CN112522288B

CN112522288B - 水稻雄性不育基因nsm1及其应用

Info

Publication number: CN112522288B
Application number: CN202011420803.4A
Authority: CN
Inventors: 陈海元; 张云辉; 唐伟杰; 张所兵; 方先文
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112522288A

Abstract

本发明涉及水稻雄性不育基因NSM1及其应用。所述水稻雄性不育基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明的雄性不育相关基因影响花粉发育和花药开裂。该基因的功能缺失突变体营养生长正常，但花粉败育，花药不开裂，最终导致植株不能结实。NSM1今后可以作为一个雄性不育基因应用于水稻杂种优势创制工作中，具有巨大的开发价值和应用前景。

Description

水稻雄性不育基因NSM1及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术工程技术领域，涉及水稻雄性不育基因NSM1及其应用。

背景技术

“三系法”和“两系法”杂交育种技术的成功应用大大提高水稻的产量。而近年来，发展出了“智能”不育系或第三代杂交水稻技术(邓兴旺等，2013；Chang et al.2016)，克服了“三系”、“两系”杂交育种技术的缺点，实现了用转基因手段生产非转基因的不育系种子和杂交稻种子，理论上所有隐性核不育基因都可以作为雄性不育基因的来源。因此克隆新的水稻雄性不育基因不仅能拓宽杂交稻的遗传基础，在不育系的稳定性与制种的安全性上具有重要的作用。

胼胝质是葡萄糖通过β-1,3糖苷键聚合而成的一种多糖，并具有一些β-1,6分枝(Ariizumi and Toriyama 2011)。胼胝质在植物花粉发育过程中起到至关重要的作用：花粉母细胞初生壁和细胞膜间胼胝质的沉积使药室中小孢子母细胞彼此分隔(Dong etal.2005)；减数分裂过程中形成的胼胝质壁使小孢子彼此分隔开(McCormick 1993；McCormick 2004)；减数分裂完成后，胼胝质壁的降解使小孢子彼此分离(Worrall etal.1992)；小孢子发育过程中，花粉外壁上的胼胝质为小孢子发育提供保护，保证花粉外壁的正常形成(McCormick 1993；McCormick 2004；Zhang et al.2009)；小胞子晚期，药室内壁加厚的主要成分是胼胝质；花粉萌发后，花粉管的形成需要胼胝质作为细胞壁的主要组分(Zhang et al2007)。因此胼胝质沉积和降解的时机对花粉的发育至关重要。

水稻中有10个编码胼胝质合成酶的基因，仅OsGSL5和OsGSL8的基因功能被阐述，其它基因的功能仍然未知。OsGSL5是拟南芥AtGSL2的同源基因，参与小孢子母细胞、二分体和四分体中的胼胝质沉积，并对花粉外壁形成至关重要(Shi et al.2015)。OsGSL8参与胚的发育(Song et al.2016)。UDPG是胼胝质合成的底物，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)和蔗糖合酶(sucrose synthase，SUS)能够催化UDPG的合成。蔗糖合酶催化6-磷酸蔗糖和UDP形成UDPG和6-磷酸果糖的可逆反应，水稻中蔗糖合酶家族包含7个基因，这些基因的表达模式不尽相同，哪些基因的主要功能是为胼胝质的合成提供底物还不清楚(Hirose et al.2008)。UGPase催化葡萄糖-1磷酸和UTP形成UDPG和焦磷酸的可逆反应，水稻中有两个编码UGPase的基因：OsUgp1和OsUgp2(Chen et al.2007)。OsUgp1的干扰植株在减数分裂前与野生型无显著差异，而减数分裂过程中胼胝质沉积显著减少，导致花粉母细胞在减数分裂早期便开始降解，花粉完全败育，且败育的小孢子也不能分开，因此该基因对水稻花粉减数分裂过程中胼胝质的沉积必不可少(Chen et al.2007)。OsUgp2主要在花粉二核期和成熟期表达，对于花粉粒中淀粉的填充起着关键作用(Mu etal.,2009；Huang et al,2011)。

