CN112522227A

CN112522227A - 高酶活的过氧化氢酶、基因以及高产过氧化氢酶的重组菌株和应用

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Publication number: CN112522227A
Application number: CN202011514714.6A
Authority: CN
Inventors: 李阳源; 黄江; 边叶雨; 江民华; 刘金山; 王勇; 王水生; 唐鹏; 陈琼银; 陈丽芝; 黄文德; 李鹏
Original assignee: Guangdong Vtr Bio Tech Co ltd
Current assignee: Guangdong Vtr Bio Tech Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112522227B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及高酶活的过氧化氢酶、基因以及高产过氧化氢酶的重组菌株和应用。所述过氧化氢酶CatR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了高酶活的过氧化氢酶及其基因，并且得到高效表达过氧化氢酶的重组菌株。通过发酵生产的重组菌株，能够高效地生产过氧化氢酶。本发明的过氧化氢酶在葡萄糖酸钠生产中得到广泛应用。

Description

高酶活的过氧化氢酶、基因以及高产过氧化氢酶的重组菌株和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及高酶活的过氧化氢酶、基因以及高产过氧化氢酶的重组菌株和应用。

背景技术

过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.)是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。该酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一,并在食品、医药、纺织、造纸、环保等行业具有重要的应用。

过氧化氢酶(CAT)是一种新型酶制剂，它在生物界的分布极广。CAT是氧自由基的自然天敌，它能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，对机体不断地补充过氧化氢酶。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40％。过氧化氢酶广泛应用在食品工业中，如用于分解葡萄糖酸钠生产过程中产生的过氧化氢，消除了过氧化氢对葡萄糖氧化酶的毒害。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。

不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。动物红细胞、肝脏以及细菌的过氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、提纯较为复杂。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞内酶，实现高产和提取均不方便。酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶。因此选用丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面具有较大优势。此外也有研究通过构建基因工程菌来生产过氧化氢酶。

已知丝状真菌的蛋白质分泌能力极高，适合作为生产酶等重组蛋白质的宿主。因此，将过氧化氢酶基因转化到丝状真菌中以重组蛋白质的形式进行大量表达，过氧化氢酶的表达量将会显著的提升。随着现代生物技术以及生物信息学的不断发展,,高产过氧化氢酶菌株的开发和应用必将呈现更加诱人的前景。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种高酶活的过氧化氢酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高酶活的过氧化氢酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述过氧化氢酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供上述高产过氧化氢酶的重组工程菌株。

本发明的再一目的是提供制备上述高酶活的过氧化氢酶的方法。

根据本发明的过氧化氢酶CatR，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO：1

MRAVQLLPSLAGLIGAASAVGCPYLTGQLDGREVHNPHEFQRRQDSGDAAASTEQFLSQFYLNDSNSYMTTDVGGPISDQNSLRAGERGPTLLEDFIFRQKIQHFDHERVPERAVHARGAGAHGTFTSYGNWSNITAASFLSAEGKETPVFVRFSTVAGSRGSSDTARDVHGFATRFYTDEGNFDIVGNNIPVFFIQDAILFPDLIHAVKPSPENEIPQAATAHDSAWDFFSQQPSALHTVFWAMSGHGIPRSFRHMDGFGVHTFRFVTDDGSSKLVKFHWTSLQGRAGLVWEEAQAAAGKNLDYMRQDLYDNIEAGRYPEWELGVQIVDEEDQLKFGFDLLDPTKILPVEYVPITPLGKLQLNRNPLNYFAETEQIMFQPGHIVRGIDFTEDPLLQGRLFSYLDTQLNRNGGPNFEQLPINRPRVPFHNNNRDGASQAFIPLNKAAYSPNTLNNGNPKQANQTVGDGFFTTPGRTASGRLLRAVSSTFSDVWSQPRLFYNSLVPAEQQFLINAIRFENSNVKSEVVRKNVITQLNRVDNDLARRVARAIGVEEPEPDPTYYHNNKTANVGTFGTPLKRIDGLKVGVLATVGDPDSISQGQSLSDTLSDSNVVVTVVAESFTDGVDALYTNSDATNFDAVIVVDGAEGLFAPSSFTAQPTNSSSTASLYPAGRPLQILVDAFRFGKPVGALGSGSKALDAAGISKSRPGVYVANSISEAFTDAIEDGLRTFKFLDRFALDE

