后通过CPZ施加减小。这些数据证明该表达系统正记录响应于辣椒素和大麻素(如CBD)两者的TRPV1电流。

实施例8–由CBD、CBN、CBDV和CBG引发的不同的TRPV1激活响应。

研究了响应于不同浓度的大麻素即CBD、CBN、CBDV和CBG的TRPV1的活化。

TRPV1响应于CBD、CBDV、CBN和CBG的各种浓度(30μM、50μM和150μM)的电流发展图在图18A-C中示出。在无缓冲的内部和外部Ca²⁺浓度下测量这些响应。这种无缓冲条件允许由外部Ca²⁺渗入细胞溶质测定的内部Ca²⁺的自由积累。通过大麻素施用活化和失活TRPV1的动力学受大麻素的剂量和类型的影响，如图19A-L针对CBD、CBDV、CBN和CBG分别所示的单个Imax图所阐明。可以看出，随着浓度从30μM增加到50μM增加到150μM，活化和失活的速度均加快了。活化动力学还表明，达到最大电流峰值的时间加快了，这导致花费在峰值电流上的时间量较少。此外，图20A-D显示通过剂量浓度使用的每种大麻素达到的Imax。这些结果表明，最大获得的电流在不同大麻素之间是不同的，其中取决于剂量浓度和大麻素种类，典型的Imax范围为1-4nA。

实施例9–TRPV1的大麻素活化的EC50测量

针对CBD、CBDV、CBN和CBG计算针对TRPV1活化的EC50。

测量了CBD、CBBV、CBN和CBG的每剂量的Imax和平均Imax，并且这些数据用于计算和产生对应的EC50值，如图21A-D所示以及如表1所列。

实施例10–大麻素调节TRPV1的外部和内部钙浓度的依赖性

首先研究CBD响应对外部钙水平的依赖性，同时将内部钙水平缓冲至180nM的恒定浓度(接近静止的细胞溶质水平)、至0nM的浓度或使内部钙水平未缓冲(Fca)，如图22A-C所示。还说明了在三种内部缓冲条件的每一种下，具有外部钙的电流Imax在0、1或3mM时的时程。在任何恒定的内部钙条件下，外部钙浓度影响TRPV1响应的激活时间和失活动力学。例如，图22A显示，较低的外部钙浓度由于钙离子的载流作用而减慢活化动力学，并且一旦获得最大电流，导致失活非常慢。相比之下，将外部钙浓度从1mM增加到3mM对活化动力学没有影响，但导致失活动力学的加速。此外，图22B显示标准化为Imax的数据和180nM的恒定内部钙浓度以及对于每个图恒定的外部钙。这些数据突出说明了当钠(0Ca_ext,0Ca_int)而不是钠/钙离子的混合物流经TRPV1的非选择性阳离子通道时电流发展的差异。

还证实了如下假说，即，外部钙浓度的增加加速活化动力学，随后加快失活动力学，而没有钙缓冲作用，如图23A-D所示。此外，还研究了内部钙浓度对响应于CBD和CBN的动力学成型的作用。如图23A-D和图24A-D所示，在恒定的外部钙条件下和各自大麻素的剂量浓度下，较高的内部钙浓度(从Ca 0nM到Ca 180nM，到620nM和未缓冲的Fca)与获得的较低的最大电流和形成电流的更快失活相关。记录的TRPV1的细胞溶质钙依赖性失活也很重要。如图23A-D所示，CBD引起逐渐的电流发展，其仅当内部钙缓冲至零以上时才失活。此外，当内部钙浓度缓冲至620nM时，TRPV1通道变得完全失活。另一方面，CBN引起TRPV1的不同表现，其快速活化，但以较慢的动力学曲线快速失活，推测与通过通道进入的钙量有关，如图24A-D所示。然而，在某些情况下，失活似乎超过了电流发展，导致通道通量的失活和消除，如可从分别针对CBD和CBN的具有620nM内部或非缓冲钙浓度的图23C-D和图24C-D看出。另外，研究了内部钙浓度对低剂量和高剂量CBD和CBDV的响应的影响，并且结果分别示于图25A-B、图26A-B、图27A-B和图28A-B中。类似地，高剂量的大麻素失活更快，这与细胞溶质中钙的利用率增加有关。表2总结了如本实施例所讨论的CBD诱导的TRPV1生理性质的调节的结果。

实施例10–TRPV1和辣椒素响应的大麻素调节差异

TRPV1是两态的通道。在辣椒素活化下，TRPV1快速通过整流状态，随后达到非整流的孔扩张状态，其特征在于线性I/V关系和高水平的渗透性，包括小的阳离子(例如钠)到大的阳离子(例如N-甲基-D-葡糖胺(NMDG))。这种孔扩张导致辣椒素通道的持续和高度渗透特性，这是神经元激活和由于不受限制的钙和钠进入而最终使神经元脱敏的重要驱动力。因此，研究了响应于大麻二酚的TRPV1的两态行为。首先，确定了TRPV1与辣椒素的两态性质。如图29A-C和图30所示，低剂量(30nM)和中等剂量(100nM)的辣椒素导致整流电流，但较高浓度(500nM)却没有。另一方面，如图29A-C所示，电流的扩张状态和非扩张状态均对辣椒平敏感。此外，图31A-C和图32显示N-甲基-D-葡糖胺(NMDG)的渗透随着通道的整流性质降低而增加，这导致TRPV1达到其扩张状态。这进一步说明线性化的I/V关系确实是扩张状态或NMDG渗透状态的标志。