NSM1基因编码一个胼胝质合成酶，该基因在水稻中尚未被克隆。克隆NSM1基因，明确该基因在水稻花粉和花药发育中的功能，有助于进一步理解植物雄性生殖发育的分子机理。该基因的突变并不影响水稻的营养生长，因此该基因是一个优良的不育基因，可以应用于水稻杂种优势的创制工作，拓宽杂交稻的遗传基础。

发明内容

本发明的目的是提供水稻雄性不育基因NSM1及其编码的蛋白。

本发明的另一目的是提供水稻雄性不育基因NSM1在杂种优势中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明通过EMS诱变，获得了一个可以稳定遗传的水稻雄性不育突变体nsm1。通过图位克隆分离了一种调控水稻雄性不育的基因NSM1，该基因具有如下(1)或(2)所述的核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

(2)与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

在严格条件下与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列也属于本发明的保护范围，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1XSSPE或含0.1％SDS的0.1XSSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

上述基因NSM1编码的蛋白也属于本发明的保护范围。该蛋白具有如下(a)或(b)所示的氨基酸残基序列：

(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加衍生得到的具有相同功能的氨基酸序列。

含有上述基因NSM1的表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌，或者上述基因NSM1的定点突变载体均属于本发明的保护范围。

所述的重组载体为重组克隆载体或重组表达载体，可用现有的植物表达载体构建所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺昔酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺昔酸信号可引导聚腺昔酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘦瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶N')s基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核普酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动了结合使用；此外，使用本发明的基囚构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可.以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS荃因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试标记基因(如抗除荞剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述的基因NSM1在培育雄性不育水稻中的应用。

上述的蛋白在培育雄性不育水稻中的应用。

上述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌，或上述的基因NSM1的定点突变载体在培育雄性不育水稻中的应用。

上述的应用是通过基因编辑或者抑制上述基因NSM1的表达得到雄性不育系水稻。

本发明的有益效果：

本发明的植物雄性不育基因NSM1影响植物的花粉发育和花药开裂过程。抑制该基因的表达可导致植物雄性不育性，并影响其结实率，从而可以培育雄性不育系转基因植物。所述蛋自及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为野生型和nsm1突变体的花器官、花粉育性和结实率比较。

其中，A为野生型和突变体小穗的比较，Bar＝5mm。B为野生型和突变体花器官的比较，Bar＝2mm。C和D分别是野生型和突变体成熟花粉粒的I₂-KI染色，Bar＝100μm。E为野生型和突变体小穗育性的比较，Bar＝5cm

图2为野生型和突变体花药开裂和柱头萌发的比较。

其中，A为野生型和突变体开花后花药开裂的比较，Bar＝1cm。B为A图的局部放大，Bar＝2mm。C为野生型和突变体花粉在柱头上萌发的比较，Bar＝50μm。D为野生型和突变体花粉管伸长的比较，Bar＝50μm。

图3为野生型和nsm1突变体小孢子胼胝质的沉积和降解比较。

S7-S8b和S10-S12表示水稻花药发育的stage 7-stage 8b和stage 10-stage 12，分别为小孢子母细胞、二分体、四分体、单核小孢子、二核小孢子和成熟花粉期，Bar＝20μm。