根据本发明的过氧化氢酶的基因，编码上述过氧化氢酶CatR。

根据本发明的具体实施方式，所述过氧化氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO：2

ATGCGCGCTGTGCAACTTCTGCCCAGCCTCGCCGGCCTGATTGGCGCTGCCTCTGCTGTCGGATGTCCGTATCTGACGGGCCAGCTCGATGGCAGAGAGGTGCACAATCCGCACGAGTTCCAGCGTCGACAGGATTCCGGAGATGCGGCAGCGTCCACGGAGCAGTTCCTGTCCCAGTTCTATCTCAATGACAGCAACAGCTACATGACCACTGATGTCGGCGGCCCCATCTCGGATCAGAACAGTTTGAGGGCGGGAGAGCGCGGTCCAACCCTGCTGGAAGACTTCATCTTCCGCCAGAAGATCCAACACTTCGATCACGAGCGGGTCCCAGAACGCGCTGTCCATGCTCGAGGAGCGGGCGCCCACGGAACGTTCACTTCCTACGGAAACTGGTCCAACATTACTGCGGCCTCCTTCCTCAGCGCAGAAGGGAAAGAGACCCCCGTGTTTGTGCGCTTCTCGACCGTGGCCGGAAGTCGAGGCAGTTCGGACACGGCGCGCGATGTGCACGGGTTTGCCACCAGGTTCTACACTGACGAGGGCAACTTTGATATTGTGGGCAACAATATTCCAGTCTTCTTCATCCAGGACGCCATTCTCTTCCCTGACCTGATCCATGCCGTCAAACCCAGCCCCGAGAACGAGATCCCCCAGGCAGCGACAGCTCATGACTCGGCCTGGGACTTCTTCAGCCAGCAGCCCAGTGCGTTGCACACGGTCTTCTGGGCCATGTCCGGCCACGGCATCCCTCGCTCTTTTCGCCATATGGACGGCTTTGGCGTCCACACTTTCCGATTTGTGACCGACGACGGATCGTCCAAGCTGGTCAAGTTCCACTGGACCTCACTGCAGGGCCGGGCCGGCCTGGTCTGGGAGGAGGCGCAAGCGGCAGCTGGGAAGAACCTGGACTATATGCGCCAGGATCTGTATGACAACATCGAAGCCGGTCGTTACCCCGAATGGGAGCTGGGCGTGCAAATTGTCGATGAGGAGGATCAGCTCAAGTTTGGATTTGATCTGCTGGATCCAACCAAGATCCTTCCTGTCGAATATGTCCCCATCACGCCGCTTGGGAAGCTACAGCTTAACCGTAATCCGCTCAACTATTTCGCCGAGACGGAGCAAATAATGTTCCAACCCGGCCATATCGTGCGCGGAATCGACTTCACCGAAGATCCCCTTCTGCAGGGACGGCTCTTCTCCTATCTCGACACGCAATTGAACCGGAATGGAGGCCCCAATTTTGAGCAGCTCCCCATCAACCGTCCTCGGGTGCCATTCCATAACAACAACCGTGACGGAGCCAGCCAAGCGTTTATCCCCCTGAACAAGGCGGCCTATAGCCCGAACACGCTCAACAACGGCAACCCCAAGCAGGCGAACCAGACCGTGGGCGATGGCTTCTTCACCACTCCTGGACGCACAGCAAGTGGCCGGCTCTTGCGCGCTGTCAGTTCGACCTTTTCCGACGTCTGGTCACAGCCACGGCTGTTCTACAACTCGCTGGTGCCGGCAGAGCAGCAGTTCCTCATCAACGCCATCCGTTTCGAGAACTCCAACGTCAAGAGCGAGGTGGTCCGGAAGAATGTCATCACCCAGCTCAACCGTGTCGACAACGACCTCGCCCGCCGGGTTGCCCGGGCCATTGGCGTTGAAGAGCCCGAGCCCGATCCCACGTACTATCACAACAACAAGACGGCCAACGTGGGTACCTTTGGCACGCCGCTCAAGCGGATCGACGGTCTCAAAGTCGGTGTCCTTGCCACTGTTGGCGACCCAGACAGCATCAGCCAGGGCCAGAGTCTCAGCGACACGCTCTCGGACTCTAATGTCGTTGTCACCGTTGTTGCCGAGTCTTTCACGGACGGAGTCGATGCGCTCTACACCAACTCGGACGCGACCAACTTCGACGCCGTTATCGTGGTTGATGGCGCCGAAGGACTCTTCGCTCCGAGCAGCTTCACAGCCCAGCCGACGAACTCGTCCTCGACGGCATCGCTTTATCCTGCCGGTCGTCCGCTGCAGATTCTGGTCGACGCCTTCCGATTTGGCAAGCCGGTCGGCGCGCTGGGCAGCGGATCTAAGGCGCTTGACGCAGCAGGTATCTCGAAGAGCCGACCGGGTGTGTACGTTGCCAACTCGATCAGCGAGGCGTTTACCGACGCTATCGAGGATGGTTTGCGGACGTTCAAGTTCCTCGACCGGTTTGCGCTGGATGAGTAATGA

根据本发明的过氧化氢酶基因的重组载体包括上述高酶活的过氧化氢酶基因。

根据本发明的重组载体包含过氧化氢酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记的基因片段，将该重组表达盒转化宿主细胞原生质体并进行筛选得到重组黑曲霉表达菌。其中，所述启动子为黑曲霉表达质粒的启动子，优选为黑曲霉糖化酶启动子、中性淀粉酶启动子、黑曲霉糖化酶启动子和中性淀粉酶启动子；更优选为黑曲霉糖化酶启动子。重组载体的筛选标记选自乙酰胺酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、潮霉素磷酸转移酶、硝酸还原酶、乳清酸核昔-5'-磷酸脱羧酶、硫酸腺酰转移酶和邻氨基苯甲酸合酶以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的构巢曲霉乙酰胺酶和潮霉素磷酸转移酶。更优选为潮霉素磷酸转移酶。

