CN112525885A - 一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，属于光谱学和生物领域。包括银溶胶、石英片和拉曼光谱仪，采用盐酸羟胺络合法制备银溶胶，将待测样品和制备的银溶胶以一定比例混合均匀后，滴于石英片上，待烘干后，使用confocal Raman microspectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪检测。所获得的拉曼光谱通过主成分分析和线性判别分析，实现对旋毛虫肌幼虫感染的定性检测。优点是检测试剂盒操作简单、耗时短、需要样品量小，特异性和灵敏度高，具有良好的应用前景。

Description

一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒

技术领域

本发明属于光谱学和生物领域，特别涉及一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒。

背景技术

旋毛虫是一种线虫，可寄生于多种动物体内，包括人和多种哺乳动物，是重要的人兽共患寄生虫病的病原。目前，人生食或半生食肉类感染旋毛虫的事件时有发生，严重威胁公共卫生安全，同时，也会影响正常的肉类进出口贸易，造成经济损失。旋毛虫目前是生猪屠宰检验中强制检验项目。

目前对于屠宰动物旋毛虫病的检验，国际通用方法为镜检法和集样消化法。然而以上两方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，其敏感性为每克待检肉样中含3条虫体时方可检出。集样消化法虽可大大提高检出率，将虫体检出率提高至每克肉样中1条虫体，但该方法仍十分繁琐，因为集样消化法以20头份为一组份，在发现阳性样品时仍需对阳性组采用镜检法进行逐头镜检。从敏感性的角度来看，由镜检法和集样消化法所造成漏检的肉类均存在安全隐患并可引起人类的感染。同时，这两种方法无法应用于活猪的旋毛虫检测。免疫学方法如ELISA是目前最为敏感的方法，其敏感性可达每克肉样中0.01条虫体，但由于目前所广泛选用的检测抗原主要来源于虫体(如ES抗原和虫体粗抗原等)，存在组分复杂、不利于大规模生产、制备过程繁琐等弊端，此外，还存在严重的交叉反应，因此免疫学方法始终未被纳入法规方法。因此亟需建立一种操作简单、快速、灵敏、无损的旋毛虫检测方法。

表面增强拉曼光谱散射(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)是指当某些分子吸附到具有纳米级的贵金属粒子表面时，得到的拉曼散射信号就会增强上百万倍，由此得到的光谱被称为“表面增强拉曼光谱”。采用SERS技术，可以利用少量血清，即可得到整体血清变化情况，从而可以实现活体检测，不会影响后续贸易。另外，由于SERS具有“分子指纹”的特征，可以很好的反映细微的变化，实现旋毛虫肌幼虫的检测。因此非常适合于生物领域的研究。

发明内容

本发明提供一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，以解决现有的检测技术费时费力、且需要配备专业技术人员的问题。

本发明采取的技术方案是：包括银溶胶、石英片和拉曼光谱仪，其中：

所述银溶胶的制备方法如下：常温下将9mL0.1M氢氧化钠溶液加入到10mL6×10^-2M盐酸羟胺溶液中，混匀后，快速加入到180mL 1.11×10^-3M硝酸银水溶液中，搅拌至均匀，生成灰白色溶胶，10000rpm 10min离心，弃去上清，取下层溶胶；

所述的石英片为波数范围300-1500cm^-1内无明显拉曼峰的基底石英片；

所述的石英片亦可由玻璃片代替；

所述的拉曼光谱仪为confocal Raman microspectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪。

所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm，收集30s，累积2次，波数范围是300-1500cm^-1。

应用上述试剂盒进行旋毛虫肌幼虫检测的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品与银溶胶以1:1的比例混合均匀；

2)将步骤1)混匀后的样品在4℃孵育1.5-2h；

3)将步骤2)孵育完成的混合液滴加于石英片上，37℃烘干；

4)对石英片上的样品进行拉曼光谱检测，拉曼光谱仪为confocal Ramanmicrospectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪，检测条件为：激光波长785nm，收集30s，累积2次，波数范围是300-1500cm^-1；

5)利用五阶多项式拟合，去除荧光背景，得到初步的拉曼光谱，然后再利用Origin软件归一化处理，得到处理后的拉曼光谱；

6)将步骤5)获得的处理后的拉曼光谱通过主成分分析和线性判别分析进行处理；

7)将步骤6)获得的结果，进行受试者工作曲线分析，验证效果并判断结果。

上述检测方法的检测环境温度在4～40℃。

本发明相对于现有技术具有如下的优点：检测试剂盒采用表面增强拉曼光谱技术，操作简便、特异性和灵敏度高，能快速检测出样品的拉曼光谱图，经主成分分析和线性判别分析等化学计量方法，能区分是否感染旋毛虫，为快速检测旋毛虫肌幼虫提供了光学图谱的依据，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明的正常大鼠血清样品和旋毛虫感染大鼠的血清样品的拉曼光谱结果图；