图4为NSM1基因的图位克隆。

其中，A为NSM1基因的精细定位。B为野生型和nsm1突变体中ORF3基因的cDNA示意图。C为野生型和突变体ORF3的部分DNA序列比对。

图5为nsm1突变体，nsm1突变体转PCAMBIA1305.1-NSM1阳性株和野生型花粉育性和小穗育性的比较。

其中，A为突变体、突变体互补植株和野生型成熟花粉I₂-KI染色(从左到右)。B为突变体、突变体互补植株和野生型小穗育性的比较(从上到下)。

图6为CRISPR技术编辑野生型ORF3基因得到的敲除植株序列和花粉表型。

其中，A为编辑植株CP1和CP8的NSM1基因结构示意图。B编辑植株CP1和CP8的I₂-KI染色，Bar＝50μm。

具体实施方法

以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、水稻不育突变体nsm1的表型鉴定

在粳稻品种南粳9108(NJ9108，本领域常见品种)的EMS诱变群体中，发现一个能够稳定遗传的不育突变体，该突变体的花器官与野生型没有显著差异。但是用1％的碘-碘化钾对野生型和突变体的成熟花粉粒进行染色发现突变的花粉在成熟期仍然黏连在一起，而且花粉部分败育(表1)，因此将该突变体命名为nsm1(none-separated microspores，保藏于江苏省农业科学院种质资源库，保藏编号M3A00413443)(见图1)。突变体的套袋结实率极低，而野生型和突变体杂交获得的F₁结实率与野生型无明显差异，进一步对野生型和突变体进行饱和授粉，结果表明突变体的结实率能恢复到野生型的水平(表1)。

表1野生型(WT)和nsm1突变体及其F1的育性表型和饱和授粉

对野生型和突变体开花后的花药进行观察，发现nsm1的花药严重不开裂。野生型开花后3h的柱头上附着正常数量的花粉粒，花粉粒在柱头上也能正常萌发，花粉管成功进入胚囊。而突变体的柱头上几乎看不到花粉粒附着，也没有观察到萌发的花粉粒和花粉管的伸长(图2)。

用0.1％苯胺蓝溶液对野生型和nsm1突变体不同发育时期小孢子的胼胝质沉积和降解进行观察，发现在S7时期，野生型和nsm1突变体小孢子母细胞初生壁和细胞膜间胼胝质正常沉积；S8a时期，野生型和突变体二分体的胼胝质壁没有显著差异；S8b时期，野生型的胼胝质壁正常形成，四个小孢子被胼胝质壁分隔，而nsm1突变体的胼胝质壁发育异常，只有一条明显的胼胝质壁分隔小孢子，另外一条胼胝质壁没有完全形成；单核小孢子至成熟期(S10-S12)，野生型小孢子间的胼胝质壁被降解，小孢子释放出来，逐渐发育成为成熟的花粉粒，而突变体在减数分裂结束后，小孢子间的胼胝质没有完全降解，一直保留到成熟时期，因此成熟花粉仍然黏连在一起(图3)。

实施例2、NSM1基因的图位克隆

将nsm1和野生型杂交构建F₂群体进行遗传分析。F₂群体中，花粉和小穗育性正常的植株与花粉和小穗呈现突变体表型的植株的比率符合3：1的分离比(179:55,χ²＝0.1766)，表明突变表型受一对隐性单基因控制(表2)。

表2nsm1突变体的遗传分析

将突变体nsm1与广亲和品种Dular(来自江苏省农业科学院种质资源库)杂交，在nsm1/Dular的F₂分离群体中随机选取与nsm1突变体表型相似的极端个体10株，及可育单株10株，分别提取DNA。用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对nsm1和Dular进行多态性分析，选择多态性良好且均匀分布在各个染色体上的134对标记分别分析上述20个单株，将雄性不育基因nsm1定位在第1染色体上标记R4和R12之间(图4A)。然后用278个F₂单株对连锁结果进行确认，并用R3、R4、R5和R12这四个分子标记对以上群体进行分析，筛选交换单株，初步将其定位在分子标记R4和R12之间。然后通过对6213个F₂单株的分析，最终将其限定在R8和R9之间的35.36kb区间内，突变基因与分子标记cap1和cap8共分离(图4A)。该区间内共预测有6个ORF，这些基因中没有已报道的花粉发育相关基因。对突变体35.36kb的定位区间进行测序，发现除了ORF3基因外，区间内的其它DNA序列与野生型一致。与野生型相比，突变体ORF3 ATG后481-755的275bp核苷酸序列缺失导致蛋白翻译提前终止((图4B和4C)。ORF3编码一个胼胝质合成酶。