根据本发明的高产过氧化氢酶的重组菌株，通过上述过氧化氢酶基因导入宿主菌获得所述重组菌株，所述宿主菌为选自属于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)或顶孢霉属(Acremonium)的丝状真菌，优选曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)，最优选黑曲霉。

根据本发明的具体实施方式，将来自真菌Rasamsonia sp.的过氧化氢酶CatR基因在黑曲霉(Aspergillus niger)中表达，筛选得到过氧化氢酶总酶活达到185695U/mL的重组黑曲霉，于2020年09月29日保藏与广东省微生物菌种保藏中心(地址，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码510070)，保藏编号GDMCC NO：61135。

根据本发明的发酵制备过氧化氢酶的方法，包括以下步骤：

构建包含编码上述过氧化氢酶CatR基因的重组载体；

将重组载体导入宿主细胞，获得重组菌株；

发酵重组菌株，获得过氧化氢酶。

本发明还提供了所述高产重组菌在生产过氧化氢酶中的应用。

本发明提供了高酶活的过氧化氢酶及其基因，并且克服了重组氧化氢酶表达效率低的问题，得到高效表达过氧化氢酶的重组菌株。通过发酵生产的重组菌株，能够高效地生产过氧化氢酶。本发明的过氧化氢酶在葡萄糖酸钠生产中得到广泛应用。

附图说明

图1显示产过氧化氢酶重组菌筛选酶活测定。

图2显示产过氧化氢酶发酵罐发酵过氧化氢酶发酵酶活。

图3为过氧化氢酶SDS-PAGE电泳图

图4为过氧化氢酶最适反应pH曲线。

图5为过氧化氢酶最适反应温度曲线。

重组黑曲霉(Aspergillus niger)菌株CATA-VTR-001于2020年09月29日保藏与广东省微生物菌种保藏中心(地址，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码510070)，保藏编号GDMCC NO：61135。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明的载体构建的规程和方法，使用基因工程领域惯用的规程和方法。

“基因”指在产生多肽中涉及的DNA片段，包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

“氨基酸取代”是指：将1个或多个氨基酸残基用其它化学上类似的氨基酸残基取代。可以列举出例如：将某个疏水性残基用其它疏水性残基取代的情况，将某个极性残基用具有相同电荷的其它极性残基取代的情况。能够进行这样的取代的功能上类似的氨基酸，按氨基酸分类是本技术领域公知的。具体的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸可以列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。

在本说明书中，针对碱基序列或氨基酸序列而言的“同一性”是指：在所比较的序列之间，构成各序列的碱基或氨基酸残基的一致程度。在本说明书中示出的任何“同一性”的数值，均只要是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值即可。

如本文中使用的“表达载体”指含有与一个或多个合适的控制序列有效连接的DNA编码序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现编码序列在宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选的操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或单纯的是潜在的基因组插入序列。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在一些情况下，可以自身整合到基因组中。质粒是最常使用的表达载体形式。然而，本发明意在包括发挥等同功能的其它形式的表达载体，所述表达载体是或者将是本领域已知的。

“启动子”指涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录中的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可用于本发明的诱导型启动子的非限制性实例是糖化酶启动子，该启动子是诱导型启动子。

术语“宿主细胞”指细胞或细胞系，用于多肽生产的重组表达载体可以转染到所述细胞或细胞系中以表达多肽。

真菌细胞能以本身已知的方式的通过涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及细胞壁的再生的过程进行转化。

根据发明，将包含编码过氧化氢酶的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞。从包含编码多肽的多核苷酸和包含与过氧化氢酶编码序列有效连接的调控序列的表达载体表达包含过氧化氢酶活性的多肽。

术语“重组菌株”当用于指细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示通过引入异源的核酸或蛋白质，或者改变天然的核酸或蛋白质而修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞源自这样修饰的细胞。

术语“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的基因，使那些含有引入的核酸或载体的宿主易于选择。

在一些实施方案中，过氧化氢酶是源自SEQ ID NO：1所述序列的成熟加工的序列。在一些实施方案中，源自SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的成熟加工的序列含有从SEQ IDNO：1的N端的1至约25个氨基酸残基的缺失，例如缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19个N端氨基酸。

本发明的蛋白质的修饰氨基酸序列的优选可以是其氨基酸具有1或多个(优选1或数个或者1、2、3或4个)保守取代的氨基酸序列。

与SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的1～741位的序列具有70％以上的同一性的氨基酸序列优选是具有80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同一性的氨基酸序列。

如本文中使用的，术语“转化”指具有非天然核酸序列的细胞，所述核酸序列整合到其基因组中，或者作为附加体质粒在多个世代中维持。可以使用任何本领域普遍已知的多种技术实施将载体引入到黑曲霉宿主细胞中，所述载体包含编码过氧化氢酶多肽的多核苷酸序列，例如，转化、电穿孔、核微注射、转导、转染、用磷酸钙DNA沉淀孵育、用DNA包被的微粒高速轰击或原生质体融合。