接着研究响应于CBD的TRPV1的状态转变。如图33-36所示，在高度获得的Imax和诱导时间下，TRPV1电流保持整流并且对辣椒平敏感。另外，即使当电流达到约10nA时，也不会响应于CBD剂量而转变为孔扩张状态。即使在0-25小时的诱导时间和高达150μM的CBD剂量浓度下，在具有大断开电流的细胞中也仅观察到引起线性非整流电流发展的CBD的一个记录。类似地，也观察到并没有获得针对CBG和CBDV的孔扩张状态，如图37-40C所示。

实施例11–不同TRP通道的大麻素响应

此实施例显示TRPV2、TRPM8和TRPA1通道上各种大麻素的不同响应。

不同大麻素靶向特定TRP通道或共同靶向多于一种通道类型的潜力是用于治疗和管理疼痛的潜在治疗选择。在容量钙测定下，以并排方式比较各种大麻素对过表达系统TRPV2、TRPM8和TRPA1的影响，其中每条迹线的测量值代表平均一式三份的100,000个细胞/样品。如图41-43所示并如表3所总结，单个通道类型的大麻素之间的响应性与对给定大麻素的通道类型之间的响应性存在明显差异。

这些数据与如上所述的TRPV1结果相结合，可以为基于响应动力学、脱敏和受体选择性的合理设计治疗策略提供基础。

通过引用并入

本申请引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献出于所有目的通过引用以其全文并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献被分别指出出于所有目的通过引用并入的程度相同。

等同物

尽管已经阐明和描述了各种具体实施方式，但是以上说明书不是限制性的。应当理解在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。通过阅读本说明书，许多变化方案对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

Claims (57)

1.一种调节TRPV1通道渗透性的方法，所述方法包括：

使表达TRPV1的细胞与至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物外部接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括选择至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的较早步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种化合物是多种化合物，所述多种化合物的每一种具有不同的TRPV1状态相关的激动剂性质。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述预定性质是离子选择性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述离子选择性是针对Ca²⁺的选择性。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述离子选择性是针对Na⁺的选择性。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述预定性质是电流整流。

8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述预定性质是选择的TRPV1通道活化性能。

9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述预定性质是选择的TRPV1通道失活性能。

10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述预定性质是TRPV1诱导的离子电流量。

11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述至少一种化合物中的至少一种是大麻素。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述大麻素是大麻酚(CBN)。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚(CBD)。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述大麻素是大麻萜酚(CBG)。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述大麻素是次大麻二酚(CBDV)。

16.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述至少一种化合物中的至少一种是萜烯。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述萜烯是月桂烯。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述萜烯为柠檬烯。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述萜烯为芳樟醇。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述萜烯为叶绿醇。

21.根据权利要求16所述的方法，其中所述萜烯是橙花叔醇。

22.根据权利要求16所述的方法，其中所述萜烯为蒎烯。

23.根据权利要求1-22任一项所述的方法，其中接触所述细胞杀死所接触的细胞。

24.根据权利要求1-22任一项所述的方法，其中接触所述细胞不杀死所接触的细胞。

25.根据权利要求1-24任一项所述的方法，其中所述接触在体内进行。

26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述至少一种化合物配制成药物组合物，并且所述方法进一步包括向需要其的受试者施用所述药物组合物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有TRPV1介导的疼痛。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有TRPV1介导的心脏肥大。

29.一种治疗疼痛的方法，其包括

向患有疼痛的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，

其中所述至少一种化合物外部接触促进受试者的疼痛感的表达TRPV1的细胞。

30.一种治疗心脏肥大的方法，其包括

向患有心脏肥大的受试者全身施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物，

其中所述至少一种化合物外部接触表达TRPV1的心脏细胞。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述方法进一步包括选择至少一种具有预定的TRPV1状态相关激动剂性质的化合物的较早步骤。

32.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种化合物是多种化合物，所述多种化合物的每一种具有不同的TRPV1状态相关的激动剂性质。

33.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中所述预定性质是离子选择性。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述离子选择性是针对Ca²⁺的选择性。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述离子选择性是针对Na⁺的选择性。

36.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中所述预定性质是电流整流。

37.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中所述预定性质是选择的TRPV1通道活化性能。

38.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中所述预定性质是选择的TRPV1通道失活性能。

39.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中所述预定性质是TRPV1诱导的离子电流量。

40.根据权利要求29-39任一项所述的方法，其中所述至少一种化合物中的至少一种是大麻素。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述大麻素是大麻酚(CBN)。

42.根据权利要求40所述的方法，其中所述大麻素是大麻二酚(CBD)。

43.根据权利要求40所述的方法，其中所述大麻素是大麻萜酚(CBG)。

44.根据权利要求40所述的方法，其中所述大麻素是次大麻二酚(CBDV)。

45.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中所述至少一种化合物中的至少一种是萜烯。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述萜烯是月桂烯。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述萜烯为柠檬烯。

48.根据权利要求45所述的方法，其中所述萜烯为芳樟醇。

49.根据权利要求45所述的方法，其中所述萜烯为叶绿醇。

50.根据权利要求45所述的方法，其中所述萜烯是橙花叔醇。

51.根据权利要求45所述的方法，其中所述萜烯为蒎烯。

52.根据权利要求29-51任一项所述的方法，其中接触所述细胞杀死所接触的细胞。

53.根据权利要求29-51任一项所述的方法，其中接触所述细胞不杀死所接触的细胞。

54.根据权利要求29-53任一项所述的方法，其中所述接触在体内进行。

55.根据权利要求54所述的方法，其中将所述至少一种化合物配制成药物组合物，并且所述方法进一步包括向需要其的受试者施用所述药物组合物。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述受试者患有TRPV1介导的疼痛。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述受试者患有TRPV1介导的心脏肥大。

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