实施例3、转基因互补和敲除验证NSM1基因的功能

(1)转基因互补

粳稻品种南粳9108的DNA作为模板，1305-NSM1-F：CGGTACCCGGGGATCCGCGTCTTCGGTTCCAGTT(SEQ ID NO:4)和1305-NSM1-R：ATGCCTGCAGGTCGACTTCTAATGACAGTTGGGAGTAC(SEQID NO:5)为引物，用KOD-FX扩增NSM1基因的全长序列(如SEQ ID NO:3所示)，包含起始密码子上游2197bp、NSM1的完整ORF和下游约1270bp的序列。NSM1的完整ORF如SEQ ID NO:2所示。引物1305-NSM1-F含有pCAMBIA1305.1载体EcoR1酶切位点附近的序列，引物1305-NSM1-R含有pCAMBIA1305.1载体BamH 1酶切位点附近的序列。用凝胶回收试剂盒(AxyGen，AXJ1035A)将扩增的DNA产物回收。用限制性内切酶EcoR1和BamH 1将pCAMBIA1305.1载体酶切成线性化DNA分子，凝胶回收试剂盒(AxyGen，AXJ1035A)回收。用In-fusion HD Cloning(Clone-tech，PT5162-1)将回收的4877bp的NSM1基因组全长序列插入到经过上述酶切的pCAMBIA1305.1载体上。重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，经过PCR鉴定的阳性克隆测序成功后，提取质粒，酶切鉴定，命名为pCAMBIA1305.1-NSM1。上述质粒转入农杆菌中，通过农杆菌介导法将pCAMBIA1305.1-NSM1质粒转入nsm1突变体中。突变体的愈伤组织是nsm1/WT的F₂种子进行愈伤诱导，通过测序选择基因型为nsm1纯合的愈伤组织进行转基因。通过PCR转基因鉴定，共获得10株阳性转基因植株。阳性转基因植株的营养生长与野生型没有明显差异；成熟花粉粒进行1％的碘-碘化钾染色，发现花粉粒和野生型一致，能够正常染色；植株成熟后，结实率也与野生型没有显著差异(图5)。

(2)转基因敲除

采用Miao等(2013)构建水稻高效定点突变载体。首先通过文献附件中开发的特异突变位点查找软件找到合适的spacer序列，合成两条带有接头的互补引物。PCR仪中缓慢退火后得到双链Oligo，通过T4连接酶将双链Oligo连接到经BsaI酶切的pOs-sgRNA入门载体中。测序成功后，通过LR反应(LR Clonase II，Invitrogen公司)替换至pH-Ubi-cas9终载体中。构建成功的载体经农杆菌EHA105转化水稻野生型愈伤组织，获得T₀代转基因植株，通过测序鉴定出该基因被编辑的植株，共鉴定到8株NSM1基因被编辑的敲除植株，其中CP1和CP8为纯合突变植株。CP1的NSM1基因ATG后483位点后插入一个碱基T，导致11个氨基酸的移码突变和翻译的提前终止(比野生型截短298个氨基酸)。CP8的NSM1基因在ATG后755-756bp处缺失了两个碱基GT，导致18个氨基酸的移码突变和翻译的提前终止(比野生型截短203个氨基酸)。CP1和CP8均表现出与nsm1突变体类似的表型，成熟花粉粒黏连在一起，且部分败育(图6)。

以上结果表明，nsm1突变体的花粉和小穗育性异常是由于NSM1基因的突变导致。通过基因编辑或者抑制NSM1基因的表达可以得到雄性不育系水稻。本发明的植物雄性不育基因NSM1影响植物的花粉发育和花药开裂过程。抑制该基因的表达可导致植物雄性不育性，并影响其结实率，从而可以培育雄性不育系转基因植物。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 水稻雄性不育基因NSM1及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