丝状真菌具有强大的蛋白分泌能力，某些丝状菌分泌的胞外总蛋白量达到40g/L，这种高效的蛋白分泌能力是细菌等原核表达宿主所不能比拟的。丝状真菌还具备各种基因翻译后加工能力，如糖基化修饰，信号肽切割及二硫键的形成等。米曲霉，黑曲霉及里氏木霉等丝状真菌都是食品安全级菌株。在工业用酶的生产中丝状菌发酵占据核心的地位，国际市场的酶制剂将近40％的酶类生产来自于丝状真菌发酵。

用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

本发明提供一种高产过氧化氢酶的丝状真菌表达宿主菌。丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

宿主细胞是在适于使用本领域中已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下，通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。

实验材料和试剂：

菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)VT-002菌株。

培养基和试剂：

TZ固体培养基：营养汁粉8g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L，淀粉10g/L.琼脂17g/L.pH 5.8。

CD培养基：蔗糖30g/L，NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L.KCl 0.5g/L，FeSO₄0.01g/L.或加15g/L琼脂，pH 7.3。

再生培养基平板：营养汁粉8g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2g/L，淀粉10g/L.琼脂17g/L.pH 5.8，再加0.8M KCl(g/L)或者山梨醇1M。

摇瓶发酵培养基：麦芽糖糊精80g/L，豆饼粉20g/L，玉米浆30mL/L，pH5.5，三角瓶装液量100mL/500mL，115℃灭菌20min。

种子罐培养基：麦芽糖糊精80g/L，豆饼粉40g/L，玉米浆10mL g/L，pH5.5，121℃灭菌30min。

发酵罐培养基：麦芽糖糊精40g/L，豆饼粉20g/L，玉米浆20mL/L，(NH₄)₂SO₄ 4g/L，氯化钙：2g/L，磷酸氢二钠：2g/L，磷酸二氢钾：3g/L，消泡剂控制发酵罐pH5.2-pH5.5，121℃灭菌35min。

裂解酶液：1％溶壁酶，用1M山梨醇溶解。

KCl溶液：0.6M KCl溶液；山梨醇溶液：1M山梨醇；S/C溶液：1M山梨醇，50mM CaCl2；PEG溶液：25％PEG8000，50mM CaCl2，10mM Tris-Hcl，pH 7.5。

实施例1、真菌Rasamsonia sp.过氧化氢酶CatR基因克隆

1.真菌Rasamsonia sp.过氧化氢酶CatR基因合成。

真菌Rasamsonia sp.菌株来自中国珠海的土壤样品通过稀释平板，从筛选平板到检测到微量过氧化氢酶酶活。后经过形态学特性和ITS rDNA序列，该菌株鉴定为Rasamsonia sp.利用引物CatR-F,CatR-R扩增出过氧化氢酶基因片段。其核苷酸序列为SEQID NO:2,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

PCR引物和反应条件如下：

CatR-F(5’-3’)：ATGCGCGCTGTGCAACTTCTGCCCAGC

CatR-R(5’-3’)：TCATTACTCATCCAGCGCAAACCGGTCGAGGAAC

反应条件：

表1

用上述引物进行PCR扩增，获得大小约为2.2kb的DNA条带，回收目的片段。

2.重组载体的构建：以上述扩增的过氧化氢酶基因片段最为模板，上游引物引入NotI(GCGGCCGC)酶切位点，下游引物引入PmeI(GAATTTC)酶切位点。引物序列如下：

NotI-CatR-F(5’-3’)：

ACGGCGGCCGCATGCGCGCTGTGCAACTTCTGCCCAGC

Pmei-CatR-R(5’-3’)：

GCGAAATTTCTCATTACTCATCCAGCGCAAACCGGTCGAGGAAC

反应条件：

表2

用上述引物进行PCR扩增，获得大小约为2.2kb的DNA条带，回收带有酶切位点的过氧化氢酶基因目的片段。将上述扩增的带有酶切位点基因片段和表达载体pAN-EXP分别进行限制性内切酶NotI和PmeI酶切。酶切目的片段和黑曲霉表达质粒电泳后分别回收这两个片段，用T4DNA连接酶将这两个片段进行酶连反应。具完成酶连反应后，将其进行大肠杆菌Top10感受态细胞转化。菌落PCR验证连接正确的转化子送去测序，测序正确后，正确转化子提取质粒。得到表达过氧化氢酶的黑曲霉表达载体pAN-EXP-CatR载体。