图2是本发明的正常大鼠血清样品和旋毛虫感染大鼠的血清样品的拉曼光谱结果图PCA-LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)二维处理图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明使用的样品为正常SD大鼠血清和旋毛虫感染SD大鼠血清，旋毛虫由吉林大学人兽共患病研究所提供，大鼠由吉林大学基础医学院提供。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，包括银溶胶、石英片和拉曼光谱仪，其中：

所述的银溶胶的制备方法如下：所述的银溶胶的制备方法如下：常温下将9mL0.1M氢氧化钠溶液加入到10mL 6×10^-2M盐酸羟胺溶液中，混匀后，快速加入到180mL

1.11×10^-3M硝酸银水溶液中，搅拌至均匀，生成灰白色溶胶，10000rpm 10min离心，弃去上清，取下层溶胶即为银溶胶；

所述的石英片为波数范围300-1500cm^-1内无明显拉曼峰的基底石英片；

所述的拉曼光谱仪为confocal Raman microspectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪；

所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm，收集30s，累积2次，波数范围是300-1500cm^-1；

应用上述试剂盒进行旋毛虫肌幼虫检测的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品(分别为正常大鼠血清和旋毛虫感染大鼠血清)与银溶胶以1:1的比例混合均匀；

2)将步骤1)混匀后的样品在4℃孵育1.5-2h；

3)将步骤2)孵育完成的混合液滴加于石英片上，37℃烘干；

4)对石英片上的样品进行拉曼光谱检测，拉曼光谱仪为confocal Ramanmicrospectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪，检测条件为：激光波长785nm，收集30s，累积2次，波数范围是300-1500；

5)利用五阶多项式拟合，去除荧光背景，得到初步的拉曼光谱，然后再利用Origin软件归一化处理，得到处理后的拉曼光谱；

6)将步骤5)获得的处理后的拉曼光谱通过主成分分析和线性判别分析进行处理；

7)将步骤6)获得的结果，进行受试者工作曲线分析，验证效果并判断结果。

检测结果如图1和图2所示，图1是本发明的正常大鼠血清样品和旋毛虫感染大鼠的血清样品的拉曼光谱结果图。两图光谱下面积存在差异，且在476cm^-1，686cm^-1和1363cm^-1三个峰位存在显著差异。由此可见，正常大鼠血清样品和旋毛虫感染大鼠的血清样品的拉曼光谱存在明显的差异，可根据差异进行主成分和线性判别分析，建立判别样品的数学模型。

主成分分析结合线性判别分析结果如图2所示，图2是本发明的正常大鼠血清样品和旋毛虫感染大鼠的血清样品的拉曼光谱结果图PCA-LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)二维处理图。由图可知，三角形代表正常大鼠血清样品，圆圈代表旋毛虫感染大鼠的血清样品。根据两种样品的谱图信息计算各主成分的得分，由主要成分1、主要成分2级线性分析法作图，得到两种样品二维图上的PCA-LDA曲线，由图可知拉曼光谱结合PCA-LDA判别正确率达到87.5％。

由此可见，此试剂盒可以快速、准确区分正常血清样品和旋毛虫感染血清样品，适用于现场活体诊断和检测的快速筛查，具有良好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，其特征在于：包括银溶胶、石英片和拉曼光谱仪，其中：

所述的银溶胶的制备方法如下：常温下将9mL0.1M氢氧化钠溶液加入到10mL6×10^-2M盐酸羟胺溶液中，混匀后，快速加入到180mL 1.11×10^-3M硝酸银水溶液中，搅拌至均匀，生成灰白色溶胶，10000rpm 10min离心，弃去上清，取下层溶胶即为银溶胶。

2.根据权利要求1所述的快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，其特征在于：所述的石英片为波数范围300-1500cm^-1内无明显拉曼峰的基底石英片。

3.根据权利要求1所述的快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，其特征在于：所述的石英片可由玻璃片代替。

4.根据权利要求1所述的快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，其特征在于：所述的拉曼光谱仪为confocal Raman microspectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪。

5.根据权利要求4所述的快速检测旋毛虫肌幼虫的检测试剂盒，其特征在于：所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm，收集30s，累积2次，波数范围是300-1500cm^-1。

6.应用权利要求1～5任一项所述的试剂盒进行旋毛虫肌幼虫检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将待测样品与银溶胶以1:1的比例混合均匀；

2)将步骤1)混匀后的样品在4℃孵育1.5-2h；

3)将步骤2)孵育完成的混合液滴加于石英片上，37℃烘干；

4)对石英片上的样品进行拉曼光谱检测，拉曼光谱仪为confocal Ramanmicrospectrometer激光共聚焦拉曼光谱仪，检测条件为：激光波长785nm，收集30s，累积2次，波数范围是300-1500cm^-1；

5)利用五阶多项式拟合，去除荧光背景，得到初步的拉曼光谱，然后再利用Origin软件归一化处理，得到处理后的拉曼光谱；

6)将步骤5)获得的处理后的拉曼光谱通过主成分分析和线性判别分析进行处理；

7)将步骤6)获得的结果，进行受试者工作曲线分析，验证效果并判断结果。

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