Met Phe Glu Ala Lys Val Ala Ser Gly Asn Gly Glu Gln Thr Leu Ser

1 5 10 15

Arg Asp Val Tyr Arg Leu Gly His Arg Leu Asp Phe Phe Arg Met Leu

20 25 30

Ser Phe Phe Tyr Thr Thr Ile Gly Phe Tyr Phe Asn Thr Met Met Val

35 40 45

Val Leu Thr Val Tyr Ala Phe Val Trp Gly Arg Phe Tyr Leu Ala Leu

50 55 60

Ser Gly Leu Glu Ala Phe Ile Ser Ser Asn Thr Asn Ser Thr Asn Asn

65 70 75 80

Ala Ala Leu Gly Ala Val Leu Asn Gln Gln Phe Val Ile Gln Leu Gly

85 90 95

Ile Phe Thr Ala Leu Pro Met Ile Ile Glu Asn Ser Leu Glu His Gly

100 105 110

Phe Leu Thr Ala Val Trp Asp Phe Ile Lys Met Gln Leu Gln Phe Ala

115 120 125

Ser Val Phe Tyr Thr Phe Ser Met Gly Thr Lys Thr His Tyr Tyr Gly

130 135 140

Arg Thr Ile Leu His Gly Gly Ala Lys Tyr Arg Ala Thr Gly Arg Gly

145 150 155 160

Phe Val Val Glu His Lys Lys Phe Ala Glu Asn Tyr Arg Leu Tyr Ala

165 170 175

Arg Ser His Phe Ile Lys Ala Ile Glu Leu Gly Val Ile Leu Thr Leu

180 185 190

Tyr Ala Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Leu Val Tyr Ile Leu

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Trp Phe Leu Val Leu Ser Trp Ile Leu Ala Pro

210 215 220

Phe Ile Phe Asn Pro Ser Gly Leu Asp Trp Leu Lys Asn Phe Asn Asp

225 230 235 240

Phe Glu Asp Phe Leu Asn Trp Ile Trp Phe Arg Gly Gly Ile Ser Val

245 250 255

Lys Ser Asp Gln Ser Trp Glu Lys Trp Trp Glu Glu Glu Thr Asp His

260 265 270

Leu Arg Thr Thr Gly Leu Phe Gly Ser Ile Leu Glu Ile Ile Leu Asp

275 280 285

Leu Arg Phe Phe Phe Phe Gln Tyr Ala Ile Val Tyr Arg Leu His Ile

290 295 300

Ala Gly Thr Ser Lys Ser Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ser Trp Ala Cys

305 310 315 320

Val Leu Leu Ala Phe Val Ala Leu Val Thr Val Ala Tyr Phe Arg Asp

325 330 335

Lys Tyr Ser Ala Lys Lys His Ile Arg Tyr Arg Leu Val Gln Ala Ile

340 345 350

Ile Val Gly Ala Thr Val Ala Ala Ile Val Leu Leu Leu Glu Phe Thr

355 360 365

Lys Phe Gln Phe Ile Asp Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ala Phe Leu Pro

370 375 380

Thr Gly Trp Gly Ile Ile Ser Ile Ala Leu Val Phe Lys Pro Tyr Leu

385 390 395 400

Arg Arg Ser Glu Met Val Trp Arg Ser Val Val Thr Leu Ala Arg Leu

405 410 415

Tyr Asp Ile Met Phe Gly Val Ile Val Met Ala Pro Val Ala Val Leu

420 425 430

Ser Trp Leu Pro Gly Leu Gln Glu Met Gln Thr Arg Ile Leu Phe Asn

435 440 445

Glu Ala Phe Ser Arg Gly Leu His Ile Ser Gln Ile Ile Thr Gly Lys

450 455 460

Lys Ser His Gly Val

465

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

atgtttgaag ccaaggttgc tagtggcaac ggtgagcaaa ctttgagcag agacgtttat 60

agactggggc acagattgga tttctttcgg atgctctctt tcttttatac aaccatcggg 120

ttttatttca acacaatgat ggtggtgcta acagtctatg catttgtatg ggggcgcttt 180

tatctcgcac tgagtggtct tgaggctttc atcagcagca atactaactc cacaaataat 240

gcagcgctag gagctgtcct taatcagcag tttgtcatac aactaggcat tttcactgca 300

ctgcccatga taattgaaaa ctcacttgaa catgggttcc tcactgcagt ttgggatttc 360

ataaaaatgc aattgcagtt tgcatctgtt ttctacacct tctcgatggg aacgaagaca 420

cattattatg ggcggacaat tcttcatgga ggtgcaaaat atcgagccac tggccgtggt 480

tttgttgtgg agcacaaaaa atttgcagaa aattataggc tgtatgctcg tagccacttc 540

atcaaagcaa tagagcttgg tgtgatattg actctttatg cttcttatgg tagcagctct 600

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attactggaa aaaaatcaca tggagtttga 1410