3.重组表达过氧化氢酶菌株的构建

(1)黑曲霉原生质体制备

黑曲霉菌株VT-002在TZ培养基上32℃培养4天，挑选标准菌落划线于CD固体培养基上，32℃培养4天，从CD平板上取4立方厘米琼脂块放入60ml CD液的三角瓶中，34℃培养4天。收集菌丝体，用1M山梨醇清洗一次，称取湿重，按质量体积比1：25加入裂解酶液，30℃，80r/min酶解2.5小时到3小时。将原生质体液过滤，回收滤液。4000r/min离心10min，弃上清。用预冷的0.6M KCl溶液离心。原生质体沉淀重悬于适量0.6M KCl溶液中，菌体浓度达到(1-3)*10⁶个/ml，置冰浴备用。原生质体再生用渗透压稳定剂将纯化的原生质体稀释并涂布原生质体再生培养基平板，32℃培养，4～5d后观察原生质体的再生情况。同时用无菌水涨破原生质体后作为对照，消除非原生质体所形成的菌落带来的误差。

(2)黑曲霉原生质体转化。

取制备好的200ul原生质体悬液，加入约5ug的pAN-EXP-CatR质粒，用枪头轻轻混匀。加入50ul PEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20-30min,缓慢加入1mL PEG缓冲液，室温放置20min后加入2mL S/C溶液，轻轻混匀，涂布于100ug/ml潮霉素的再生培养基平板，34℃培养5-6天。

(3)黑曲霉转化子筛选和摇瓶培养。

在潮霉素抗性板上生长了63个转化子，挑取39菌落较大的单菌落到装有摇瓶发酵培养基三角瓶进行培养，32℃摇床培养5天。

4.过氧化氢酶酶活测定和高酶活菌株酶活测定筛选。

过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为：

H₂O₂+2KI+H₂SO₄→I₂+K₂SO₄+2H₂O

I₂+2Na₂S₂O₃→2NaI+Na₂S₄O₆

取三个100mL三角瓶编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0mL，随即在3号瓶中加入1.8mol/L硫酸5.0ml以终止酶的活力，作为空白溶液。各瓶均加入5.0mL0.01mol/L过氧化氢溶液，每加一瓶即摇匀并开始记时。5min(必须准确)后立即向1、2号瓶各加5.0mL1.8mol/L硫酸溶液。

各瓶分别加入1.0mL20％的碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol/L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液淡黄色后加入5滴1％的淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。

反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。

被分解的过氧化氢量(μmol)＝1/2×V_Na2S2O3(空白滴定值-样品测定值)(mL)×10^-3×0.02×10⁶

如图1所示，过氧化氢酶酶活检测显示，从39个转化子中A19摇瓶酶活最高，酶活为2176U/ml。将过氧化氢酶酶活最高的黑曲霉重组菌株命名为黑曲霉重组菌株AN-A19。

5.过氧化氢酶菌株发酵。

采用7L搅拌式生物反应器，初始装液量为4L，接种量为500mL，移种条件:菌体浓度增大，镜检菌体染色深、视野清晰无杂菌，酶活力在3000u/ml左右；30℃，发酵过程中pH降至5.0时开始通氨通过流加氨水控制pH为5.0～5.2，通风量8L/min，转速：500～1000rpm，补料DE值控制在10；56小时至放罐补料DE值控制在30。后期转速逐渐加大，培养183h，定时取样测定酶活。离心菌体获得发酵上清液即为粗酶液，如图3所示，进行蛋白电泳SDS-PAGE检测和酶学性质检测。利用发酵培养基对重组工程菌进行7L发酵罐发酵培养，如图2所示，其中重组菌株的过氧化氢酶总酶活达到185695U/mL。

6.过氧化氢酶酶学性质。

(1)重组过氧化氢酶的最适反应温度

在25℃～50℃下，以5℃为间隔，分别测定过氧化氢酶的活力，以30℃下的酶活力为对照，测定不同温度下的相对酶活。结果如图5，过氧化氢酶作用的最适合温度为35℃。

(2)重组过氧化氢酶的最适反应pH

在不同pH(2.5～10.0)的缓冲液体系中分别测定过氧化氢酶的酶活，以pH值7.0的酶活为对照，测定不同pH值下的相对酶活。结果如图4所示，该过氧化氢酶作用的最适pH值为7.0。在pH4.5-pH10,相对酶活大于或等于80％，应用范围广。

7.过氧化氢酶在葡萄糖酸钠生产中的应用

在葡萄糖酸钠生产过程中，在氧气存在的条件下，葡萄糖氧化酶高效地将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，但过氧化氢的存在对葡萄糖氧化酶产生毒害作用，限制反应的继续进行，而过氧化氢酶能高效地将葡萄糖氧化生成的过氧化氢分解为氧气和水，消除过氧化氢对葡萄糖氧化酶活力的影响，促进葡萄糖酸钠生产过程的进行。本重组过氧化氢酶发酵总酶活高，温度和pH适用范围广，与葡萄糖氧化酶兼容性好，在pH5.2-6.0,温度35-45℃的条件下适用于葡萄糖酸钠的生产，具体操作实例如下：

(1)在20L发酵罐中，加入浓度为35％的葡萄糖溶液10L，按1500U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，30U/g葡萄糖氧化酶，在pH5.2，温度40℃，罐压0.1MPa，转速500r/min的条件下反应20h，反应过程中用10M氢氧化钠溶液进行中和维持pH稳定，反应结束后反应液体积为11.91L，残糖为0.65％，葡萄糖酸钠浓度为346.3g/L，葡萄糖利用率为97.23％。

(2)在20L发酵罐中，加入浓度为35％的葡萄糖溶液10L，按1500U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，30U/g葡萄糖氧化酶，在pH5.6，温度40℃，罐压0.1MPa，转速500r/min的条件下反应20h，反应过程中用10M氢氧化钠溶液进行中和维持pH稳定，反应结束后反应液体积为11.96L,残糖为0.58％，葡萄糖酸钠浓度为346.8g/L，葡萄糖利用率为97.79％。

(3)在20L发酵罐中，加入浓度为35％的葡萄糖溶液10L，按1500U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，30U/g葡萄糖氧化酶，在pH6.0，温度40℃，罐压：0.1MPa，转速：500r/min的条件下反应20h，反应过程中用10M氢氧化钠溶液进行中和维持pH稳定，反应结束后反应液体积为11.92L,残糖为0.77％，葡萄糖酸钠浓度为346.5g/L，葡萄糖利用率为97.38％。

(4)在20L发酵罐中，加入浓度为35％的葡萄糖溶液10L，按1500U/g葡萄糖加入所述得到的过氧化氢酶，30U/g葡萄糖氧化酶，在pH5.6，温度35℃，罐压：0.1MPa，转速：500r/min的条件下反应20h，反应过程中用10M氢氧化钠溶液进行中和维持pH稳定，反应结束后反应液体积为11.95L,残糖为0.68％，葡萄糖酸钠浓度为346.6g/L，葡萄糖利用率为97.65％。

(5)在20L发酵罐中，加入浓度为35％的葡萄糖溶液10L，按1500U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，30U/g葡萄糖氧化酶，在pH5.6，温度45℃，罐压：0.1MPa，转速：500r/min的条件下反应20h，反应过程中用10M氢氧化钠溶液进行中和维持pH稳定，反应结束后反应液体积为11.89L,残糖为0.71％，葡萄糖酸钠浓度为347.2g/L，葡萄糖利用率为97.33％。

8.过氧化氢酶在葡萄糖酸钙生产中的应用

在葡萄糖酸钙生产过程中，在氧气存在的条件下，葡萄糖氧化酶高效地将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，但过氧化氢的存在对葡萄糖氧化酶产生毒害作用，限制反应的继续进行，而过氧化氢酶能高效地将葡萄糖氧化生成的过氧化氢分解为氧气和水，消除过氧化氢对葡萄糖氧化酶活力的影响，促进葡萄糖酸钙生产过程的进行。本重组过氧化氢酶发酵总酶活高，温度和pH适用范围广，与葡萄糖氧化酶兼容性好，在温度35-45℃的条件下适用于葡萄糖酸钙的生产，具体操作实例如下：

(1)在20L发酵罐中，加入葡萄糖2000g，碳酸钙590g,加水混匀后，加水定容至10L，按800U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，10U/g葡萄糖氧化酶，在温度35℃，罐压0.1MPa，转速500r/min的条件下反应10h，反应结束后补水至10L，残糖浓度为0.42％，葡萄糖酸钙浓度为243.6g/L，葡萄糖利用率为97.79％。

(2)在20L发酵罐中，加入葡萄糖2000g，碳酸钙590g,加水混匀后，加水定容至10L，按800U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，10U/g葡萄糖氧化酶，在温度：40℃，罐压：0.1MPa，转速：500r/min的条件下反应10h，反应结束后补水至10L，残糖浓度为0.26％，葡萄糖酸钙浓度为245.7g/L，葡萄糖利用率为98.60％。

(3)在20L发酵罐中，加入葡萄糖2000g，碳酸钙590g,加水混匀后，加水定容至10L，按800U/g葡萄糖加入得到的过氧化氢酶，10U/g葡萄糖氧化酶，在温度：45℃，罐压：0.1MPa，转速：500r/min的条件下反应10h，反应结束后补水至10L,残糖浓度为0.48％，葡萄糖酸钙浓度为242.9g/L，葡萄糖利用率为97.51％。

序列表

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 高酶活的过氧化氢酶、基因以及高产过氧化氢酶的重组菌株和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 741

<212> PRT

<213> 丝状真菌(Rasamsonia sp.)