<210> 3

<211> 4877

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 3

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cctgacctca agggattcta tgatcaatgt cccaaagaac cttgaagctc gtcgaaggat 900

tgctttcttc agtaattcgt tgttcatgaa cataccacgg gccacccagg tggagaagat 960

gatggccttc agcgtcttga cgccatacta caatgaagag gtgttgtaca gcaaggacca 1020

gctctataag gagaatgaag atggcatctc aatcctgtac tatctgcaac aaatctatcc 1080

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gacactatca cgtactgtga ggggaatgat gtactactat gaagctctca agatgctgac 1260

atttcttgat tctgcatctg aacatgactt acggactgga tcccgggagc ttgctactat 1320

gggctcatca aggataggat cttcgagacg ggaagtgggt tctgatgggt caggatatta 1380

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taaaggcagc gagtatggga ctgtccttat gaaatacact tatgtggttg catgccagat 1500

ttacggtcag cagaaagcta agaatgaccc tcatgctttt gagattttag agctaatgaa 1560

gaattatgaa gcactacgtg ttgcctatgt tgatgaaaag aactccaatg gtggtgaaac 1620

agaatatttc tctgtccttg tgaaatatga tcagcaactg cagcgggagg ttgagattta 1680

tcgtgttaag ttgcctggac cactgaagct tggtgaaggc aaaccagaga accaaaatca 1740

tgcactcatc ttcacaaggg gtgatgctgt ccaaactatt gatatgaacc aagacaacta 1800

ttttgaagaa gctctcaaga tgagaaatct gctagaggag ttcaatcgcc attatggaat 1860

tcgcaagcca aaaatccttg gggttcggga acatgttttc actggttctg tgtcttctct 1920

agcttggttc atgtctgccc aggaaacaag ttttgttact ctggggcagc gtgttctggc 1980

agatccactg aaggtccgaa tgcattatgg ccatccagat gtctttgatc gtctttggtt 2040

cttgggacga ggtggtatca gtaaagcatc aagagttata aacatcagtg aggatatatt 2100

tgctgggttc aattgtaccc tccgtggggg taatgttaca caccatgaat acatccaggt 2160

tggtaaagga agggatgtgg ggctcaatca ggtttccatg tttgaagcca aggttgctag 2220

tggcaacggt gagcaaactt tgagcagaga cgtttataga ctggggcaca gattggattt 2280

ctttcggatg ctctctttct tttatacaac catcgggttt tatttcaaca caatgatggt 2340

ggtgctaaca gtctatgcat ttgtatgggg gcgcttttat ctcgcactga gtggtcttga 2400

ggctttcatc agcagcaata ctaactccac aaataatgca gcgctaggag ctgtccttaa 2460

tcagcagttt gtcatacaac taggcatttt cactgcactg cccatgataa ttgaaaactc 2520

acttgaacat gggttcctca ctgcagtttg ggatttcata aaaatgcaat tgcagtttgc 2580

atctgttttc tacaccttct cgatgggaac gaagacacat tattatgggc ggacaattct 2640

tcatggaggt gcaaaatatc gagccactgg ccgtggtttt gttgtggagc acaaaaaatt 2700

tgcagaaaat tataggctgt atgctcgtag ccacttcatc aaagcaatag agcttggtgt 2760

gatattgact ctttatgctt cttatggtag cagctctggg aacacattag tgtacatcct 2820

gctgacaatt tccagttggt ttctagttct ttcgtggatt cttgctccat tcatttttaa 2880

tccttcagga ttggattggc tgaagaattt taatgatttt gaggatttcc taaactggat 2940