<400> 1

Met Arg Ala Val Gln Leu Leu Pro Ser Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ala

1 5 10 15

Ala Ser Ala Val Gly Cys Pro Tyr Leu Thr Gly Gln Leu Asp Gly Arg

20 25 30

Glu Val His Asn Pro His Glu Phe Gln Arg Arg Gln Asp Ser Gly Asp

35 40 45

Ala Ala Ala Ser Thr Glu Gln Phe Leu Ser Gln Phe Tyr Leu Asn Asp

50 55 60

Ser Asn Ser Tyr Met Thr Thr Asp Val Gly Gly Pro Ile Ser Asp Gln

65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Gly Glu Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp Phe

85 90 95

Ile Phe Arg Gln Lys Ile Gln His Phe Asp His Glu Arg Val Pro Glu

100 105 110

Arg Ala Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Thr Phe Thr Ser

115 120 125

Tyr Gly Asn Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Ser Ala Glu

130 135 140

Gly Lys Glu Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly Ser

145 150 155 160

Arg Gly Ser Ser Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr Arg

165 170 175

Phe Tyr Thr Asp Glu Gly Asn Phe Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile Pro

180 185 190

Val Phe Phe Ile Gln Asp Ala Ile Leu Phe Pro Asp Leu Ile His Ala

195 200 205

Val Lys Pro Ser Pro Glu Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala His

210 215 220

Asp Ser Ala Trp Asp Phe Phe Ser Gln Gln Pro Ser Ala Leu His Thr

225 230 235 240

Val Phe Trp Ala Met Ser Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Phe Arg His

245 250 255

Met Asp Gly Phe Gly Val His Thr Phe Arg Phe Val Thr Asp Asp Gly

260 265 270

Ser Ser Lys Leu Val Lys Phe His Trp Thr Ser Leu Gln Gly Arg Ala

275 280 285

Gly Leu Val Trp Glu Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gly Lys Asn Leu Asp

290 295 300

Tyr Met Arg Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Ile Glu Ala Gly Arg Tyr Pro

305 310 315 320

Glu Trp Glu Leu Gly Val Gln Ile Val Asp Glu Glu Asp Gln Leu Lys

325 330 335

Phe Gly Phe Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Leu Pro Val Glu Tyr

340 345 350

Val Pro Ile Thr Pro Leu Gly Lys Leu Gln Leu Asn Arg Asn Pro Leu

355 360 365

Asn Tyr Phe Ala Glu Thr Glu Gln Ile Met Phe Gln Pro Gly His Ile

370 375 380

Val Arg Gly Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu

385 390 395 400

Phe Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg Asn Gly Gly Pro Asn Phe

405 410 415

Glu Gln Leu Pro Ile Asn Arg Pro Arg Val Pro Phe His Asn Asn Asn

420 425 430

Arg Asp Gly Ala Ser Gln Ala Phe Ile Pro Leu Asn Lys Ala Ala Tyr

435 440 445

Ser Pro Asn Thr Leu Asn Asn Gly Asn Pro Lys Gln Ala Asn Gln Thr

450 455 460

Val Gly Asp Gly Phe Phe Thr Thr Pro Gly Arg Thr Ala Ser Gly Arg

465 470 475 480

Leu Leu Arg Ala Val Ser Ser Thr Phe Ser Asp Val Trp Ser Gln Pro

485 490 495

Arg Leu Phe Tyr Asn Ser Leu Val Pro Ala Glu Gln Gln Phe Leu Ile

500 505 510

Asn Ala Ile Arg Phe Glu Asn Ser Asn Val Lys Ser Glu Val Val Arg

515 520 525

Lys Asn Val Ile Thr Gln Leu Asn Arg Val Asp Asn Asp Leu Ala Arg

530 535 540

Arg Val Ala Arg Ala Ile Gly Val Glu Glu Pro Glu Pro Asp Pro Thr

545 550 555 560

Tyr Tyr His Asn Asn Lys Thr Ala Asn Val Gly Thr Phe Gly Thr Pro

565 570 575

Leu Lys Arg Ile Asp Gly Leu Lys Val Gly Val Leu Ala Thr Val Gly

580 585 590

Asp Pro Asp Ser Ile Ser Gln Gly Gln Ser Leu Ser Asp Thr Leu Ser

595 600 605

Asp Ser Asn Val Val Val Thr Val Val Ala Glu Ser Phe Thr Asp Gly

610 615 620

Val Asp Ala Leu Tyr Thr Asn Ser Asp Ala Thr Asn Phe Asp Ala Val

625 630 635 640

Ile Val Val Asp Gly Ala Glu Gly Leu Phe Ala Pro Ser Ser Phe Thr

645 650 655

Ala Gln Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Ala Ser Leu Tyr Pro Ala Gly

660 665 670

Arg Pro Leu Gln Ile Leu Val Asp Ala Phe Arg Phe Gly Lys Pro Val

675 680 685

Gly Ala Leu Gly Ser Gly Ser Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Ile Ser

690 695 700

Lys Ser Arg Pro Gly Val Tyr Val Ala Asn Ser Ile Ser Glu Ala Phe

705 710 715 720

Thr Asp Ala Ile Glu Asp Gly Leu Arg Thr Phe Lys Phe Leu Asp Arg

725 730 735

Phe Ala Leu Asp Glu

740

<210> 2

<211> 2229

<212> DNA

<213> 丝状真菌(Rasamsonia sp.)

<400> 2

atgcgcgctg tgcaacttct gcccagcctc gccggcctga ttggcgctgc ctctgctgtc 60

ggatgtccgt atctgacggg ccagctcgat ggcagagagg tgcacaatcc gcacgagttc 120

cagcgtcgac aggattccgg agatgcggca gcgtccacgg agcagttcct gtcccagttc 180

tatctcaatg acagcaacag ctacatgacc actgatgtcg gcggccccat ctcggatcag 240

aacagtttga gggcgggaga gcgcggtcca accctgctgg aagacttcat cttccgccag 300

aagatccaac acttcgatca cgagcgggtc ccagaacgcg ctgtccatgc tcgaggagcg 360

ggcgcccacg gaacgttcac ttcctacgga aactggtcca acattactgc ggcctccttc 420

ctcagcgcag aagggaaaga gacccccgtg tttgtgcgct tctcgaccgt ggccggaagt 480

cgaggcagtt cggacacggc gcgcgatgtg cacgggtttg ccaccaggtt ctacactgac 540

gagggcaact ttgatattgt gggcaacaat attccagtct tcttcatcca ggacgccatt 600

ctcttccctg acctgatcca tgccgtcaaa cccagccccg agaacgagat cccccaggca 660

gcgacagctc atgactcggc ctgggacttc ttcagccagc agcccagtgc gttgcacacg 720

gtcttctggg ccatgtccgg ccacggcatc cctcgctctt ttcgccatat ggacggcttt 780

ggcgtccaca ctttccgatt tgtgaccgac gacggatcgt ccaagctggt caagttccac 840

tggacctcac tgcagggccg ggccggcctg gtctgggagg aggcgcaagc ggcagctggg 900

aagaacctgg actatatgcg ccaggatctg tatgacaaca tcgaagccgg tcgttacccc 960

gaatgggagc tgggcgtgca aattgtcgat gaggaggatc agctcaagtt tggatttgat 1020

ctgctggatc caaccaagat ccttcctgtc gaatatgtcc ccatcacgcc gcttgggaag 1080

ctacagctta accgtaatcc gctcaactat ttcgccgaga cggagcaaat aatgttccaa 1140

cccggccata tcgtgcgcgg aatcgacttc accgaagatc cccttctgca gggacggctc 1200

ttctcctatc tcgacacgca attgaaccgg aatggaggcc ccaattttga gcagctcccc 1260

atcaaccgtc ctcgggtgcc attccataac aacaaccgtg acggagccag ccaagcgttt 1320

atccccctga acaaggcggc ctatagcccg aacacgctca acaacggcaa ccccaagcag 1380

gcgaaccaga ccgtgggcga tggcttcttc accactcctg gacgcacagc aagtggccgg 1440

ctcttgcgcg ctgtcagttc gaccttttcc gacgtctggt cacagccacg gctgttctac 1500

aactcgctgg tgccggcaga gcagcagttc ctcatcaacg ccatccgttt cgagaactcc 1560

aacgtcaaga gcgaggtggt ccggaagaat gtcatcaccc agctcaaccg tgtcgacaac 1620

gacctcgccc gccgggttgc ccgggccatt ggcgttgaag agcccgagcc cgatcccacg 1680

tactatcaca acaacaagac ggccaacgtg ggtacctttg gcacgccgct caagcggatc 1740

gacggtctca aagtcggtgt ccttgccact gttggcgacc cagacagcat cagccagggc 1800

cagagtctca gcgacacgct ctcggactct aatgtcgttg tcaccgttgt tgccgagtct 1860

ttcacggacg gagtcgatgc gctctacacc aactcggacg cgaccaactt cgacgccgtt 1920

atcgtggttg atggcgccga aggactcttc gctccgagca gcttcacagc ccagccgacg 1980

aactcgtcct cgacggcatc gctttatcct gccggtcgtc cgctgcagat tctggtcgac 2040

gccttccgat ttggcaagcc ggtcggcgcg ctgggcagcg gatctaaggc gcttgacgca 2100

gcaggtatct cgaagagccg accgggtgtg tacgttgcca actcgatcag cgaggcgttt 2160

accgacgcta tcgaggatgg tttgcggacg ttcaagttcc tcgaccggtt tgcgctggat 2220

gagtaatga 2229

Claims

1.过氧化氢酶CatR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种过氧化氢酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的过氧化氢酶CatR。

3.根据权利要求2所述的过氧化氢酶基因，其特征在于，所述过氧化氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.包含权利要求2所述过氧化氢酶基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含过氧化氢酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记的基因片段，

其中，所述启动子为黑曲霉表达质粒的启动子

所述筛选标记的基因片段选自乙酰胺酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、潮霉素磷酸转移酶、硝酸还原酶、乳清酸核昔-5'-磷酸脱羧酶、硫酸腺酰转移酶和邻氨基苯甲酸合酶。

6.包含权利要求2所述过氧化氢酶基因的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，通过将权利要求2所述的过氧化氢酶基因导入宿主菌获得所述重组菌株，其中，所述宿主菌为选自属于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)或顶孢霉属(Acremonium)的丝状真菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏编号GDMCC NO:61135。

9.权利要求1所述过氧化氢酶CatR的应用。

10.一种发酵制备过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

构建包含编码权利要求1所述过氧化氢酶CatR基因的重组载体；

将重组载体导入宿主细胞，获得重组菌株；

发酵重组菌株，获得过氧化氢酶。