ttggttccgg ggtggaatct cagtgaagtc agatcaaagc tgggagaagt ggtgggaaga 3000

agaaactgat catcttcgga caactggtct gtttgggagc atattggaaa tcatattgga 3060

ccttcggttt ttcttctttc aatatgcaat tgtttatcgg ctacacattg ccggtacaag 3120

caaaagcatc cttgtctacc ttctttcctg ggcatgtgtc ctgctggctt ttgtggctct 3180

tgtgacagtt gcttactttc gcgacaaata ttcagcaaag aagcacatac gttaccggct 3240

tgtccaggct attattgttg gtgcaacggt ggctgctatt gttctgttgt tagaattcac 3300

aaagttccaa ttcattgata cctttaccag ccttttggct tttcttccga ctggctgggg 3360

aatcatatct attgctctgg tattcaagcc ttatctgagg aggtctgaga tggtctggag 3420

aagtgtggtt actttggcac gcctatatga tataatgttt ggagtaattg ttatggcacc 3480

agtagctgtg ttgtcatggc tgcctggact ccaggagatg cagacgagga tcctgttcaa 3540

tgaagcattt agtaggggac tacatatttc ccaaatcatt actggaaaaa aatcacatgg 3600

agtttgaggt atgatatgtg gtacataatc catccctaag gtcagctcat taaatgtctg 3660

aaactgattg ataaccattt acatcttgag gctccttatc ccattattct ccattcattg 3720

gttattacaa tctcagttat tatgttttag tcctgttagt tctgtttgaa catttgattg 3780

aattggacgt gttctctaac atgcagctta taagctaata gggttattaa atgattttca 3840

cttgcgagtg tgttcacttt tcagttttat taagctgtct ttcatacttt ccatacattt 3900

gagtcgatac tactggcaaa ctcacacgaa acgttgcaca tattacgatg tactgatgtc 3960

caaacttgtt ggcttgatgc ttggttatta gcaaattgtt ttttttaatt ggttgtttcc 4020

aaattaagaa agttgatcac tacttttatg ggcactcaac ctggaacata tgtgataaat 4080

ggaattaagt gccaacactt cactgcctgg aggataaatt cattttgaga taaattttct 4140

tgtattgctc caatttaaga tgtgaggctt atcacgataa aagctggttt gttactgctt 4200

gtttgtcaag gatcatttat gcaatctgtc agtttttaat gttgccttta gcacctctgt 4260

tgcatttttt ttaactctct attgctagtg cttttgctag ctttcaagtt atatcatgtc 4320

ccctagcaat gatcatgaac atttgcaatt ttttctttca gctggattca tcttcctttt 4380

ctgaaaatga cctgccttga tggtattcta ttggaacgct gcccttctca aggtatgtta 4440

catagattgc tcatggtcaa atagttttac caaatgctgt ttaaacttaa actaaaattg 4500

agattgctcc gcaggttcat acaggcttcc cagtttagat tagatggatg ctagttctat 4560

gtacaggact ctttatcttg attcttctta actcaattta cacatggatt tctatggtag 4620

agatgataca gtcgatcgaa tgggttgtca atttggttta tattcatggt tcgagatttg 4680

gtagcttatt agaaattttg tagcgaaaca gagctgtaca aactttatcg tgaatgcacc 4740

tgcttatgcc gtgcgtagat ctcttgaggt ggctgccctt tttgttgtaa agtttattgt 4800

ttgctgtttg cgcatacctg cacatacacc ttcattgtgg tgagatagta attttgtact 4860

cccaactgtc attagaa 4877

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtacccgg ggatccgcgt cttcggttcc agtt 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcctgcag gtcgacttct aatgacagtt gggagtac 38

Claims

1.基因NSM1在培育雄性不育水稻中的应用，其特征在于，通过抑制核苷酸序列如SEQID NO:2所示的基因NSM1的表达得到雄性不育系水稻。